DE10003356A1

DE10003356A1 - Novel ribozymes targeted against the catalytic subunit of the human telomerase enzyme reverse transcriptase are useful for treating tumors

Info

Publication number: DE10003356A1
Application number: DE10003356A
Authority: DE
Inventors: Zglinicki Thomas Von; Gabriele Saretzki; Antje Ludwig
Original assignee: Humboldt Universitaet zu Berlin; Universitatsklinikum Charite Berlin
Current assignee: Humboldt Universitaet zu Berlin; Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2000-07-27
Also published as: WO2000043501A2; EP1149161A2; JP2002536967A; WO2000043501A3

Abstract

A ribozyme, which reduces the activity of the catalytic subunit of the human telomerase hTERT (human Telomerase Enzyme Reverse Transcriptase), is new.

Description

Die Erfindung betrifft Anti-Telomerase-Ribozyme und ihre Verwendung. Die Ribozyme vermindern die Aktivität der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase (human Telomerase Enzyme Reverse Transcriptase, hTERT). Sie dienen als Telomerase-Inhibitoren, begrenzen die proliferative Kapazität und erhöhen die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber Zytostatika.The invention relates to anti-telomerase ribozymes and their use. The Ribozymes decrease the activity of the catalytic subunit of human telomerase (human Telomerase Enzyme Reverse Transcriptase, hTERT). They serve as telomerase inhibitors, limit the proliferative capacity and increase the sensitivity to tumor cells Cytostatics.

Die Telomerase ist eine unikale reverse Transkriptase, die mit Hilfe einer internen RNA- Komponente Telomerensequenzen de novo an das 3'DNA-Ende der Telomeren anhängt. Damit wirkt sie einer progressiven mitotischen Telomerenverkürzung entgegen, deren Ergeb nis in mortalen somatischen Zellen zur proliferativen Seneszenz führt. Obwohl es, insbeson dere bei experimentell immortalisierten Zellen sowie bei anderen Spezies, alternative Mög lichkeiten zum Telomerenlängenerhalt gibt, ist deren Bedeutung für die Tumorentstehung beim Menschen offenbar eher gering. Die weit überwiegende Mehrheit unterschiedlicher hu maner Tumoren besitzt eine hohe Telomeraseaktivität, während Ausgangszellen und nichtin vasive Tumorvorstufen meist nur geringe Aktivität aufweisen.Telomerase is a unique reverse transcriptase that is generated using an internal RNA Component telomer sequences is attached de novo to the 3'DNA end of the telomeres. It thus counteracts a progressive mitotic telomere shortening, the result of which leads to proliferative senescence in mortal somatic cells. Although it is, in particular in experimentally immortalized cells as well as in other species, alternative possibilities of telomere length maintenance is their importance for tumor development apparently rather low in humans. The vast majority of different hu some tumors have high telomerase activity, while parent cells and not vasive tumor precursors usually have little activity.

Die Telomeraseaktivität kann in vitro allein aus der RNA-Komponente und der katalytischen Untereinheit rekonstituiert werden. In der katalytischen Untereinheit konnte außer 7 konser vierten Sequenzmotiven für Reverse Transkriptasen ein telomerasespezifisches T-Motiv nachgewiesen werden. Mutationen in konservierten Aminosäuren des T-Motivs führen zu einem drastischen Funktionsverlust im zellfreien System (Weinrich S. L., Pruzan, R., Ma, L., Oulette, M., Tesmer, V. M., Holt, S. H., Bodnar, A., Lichtsteiner, S., Kim, N. W., Trager, J. B., Taylor, R. D., Carlos, R., Andrews, W. H., Wright, W., Shay, J W., Harley, C. B., Morin, G. B., Nature Genetics, 17, 1997, 498-502).The telomerase activity can be determined in vitro solely from the RNA component and the catalytic Subunit to be reconstituted. In the catalytic subunit, besides 7 cons fourth sequence motifs for reverse transcriptases a telomerase-specific T motif be detected. Mutations in conserved amino acids of the T motif lead to a drastic loss of function in the cell-free system (Weinrich S.L., Pruzan, R., Ma, L., Oulette, M., Tesmer, V. M., Holt, S. H., Bodnar, A., Lichtsteiner, S., Kim, N. W., Trager, J. B., Taylor, R. D., Carlos, R., Andrews, W. H., Wright, W., Shay, J W., Harley, C. B., Morin, G. B., Nature Genetics, 17, 1997, 498-502).

Hemmung der Telomerase wurde schon sehr früh als eine potentiell hochspezifische Mög lichkeit zur "Remortalisierung" und therapeutischen Kontrolle von Tumorzellen vorgeschla gen. Es war jedoch klar, daß Telomerase-Inhibition erst nach erheblicher Zeitverzögerung zur telomerenabhängigen Zellzyklusblockade führen würde (Kipling, D., Nature Genet 9, 1995: 104-105).Inhibition of telomerase was recognized very early on as a potentially highly specific possibility proposed for "remortalization" and therapeutic control of tumor cells gen. However, it was clear that telomerase inhibition only after a considerable time delay telomere-dependent cell cycle blockade (Kipling, D., Nature Genet 9, 1995: 104-105).

Die bisherigen Bemühungen, die Aktivität der Telomerase auszuschalten, richteten sich in erster Linie gegen die RNA-Komponente des Enzyms, da diese bereits seit 1995 bekannt ist. Eine erfolgreiche Telomeraseinhibition durch hTR-Antisensevektoren, die zu einer Telome renverkürzung und Seneszenz der entsprechenden Kultur führt, ist bisher nur einmal in HeLa Zellen demonstriert worden (Feng, J., Funk, W., Wang, S. S., Weinrich, S. L.,. Avilion, A. A., Chiu, C. P., Adams, R. R., Chang, E., Allsopp, R. C., Yu, J., Le, S., West, M. D., Harley, C. B., Andrews, W. H., Greider, C. W., Villeponteau, B, Science 1995, 269: 1236-1241). Erst in letzter Zeit sind Arbeiten einer Gruppe erschienen, die Telomerase-Inhibition in Gliomzellen mit nachfolgender Induktion von Apoptose oder Differenzierung durch Einsatz modifizierter Antisense-RNA berichten (Kondo, Y., Kondo, S., Li, G., Silvermann, R. H., Cowell, J. K., On cogene 1998, 16: 3323-3330; Kondo, Y., Kondo, S., Tanaka, Y., Haqqi, T., Barna, B. P., Co well, J. K., Oncogene 1998, 16: 2243-2248). Die Spezifität dieser Effekte ist jedoch unklar, Telomerenerosion wurde nicht nachgewiesen und ist hier wahrscheinlich nicht die Ursache der Apoptoseinduktion. Die RNA-Komponente ist möglicherweise nicht das beste Target für Telomerase-Inhibition, da sie auch in normalen Zellen exprimiert wird.The previous efforts to switch off the activity of telomerase have been directed towards primarily against the RNA component of the enzyme, since it has been known since 1995. Successful inhibition of telomerase by hTR antisense vectors resulting in a telome shortening the senes and senescence of the corresponding culture is only once in HeLa Cells have been demonstrated (Feng, J., Funk, W., Wang, S. S., Weinrich, S. L.,. Avilion, A. A., Chiu, C.P., Adams, R.R., Chang, E., Allsopp, R.C., Yu, J., Le, S., West, M.D., Harley, C.B., Andrews, W.H., Greider, C.W., Villeponteau, B, Science 1995, 269: 1236-1241). Only in Recently, work has been published by a group on telomerase inhibition in glioma cells with subsequent induction of apoptosis or differentiation by using modified Antisense RNA reports (Kondo, Y., Kondo, S., Li, G., Silvermann, R.H., Cowell, J.K., On cogene 1998, 16: 3323-3330; Kondo, Y., Kondo, S., Tanaka, Y., Haqqi, T., Barna, B.P., Co well, J.K. Oncogene 1998, 16: 2243-2248). However, the specificity of these effects is unclear Telomeric erosion has not been demonstrated and is probably not the cause here the induction of apoptosis. The RNA component may not be the best target for Telomerase inhibition because it is also expressed in normal cells.

Nukleosidanaloga, wie z. B. der bekannte Hemmer reverser Transkriptasen Azidothymidin, funktionieren gut im zellfreien System, zeigen in Zellen aber starke unspezifische Nebenwir kungen (Strahl, C., Blackburn, E., Mol Cell Biol 16, 1996, 53-65; Janta-Lipinski, Matthes, MDC Buch, pers. Mitteilung). Andere Strategien zur Hemmung der Telomerase wie z. B. An tisense-Technik mit peptidgekoppelten Nukleinsäuren oder Einsatz von Nicht-Nukleosiden sind bislang nur im zelifreien System erprobt.Nucleoside analogs such as e.g. B. the well-known reverse transcriptase inhibitor azidothymidine, work well in a cell-free system, but show strong non-specific side effects in cells kungen (Strahl, C., Blackburn, E., Mol Cell Biol 16, 1996, 53-65; Janta-Lipinski, Matthes, MDC book, personal communication). Other strategies to inhibit telomerase such as B. An tisense technique with peptide-coupled nucleic acids or use of non-nucleosides have so far only been tested in the cell-free system.

Hammerhead-Ribozyme sind katalytische RNAs mit einer wohldefinierten Struktur, die RNA- Targets mit der Sequenz XUN (N = A, C oder U) spezifisch spalten. Die Sequenz GUC gehört zu den besonders gut spaltbaren Targets. Hemmung der Telomerase und folgende Telomeren verkürzung durch Ribozyme gegen hTR wurde beschrieben (Yokoyama, Y., Takahashi, Y., Shinohara, A., Lian, Z., Wan, X., Niwa, K., Tamaya, T., Cancer Res., 58, 1998 : 5406-5410). Eine verläßliche Inhibition des Zellwachstums wurde bisher mit Ribozymen gegen hTR nicht erreicht. Ribozyme mit Aktivität gegen hTERT, die mRNA der katalytischen Untereinheit der Telomerase, wurden bisher nicht beschrieben.Hammerhead ribozymes are catalytic RNAs with a well-defined structure, the RNA- Specifically split targets with the sequence XUN (N = A, C or U). The sequence belongs to GUC to the particularly easy to split targets. Inhibition of telomerase and subsequent telomeres shortening by ribozymes against hTR has been described (Yokoyama, Y., Takahashi, Y., Shinohara, A., Lian, Z., Wan, X., Niwa, K., Tamaya, T., Cancer Res., 58, 1998: 5406-5410). So far, no reliable inhibition of cell growth has been achieved with ribozymes against hTR reached. Ribozymes with activity against hTERT, the mRNA of the catalytic subunit of Telomerase have not been described previously.

In letzter Zeit gibt es erste Hinweise auf spezifische Wechselbeziehungen zwischen Telome ren und Telomerase einerseits und DNA-schädigenden Prozessen andererseits. Das bedeutet, daß Telomerase nicht nur durch Kompensation der "normalen" Telomerenerosion zur unlimi tierten Proliferation von Tumorzellen beitragen könnte. Telomeren sind hypersensitiv gegen über oxidativem Streß (Petersen, S., Saretzki, G., von Zglinicki, T. Exp. Cell Res. 1998, 239: 152-160). Inhibition der Telomerase in humanen Glioblastomzellen führt zur Induktion von Apoptose (Kondo, Y., Kondo, S., Li, G., Silvermann, R. H., Cowell, J. K., Oncogene 1998, 16: 3323-3330) oder zur Sensibilisierung gegen cis-Platin (Kondo, Y., Kondo, S., Tanaka, Y., Haqqi, T., Barna, B. P., Cowell, J. K., Oncogene 1998, 16: 2243-2248) innerhalb weniger Tage, d. h. bevor eine signifikante Telomerenverkürzung auftreten kann.Recently there have been first indications of specific interrelationships between telomes and telomerase on the one hand and DNA damaging processes on the other. That means, that telomerase not only by compensation of the "normal" telomer erosion to the unlimited proliferation of tumor cells could contribute. Telomeres are hypersensitive to on oxidative stress (Petersen, S., Saretzki, G., von Zglinicki, T. Exp. Cell Res. 1998, 239: 152-160). Inhibition of telomerase in human glioblastoma cells leads to the induction of Apoptosis (Kondo, Y., Kondo, S., Li, G., Silvermann, R.H., Cowell, J.K., Oncogene 1998, 16: 3323-3330) or for sensitization to cis-platinum (Kondo, Y., Kondo, S., Tanaka, Y., Haqqi, T., Barna, B.P., Cowell, J.K., Oncogene 1998, 16: 2243-2248) within a few days, d. H. before significant telomere shortening can occur.

In der Patentliteratur werden Telomerase-Inhibitoren mehrfach beschrieben. Sie richten sich vorwiegend gegen die RNA-Komponente des Enzyms (z. B. EP 666313 WO 97/37 691 und WO 98/28 442). Über Methoden zur Krebsbehandlung unter Verwendung von Telomerase- Inhibitoren wird in den US-Patenten US 5767278, US 5770613, US 5703116, US 5760062 und 5656638 berichtet. Die katalytische Untereinheit der menschlichen Telomerase (hTERT) hat die internationale Patentanmeldung WO 98/14 593 und die daraus hervorgegangene euro päische (EP 841396) bzw. deutsche Patentanmeldung (DE 197 43 497) zum Inhalt. Die darin beschriebenen Polynucleotide und Plasmide eignen sich zur Diagnose, Prognose und Behand lung von menschlichen Krankheiten und zur Veränderung der Proliferationskapazität von Zellen und Organismen. Die Patentschriften WO 98/14 593 und WO 98/14 592 beziehen sich auf Plasmide, darunter auch solche, die den Bereich des T-Motivs von hTERT überspannen, und zwar sowohl Expressionplasmid(e) als auch antisense-Plasmide. Antisense-Plasmide können zur Inhibition der Telomerase eingesetzt werden. Die deutsche Patentanmeldung DE 197 20 151 beschreibt ein chemisch modifiziertes Oligodesoxynukleotid, das einerseits einen Antisense-Effekt gegen hTR ausübt, andererseits an seinem 5'-Ende mit dem Protein der kata lytischen Untereinheit hTERT reagiert.Telomerase inhibitors are described several times in the patent literature. You align yourself predominantly against the RNA component of the enzyme (e.g. EP 666313 WO 97/37 691 and WO 98/28 442). About Cancer Treatment Methods Using Telomerase Inhibitors are described in US Patents US 5767278, US 5770613, US 5703116, US 5760062 and 5656638 reports. The catalytic subunit of human telomerase (hTERT) has the international patent application WO 98/14 593 and the resulting euro content (EP 841396) or German patent application (DE 197 43 497). The one in it The polynucleotides and plasmids described are suitable for diagnosis, prognosis and treatment development of human diseases and to change the proliferation capacity of Cells and organisms. The patent specifications WO 98/14 593 and WO 98/14 592 relate for plasmids, including those that span the area of the T motif of hTERT, both expression plasmid (s) and antisense plasmids. Antisense plasmids can be used to inhibit telomerase. The German patent application DE 197 20 151 describes a chemically modified oligodeoxynucleotide that has one Antisense effect against hTR, on the other hand at its 5 'end with the protein of the kata lytic subunit responds.

Ribozyme, d. h. Polyribonukleotide, die antisense-Flanken mit einer zentralen RNA- schneidenden Struktur verbinden, sind jedoch in den o. g. Patenten nicht erwähnt. Zur spezifi schen Hemmung der katalytischen Untereinheit der Telomerase existieren bislang keine pu blizierten Ergebnisse.Ribozymes, i.e. H. Polyribonucleotides, the antisense flanks with a central RNA connect cutting structure, but are in the above. Patents not mentioned. For speci pu inhibition of the catalytic subunit of telomerase does not yet exist published results.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Aktivität der katalytischen Untereinheit der hu manen Telomerase (human Telomerase Enzyme Reverse Transcriptase, hTERT) zu vermin dern und damit neue Telomerase-Inhibitoren zur Verfügung zu stellen.The invention was based on the object, the activity of the catalytic subunit of the hu minine telomerase (human telomerase enzyme reverse transcriptase, hTERT) and thus to provide new telomerase inhibitors.

Die Aufgabe wurde durch neue Ribozyme, die gegen das T-Motiv der humanen Telomerase gerichtet sind, gelöst. Die erfindungsgemäßen Ribozyme enthalten folgende Sequenzen:
The task was solved by new ribozymes, which are directed against the T motif of human telomerase. The ribozymes according to the invention contain the following sequences:

1.5'-GCUCGAC CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACGUACACA-3 '
2.5'-GCAGCUC CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACGACGUAC-3 '
3.5'-AAAGAAA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACCUGAGCA-3 '
4. 5'-UCUCCGU CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACAUAAAAG-3 '
5. 5'-UGCUCCA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACACUCUUC-3 '
6.5'-GACGACG CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACACACUCA-3 '
7.5'-CUUUUGA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACGUGGUCU-3 '
8. 5'-GCUUUGC CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACUUGCUCC-3 '
9. 5'-AAGACCU CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AGCAGCUCG-3 '
10. 5'-UGUUUUU CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AGCCUGUUC-3 '
11. 5'-CAUAAAA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AAAGACCUG-3 '
12. 5'-UUCUUUU CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AAACGUGGU-3 '
13. 5'-UCCGGUA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AAAAAGAGC-3 '

(kleine Buchstaben bezeichnen im Rahmen der Komplementarität der Nukleotide im Stemloop frei wählbare Nukleotide).(Small letters refer to the complementarity of the nucleotides in the Stemloop freely selectable nucleotides).

Es hat sich herausgestellt, daß die erfindungsgemäßen Ribozyme das T-Motiv der humanen Telomerase (hTERT) wie designt an einer der Sequenzen GUC, GUA, GUU, CUC oder UUC spalten.It has been found that the ribozymes according to the invention have the T motif of human Telomerase (hTERT) as designed on one of the sequences GUC, GUA, GUU, CUC or UUC columns.

Die erfindungsgemäßen Hammerhead-Ribozyme besitzen katalytische Aktivität in vitro. Sie spalten die mRNA für die humane Telomerase (hTERT) im T-Motiv an den vom Design ge planten Sequenzen. Die Hemmung der Telomerase in Zellen gelingt durch stabile Transfekti on eines Expressionsvektors, in den das Ribozym kloniert wurde. Sie gelingt ebenfalls mit anderen Transfektionsverfahren (z. B. transiente Transfektion oder Infektion mit einem re kombinanten Virus). Ein im katalytischen Zentrum mutiertes Ribozym hat keinen Effekt. Er findungsgemäß tritt Telomerenverkürzung und Krise in Klonen mit gehemmter Telomerase ein.The hammerhead ribozymes according to the invention have catalytic activity in vitro. she cleave the mRNA for human telomerase (hTERT) in the T motif at the ge of the design planned sequences. The inhibition of telomerase in cells is achieved through stable transfecti on an expression vector in which the ribozyme was cloned. She also succeeds other transfection methods (e.g. transient transfection or infection with a re combined virus). A ribozyme mutated in the catalytic center has no effect. He According to the invention, telomere shortening and crisis occur in clones with inhibited telomerase on.

Die Klone mit gehemmter Telomerase steigern die Sensitivität gegenüber Doxorubicin (gemessen mit XTT-Assay - kolorimetrischer Assay - als Konzentration, die 50% der Zellen abtötet - LD50) um einen Faktor 2-3.The clones with inhibited telomerase increase the sensitivity to doxorubicin (Measured using XTT assay - colorimetric assay - as a concentration that 50% of the cells kills - LD50) by a factor of 2-3.

Die Hemmung der Telomerase durch die erfindungsgemäßen Ribozyme wird sowohl in allei niger Anwendung als auch in Kombination mit Zytostatikagabe und/oder Bestrahlung erreicht. Dadurch wird sowohl die "klassische" Telomerenverkürzung nach Hemmung der Telomerase, die im Verlauf mehrerer Zellteilungen schließlich zur Krise und zum Absterben der Zellen führt, als auch die Telomerenverkürzungsrate durch DNA-Schädigung beschleunigt, oder es werden unabhängige Reparatureigenschaften der Telomerase ausgeschaltet, was eine erhöhte Sensitivität bewirkt.The inhibition of telomerase by the ribozymes according to the invention is both in allei niger application and in combination with cytostatic administration and / or radiation achieved. As a result, both the "classic" telomere shortening after inhibition of telomerase, which, in the course of several cell divisions, ultimately leads to the crisis and cell death leads, as well as the rate of telomere shortening accelerated by DNA damage, or it independent repair properties of telomerase are switched off, which increases Sensitivity causes.

Das Wesen der Erfindung liegt in einer Kombination bekannter Elemente und neuer Lö sungswege, die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Ge brauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, daß nunmehr Inhibitoren der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase (human Telomerase Enzyme Reverse Transcriptase, hTERT) zur Verfügung stehen.The essence of the invention lies in a combination of known elements and new Lö paths that influence each other and have a new overall effect advantage and the desired success, which lies in the fact that now inhibitors of catalytic subunit of human telomerase (human telomerase enzyme reverse Transcriptase, hTERT) are available.

Die erfindungsgemäßen Ribozyme eignen sich zur Verwendung als Telomerase-Inhibitoren und zur Telomerenverkürzung, auch in Kombination mit Zytostatikagabe und/oder Bestrah lung oder mit Topoisomerase-Inhibition und dadurch zur Beschleunigung der Telomerenver kürzungsrate durch DNA-Schädigung sowie zur Ausschaltung der Reparatureigenschaften der Telomerase. Die erfindungsgemäßen Ribozyme eignen sich zur Behandlung von Tumoren und zur Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber Zytostatika.The ribozymes according to the invention are suitable for use as telomerase inhibitors and to shorten telomeres, also in combination with cytostatic administration and / or irradiation lung or with topoisomerase inhibition and thereby to accelerate the Telomerever cut rate due to DNA damage and to switch off the repair properties of the Telomerase. The ribozymes according to the invention are suitable for the treatment of tumors and to increase the sensitivity of tumor cells to cytostatics.

Die folgenden Beispiele dienen der Verdeutlichung der Erfindung, ohne sie auf diese Beispie le zu beschränken.The following examples serve to illustrate the invention without being based on this example to limit le.

Embodiments example 1 Ribozyme design

Ribozyme bestehen aus den Helizes I und III, die mit den die Schnittstelle flankierenden Se quenzen des Targets hybridisieren, sowie dem katalytischen Kern und dem Stemloop (Helix II) mit der Struktur CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA. Die Herstellung der Ribozyme kann z. B. als Oligoribonukleotid erfolgen. Dazu wird die Sequenz wie angegeben aus den Ribonu kleotiden G, C, A und U nach bekannten Verfahren synthetisiert. Stabilisierung des 3'- und des 5'-Endes mittels modifizierter Nukleotide oder cap-Strukturen ist prinzipiell möglich, der Einfluß dieser Modifikationen auf die katalytische Aktivität des Ribozyms muß im Einzelfall getestet werden. Diese Ribozyme können direkt eingesetzt werden. Eine andere Möglichkeit ist die Synthese der cDNA für das Ribozym aus den Desoxyribonukleotiden G, C, A und T. Diese Form der Ribozyme kann in Verbindung mit geeigneten Promotor(en) und Transfekti onsvektoren (z. B. adeno- oder retrovirale Vektoren) eingesetzt werden.Ribozymes consist of helices I and III, which with the Se flanking the interface hybridize sequences of the target, as well as the catalytic core and the stem loop (helix II) with the structure CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA. The production of the ribozymes can e.g. B. done as an oligoribonucleotide. To do this, the sequence is given from the Ribonu Kleotiden G, C, A and U synthesized by known methods. Stabilization of the 3'- and of the 5 'end using modified nucleotides or cap structures is possible in principle The influence of these modifications on the catalytic activity of the ribozyme must be determined in individual cases getting tested. These ribozymes can be used directly. Another possibility is the synthesis of the cDNA for the ribozyme from the deoxyribonucleotides G, C, A and T. This form of ribozymes can be used in conjunction with suitable promoters and transfectives ons vectors (e.g. adenoviral or retroviral vectors) are used.

cDNA sequence of the T motif from hTERT (GenBank AF015950)

Nicht zum T-Motiv gehörende Nukleotide sind kursiv dargestellt. Aus der Sequenz ergeben sich die möglichen Schnittstellen und die Sequenzen der Antisense-Helizes für die möglichen Ribozyme 1-13. Die Schnittstelle des ersten Ribozyrris (R1) ist fett dargestellt, und die flan kierenden Sequenzen sind einmal bzw. zweimal unterstrichen. Darunter befindet sich das zu gehörige Ribozym mit entsprechender Darstellung:
Nucleotides not belonging to the T motif are shown in italics. The possible interfaces and the sequences of the antisense helices for the possible ribozymes 1-13 result from the sequence. The interface of the first ribozyrris (R1) is shown in bold and the flanking sequences are underlined once or twice. Below is the corresponding ribozyme with the corresponding representation:

Example 2 Evidence of the catalytic activity of ribozymes 1-4 in vitro

Eine 224 Nukleotide (nt) lange RNA, die die Sequenz des T-Motivs einschließt, wurde durch in-vitro-Transkription aus der mit einem T7-Promoter verlinkten cDNA von hTERT herge stellt (Target-RNA). Während der Transkription erfolgte die radioaktive Markierung mittels P³²-UTP. Ribozyme wurden nach Standardverfahren aus Ribonukleotiden mit durch Fpmp (11-(2-Fluorophenyl)-4-methoxy-piperidin-1-yl) geschützten 2'-Hydroxylgruppen syntheti siert und HPLC-gereinigt. Sie wurden vor Gebrauch entschützt. Die Target-RNA wurde mit Ribozym 1, 2, 3 oder 4 bzw. ohne Ribozym (/) für 60 und 180 min inkubiert und die Reakti onsprodukte elektrophoretisch im Polyacrylamid-Gel getrennt. Das Gel wurde im Phosphoi mager ausgewertet und zeigt Spaltung der Target-RNA an den designierten Stellen durch die Ribozyme 3 und 4 mit hoher Effizienz und geringe Wirksamkeit der Ribozyme 1 und 2 (Fig. 1).A 224 nucleotide (nt) long RNA, which includes the sequence of the T motif, was produced by in vitro transcription from the cDNA linked to a T7 promoter from hTERT (target RNA). During the transcription, the radioactive labeling was carried out using P ³² -UTP. Ribozymes were synthesized according to standard procedures from ribonucleotides with 2'-hydroxyl groups protected by Fpmp (11- (2-fluorophenyl) -4-methoxy-piperidin-1-yl) and purified by HPLC. They were deprotected before use. The target RNA was incubated with ribozyme 1, 2, 3 or 4 or without ribozyme (/) for 60 and 180 min and the reaction products were separated electrophoretically in the polyacrylamide gel. The gel was evaluated lean in the phosphoi and shows cleavage of the target RNA at the designated sites by the ribozymes 3 and 4 with high efficiency and low effectiveness of the ribozymes 1 and 2 ( FIG. 1).

Example 3

Nachweis der Hemmung der Telomerase durch stabile Transfektion und Expression des Ribo zyms 4 in HBL100, einer immortalen Mammaepithelzelllinie mit hoher Telomeraseaktivität, und in MCF-7, einer Mammatumorzelllinie. Ein im katalytischen Zentrum mutiertes Ribozym hat keinen Effekt.Detection of the inhibition of telomerase by stable transfection and expression of the ribo zyms 4 in HBL100, an immortal mammary epithelial cell line with high telomerase activity, and in MCF-7, a breast tumor cell line. A ribozyme mutated in the catalytic center has no effect.

Beide Stränge der für das Ribozym R4 (4. Ribozym in der Liste) bzw. der für das im katalyti schen Zentrum mutierte Ribozym mutR4 kodierenden cDNA wurden als Oligodesoxyribonu kleotide nach Standardverfahren synthetisiert. Sie wurden in den Expressionvektor (Plasmid) pCDNA3.1 kloniert und stabil in MCF-7 - (Fig. 2a) bzw. HBL-100-Zellen (Fig. 2b) - ex primiert. Die Telomeraseaktivität in den numerierten Klonen wurde mittels semiquantitativen TRAP-Assay (Telomerase Repeat Amplification Protocol) gemessen. Die Intensität des Lei termusters in der jeweiligen Spur im Verhältnis zur Intensität der Kontrollbande (Dreieck) ist ein Maß für die Aktivität der Telomerase. Die HBL-100- bzw. MCF-7-Klone, die mit einem im katalytischen Zentrum mutierten Ribozym transfiziert wurden (mut R4), zeigen etwa die gleiche Telometaseaktivität wie die parentalen Zellen (p = Parentale Zellen, R8 = Positivkon trolle, NC = Negativkontrolle). Expression von R4 reduziert die Telomeraseaktivität auf Werte zwischen < 1 und etwa 30%.Both strands of the cDNA coding for the ribozyme R4 (4th ribozyme in the list) and for the ribozyme mutR4 mutated in the catalytic center were synthesized as oligodeoxyribonucleotides by standard methods. They were cloned into the expression vector (plasmid) pCDNA3.1 and stably expressed in MCF-7 ( Fig. 2a) or HBL-100 cells ( Fig. 2b). The telomerase activity in the numbered clones was measured using a semiquantitative TRAP assay (Telomerase Repeat Amplification Protocol). The intensity of the conductor pattern in the respective track in relation to the intensity of the control band (triangle) is a measure of the activity of the telomerase. The HBL-100 and MCF-7 clones, which were transfected with a ribozyme mutated in the catalytic center (mut R4), show approximately the same telometase activity as the parental cells (p = parental cells, R8 = positive control, NC = Negative control). Expression of R4 reduces telomerase activity to values between <1 and about 30%.

Example 4 Detection of telomere shortening in clones with inhibited telomerase

Die Telomerenlänge in den Zellinien MCF-7 (Fig. 3A) und HBL-100 (Fig. 3B) wurde im Southernblot gemessen und quantifiziert wie beschrieben (Petersen, S., Saretzki, G., von Zglinicki, T. Exp. Cell Res. 1998, 239: 152-160). Die Anzahl der untersuchten Klone n und die jeweilige Telomeraseaktivität (in % der Aktivität in parentalen/mutR4-transfizierten Zel len, X-Achse) ist angegeben. Die Telomerenlänge in mit mutR4 transfizierten Klonen (mutR4) oder in den R4-transfizierten Klonen, die nur geringfligige Verminderung der Telo meraseaktivität aufweisen, weicht nicht signifikant von der in parentalen Zellen ab. Die Telo merenlänge in den Klonen mit deutlich gehemmter Telomerase ist jedoch signifikant geringer.The telomeric length in the cell lines MCF-7 ( FIG. 3A) and HBL-100 ( FIG. 3B) was measured in the Southern blot and quantified as described (Petersen, S., Saretzki, G., von Zglinicki, T. Exp. Cell Res 1998, 239: 152-160). The number of clones n examined and the respective telomerase activity (in% of the activity in parent / mutR4-transfected cells, X axis) is indicated. The telomeric length in mutR4-transfected clones (mutR4) or in the R4-transfected clones, which show only a slight reduction in telomerase activity, does not differ significantly from that in parental cells. However, the telomere length in the clones with clearly inhibited telomerase is significantly shorter.

Example 5

Nachweis der Inhibition des Zellwachstums in MCF-7-Klonen mit inhibierter Telomerase Netto-Proliferationsraten wurden durch Zellzählung in jeder Passage ermittelt. Die Anzahl der untersuchten Klone n und die jeweilige Telomeraseaktivität (in % der Aktivität in parenta len/mutR4-transfizierten Zellen, X-Achse) ist angegeben. In Klonen mit einer Telomerase- Aktivität unter 25% der Ausgangszellen ist das Zellwachstum inhibiert (Fig. 4A).Detection of inhibition of cell growth in MCF-7 clones with inhibited telomerase Net proliferation rates were determined by cell counting in each passage. The number of clones n examined and the respective telomerase activity (in% of the activity in parent / mutR4-transfected cells, X axis) is indicated. In clones with a telomerase activity below 25% of the starting cells, cell growth is inhibited ( FIG. 4A).

Nachweis einer geänderten Morphologie in telomerase-inhibierten MCF-7-Klonen. Die Mor phologie lebender Zellen wurde im Phasenkontrast-Umkehrmikroskop kontrolliert. Mit mutR4 stabil transfizierte Klone (links) zeigen normales, schnelles Wachstum und die gleiche Morphologie wie parentale Zellen. Klone mit durch R4 inhibierter Telomerase (rechts) zeigen eingeschränktes Wachstum und zum überwiegenden Teil, insbesondere an der Peripherie der entstehenden, vergleichsweise kleinen Kolonien, Zellen mit charakteristisch seneszenter Mor phologie (gleiche Vergrößerung links und rechts) (Fig. 4B).Evidence of an altered morphology in telomerase-inhibited MCF-7 clones. The morphology of living cells was checked in the phase contrast reversing microscope. Clones stably transfected with mutR4 (left) show normal, rapid growth and the same morphology as parental cells. Clones with telomerase inhibited by R4 (right) show restricted growth and for the most part, especially on the periphery of the resulting, comparatively small colonies, cells with characteristic senescent morphology (same magnification left and right) ( FIG. 4B).

Nachweis der Erzeugung eines seneszenten Phänotyps durch retrovirale Infektion mit dem Ribozym R4 in einer Massenkultur von MCF-7. R4 wurde in einen retroviralen Expressions vektor (pBabe) kloniert und rekombinante Viren nach Standard-Prozedur generiert. Jeweils 10⁵ MCF-7-Zellen wurden entweder mit dem unmodifizierten Vektor (links) oder mit R4- pBabe (rechts) infiziert. Dargestellt sind die Massenkulturen 2 Wochen nach Infektion. Infek tion mit R4-pBabe vermindert die Telomeraseaktivität und blockiert das Wachstum in der Kultur. Zahlreiche Zellen sterben ab und lösen sich von der Kulturschale. Die wenigen über lebenden Zellen zeigen einen seneszenten Phänotyp (gleiche Vergrößerung links und rechts) (Fig. 4C).Evidence of the generation of a senescent phenotype by retroviral infection with the ribozyme R4 in a mass culture of MCF-7. R4 was cloned into a retroviral expression vector (pBabe) and recombinant viruses were generated according to the standard procedure. 10 ⁵ MCF-7 cells were infected either with the unmodified vector (left) or with R4-pBabe (right). The mass cultures are shown 2 weeks after infection. Infection with R4-pBabe reduces telomerase activity and blocks growth in the culture. Numerous cells die and detach from the culture dish. The few surviving cells show a senescent phenotype (same magnification left and right) ( Fig. 4C).

Example 6 Evidence of a sensitivity of the clones with inhibited telo increased by a factor of 2-3 merase versus doxorubicin

HBL-100-Zellen wurden mit R4 bzw. mutR4 transfiziert. Die Telomeraseaktivität wurde mit TRAP-Assay gemessen. Die Klone wurden mit Doxorubicin in Konzentrationen zwischen 10 und 1000 ng/ml für drei Tage behandelt und dann das Zellüberleben mit XTT-Assay gemes sen. Die Doxorubicin-Konzentration, die in einem um 50% reduzierten XTT-Signal (kolorimetrisches Signal) resultiert (LD50), wurde berechnet. Die Anzahl der untersuchten Klone n und die jeweilige Telomeraseaktivität (in % der Aktivität in parentalen/mutR4- transfizierten Zellen, X-Achse) ist angegeben. Klone mit einer Telomeraseaktivität < 25% der Ausgangszellen weisen eine etwa um den Faktor 2 verminderte LD50 auf (Fig. 5A).HBL-100 cells were transfected with R4 or mutR4. Telomerase activity was measured using a TRAP assay. The clones were treated with doxorubicin in concentrations between 10 and 1000 ng / ml for three days and then cell survival was measured with an XTT assay. The doxorubicin concentration resulting in a 50% reduced XTT signal (colorimetric signal) (LD50) was calculated. The number of clones n examined and the respective telomerase activity (in% of the activity in parental / mutR4-transfected cells, X axis) is indicated. Clones with a telomerase activity <25% of the starting cells have an LD50 reduced by a factor of 2 ( FIG. 5A).

Bestimmung der LD50 für Doxorubicin in MCF-7-Klonen (s. oben). Klone mit einer Telome raseaktivität unter 25% sind drei- bis viermal sensitiver gegenüber Doxorubicin (Fig. 5B).Determination of the LD50 for doxorubicin in MCF-7 clones (see above). Clones with a telomic activity below 25% are three to four times more sensitive to doxorubicin ( Fig. 5B).

Example 7 Evidence of the increased sensitivity of telomerase-negative cells to topoisomera se-inhibiting cytostatics

Die Sensitivität gegenüber den angegebenen Zytostatika wurde als LD50 mittels XTT-Assay pBabe gemessen. Angegeben ist das Verhältnis der LD50 der telomerase-positiven zu den telo merase-negativen Klonen. Untersucht wurden mutR4-transfizierte vs. R4-transfizierte HBL- 100- und MCF-7-Klone und hTERT-exprimierende vs parentale BJ-Fibroblasten (Bodnar, A. G., Oulette, M., Frolkis, M., Holt, S. E., Chiu, C. P. Morin, G. B., Harley, C. B., Shay, J. W., Lichtsteiner, S., Wright, W. Science 1998, 279: 349-352). Zellen mit verringerter Telomerase aktivität sind sensitiver als die isogenen Klone mit aktiver Telomerase gegenüber allen unter suchten Topoisomerase-Inhibitoren (Mitoxantron, Etoposid und Doxorubicin - Römpp Che mie Lexikon 1995), nicht aber gegenüber den anderswirkenden Zytostatika cis-Platin und Bleomycin oder dem alkylierenden Wirkstoff N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG) oder oxidativer Belastung mittels Wasserstoffperoxid (H₂O₂) (Fig. 6). The sensitivity to the specified cytostatics was measured as LD50 using the XTT assay pBabe. The ratio of the LD50 of the telomerase-positive to the telomerase-negative clones is given. MutR4-transfected vs. R4-transfected HBL-100 and MCF-7 clones and hTERT-expressing vs parental BJ fibroblasts (Bodnar, AG, Oulette, M., Frolkis, M., Holt, SE, Chiu, CP Morin, GB, Harley, CB, Shay, JW, Lichtsteiner, S., Wright, W. Science 1998, 279: 349-352). Cells with reduced telomerase activity are more sensitive than the isogenic clones with active telomerase to all investigated topoisomerase inhibitors (mitoxantrone, etoposide and doxorubicin - Römpp Chemie Lexikon 1995), but not to the other cytostatic agents cis-platinum and bleomycin or the alkylating agent N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) or oxidative stress using hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) ( Fig. 6).

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Ribozymes, the activity of the catalytic subunit of human telomerase Reduce hTERT (human telomerase enzyme reverse transcriptase).

2. Ribozymes according to claim 1, characterized in that they counter the T motif of the hu manen telomerase are directed.

3. Ribozymes according to claim 1 and 2, characterized in that they have the T motif of hu manen telomerase (hTERT) on the sequences GUC, GUA, GUU, CUC or UUC to cut.

4. Ribozymes according to claim 1 to 3, characterized in that it is hammerhead ribozymes with the following sequences:

a) 5'-GCUCGAC CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACGUACACA-3 '
b) 5'-GCAGCUC CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACGACGUAC-3 '
c) 5'-AAAGAAA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACCUGAGCA-3 '
d) 5'-UCUCCGU CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACAUAAAAG-3 '
e) 5'-UGCUCCA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACACUCUUC-3 '
f) 5'-GACGACG CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACACACUCA-3 '
g) 5'-CUUUUGA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACGUGGUCU-3 '
h) 5'-GCUUUGC CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA ACUUGCUCC-3 '
i) 5'-AAGACCU CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AGCAGCUCG-3 '
j) 5'-UGUUUUU CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AGCCUGUUC-3 '
k) 5'-CAUAAAA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AAAGACCUG-3 '
l) 5'-UUCUUUU CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AAACGUGGU-3 '
m) 5'-UCCGGUA CUGAuGAGuCcGUGAgGaCGAA AAAAAGAGC-3 '

5. Use of ribozymes according to claims 1 to 4 as telomerase inhibitors.

6. Use of ribozymes according to claim 1 to 4 for telomere shortening.

7. Use of ribozymes according to claim 1 to 4 in combination with cytostatic administration and / or radiation to shorten telomeres.

8. Use of ribozymes according to claim 1 to 4 in combination with topoisomerase Inhibition of telomere shortening.

9. Use according to claim 7 or 8 for accelerating the rate of telomere shortening through DNA damage and to switch off the repair properties of the telome race.

10. Use of ribozymes according to claim 1 to 9 for the treatment of tumors.

11. Use according to claims 1 to 4 to increase the sensitivity of tumor cells compared to cytostatics.