DD301781A9 - Virus-Safe Human Transfer Factor Preparations and Methods for their Preparation - Google Patents
Virus-Safe Human Transfer Factor Preparations and Methods for their PreparationInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Virusinaktivierung von humanen Transfer-Faktor-Präparaten aus frischen buffy coats, die bei der Fraktionierung des Vollbluts in zelluläre und plasmatische Bestandteile als Nebenprodukt anfallen. Transfer-Faktor-Präparate, die als Modulatoren des zellulären Immunsystems wirken, werden therapeutisch zur Therapie von Immundefekterkrankungen angewandt. Die Einführung von Großpoolverfahren, die die Anforderungen der Arzneimittelgesetzgebung an ein Arzneimittel hinsichtlich Einheitlichkeit und Standardisierbarkeit erfüllen konnten, bergen jedoch in erhöhtem Maße das Risiko der Kontamination des Pools mit virusbehaftetem Material in sich, so daß trotz gewissenhaftem Spenderscreening die Integration eines virusinaktivierenden Schrittes in das Präparationsverfahren unabdingbar wurde. Als Virusinaktivierungsverfahren wird eine Temperaturbehandlung in flüssiger Phase (Pasteurisierung) über 10 bis 12 Stunden bei 60 bis 70 Grad C vorgenommen, die ohne Stabilisatoren oder zusätzliche Agenzien auskommt und zu einer Aktivierung der immunologischen in-vitro-Aktivität der Präparate führt.{Virusinaktivierung; Transfer-Faktor; Immunsystem; buffy coats; Immundefekterkrankung; Großpoolverfahren; Standardisierbarkeit; Pasteurisierung; Aktivierung; Stabilisator}The invention relates to a method for virus inactivation of human transfer factor preparations from fresh buffy coats, which are obtained as a by-product in the fractionation of whole blood into cellular and plasmatic components. Transfer factor preparations, which act as modulators of the cellular immune system, are used therapeutically for the treatment of immune deficiency diseases. However, the introduction of large pool procedures that have met the requirements of drug legislation for a drug in terms of uniformity and standardizability entail to an increased degree the risk of contamination of the pool of virus-afflicted material so that, despite careful donor screening, integration of a virus-inactivating step into the preparation procedure became indispensable. As a virus inactivation method, liquid phase temperature treatment (pasteurization) is carried out for 10 to 12 hours at 60 to 70 degrees C, which does not require stabilizers or additional agents and leads to an activation of the in vitro immunological activity of the preparations {viral inactivation; Transfer factor; Immune system; buffy coats; Immunodeficiency disease; Great pool procedures; standardization; Pasteurization; Activation; Stabilizer}
Description
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von virussicheren humanen Transfer-Faktor-Präparaten aus pcripheren Blutleukozyten gesunder Blutspender, wobei sich das Virusinaktivierungsverfahren durch eine gleichzeitige Erhöhung der immunologischen In-vitro-Wirksamkeit bei der Modulation des zellulären Immunsystems auszeichnet. Das medizinische Bedürfnis für die Entwicklung und Herstellung von humanen Transfer-Faktor-Präparaten ergab sich aus den in den letzten Jahren gewonnenen neuen Erkenntnissen über Immundefekterkrankungen und der noch immer unbefriedigenden Situation in der therapeutischen Beeinflußbarkeit dieser oft lebensbedrohlichen Erkrankungen. Der Transfer-Faktor beeinflußt als Immunmodulator in vitro und in vivo die Korrelate der zellulären Immunität, ohne daß dessen wirksame Komponenten und deren Wirkungsweise im einzelnen bekannt wären. Er wird aus immunkompetenten Zellen gewonnen und scheint in äußerst komplexer Weise, als Ensemble seiner einzelnen Bestandteile, auf das Immunsystem Einfluß zu nehmen. Transfer-Faktor setzt sich aus einem Gemisch niedermolekularer Polypeptide (MG < 10000 D) mit bis zu 12 Aminosäuren und einem Ribonukleinsäureanteil von 2 bis 3 Nukleotidbasen zusammen.The invention relates to a method for producing virus-safe human transfer factor preparations from peripheral blood leukocytes of healthy blood donors, wherein the virus inactivation method is characterized by a simultaneous increase in immunological in vitro efficacy in the modulation of the cellular immune system. The medical need for the development and production of human transfer factor preparations has arisen from the recent discovery of new findings on immune deficiency diseases and the still unsatisfactory situation in the therapeutic influence of these often life-threatening diseases. The transfer factor, as an immunomodulator, influences the correlates of cellular immunity in vitro and in vivo, without the details of its effective components and their mode of action. It is derived from immunocompetent cells and seems to be an extremely complex way of influencing the immune system as an ensemble of its constituents. Transfer factor is composed of a mixture of low molecular weight polypeptides (MW <10000 D) with up to 12 amino acids and a ribonucleic acid moiety of 2 to 3 nucleotide bases.
Als Indikationen für die therapeutische Anwendung des Transfer-Faktors gelten alle Situationen, bei denen eine Einschränkung der immunologischen Reaktionsfähigkeit nachgewiesen wurde oder mit hoher Wahrscheinlichkeit zu vermuten ist, wieIndications for the therapeutic use of the transfer factor are all situations in which a restriction of the immunological reactivity has been demonstrated or is highly probable, such as
- primäre und sekundäre Immundefekte- primary and secondary immunodeficiencies
- schwere chronisch rezidivierende Infektionen mit Erregerpersistenz (z. B. Zytomegalie-, Epstein-Barr- und Herpes-Virusinfektionen, chronische mucocutane Candidiasis)- severe chronic recurrent infections with pathogen persistence (eg cytomegalovirus, Epstein-Barr and herpes virus infections, chronic mucocutaneous candidiasis)
- ausgewählte Autoimmunerkrankungen (z. B. Rheumatoidarthritis hoher Aktivität, Lupus erythematodes, endogene Uveitis). Kontraindikationen sind nicht bekannt.Selected autoimmune diseases (eg rheumatoid arthritis of high activity, lupus erythematosus, endogenous uveitis). Contraindications are unknown.
In den letzten Jahren, besonders seit der Entdeckung der AIDS-Viren jnd ihrer Auswirkungen, ist die Virussicherheit von Blutpräparaton zu ein 9m ethischen Anliegen höchster Priorität geworden. Die Notwendigkeit der Eliminierung und Inaktivierung von im menschlicher. Blut vorkommenden Viren wie Hepatitis B-, Hepatitis-Delta-, Non A-Non B-Hepatitis-, AIDS-, HTLV-1 -, Herpos-, Parvo-, Hepatitis A- sowie Creutzfeldt-Jakob-Disease-Viren ist heute, besonders bei Großpoolpräparaten, unumstritten. Um diesen Erfordernissen Rechnung zu tragen, ist zum Schütze des Patienten und aus ethisch-moralischen Gründen eine effiziente Virusinaktivierung für im Großpoolverfahren hergestellte Transfer-Faktor-Präparate unabdingbar.In recent years, especially since the discovery of the AIDS virus and its effects, the virus safety of blood preparation has become a 9m ethical concern of the highest priority. The need for elimination and inactivation of human. Bloodborne viruses such as hepatitis B, hepatitis delta, non A-non B hepatitis, AIDS, HTLV-1, herpes, parvo, hepatitis A and Creutzfeldt-Jakob disease viruses are today, especially with large pool preparations, undisputed. In order to meet these requirements, efficient virus inactivation is essential for protecting the patient and for ethical-moral reasons for large scale pooled transfer factor preparations.
Bisher wurden humane Transfer-Faktor-Präparate überwiegend als Einzelpräparationen gezielt von ausgewählten Probanden wie Rekonvaleszenten oder Verwandten der Patienten bzw. in geringeren Poolgrößen von 10 bis 20 Blutspendern durch Zellseparation am Spender bzw. durch eine auf die maximale Gewinnung der Leukozyten orientierte Fraktionierung dos Blutes gewonnen. Diese Art der Transfer-Faktor-Herstellung ist zwar im Hinblick auf die Übertragung von Viruserkrankungen auf Grund der Begrenztheit der Spenderzahl mit einem kalkulierbaren Risiko behaftet, erweist sich jedoch für langfristige Therapien mit einem einheitlichen, standardisierten Präparat als ungeeignet und ist außerdem nicht effektiv, technisch aufwendig und kostenintensiv. Infolge der geringen Poolfjrößen war es nicht möglich, Parameter zur Zusammensetzung und vor allem zur immunologischen !n-vitro-Wirksamkeit anzugeben. Um diesen Mangel zu beseitigen, wurden Gioßpoolverfahren zur Transfer-Faktor-Herstellung entwickelt, die zwar die Anforderungen der Arzneimittelgesetzgebung an ein. Arzneimittel hinsichtlich Einheitlichkeit und Standardisierbarkcit erfüllen konnten, jedoch durch die Vielzahl der Spender trotz gewissenhaftem Spenderscreening und sorgfältiger Dokumentation das Risiko der Kontamination des Pools mit virusbehaftetem Material in sich bargen (DDR-WP Nr. 211443 vom 11.7.84). Tonsillen als Ausgangsmaterial für die Transfer-Faktor-Herstellung konnten den arzneimittelrechtlichen Anforderungen nicht genügen, da es sich hierbei um pathogenes Material handelt und der Nachweis, daß virogene und pyrogene Bestandteile mit Sicherheit nicht ins Endprodukt gelangen können, nicht geführt werden konnte. Buffy coats von gesunden Blutspendern bieten durch die gesetzlich geregelten Anforderungon an Blutspender von der arzneimittelrechtlichen Seite her gute Voraussetzungen als Ausgangsmaterial, zumal sie bei der Trennung des Frischblutes in plasmatische und zelluläre Bestandteile in großen Mengen anfallen und bisher als weitgehend ungenutztes Nebenprodukt verworfen wurden, jedoch auch hier kann die Übertragung einer Virusinfektion infolge der begrenzten Aussage der diagnostischen Screeningmethoden nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden. Deshalb war es erforderlich, als organisatorische Vorsichtsmaßnahme eine sechsmonatige Quarantänelagerung nach der Blutabnahme anzuschließen, um bei eventuell in dieser Zeit auftretenden Viruserkrankungen der Blutspender das Ausgangsmaterial von der Weiterverarbeitung sperren zu können. Diese Maßnahme war mit einem hohen organisatorischen Aufwand verbunden und führte im Falle eines positiven Befundes zum Verlust einer größeren Menge buffy coats, im Extremfall zur Sperrung einer ganzen Charge. Eine absolute Virussicherheit konnte jedoch auch mit dieser Maßnahme nicht erzielt werden.So far, human transfer factor preparations have been obtained predominantly as individual preparations targeted by selected subjects such as convalescents or relatives of patients or in smaller pool sizes of 10 to 20 blood donors by cell separation at the donor or by a focused on the maximum recovery of leukocytes fractionation of the blood , This type of transfer factor production is zwa r carry a incalculable risk with respect to the transmission of viral diseases due to the limitations of the number of donors, however, proves to be for long-term therapy with a uniform, standardized preparation as inappropriate and is also not effective, technically complex and costly. Due to the small size of the pools, it was not possible to give parameters for the composition and especially for the in vitro immunological efficacy. To remedy this deficiency, Gioßpool procedures for transfer factor production have been developed which, while meeting the requirements of pharmaceutical legislation. However, due to the large number of donors, despite careful donor screening and careful documentation, the risk of contamination of the pool with virus-afflicted material was evident (DDR-WP No. 211443 of 11.7.84). Tonsils as a starting material for the transfer factor production could not meet the drug requirements, since this is pathogenic material and the evidence that virogenous and pyrogenic components can not reach the end product with certainty, could not be conducted. Buffy coats from healthy blood donors provide by the legally regulated request donation to blood donors from the drug law side her good conditions as starting material, especially as they arise in the separation of fresh blood into plasmatic and cellular components in large quantities and have been discarded as largely untapped by-product, but also Here, the transmission of a viral infection due to the limited evidence of diagnostic screening methods can not be ruled out with certainty. It was therefore necessary, as an organizational precautionary measure, to attach a six-month quarantine storage after blood collection in order to be able to block the starting material from further processing in the event of any viral diseases occurring during this time. This measure was associated with a high organizational effort and resulted in the case of a positive finding to the loss of a larger amount of buffy coats, in extreme cases, to block a whole batch. An absolute virus security could not be achieved even with this measure.
Die gebräuchlichsten Methoden zur Virusinaktivierung in Blutderivaten sind die Behandlung mit ß-Propiolacton und UV-Licht, die Immunneutralisation, Erhitzen in flüssiger Phase, Erhitzen im lyophilisierten Zustand, Erhitzen des Lyophilisats in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln oder Dampf und die Lösungsmittel/Oetergentien-Behandlung (A. M. Prince et al., Eur. J. Epidemiol. 3:103-118 [1987)). Die Effizienz der Methoden ist unterschiedlich, ebenso die Resistenz der Viren gegenüber den einzelnen Verfahren. Das sicherste Verfahren gegenüber allen im menschlichen Blut vorkommenden Viren ist nach dem gegenwärtigen Wissensstand die zehnstündige Temperaturbehandlung bei +600C in flüssiger Phase (Pasteurisierung). Nachteil fast aller Methoden ist, darunter auch der Pasteurisierung, daß zur Stabilisierung der Blutderivate während der Inaktivierung Schutzsubstanzen in erheblichen Konzentrationen zugesetzt werden müss.en, die anschließend quantitativ und mit erheblichem apparativem Aufwand wieder entfernt werden müssen. Trotzdem kommt os bei allen Verfahren zu einem teilweise bedeutendem Aktivitätsverlust der Präparate, was sich ungünstig auf die Ausbeute auswirkt und ein Hinweis auf Denaturierungserscheinungen ist. Über Virusinaktivierungsverfahren von Transfer-Faktor-Präparaten finden sich in der Literatur keine Hinweise, was Ausdruck dafür sein dürfte, daß einerseits in der im Herstellungsverfahren beinhalteten Ultrafiltration bzw. Dialyse eine ausreichende Barriere gegen das Eindringen von virogenem Material gesehen wird, andererseits diesem Problem noch zu wenig Aufmerksamkeit geschenkt wird, ganz im Gegensatz zu plasmatischen Blutderivaten.The most common methods of viral inactivation in blood derivatives are treatment with β-propiolactone and UV light, immuno-neutralization, liquid phase heating, lyophilized heating, heating the lyophilizate in the presence of organic solvents or steam, and solvent / oxygenating treatment ( Prince et al., Eur. J. Epidemiol., 3: 103-118 (1987)). The efficiency of the methods varies, as well as the resistance of the viruses to the individual procedures. The safest method against all occurring in human blood viruses is the present state of knowledge, the ten-hour temperature treatment at +60 0 C in the liquid phase (pasteurization). Disadvantage of almost all methods is, including the pasteurization that must be added to stabilize the blood derivatives during inactivation protective substances in significant concentrations must be., Which must then be removed quantitatively and with considerable expenditure on equipment again. Nevertheless, in all of the methods, os leads to a partially significant loss of activity of the preparations, which has an unfavorable effect on the yield and is an indication of denaturation phenomena. There are no indications in the literature about virus inactivation methods of transfer factor preparations, which might indicate that on the one hand a sufficient barrier against the penetration of virogenic material is seen in the ultrafiltration or dialysis involved in the production process, and on the other hand this problem is still too great little attention is paid, in contrast to plasmatic blood derivatives.
Für gerinnungsaktive Plasmafraktionen, die während der Pasteurisierung mit Glyzin und Saccharose stabilisiert wurden, konnte folgende Effizienz des Virusinaktivierungsverfahrens ermittelt werden:For clot-active plasma fractions stabilized with glycine and sucrose during pasteurization, the following efficacy of the virus inactivation method was found:
Hepatitis B-Viren 1045CID60 Hepatitis B viruses 10 45 CID 60
Non A-Non B-Hepatitis-Viren 1056 CID60 Non A-Non B Hepatitis Viruses 10 56 CID 60
HI-Viren 1055TCID60 (Vox Sang. 54:236(1988)).HI viruses 10 55 TCID 60 (Vox Sang. 54: 236 (1988)).
Ausgehend von der Tatsache, daß diß für die labilen Gerinnungsfaktoren erforderlichen Stabilisatoren ebenso die Viren stabilisieren (Transfusion 25: 523-27 (1985)), kann geschlußfolgert werden, daß b«i einer thermischen Behandlung des Transfer-Faktors ohne Zusatz von Stabilisatoren die Effizienz der Virusinaktivierung noch bedeutend höher liegt. In klinischen Versuchen konnte nachgewiesen werden, daß bei der Therapie mit Gerinnungsfaktorenkonzentraten, die verschiedenen Virusinaktivierungsverfahren unterzogen worden waren, die Pasteurisierung (10 Stunden bei 600C in Lösung) das einzige Verfahren war, das keine Hepatitis-Infektionen zur Folge hatte (New. Engl. J. Med. 316: 918-922 [1987J).Based on the fact that the stabilizers required for the labile coagulation factors also stabilize the viruses (Transfusion 25: 523-27 (1985)), it can be concluded that the thermal treatment of the transfer factor without the addition of stabilizers is efficient the virus inactivation is still significantly higher. In clinical trials, it has been demonstrated that in the treatment with coagulation factor concentrates which had undergone various virus inactivation procedures, pasteurization (10 hours at 60 ° C. in solution) was the only procedure that did not result in hepatitis infection (New Engl J. Med. 316: 918-922 [1987J].
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist es, mit dem „Transfer-Faktor (human) VS" ein virussicheres immunbiologisches Therapeutikum zur Immunmodulation der T-zellabhängigen Reaktionsfähigkeit unter Verwendung von bei der Präparation leukozytenarmer Erythrozytensedimente anfallender buffy coats auf sehr effektive Weise herzustellen, ohne daß sich dasThe aim of the invention is to produce with the "transfer factor (human) VS" a virus-safe immunobiological therapeutic agent for immunomodulation of the T cell-dependent reactivity using accumulating in the preparation leukocytearmer erythrocytes sediments buffy coats in a very effective manner without that
Virusinaktivierungsverfahren nachteilig auf die Zusammensetzung und biologische Verträglichkeit des Produktes auswirkt und mit keinem Verlust an immunologischer Aktivität verbunden ist. Damit soll eine ausreichende Sicherheit vor der möglichen Übertragung von Virusinfektionen erreicht werden, die es erlaubt, Präparate mit sehr hohen Ausgangspoolgrößen, die in sich einheitlich und in ihrer Zusammensetzung und immunologischen Wirksamkeit standardisiert sind, herzustellen und auf bisher erforderliche Quarantänelagerungen zu verzichten. Das Virusinaktivierungsverfahren sollte sicher, auch gegenüber relativ resistenden Viren sein, und ebenso die mögliche Übertragung einer Non A-Non B-Hepatitis mit Sicherheit verhindern und möglichst ohne physiologisch nicht unbedenkliche Stabilisatoren und Schutzsubstanzen auskommen, die einen Einfluß auf die Transfer-Faktor-Wirkung ausüben können bzw. anschließend entfernt werden müssen. Das Virusinaktiviorungsverfahren muß sich in das bisherige Verfahren zur Transfer-Faktor-Präparation nahtlos integrieren lassen und mit den vorhandenen Apparaturen anhand der Verfahrensparametei eindeutig verifizieren lassen.Virus inactivation method adversely affects the composition and biocompatibility of the product and is associated with no loss of immunological activity. This is intended to provide sufficient safety against the possible transmission of viral infections, which makes it possible to produce preparations with very high starting pool sizes, which are standardized in their uniformity and their composition and immunological effectiveness, and to dispense with previously required quarantine storage. The virus inactivation method should be safe, even against relatively resistant viruses, as well as preventing the possible transmission of non A-non B hepatitis with certainty and, if possible, do without physiologically unacceptable stabilizers and protective substances exerting influence on the transfer factor effect can or must be removed afterwards. The virus inactivation method must be able to be seamlessly integrated into the previous method of transfer factor preparation and be clearly verified with the existing apparatus by the Verfahrensparametei.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Die in der Charakteristik der bekannten Lösungen beschriebenen Mängel lassen sich auf die folgenden Ursachen zurückführen: Einzelne Präparationen von Transfer-Faktor durch Zellseparation am Blutspender, Rekonvaleszenten bzw. Verwandten des Patienten bzw. die Limitierung der Poolgröße, um ein mögliches Infektionsrisiko so gering wie möglich zu halten, führten zu keinem einheitlichen und standardisierbaren Präparat, was für eine langfristige und zielgerichtete Thorapie aber unerläßlich ist. Großpoolverfahren zur Transfer-Faktor-Herstellung, die bisher ohne virusinaktivierende Schritte arbeiteten, haftete dagegen trotz gewissenhaftem Blutspenderscreening und einer sechsmonatigen Quarantänelagerurig, die eir.e mögliche Virusinfektion von Blutspendern signalisieren und zu einer Sperrung der Präparate führen sollte, die Gefahr an, daß auch unter dem Aspekt der im Präparationsverfahren beinhalteten Ultrafiltration bzw. Dialyse potentiell virogenes Material in das Endprodukt gelangen und damit Auslöser einer Virusinfektion sein könnte. Besonders im Hinblick auf die im Blutspenderscreening nicht sicher nachweisbare Non A-Non B-Hepatitis und dio nicht in jedem Fall und zu jedem Zeitpunkt nachweisbaren HIV-Antikörper bei einer HIV-Infektion ist eine Virusinaktivierung als Sicherheitsmaßnahme für den Empfänger unabdingbar geworden. Um diese Ursachen zu beseitigen,liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem unter Einordnung in den technologischen Ablauf der Präparation von humanem Transfer-Faktor aus buffy coats ein virusinaktivierender Schritt zwischengeschaltet wird, der bei der Gewährleistung einer hohen Virussicherheit die biologische Zusammensetzung der Transfer-Faktor-Präparate so wenig wie möglich verändert und deren immunologische Wirksamkeit nicht nachteilig beeinflußt. Dabei sollte möglichst auf eine chemische Virusinaktivierung verzichtet werden, da die zuzusetzenden Agenzien und Hilfsstoffe physiologisch nicht unbedenklich sind und deshalb mit hohem Aufwand wieder quantitativ entfernt werden müssen und die Auswirkungen dieser Stoffe auf die bisher nur ungenügend bekannte Zusammensetzung der wirksamen Bestandteile des Transfer-Faktors nicht kalkulierbar sind.The deficiencies described in the characteristics of the known solutions can be attributed to the following causes: Individual preparations of transfer factor by cell separation at the blood donor, convalescent or relatives of the patient or the limitation of the pool size, as low as possible to avoid a possible risk of infection However, this does not lead to a uniform and standardisable product, which is indispensable for long-term and targeted thoracic therapy. Large pool procedures for transfer factor production, which previously worked without virus-inactivating steps, on the other hand, despite thorough blood donor screening and a six-month quarantine storage, the eir.e signal possible viral infection of blood donors and should lead to a blocking of the preparations, the risk that even under the aspect of the ultrafiltration or dialysis process contained in the preparation process could potentially lead to virogenic material in the end product and thus trigger a viral infection. Particularly with regard to non-non-B hepatitis, which can not be reliably detected in blood donor screening, and the HIV antibodies that are not detectable in every case and at any time in the case of HIV infection, virus inactivation has become indispensable as a safety measure for the recipient. In order to eliminate these causes, the invention has the object to develop a method in which a virus-inactivating step is interposed by placing in the technological process of the preparation of human transfer factor from buffy coats, which in ensuring a high viral safety the biological composition of the transfer factor preparations as little as possible changed and their immunological activity is not adversely affected. It should be possible to dispense with a chemical virus inactivation, since the agents and adjuvants to be added are physiologically unobjectionable and therefore must be removed quantitatively again at great expense and the effects of these substances on the hitherto insufficiently known composition of the active components of the transfer factor not are calculable.
Durch eine thermische Behandlung des Transfer-Faktors in flüssiger Phase gelingt es dagegen auf technologisch überraschend einfache und wenig kostenintensive Weise, sämtliche bekannten humanen Viren bzw. virogene Bestandteile effektiv und hochwirksam zu inaktivieren ohne daß sich die Zusammensetzung der wirksamen Komponenten des Transfer-Faktors wesentlich verändert und ohne jeglichen Verlust an immunologischer Aktivität. Gleichzeitig führt die thermische Behandlung zu einer Aktivierung der wirksamen Bestandteile des Transfer-Faktors, was in einer deutlichen Erhöhung der immunologischen In-vitro-Aktivität der Präparate zum Ausdruck kommt. Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß das aus den durch mehrfache Einfrier-Auftauschritte lysierten buffy coats gewonnene Ultrafiltrat nach einer Sterilfiltration in verschlossenen Flaschen innerhalb von 3 bis 5 Stunden langsam auf +60 bis +7O0C aufgeheizt wild und anschließend bei der konstant gehaltenen Temperatur 10 bis 12 Stunden lang pasteurisiert wird. Anschließend wird in 1,5 bis 2 Stunden auf Zimmertemperatur abgekühlt und sofort rollend eingefroren. Die Zwischenlyophilisation des pasteurisierten Ultrafiltrats erfolgt beginnend bei -30 bis -350C unter einem Vakuum von 13,3 bis 40,0 Pa ca. 5 Tage lang bei -2O0C bis zu einer Endtemperatur von +20°C nach 7 Tagen. Nach Durchführung der in-prozeß-Kontrolle des Peptid- und Ribose-Gehalts im Ultrafiltrat erfolgt nach dem Lösen des Lyophilisats in aqua ad injektionen und erneuter Sterilfiltration die Portionierung des gepoolten Präparates in 5ml ä 5 Transfer-Faktor-Einheiten in 7,5-ml-Rollrandflaschen, die sich in sterilisierten Kassetten mit dicht schließendem Deckel befinden, unter Laminar-flow-Bedingungen. Nach dem Einfrieren bei -350C erfolgt die Lyophilisation unter den gleichen obengenannten Bedingungen.By a thermal treatment of the transfer factor in the liquid phase, however, it is possible in a technologically surprisingly simple and inexpensive manner to effectively and highly effectively inactivate all known human viruses or virogenic components without significantly changing the composition of the active components of the transfer factor and without any loss of immunological activity. At the same time, the thermal treatment leads to an activation of the active components of the transfer factor, which is reflected in a marked increase in the immunological in vitro activity of the preparations. According to the invention this is achieved in that the ultrafiltrate obtained from the lysed by multiple freeze-thawing steps buffy coats after sterile filtration in closed bottles within 3 to 5 hours slowly to +60 to + 7O 0 C heated wild and then at the constant temperature being kept Pasteurized for 10 to 12 hours. It is then cooled to room temperature in 1.5 to 2 hours and immediately frozen by rolling. The intermediate lyophilization of the pasteurized ultrafiltrate takes place starting at -30 to -35 0 C under a vacuum of 13.3 to 40.0 Pa for about 5 days at -2O 0 C to a final temperature of + 20 ° C after 7 days. After carrying out the in-process control of the peptide and ribose content in the ultrafiltrate, after dissolving the lyophilisate in aqua ad injections and renewed sterile filtration, the portioning of the pooled preparation in 5 ml a 5 transfer factor units in 7.5 ml Roll rim bottles, which are in sterilized cassettes with tight-fitting lids, under laminar flow conditions. After freezing at -35 0 C, the lyophilization takes place under the same conditions above.
Die thermische Behandlung in flüssiger Phase zur Virusinaktivierung kann jedoch anstelle im Ultrafiltrat auch erst im wiederaufgelösten Zwischenlyophilisat durchgeführt werden. Dazu wird nach der in-prozeß-Bestimmung des Peptid- und Ribose-Gehalts im Ultrafiltrat das Zwischenlyophilisat in dem entsprechenden Volumen aqua ad injektionen gelöst, die Lösung in einer Bluko-Flasche gepoolt und anschließend nach einem 3- bis 5stündigen Aufheizen auf +60 bis +7O0C bei der konstant gehaltenen Endtemperatur 10 bis 12 Stunden lang pasteurisiert. Nach einer Abkühlungszeit von 1,5 bis 2 Stunden bis auf Zimmertemperatur wird nach einer erneuten Sterilfiltration sofort zu 5ml ä 5 Transfer-Faktor-Einheiten in 7,5-ml-Rollrandflaschen abgefüllt, eingefroren und lyophilisiert. Zum Lösen des Zwischenlyophilisats können auch Aminosäurelösungen, vorzugsweise Glyzin in 0,1 bis 1,0 molarer Konzentration, oder 0,1-bis 2,0%ige Albuminlösung verwendet werden.However, the thermal treatment in the liquid phase for virus inactivation can also be carried out in the re-dissolved intermediate lyophilisate instead of in the ultrafiltrate. For this purpose, after the in-process determination of the peptide and ribose content in the ultrafiltrate, the intermediate lyophilisate is dissolved in the corresponding volume of aqua ad injections, the solution is pooled in a bluko bottle and then heated to +60 to + 3 to 5 hours after heating + 7O 0 C pasteurized at the constant final temperature for 10 to 12 hours. After a cooling time of 1.5 to 2 hours to room temperature, after a new sterile filtration, 5 ml of 5 transfer factor units are immediately filled into 7.5 ml roll-edge bottles, frozen and lyophilized. Amino acid solutions, preferably glycine in 0.1 to 1.0 molar concentration, or 0.1 to 2.0% albumin solution can also be used to dissolve the intermediate lyophilisate.
Zur Stabilisierung des Transfer-Faktors während der thermischen Behandlung sind diese Zusätze jedoch nicht erforderlich. Sie stellen nur Tablettierhilfsmittel dar, die während der Lyophilisation einen gleichmäßigen Strukturaufbau des Lyophilisats gewährleisten.However, to stabilize the transfer factor during the thermal treatment, these additives are not required. They are only tabletting aids which ensure a uniform structure structure of the lyophilisate during lyophilization.
Bei exakter Einhaltung und Dokumentation der Prozeßparameter während der Virusinaktivierung ist die thermische Behandlung in flüssiger Phase über 10 Stunden bei 6O0C als absolut sicherste Methode zu betrachten, um alle im Blut und in Blutderivaten vorkommenden Viren abzutöten. Das auf die erfindungsgemäße Weise hergestellte virussichere humane Transfer-Faktor-Präparat ist steril, pyrogenfrei und weist im Tierversuch eine gute Verträglichkeit auf. Jede Transfer-Faktor-Charge, die einer Ausgangspoolgröße von 1 200-1 500 buffy coats entstammt, wird entsprechend den vorgesehenen staatlichen Prüfungen auf die physiko- und biochemischen Parameter sowie auf die immunologische In-vitro-Wirksamkeit geprüft. Die Restfeuchte der lyophilisierten Substanz darf bei einer Verwendbarkeitsdauer ab staatlicher Freigabe von 18 Monaten 5,0Ma.-% betragen. Der pH-Wert des in isotonischer NaCI-Injektionslösung gelösten Präparates muß im Bereich von 5,8 bis 6,8 liegen. Nach LösenWith exact adherence and documentation of the process parameters during the virus inactivation, the thermal treatment in liquid phase over 10 hours at 6O 0 C is to be regarded as the absolutely safest method to kill all viruses occurring in the blood and in blood derivatives. The virus-safe human transfer factor preparation produced in the manner according to the invention is sterile, pyrogen-free and has good tolerability in animal experiments. Each transfer factor batch, which is derived from an initial pool size of 1,200-1,500 buffy coats, will be tested for physico-biochemical parameters and for in vitro immunological efficacy in accordance with the intended governmental tests. The residual moisture content of the lyophilized substance may be 5.0 Ma .-% for a period of use from government approval of 18 months. The pH of the preparation dissolved in isotonic NaCl injection solution must be in the range of 5.8 to 6.8. After releasing
in aqua ad Injektionen muß das Verhältnis der optischen Dichte bei 260nm und 280nm 2,40 ± 0,40 betragen. Der Ribose-Gehalt von 5 TF-Einhoiten muß im Bereich von 1,0 bis 5,0mg, vorzugsweise 3,0 bis 4,5mg, uno der Peptid-Gehalt im Bereich von 15,0 bis 30,0 mg, vorzugsweise von 15,0 bis 20,0 mg, liegen. Die immunologische Wirksamkeit jeder virusinaktivierter Transfor-Faktor-Charge wird im Mikro-Lymphozytentransformationstest (LTT) und im E-Rosetten-Recovery-Test untersucht und darf keine Aktivitätsverminderung in beiden Tests gegenüber der unbehandelten Charge aufweisen. Die Pasteurisierung kann zu einer deutlichen Aktivitätserhöhung im Vergleich zur unbehandelten Charge führen, so daß im LTT der Verstärkungsindex als Maß für die durch Transfer-Faktor erhöhte Stimulierbarkeit der Lymphozyten sowohl ohne als auch mit Phytohämagglutinin bis zum Zwei- bis Dreifachen der Norm und im E-Rosetten-Recovery-Test der Recovery-Index als Maß der Beschleunigung der Fähigkeit zur E-Hosettenbildung trypsiniorter humaner Lymphozyien unter Transfor-Faktor-Inkubation auf das 1,5- bis 2fache der Norm zunimmt. Untersuchungen in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) zeigen eine gute Übereinstimmung der Elutionsprofile der pasteurisierten Chargen mit der unbehandelten Charge. Durch die Pasteurisierung entstehen keine Denaturierungsprodukte oder Spaltprodukte, obwohl es im niederen Molekulargewichtsbereich Verschiebungen in den Konzentrationen der Transfer-Faktor-Bestaridteile untereinander, abhängig von der Führung des Pasteurisierungsprozesses, gibt.in aqua ad injections, the ratio of optical density at 260nm and 280nm must be 2.40 ± 0.40. The ribose content of 5 TF units must be in the range of 1.0 to 5.0 mg, preferably 3.0 to 4.5 mg, and the peptide content must be in the range of 15.0 to 30.0 mg, preferably 15 , 0 to 20.0 mg. Lie. The immunological efficacy of each virus inactivated transform factor lot is examined in the micro lymphocyte transformation assay (LTT) and in the E rosette recovery assay and must have no activity reduction in both assays versus the untreated lot. The pasteurization can lead to a significant increase in activity compared to the untreated batch, so that in LTT the gain index as a measure of the transfer factor increased stimulation of lymphocytes both with and without phytohemagglutinin up to two to three times the norm and in e- Rosette recovery test the recovery index as a measure of the acceleration of the ability to E-hosette trypsiniorter human lymphocytes under transfor factor incubation increases to 1.5 to 2 times the norm. High pressure liquid chromatography (HPLC) studies show good agreement of the elution profiles of the pasteurized batches with the untreated batch. Pasteurization does not give rise to any denaturation products or cleavage products, although there are shifts in the concentrations of the transfer factor constituents among each other in the low molecular weight range, depending on the conduct of the pasteurization process.
Ausführungsbeispielembodiment
Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below on some embodiments.
Die durch zehnmaliges Einfrieren und Auftauen aufgeschlossenen buffy coats von 1200 frischen CPD-Blutkonserver wurden nach der Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation (40min bei 2000U/min +4"C) einer Ultrafiltration mit anschließender Sterilfiltration unterzogen und das Ultrafiltrat unter Laminar-flow-Bedingungen zu jeweils 300ml in 500-ml-Blukoflaschen abgefüllt. Ein Drittel der Charge wurde unmittelbar im Anschluß an die Sterilfiltration innerhalb von vier Stunden von Zimmertemperatur auf +600C aufgeheizt, 10 Stunden lang bei dieser Temperatur pasteurisiert und innerhalb von zwei Stunden auf +2O0C abgekühlt. Das pasteurisierte Ultrafiltrat wurde anschließend sofort bei einer Temperatur -4O0C rollend eingefroren.The buffy coats of 1200 fresh CPD blood conserves digested by ten freezing and thawing were subjected to ultrafiltration followed by sterile filtration after separation of cell debris by centrifugation (40 min at 2000 rpm + 4 "C) and the ultrafiltrate added under laminar flow conditions each 300ml filled into 500 ml Blukoflaschen. One third of the charge was heated immediately after the sterile filtration within four hours from room temperature to +60 0 C, 10 hours pasteurized at this temperature and within two hours to + 2O 0 C cooled. The pasteurized ultra-filtrate was then frozen immediately rolling at a temperature -4o 0 C.
Die beiden anderen Drittel der Charge wurden im Anschluß an die Sterüfiltration sofort rollend eingefroren und die gesamte Charge lyophilisiert. Das zweite Drittel der Charge wurde in der durch die in-prozeß-Kontrolle des Peptid- und Ribose-Gohalts des Ultrafiltrats ermittelten Menge aqua ad Injektionen gelöst, innerhalb von 4 Stunden von Zimmertemperatur auf +60cC aufgeheizt, 10 Stunden lang bei dieser Temperatur pasteurisiert und innerhalb von zwei Stunden auf+20°C abgekühlt. Daran anschließend wurde erneut sterilfiltriert und unter Laminar-flow-Bedingungen in 7,5-ml-lnjektionsflaschen, die in Kassetten mit dicht schließendem Deckel sterilisiert worden waren, zu 5 TF-Einheiten abgefüllt. Das erste und dritte Drittel der Charge wurde in dem ermittelten Volumen aqua ad Injektionen gelöst und ebenfalls unter den obengenannten Bedingungen portioniert. Nach der Lyophilisation wurden folgende Parameter ermittelt:The other two-thirds of the batch were immediately roll-frozen following sterile filtration and the entire batch lyophilized. The second third of the batch was dissolved in the amount of aqua ad injections determined by the in-process control of the peptide and ribose content of the ultrafiltrate, heated from room temperature to + 60 ° C. within 4 hours, at this temperature for 10 hours pasteurized and cooled to + 20 ° C within two hours. Thereafter, it was again sterile filtered and filled under laminar flow conditions into 7.5 ml injection bottles sterilized in tight-fitting lids into 5 TF units. The first and third thirds of the batch were dissolved in the determined volume aqua ad injections and also portioned under the above conditions. After lyophilization, the following parameters were determined:
Sowohl die pasteurisierten als auch die unbehandelten TF-Präparate waren steril, pyrogenfrei und wiesen eine sehr gute Verträglichkeit im Tierversuch auf.Both the pasteurized and the untreated TF preparations were sterile, pyrogen-free and showed a very good tolerability in animal experiments.
Die immunologischen Untersuchungen der In-vitro-Wirksamkeit im LTT sowie im E-Rosetten-Recovery-Test wiesen nicht nur auf keine Verringerung der Aktivität durch die Pasteurisierung hin, sondern zeigen einen deutlichen Anstieg der immunologischen Aktivität:The immunological studies of in vitro efficacy in LTT as well as in the E-rosette recovery test not only showed no reduction in pasteurization activity, but show a marked increase in immunological activity:
Der Vergleich der Elutionsprofile der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) zeigt, daß sowohl bei don pasteurisierten, als auch bei den unbehandelten Präparaten acht charakteristi; ehe Peaks erscheinen, wobei im unteren Molekulargewichtsbereich Unterschiede in den Flächenanteikm zu verzeichnen sind. Die geringsten Unterschiede in den Konzentrationen der Transfer-Faktor-Fraktionen zur unbehandelten Charge weisen die aus dem 10 h lang bei +600C pasteurisierten Ultrafiltrat hervorgegangenen Präparate auf.The comparison of the elution profiles of high pressure liquid chromatography (HPLC) shows that in both the pasteurized and the untreated preparations eight are characteristic; before peaks appear, with differences in the surface area in the lower molecular weight range. The smallest differences in the concentrations of the transfer factor fractions with the untreated batch to from 10 hours at +60 0 C pasteurized ultrafiltrate emerged preparations.
Die Herstellung der Transfer-Faktor-Präparate erfolgte analog der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise. Als Ausgangsmaterial dienton 1 500 buffy coats frischer CPD-Blutkonserven. Nach der Ultrafiltration und Sterilfiltration wurde das Ultrafiltrat in drei Teile geteilt, eingefroren und lyophilisiert. Die Lyophiüsate wurden in dem nach der in-prozeß-Kontrolle des Peptid- und Ribose-Gehalts im Ultrafiltrat ermittelten Lösungsmittelvolumen gelöst, zwei Drittel der Charge zur Virusinaktivierung innorhalb von 3,5 Stunden auf +6O0C aufgeheizt, 12 Stunden lang bei dieser Temperatur pasteurisiert und anschließend innerhalb von 1,5 Stunden auf Zimmertemperatur abgekühlt. Als Lösungsmittel wurden aqun ad injektionen (ohne Pasteurisierung) sowie 0,1%ige Albuminlösung und 0,266 m Glyzinlösung verwendet. Die im jeweiligen Lösungsmittel gelösten Zwischenlyophilisate wurden nach der Pasteurisierung sterilfiltriert und wie im Beispiel 1 beschrieben zu jeweils 5 TF-Einheiten abgefüllt, eingefroren und lyophilisiert. Folgende biochemischen und physikalischen Parameter wurden ermittelt:The preparation of the transfer factor preparations was carried out analogously to the manner described in Example 1. The starting material used is 1 500 buffy coats of fresh CPD blood. After ultrafiltration and sterile filtration, the ultrafiltrate was divided into three parts, frozen and lyophilized. The Lyophiüsate were dissolved in the determined in the ultrafiltrate after the in-process monitoring of the peptide and ribose content volume of solvent, two-thirds of the batch for virus inactivation innorhalb of 3.5 hours at + 6O 0 C is heated for 12 hours at this temperature pasteurized and then cooled to room temperature within 1.5 hours. Aqun ad injections (without pasteurization) and 0.1% albumin solution and 0.266 m glycine solution were used as solvents. The intermediate lyophilizates dissolved in the respective solvent were sterile-filtered after the pasteurization and filled into 5 TF units as described in Example 1, frozen and lyophilized. The following biochemical and physical parameters were determined:
TF gelöst inTF solved in
5TFE aquaadinj. 0,1%Albumin 0,266mGlyzin5TFE aquaadinj. 0.1% albumin 0,266mglycine
unbehandelt 10h60°C 10h60°Cuntreated 10h60 ° C 10h60 ° C
* 5mg Albumin* 5mg albumin
Alle Präparate waren steril, pyrogenfrei und wiesen eine gute Verträglichkeit im Tierversuch auf. Die immunologischen Untersuchungen der In-vitro-Wirksamkeit im LTT und im E-Rosetten-Recovery-Test zeigten ebenfalls einen deutlichen Anstieg der Aktivität durch die thermische Behandlung in flüssiger Phase.All preparations were sterile, pyrogen-free and showed good tolerability in animal experiments. The immunological studies of in vitro efficacy in LTT and in the E-rosette recovery test also showed a marked increase in activity by thermal treatment in the liquid phase.
Aus den Ausführungsbeispielen geht die besondere Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines virussicheren, standardisierten und in seiner immunologischen Aktivität durch die thermische Behandlung in flüssiger Phase gesteigerten Transfer-Faktor-Präpar;; s hervor. Durch die Integration des virusinaktivierenden Schrittes, der ohne zusätzliche Agenzien oder Stabilisatoren durchgeführt werden kann und sich damit problemlos in praktizierte Großpoolverfahren zur Transfer-Faktor-Herstellung einordnen läßt, gelingt es auf eine sehr rationelle und kostengünstige Weise, die Sicherheit des Präparates gegenüber Virusübertragungen mit einer Erhöhung der immunologischen Aktivität auf sinnfällige Art zu verbinden.From the embodiments, the particular suitability of the method according to the invention for the production of a virus-safe, standardized and increased in its immunological activity by the thermal treatment in the liquid phase transfer factor preparation; s. By integrating the virus-inactivating step, which can be carried out without additional agents or stabilizers and thus can be easily classified in practiced large-pool procedures for transfer factor production, it is possible in a very rational and cost-effective manner, the safety of the preparation against virus transmissions with a Increase of immunological activity in a meaningful way to connect.
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