DD301740A7

DD301740A7 - Method for the microbial degradation of sterols to ndrosta-1,4-diene-3,17-dione

Info

Publication number: DD301740A7
Application number: DD34242290A
Authority: DD
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1990-07-02
Publication date: 1993-09-16

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Sterolen zu Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD) durch Degradation der Seitenkette. Die Verbindung ADD ist als Intermediärprodukt des Sterolabbaus bekannt und dient als Schlüsselprodukt für die Herstellung einer Reihe von Steroidwirkstoffen. Die Aufgabe der Erfindung, mit hohen analytischen Produktbildungsraten und hohen molaren Ausbeuten zunächst ADD-Rohprodukte herzustellen, deren AD-Nebenproduktanteil so niedrig ist, daß mittels einfacher präparativer Aufarbeitung ADD hoher Reinheit erhalten wird, wird dadurch gelöst, daß für einen Mikroorganismus der Species Mycobacterium vaccae eine definierte Führung der Impfkultur angewendet wird, die mit einer spezifischen Alkalisierung als meßtechnisch erfaßbarem Parameter einhergeht. Nach Fermentation der Hauptkultur in an sich bekannter Weise und nach Abtrennung von anderen Begleitstoffen wird dann durch einfache Aufarbeitung (Auskristallisation) das Zielprodukt ADD in hoher Reinheit gewonnen.{mikrobieller Abbau von Sterolen; Mikroorganismus Mycobacterium vaccae; definierte Führung der Impfkultur; Hauptprodukt Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD); hohe Produktbildungsrate; niedriger Androst-4-en-3,17-dion-Anteil (AD)}The invention relates to an improved process for the microbial degradation of sterols to androsta-1,4-diene-3,17-dione (ADD) by degradation of the side chain. The compound ADD is known as an intermediate of sterol degradation and serves as a key product for the production of a range of steroid drugs. The object of the invention to initially produce ADD crude products with high analytical product formation rates and high molar yields whose AD by-product content is so low that ADD of high purity is obtained by simple preparative workup, is achieved in that for a microorganism of the species Mycobacterium vaccae a defined management of the seed culture is used, which is accompanied by a specific alkalization as metrologically detectable parameter. After fermentation of the main culture in a manner known per se and after separation of other accompanying substances, the target product ADD is then obtained in high purity by simple work-up (crystallization). {Microbial degradation of sterols; Microorganism Mycobacterium vaccae; defined management of the seed culture; Major product androsta-1,4-diene-3,17-dione (ADD); high product formation rate; low androst-4-ene-3,17-dione fraction (AD)}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Sterolen zu Androsta-1,4-dien-3,17-dton (ADD). ADD ist als Intermediärprodukt des Sterolabbaus bekannt und dient als Schlüsselprodukt bei der Herstellung von Steroidwirkstoffen. Aus ADD können durch bekannte Synthesen hochwirksame Steroide der Pregnanreihe mit einem großen Anwendungsbereich in der Humantherapie und auch in der Veterinärmedizin gewonnen werdenThe invention relates to a process for the microbial degradation of sterols to androsta-1,4-diene-3,17-dtones (ADD). ADD is known as an intermediate product of sterol degradation and serves as a key product in the production of steroid drugs. From ADD, by means of known syntheses, highly effective steroids of the pregnane series can be obtained with a wide range of applications in human therapy and also in veterinary medicine

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen Forschung und Industrie. The field of application of the invention lies in the pharmaceutical research and industry.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Die Herstellung von ADD und Androst-4-en-3,17-dion (AD) durch mikrobielle Fermentation von Sterolen ist bereits des öfteren beschrieben worden. Dabei werden zur Gewinnung von ADD als Hauptprodukt des Sterolabbaus der Mikroorganismus Mycobacterium spec. NRRL B-3683 sowie aus diesem isolierte Selektanten verwendet (vgl. Patentschriften US 3684857, DD 248143 und DD 248144). Das hierbei vorzugsweise eingesetzte Fermentationsmedium enthält zu Fermentationsbeginn jeweils freie bzw. komplexe Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie neben verschiedenen Mineralsalzen ein Sterol bzw. Sterolgemisch bis 50g/l, einen Adsorber vom Typ eines organischen Polymeren, der polare Gruppen, vorzugsweise Acrylsäurederivate, enthält und weiterhin ein nichtionisches Tensid aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropyljnoxid-Addukte des N',N"-Tetra-(-oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriamins (siehe Patentschrift DD 248145). Schäumung und Entmischung als Störfaktoren der reproduzierbaren Prozeßführung werden durch koinzidierende Variation von Rührung und Belüftung als Stellmaßnahmen einer Soll-Wert-Regelung der relativen Gelöstsauerstoff-Sättigung der Kulturlösung (pO₂-Wert) stark vermindert (siehe Patentschrift DD 248144). Die angegebene Prozeßführung zur fermentativen Gewinnung von ADD ist durch das Auftreten von Nebenprodukten wie AD, 21 -Hvdroxy-20-methylprogna-1,4-dien-3-on (1,4-C₂₂-Alkohol) sowie Spuren von 21-Hydroxy-20-methylpregn-4-en-3-on (4-C₂₂-AIkOhOl) gekennzeichnet. Dabei werden insbesondere Rohproduktgemische erhalten, die als Nebenkomponente stets 9% bis 12% AD (bezogen auf die Gesamtmenge an ADD und AD) enthalten, und die mittlere Produktbildungsrate beträgt für die Chargenfermentation (Batch-Verfahren) höchstens 1,79Gramm ADD je Liter Fermentationslösung im Rohprodukt in 24 Stunden. Dabei werden bis zum Ende der Fermentation analytisch molare Ausbeuten an ADD (bezogen auf die eingesetzte Sterolmenge) von 50% bis 70% der Theorie erreicht. Über die Chargenfermentation hinausgehend, wurde inzwischen auch ein hinsichtlich der erzielten Produktbildungsraten verbessertes Verfahren zur fermentativen Gewinnung von ADD aus Sterolen offengelegt (sieiie Patentschrift DD 276887). Die Zufütterung von frei metabolisierbaren Nährstoffen zum Fermentationsmedium in Abhängigkeit vom pH-Profil und/oder vom pGyWert während der Transformationsphase (I ed-batch-Verfahren) bewirkt hierbei eine Intensivierung der Produktbildung. Die analytischen Produktbildungsraten betragen bis zu 3Gramm ADD je Liter Fermentationslösung im Rohprodukt in 24 Stunden. Der Anteil des Nebenprodukts AD ist gegenüber der Chargenfermentation allerdings auf 11 % bis 13% erhöht. Die molaren Ausbeuten an ADD (analytisch, bezogen auf die eingesetzte Sterolmenge) bis zum Ende der Fermentation liegen unter 60% der Theorie.The production of ADD and androst-4-ene-3,17-dione (AD) by microbial fermentation of sterols has been described many times. In this case, to obtain ADD as the main product of Sterolabbaus the microorganism Mycobacterium spec. NRRL B-3683 and from this isolated selectants used (see patents US 3684857, DD 248143 and DD 248144). The here preferably used fermentation medium contains at the beginning of fermentation each free or complex carbon and nitrogen sources and in addition to various mineral salts a sterol or Sterolgemisch to 50g / l, an adsorbent of the organic polymer type, the polar groups, preferably acrylic acid derivatives, and further comprises nonionic surfactant from the group of the polyethylene oxide-polypropylene oxide adducts of N ', N "-tetra (-oxypropylpropyol) -N' - (2-oxypropyl) -diethylenetriamine (see patent specification DD 248145) .Foaming and separation as interfering factors of reproducible process control are greatly reduced by coincidental variation of agitation and aeration as controls of a target value control of the relative dissolved oxygen saturation of the culture solution (pO ₂ value) (see patent specification DD 248144) The process procedure given for the fermentative recovery of ADD is by the occurrence of by-products such as AD, 21 -Hydroxy-2 0-methylprogna-1,4-dien-3-one (1,4-C ₂₂ alcohol) and traces of 21-hydroxy-20-methylpregn-4-en-3-one (4-C ₂₂ -AlkOhOl) , In particular, crude product mixtures are obtained which contain as minor component always 9% to 12% AD (based on the total amount of ADD and AD), and the average product formation rate for the batch fermentation (batch process) is at most 1.79 grams ADD per liter of fermentation solution in Crude product in 24 hours. In this case, analytically molar yields of ADD (based on the amount of sterol used) of 50% to 70% of theory are achieved until the end of the fermentation. In addition to batch fermentation, a method for the fermentative recovery of ADD from sterols, improved in terms of product formation rates, has since been disclosed (see patent DD 276887). The addition of freely metabolizable nutrients to the fermentation medium as a function of the pH profile and / or the pGy value during the transformation phase (I ed-batch method) in this case causes an intensification of product formation. The analytical product formation rates are up to 3Gramm ADD per liter of fermentation solution in the crude product in 24 hours. However, the proportion of by-product AD is increased to 11% to 13% compared to batch fermentation. The molar yields of ADD (analytically, based on the amount of sterol used) until the end of the fermentation are below 60% of theory.

Bekannt sind Inzwischen weiterhin fermentative) Verfahren, in denen unter anderem der ivlikroorganismen-Stamm Mycobacterium vaccao 7IMET11094 zur mikrobiollon Transformation von Sterolen zum Produkt ADD (vgl, die Patentschriften DD 29134'iundDD 291342) sowie auch zu anaeron Zielvorbindungen -so unter anderem zu 9a-Hydroxy-.indrost-4-e'i-3,17-dion (Vgl. Patentschrift DD 29¹341) und zu 2a,3a,6a-MS - 004 herangezogen wird. Ebenso wie die eingangs skizzierten früheren technischen Lösungen zur ADD-Gewinnung laufen diese fermentativen Verfahren in den Stufen Vor- und Hauptkultur ab, wobei die Vorkultur in Medien durchgeführt wird, die immer auch sog. komlexe Nährmedienbestandteile wie Hefeextrakte und/oder Peptone enthalten. In den auf dem Einsatz von Stamm M. vaccae ZIMET11094 basierenden bisherigen Verfahren zur Herstellung von ADD werden Ausbeuten bis zu 4,0Gramm ADD je Liter Fermentationslösung im Rohprodukt erreicht. Allen genannten Verfahren haften dabei noch folgende Nachteile an:In the meantime, fermentative processes continue to be known, in which, inter alia, the microorganism strain Mycobacterium vaccao 7IMET11094 is used for the microbiolollon transformation of sterols to the product ADD (cf., patents DD 29134'i andDD 291342) as well as to anaerone target precursors. hydroxy-4-.indrost e'i-3,17-dione (See Patent DD 29 ¹ 341)., and 2a, 3a, 6a-MS - is used 004th As well as the earlier outlined technical solutions for ADD recovery mentioned above, these fermentative processes take place in the stages pre- and main culture, the preculture is carried out in media that always contain so-called complex Nährmedienbestandteile as yeast extracts and / or peptones. Yields of up to 4.0 grams ADD per liter of fermentation solution in the crude product are achieved in the previous methods for the production of ADD based on the use of strain M. vaccae ZIMET11094. All these methods are still liable to the following disadvantages:

- Sowohl im Batch-Verfahren mit seinen relativ niedrigen ADD-Bildungöraten als auch insbesondere im Fed-batch-Verfahren mit bereits höheren ADD-Bildungsraten werden Rohprodukt-Gemische erhalten, die mehr als 9,0% des !inerwünschten Nebenprodukts AD (bezogen auf die Gesamtmenge an ADD und AD) aufweisen. Dieses in der Fermentation entstehende ADD/AD-Gemisch kann nur durch die Einschaltung aufwendiger ergänzender Verfahrensschritte getrennt und damit nur unter erheblichen Ausbeuteverlusten bis auf ein Endprodukt mit einem AD-Anteil <3,0% aufgereinigt werden. (Diese Reinheitsfordorung resultiert im Gesamtverfahren zur Herstellung von Steroidwirkstoffen aus den Erfordernissen der nachfolgenden Syntheseschritte.)Both in the batch process with its relatively low ADD formation rates and in particular in the fed-batch process with already higher ADD formation rates, crude product mixtures are obtained which contain more than 9.0% of the desired by-product AD (based on the Total amount of ADD and AD). This resulting in the fermentation ADD / AD mixture can only be separated by the involvement of complex complementary process steps and thus be purified only at considerable yield losses to an end product with an AD content <3.0%. (This Reinheitsfordorung results in the overall process for the production of steroidal agents from the requirements of subsequent synthetic steps.)

- In beiden Verfahrensgrundtypen werden bis zum Ende der fermentativen Umsetzung im Rohprodukt analytisch nur molare ADD-Ausbeuten bis zu maximal 70% der Theorie erreicht. Diese Ausbeuteverhältnisse sind angesichts des Kostenniveaus bei den Einsat/stoffen sowie angesichts der Effektivität des Gesamtverfahrens verbesserungsbedürftig.In both basic process types, only molar ADD yields up to a maximum of 70% of theory are analytically achieved in the crude product until the end of the fermentative reaction. These yield ratios need to be improved in view of the cost level of the ingredients and in view of the effectiveness of the overall process.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die vorliegende Erfindung verfolgt das Ziel, Androsta-1,4-dien-3,17-dion fermeniativ in hohen Ausbeuten sowie in großer Reinheit herzustellen.The present invention pursues the goal of producing androsta-1,4-diene-3,17-dione by itself in high yields and in high purity.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Transformation von Sterolen zu Androsta-1,4-dien-3,17-dion zu beschreiben, das dieses Produkt mit hohen molaren Ausbeuten liefert. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:The invention has for its object to describe an improved process for the microbial transformation of sterols to androsta-1,4-diene-3,17-dione, which provides this product with high molar yields. According to the invention, this object is achieved in its basic feature as follows:

Das dargelegte Verfahren zur mikrobiellen Gewinnung von Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD) wird unter aeroben Bedingungen in den Fermentationsstufen Vorkultur und submerser Hauptkultur durchgeführt, wobei in letztgenannter Stufe Sterole wie Sito-, Stigma-, Campe-, Ergo- oder Cholesterol bzw. Gemische dieser Sterole in Konzentrationen von 1,0g/l bis 50g/l eingesetzt werden. Der wäßrige Fermentationsansatz der Hauptkultur enthält dabei neben wenigstens einer Kohlenstoff- und wenigstens einer organischen Stickstoffquelle sowie neben Mineralstoffen weiterhin in an sich bekannter Weise eine Sterol-Tensid-Präparation mit einem Mindestgehalt von 10g Sterol oder Sterolgemisch je Liter Präparationsflüssigkeit. Verfahrenswesentlich ist nun, daß dieser Fermentationsansau mit einer Impfkultur des Stammes Mycobacterium vaccae ZIMET 11094 inokuliert wird, die einer Vorkultur entnommen ist, in welcher zürn Überimpfungszeitpunkt eine pH-Änderung in Richtung . Alkalisierung von mindestens ApH = 0,3 als Ausdruck für das Auftreten von Limitationen sowohl an frei verwertbaren Kohlenstoff- als auch an frei verwertbaren Stickstoffquellen eingetreten ist. Werden die mit M. vaccae ZIMET11094-lnokulum dieser Kennzeichnung beimpften wäßrigen Fermentationsansätze der Hauptkultur dann in an sich bekannter Weise, nämlich bei pH-Werten um den Neutralpunkt (pH = 7,0 ± 1,0) für die Dauer von 24 Stunden bis 192 Stunden bei Temperaturen zwischen 20⁰C und 45⁰C unter Zusatz von Adsorbentien, kultiviert, so läuft die Steroltransformation zu ADD in dieser Kultivierungsstufe mit höheren molaren Ausbeuten sowie mit erhöhten Rohorodukt-Bildungsgeschwindigkeiten ab, wobei der Anteil an unerwünschtem Nebenprodukt AD, bezogen auf die insgesamt gebildete Menge an ADD und AD, deutlich erniedrigt ist und weniger als 9% beträgt.The procedure described for the microbial recovery of androsta-1,4-diene-3,17-dione (ADD) is carried out under aerobic conditions in the fermentation stages preculture and submerged main culture, whereby in the latter stage sterols such as Sito, Stigma, Campe , Ergo- or cholesterol or mixtures of these sterols in concentrations of 1.0 g / l to 50g / l are used. The aqueous fermentation mixture of the main culture contains besides at least one carbon and at least one organic nitrogen source and in addition to minerals in a known manner a sterol surfactant preparation with a minimum content of 10g sterol or sterol mixture per liter of preparation liquid. It is essential to the process that this fermentation batch is inoculated with a seed culture of the strain Mycobacterium vaccae ZIMET 11094, which is taken from a preculture, in which there is a pH change in the direction at the time of inoculation. Alkalization of at least ApH = 0.3 has occurred as an expression of the limitations of both freely utilizable carbon and freely utilizable nitrogen sources. The aqueous fermentation batches of the main culture inoculated with M. vaccae ZIMET1094 inoculum of this labeling are then administered in a manner known per se, namely at pH values around the neutral point (pH = 7.0 ± 1.0) for a period of 24 hours to 192 Hours at temperatures between 20 ⁰ C and 45 ⁰ C with the addition of adsorbents, cultured, the sterol transformation proceeds to ADD in this culture step with higher molar yields and with increased Rooderodukt formation rates, the proportion of undesirable by-product AD, based on the Total amount of ADD and AD formed is significantly reduced and less than 9%.

Die Hauptkultur kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Volumens sowie in Glasfermentoren und in Stahl-Großtanks durchgeführt werden, wobei in jedem dieser Fermentationsgefäße ein herkömmliches Regime der Belüftung realisierbar sein muß.The main culture can be carried out in steep-breasted bottles and round-bottomed flasks of various volumes, in glass fermentors and in large steel tanks, whereby in each of these fermentation vessels a conventional ventilation regime must be feasible.

Der verfahrensgemäße mikrobielle Abbau von Storolen zu ADD läßt sich mit besonderem Vorteil ausführen, wenn ein Hauptkultur-Fermentationsansatz der oben beschriebenen Zusammensetzung mit einer Impfkultur von M. vaccae ZIMET11094 inokuliert wird, die aus einer mehrstufigen Vorkultur dieses Stammes gerade dann entnommen worden ist, nachdem in dieser eine pH-Änderung der oben angegebenen Beschaffenheit, d. h. eine Änderung von mindestens ΔρΗ = 0,3 in Richtung Alkalisierung, als Markierung für das Auftreten einer Limitation an frei verwertbaren Kohlenstoffquellen vor einer Limitation an frei verwertbaren Stickstoffquellen eingetreten ist.The microbial degradation of storoles to ADD according to the invention can be carried out with particular advantage if a main culture fermentation batch of the composition described above is inoculated with a seed culture of M. vaccae ZIMET11094 which has just been taken from a multistage preculture of this strain, after this one pH change of the above nature, d. H. a change of at least ΔρΗ = 0.3 in the direction of alkalization has occurred as a marker for the occurrence of a limitation on freely usable carbon sources before a limitation on freely usable nitrogen sources.

In solcherart beimpften Hauptkultur-Fermentationsansätzen kann-bei Einhaltung der übrigen Bedingungen- der in o.a. definierte Anteil an AD im Rohprodukt deutlich aufwerte unter 8% herabgedrückt werden (vgl. die Ausführungsbeispiele 3 und 4), und zwar sowohl in einer als Batch-Kultur a's auch in einer als Fed-batch-Kultur durchgeführten Hauptfermentation. Das Verfahren wird in seiner weiteren Ausgestaltung nun vorteilhaft wie folgt realisiert: Zur Anzucht von Biomasse wird von Konserven des genannten Sterol-Umwandlers M. vaccae ZIMET11094 ausgegangen, die durch Einfrieren unter Zusatz von Glycerol hergestellt worden sind. Die Biomasse-Anzucht erfolgt durch eine oder durch mehrere nacheinander vorgenommene submerse Kultivierungsstufe(n). Die Anzahl der zu durchlaufenden Impfkulturstufen richtet sich nach den Erfordernissen der Maßstabsvergrößerung.In such inoculated main culture fermentation approaches may - in compliance with the other conditions - in o.a. defined proportion of AD in the crude product are significantly reduced below 8% (see the exemplary embodiments 3 and 4), both in a batch culture a's also in a main batch fermentation carried out as a fed-batch culture. In its further embodiment, the process is now advantageously carried out as follows: The growth of biomass is based on preserving the said sterol converter M. vaccae ZIMET11094, which has been prepared by freezing with the addition of glycerol. The biomass cultivation is carried out by one or more sequentially carried out submerse cultivation stage (s). The number of Impfkulturstufen to be passed depends on the requirements of the scale-up.

Der Mikroorganismus wird hierbei unter aeroben Bedingungen in Medien kultiviert, die als Kohlenstoffquellen vorzugsweise Glycerol oder Glukose, als Stickstoffquellen vorzugsweise Hefeextrakt, Nitrate, Harnstoff oder Ammoniumsalze sowie weiterhin Mineralsalze verschiedener Zusammensetzungen enthalten. Außerdem sind dem Nährmedium der lernen ImpfkulturThe microorganism is cultured here under aerobic conditions in media which contain as carbon sources preferably glycerol or glucose, as nitrogen sources preferably yeast extract, nitrates, urea or ammonium salts and furthermore mineral salts of various compositions. Besides, the nutrient medium is the learning vaccine culture

vorteilhafterweise noch weitere komplexe Bestandteile wie Sojamehl und/oder Sojahydrolysat beigegeben. Der pH-Wert liogt um den Neutralpunkt Im Bereich von pH 6,7 bis pH 7,4. Die Inkubationstemperatur wird zwischen 25⁰C und 45⁰C, vorzugsweise zwischen 28⁰C und 34°C, gewählt; die Bebrütungsdauer beträgt 10 Stunden bis 80 Stunden, vorzugsweise 3Θ bis 48 Stunden. Mit 2,5% bis 20%, vorzugsv.uise mit 10%, des Volumens der vorausgehenden Impfkulturstiife wird die jeweils nachfolgende Kulturstufe beimpft, wobei in den einzelnen Stufen das Fermentationsmedium nicht unbedingt die gleiche Zusammensetzung wie in der vorausgegangenen Anzuchtstufe aufweisen muß (vgl. hierzu die Ausführungsbeispiele). In diesem Zusammenhang kann es von Vorteil sein, beim Nährmedium dar letzten Stufe der M. vaccae ZIMET 11094-Vorkultivierung in Vorversuchen in an sich bekannter Weiseadvantageously added further complex ingredients such as soybean meal and / or soy hydrolyzate. The pH is around the neutral point in the range of pH 6.7 to pH 7.4. The incubation temperature is between 25 ⁰ C and 45 ⁰ C, preferably selected between 28 ⁰ C and 34 ° C; the incubation period is 10 hours to 80 hours, preferably 3Θ to 48 hours. With 2.5% to 20%, preferably with 10%, of the volume of the preceding Impfkulturstiife the respective subsequent culture stage is inoculated, wherein in the individual stages, the fermentation medium does not necessarily have the same composition as in the previous cultivation stage (see. For this the embodiments). In this context, it may be advantageous in the nutrient medium in the last stage of M. vaccae ZIMET 11094 precultivation in preliminary experiments in a conventional manner

a) die Biomasse-Ertragskoeffizienten in Abhängigkeit von den bestimmenden Substraten dieses Modiums, so von den freien Kohlenstoffquellen (wie Glukose, Zitraten bzw. Glycerol) und/oder von den freien Stickstoffquellen (wie Nitraten, Ammoniumsalzen bzw. freien Aminosäuren), sowiea) the biomass yield coefficients as a function of the determining substrates of this mode, such as free carbon sources (such as glucose, citrates or glycerol) and / or free nitrogen sources (such as nitrates, ammonium salts or free amino acids), and

b) die maximalen spezifischen Wachstumsraten der Zellpopulationb) the maximum specific growth rates of the cell population

mit dem Ziel zu ermitteln, aus diesen Daten Anhaltspunkte für solche Dotierungen dieses Mediums zu gewinnen, die gegen Ende der Stufe, d. h. nachdem der pH-Wert ein Minimum durchlaufen hat und die erwähnte pH-Änderung in Richtung Alkalisierung zu verzeichnen ist, zu einer Limitation an freien Kohlenstoffquellen und einer nachfolgenden Limitation der eingesetzten froien Stickstoffquellen im Vorkultur-Medium führen. Wie die diesbezüglichen Vorversuche ergeben haben, läßt sich dieser SoII-Zustand, d. h. der sog. Reifezustand der Impfkultur, immer dann erreichen, wenn das C/N-Verhältnis der in der abschließenden Vorkultivierungsstufe verwendeten Substrate im Bereich von 4:1 bis 32:1 liegt.with the aim of obtaining from these data clues for such doping of this medium, towards the end of the stage, d. H. after the pH has gone through a minimum and the mentioned pH change towards alkalization is recorded, lead to a limitation of free carbon sources and a subsequent limitation of the froien nitrogen sources used in preculture medium. As the related preliminary experiments have shown, this SoII condition, i. H. the so-called mature state of the seed culture, whenever the C / N ratio of the substrates used in the final precultivation step is in the range of 4: 1 to 32: 1.

Darüber hinaus läßt sich im Ergebnis weiterer durchgeführter Untersuchungen die Feststellung treffen, daß der an der verfahrensgemäßen pH-Änderung erkennbare Reifezustand der Impfkultur vorzugsweise immer dann erreicht ist, wenn die entsprechenden analytischen Nachweise im Medium das VorhandenseinIn addition, it can be concluded as a result of further investigations carried out that the recognizable to the pH change process recognizable maturity state of the seed culture is preferably always reached when the corresponding analytical evidence in the medium the presence

- einer (Rest-)Konzentration an freier Kohlenstoffquelle S0,1 g/l,a (residual) concentration of free carbon source S0.1 g / l,

- begleitet von einer (Rest-)Konzentration an freier Stickstoffquelle S 1,0% der maximal verwertbaren Stickstoffmenge, belegen.- Accompanied by a (residual) concentration of free nitrogen source S 1.0% of the maximum usable amount of nitrogen, occupy.

Wird die Anzucht der letzten Impfkultur-Stufe im gerührten, belüfteten Fermentor vorgenommen (vgl. Ausführungsbeispiel 4), so ist ihr verfahrensgemäßer Reifezustand insbesondere auch daran erkennbar, daß zusätzlich zu der spezifischen pH-Änderung in Richtung Alkalisierung eine Absenkung des Sauerstoff-Verbrauchs, quantitativ erfaßt über die sog. Sauerstoff-Aufnahmerate, auf wenigstens 2,0% des Maximalwertes eingetreten ist.If the cultivation of the last seed culture stage is carried out in a stirred, ventilated fermenter (see Embodiment 4), then its maturity state according to the method is also evident from the fact that, in addition to the specific pH change in the direction of alkalization, a reduction in the oxygen consumption, quantitatively detected via the so-called oxygen uptake rate, has occurred at least 2.0% of the maximum value.

Eine auf diese Weise angezüchtete Impfkultur von M. vaccae ZIMET11094 im Reifezustand wird in einem Volumenverhältnis von 5% bis 30%, vorzugsweise von 10% bis 20%, des Volumens des Hauptkultur-Nährmediums zur Inokulation eben dieser Kultur verwendet. Die verfahrensgemäße Führung der letzten Impfkulturstufe diesos Stammes ergibt somit reproduzierbar ein physi alogisch definiertes Inokulum, welches insbesondere hinsichtlich seines pH-Status sowie hinsichtlich seines Limitationszustandes genau charakterisiert ist.A seed culture of M. vaccae ZIMET11094 grown in this way is used in a volume ratio of 5% to 30%, preferably 10% to 20%, of the volume of the main culture medium to inoculate the same culture. The procedural management of the last Impfkulturstufe diesos strain thus reproducibly results in a physiologically defined inoculum, which is precisely characterized in particular with regard to its pH status and in terms of its Limitationszustandes.

Die Fermentation der Hauptkultur zur Transformation von Sterolen zu ADD sowie die chemische Aufarbeitung der Rohprodukte erfolgen dann in an sich bekannter Weise, vorzugsweise nach den in den Patentschriften DD 248143 (Batch-Kultivierung) und DD 276887 (Fed-batch-Kultivierung) angegebenen Teilverfahren. Dabei werden molare ADD-Ausbeuten höher als 70% der Theorie sowie hohe Rohprodukt-Bildungsgeschwindigkeiten ermöglicht; und der Anteil an unerwünschtem Nebenprodukt AD wird, bezogen auf die Gesamtmenge der gebildeten Produkte ADD und AD, signifikant auf Werte niedriger als 9% heruntergedrückt.The fermentation of the main culture for the transformation of sterols to ADD and the chemical workup of the crude products are then carried out in manner known per se, preferably according to the partial process specified in patents DD 248143 (batch cultivation) and DD 276887 (fed-batch cultivation). It allows molar ADD yields higher than 70% of theory and high crude product formation rates; and the proportion of undesired by-product AD is significantly reduced to values lower than 9%, based on the total amount of products ADD and AD formed.

Im Ergebnis dieses Befundes lassen sich die nach diesem Verfahren erhaltenen Rohprodukte (nach Abtrennung der übrigen ' Nebenprodukte und Begleitstoffe) durch einfache Auskristallisation und damit in hohen präparativen Ausbeuten zu einem ADD-Endprodukt reinigen, dessen AD-Anteil bei 1,0% liegt (vgl. Ausführungsbeispiele 3 und 4), d. h., die eingangs genannte Reinheitsforderung kann erheblich unterböte ι werden.As a result of this finding, the crude products obtained by this process (after separation of the remaining 'by-products and by-products) can be purified by simple crystallization and thus in high preparative yields to an ADD end product whose AD content is 1.0% (see Embodiments 3 and 4), d. h., The above-mentioned purity requirement can be considerably öt be ι.

Ausführungsbeispieleembodiments

example 1

Eine M. vaccae ZIMET 11094-Probe wird 48 Stunden bis 120 Stunden bei 28⁰C als Schrägagarkultur auf 20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton, 3g Fleischextrakt, 15g Agar-Agar, Aquadest. ad 1000ml, pH7,0; kultiviert.An M. vaccae ZIMET 11094 sample is from 48 hours to 120 hours at 28 ⁰ C as the slant on 20 g glycerol, 5 g Bacto-peptone, 3g of meat extract, 15g agar, aqua dest. ad 1000ml, pH 7.0; cultured.

Mit aliquoten Mengen der erhaltenen Zellkultur je eines Röhrchens werden 500ml-Stehrundkolben mit je 50ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft:Aliquots of the obtained cell culture per tube are inoculated into 500 ml stalk flasks with 50 ml nutrient solution each of the following composition:

10g Glukose; 10g Hefeextrakt; 0,5g KH₂PO₄; 0,5g K₂HPO₄; 1,5g (NH₄I₂HPO₄; 0,2g MgSO₄ · 7H₂O; 0,01 g FeSO₄ 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ · 7 H₂O; Aqua dest. ad 1000ml; pH7,0.10g glucose; 10g yeast extract; 0.5 g KH ₂ PO ₄ ; 0.5 g K ₂ HPO ₄ ; 1.5 g (NH ₄ I ₂ HPO _4; 0.2 g MgSO ₄ · 7H ₂ O 0.01 g FeSO ₄ 7H ₂ O; ZnSO ₄ 0,002g · 7 H ₂ O; Distilled water ad 1000 ml;. PH 7.0 ,

Nach Inkubation über 43 Stunden bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelmaschine (180U/min) wird diese Submerskultur im Verhältnis 1:10 zur Beimpfung einer zweiten Submerskultur verwendet, deren Nährlösung eine weitgehend gleiche Zusammensetzung besitzt. Variiert werden jedoch die Konzentrationen an Glukose bzw. Hefeextrakt in folgender Weise (je Variante 3 Stehrundkolben mit je 50ml Nährmedium):After incubation over 43 hours at 28 ⁰ C on a rotary shaker (180U / min), these submerged culture is used in the ratio of 1:10 to inoculate a second submerged culture, their culture medium has a substantially same composition. However, the concentrations of glucose or yeast extract are varied in the following manner (depending on the variant, 3 stirrer flasks with 50 ml of nutrient medium each):

Variantevariant CnefeexlraktCnefeexlrakt ^Glucose^ glucose (g-r¹)(gr ¹ ) (g-r¹)(gr ¹ ) 11 1010 1010 22 1010 CJlCJL 33 1010 2020 44 1515 2020 CJICJI 2020 00 66 2020 CJlCJL 77 2020 1010

Nach 48 Stunden Schütteln bot 28⁹C werden diese SuLmorskulturen im Verhältnis 1:5 zur Beimpfung sterolhaltlgor Hauptkulturen verwondet.After shaking for 48 hours, 28 ⁹ C were applied to these cultures of SuLmor in a ratio of 1: 5 to inoculate sterolhaltlgor main cultures.

Dazu werdon je Variante jeweils 3 Stehrundkolben mit jo 50 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung verwendet: 1,2 g KH₂PO₄; 6,0g K₂HPO₄ · 3H₂O; 1,8g (NH₄IjSO₄; 0,2g MgSO₄ · 7H₂O; 0,01g FoSO₄ · 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ · 7H₁O; 0,20g Harnstoff; 4,6g Glukose; 5,0g Dinatriumziuatdihydr at; 20g Sitostorol/Camposterol-Gomisch (ZZW Wittonborgo) sowie 220ml (Schüttvolumen) makroporösos Styron-Divinylbenzon-Polymeros mit Acrylsäuremethylestor-Anteil; Aqua dost, ad 1000ml; pH7,2.For this purpose, depending on the variant, 3 stirrer flasks each containing 50 ml of nutrient medium of the following composition are used: 1.2 g of KH ₂ PO ₄ ; 6.0 g K ₂ HPO ₄ .3H ₂ O; 1.8 g (NH ₄ IjSO ₄ ; 0.2 g MgSO ₄ .7H ₂ O; 0.01 g FoSO ₄ .7H ₂ O; 0.002 g ZnSO ₄ .7H ₁ O; 0.20 g urea; 4,6 g glucose; 0g Dinatriumziuatdihydr at; 20g Sitostorol / Camposterol-Gomisch (ZZW Wittonborgo) and 220ml (bulk volume) macroporous Styron-Divinylbenzon-Polymeros with Acrylic methyl ester content; Aqua dost, ad 1000ml; pH7.2.

Die Kulturen werden 96 Stunden bei 28°C geschüttolt. Nach beendetor Fermentation wird der o.g. Adsorber durch Siebon von der Nährlösung abgetrennt, durch Waschen mit Aqua dost, von anhaftenden Verunreinigungen befreit und anschließend mit Methanol oluiert (100ml Methanol je Stohrundkolben). In den so erhaltonen Eluaten wird dio Menge der entstandenen Produkte analytisch bestimmt (GC oder DC).The cultures are shaken for 96 hours at 28 ° C. After completion of the fermentation, the o.g. Adsorber by Siebon from the nutrient solution separated, by washing with Aqua dost, freed of adhering impurities and then with methanol (100ml methanol per Stohrundkolben). In the eluates thus obtained, the amount of the resulting products is determined analytically (GC or DC).

Folgende Produktausbeuton wurden erhalten (Durchschnittswerte üus je 3 Experimenten der jeweils gloichon Impfkultur-Variante):The following product wastes were obtained (average values per 3 experiments of each gloichon seed culture variant):

Variantevariant Biotrockenmassedry biomass ADDADD ADAD ADAD (Inoculum)(Inoculum) ADD + ADADD + AD (Ο-Ι-'ί(Ο-Ι-'ί (g-ΐΊ(G-ΐΊ (g-r¹)(gr ¹ ) (%)(%) 11 0,910.91 3,93.9 0,50.5 11,511.5 22 0,860.86 5,35.3 0,60.6 10,210.2 33 1,131.13 4,24.2 1,71.7 28,828.8 44 1,131.13 6,36.3 0,70.7 10,010.0 55 0,500.50 0,60.6 0,20.2 25,025.0 66 0,980.98 6,86.8 0,90.9 11,711.7 77 1,131.13 4,94.9 0,40.4 7,57.5

Example 2

Die Anzucht der Schrägagarkulturen von M. vaccae ZIMET11094 erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben. Mit (liquoten Mengen der erhaltenen Zollkultur je eines Röhrchens werden 500-ml-Steilbrustflaschen mit je 50ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft:Cultivation of the skew agar cultures of M. vaccae ZIMET11094 is carried out as indicated in Example 1. With ( liquoten quantities of the obtained customs culture of each tube 500 ml steep breast bottles are inoculated with 50 ml of nutrient solution of the following composition:

Glukose 10g; Hefeextrakt 10g; KH₂PO₄ '.,Cg; (NH₄)₂HPO₄ 1,5g; MgSO₄ · 7H₂O0,2g; 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ · 7H₂Q; Aqua dest. ad 1000ml; pH7,4.Glucose 10g; Yeast extract 10g; KH ₂ PO ₄ '., Cg; (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ 1.5g; MgSO ₄ .7H ₂ O0.2g; 0.01 g of FeSO ₄ .7H ₂ O; 0.002 g ZnSO ₄ .7H ₂ Q; Distilled water ad 1000ml; pH 7.4.

Nach 48stündiger Inkubation bei 29⁰C wird diese 1. Submerskultur im Verhältnis 1:5zur Beimpfung einer 2.Submerskultur (2-l-Steilbrustflasche mit 250 ml Medium) verwendet, deren Nährlösung die gleiche Zusammensetzung aufweist. pH-Verlauf und Glukosekonzentration werden gemessen. Nach vollständigem Verbrauch der enthaltenen Glukose und einer Alkalisierunpsphase von ΔρΗ S 0,3 am Ende der aktiven Wachstumsphase ist die Anzucht der Impfkuitur beendet, und ein Edelstahl-Glas-Rührfermentor von 4,51 Bruttovolumen wird mit 600 ml der 2. Submerskultur beimpft. Das Fermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:After 48 hours of incubation at 29 ⁰ C, these 1. submerged in the ratio 1: 5TO inoculate a 2.Submerskultur (2-l-Reagent bottle with 250 ml medium) used, the nutrient solution of the same composition. pH history and glucose concentration are measured. After complete consumption of the glucose contained and an alkalization phase of ΔρΗ S 0.3 at the end of the active growth phase, inoculation of the vaccine culture is complete and a 4.51 gross volume stainless steel glass stirred fermentor is inoculated with 600 ml of the 2nd submerged culture. The fermentation medium has the following composition:

15g (MH₄)jSO₄; 24g NaHPO₄-12H₂O; 9g KH₂PO₄; 0,6g MgSO₄-7H₂O; 0,03g FeSO₄-7H₂O; 0,006gZnSO₄-7H₂O; Glukose30g; 30g Magermilchpulver; Adsorber gemäß Beispiel 1; Aqua dest. ad 1600ml; pH6,8.15g (MH ₄ ) jSO ₄ ; 24 g of NaHPO ₄ -12H ₂ O; 9g KH ₂ PO ₄ ; 0.6g MgSO ₄ -7H ₂ O; 0.03g FeSO ₄ -7H ₂ O; 0.006 g of ZnSO ₄ -7H ₂ O; Glukose30g; 30g skimmed milk powder; Adsorber according to Example 1; Distilled water ad 1600ml; pH 6.8.

Nach der Beimpfung wird bei einer Prozeßtemperatur von 31⁰C die relative Gelöstsauerstoffsättigung als pOj-Wert in der gerührten und belüfteten Fermentationsbrühe als 100%-Wort geeicht. Die Einhaltung eines vorgegebenen pOj-Soll-Wertes von 40% wird durch die koinzidierende Variation von Rührung und Bolüftung erreicht. Dabei beträgt die Basisdrehzahl 460 U/min bei unterbrochen*. Luftzufuhr. Bei Unterschreitung der Regelschwelle wird die Drehzahl auf 600U/min erhöht, gleichzeitig der Zuluftweg geöffnet und mit 0,31 Luft je Minute und je Liter Fermentationslösung bis zum Erreichen der Regelschwelle von 40% belüftet.After inoculation, the relative dissolved oxygen saturation is calibrated as Poj value in the agitated and aerated fermentation broth to be 100% -word at a process temperature of 31 ⁰ C. The compliance with a predetermined target pOj value of 40% is achieved by the coincident variation of agitation and ventilation. The base speed is 460 rpm at interrupted *. Air supply. If the temperature falls below the control threshold, the speed is increased to 600 rpm, while the supply air is opened and vented with 0.31 air per minute and per liter of fermentation solution until the control threshold of 40% is reached.

Die Zugabe des Sterol-Substrates erfolgt durch Zupumpen einer wäßrigen Suspension in zwei Portionen. Dabei werden von Beginn der Fermentation an 15g eines Sitosterol/Campesterol-Gemisches (ZZW Wittenberge) in 400ml Aqua dest. im Verlauf von einer Stunde zugepumpt. Weitere 15g des gleichen Gemisches in 400 ml Aqua dest. sowie 2,5ml dos nichtionischen Tensides Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Addukt des N,N'-Tetra(-Oxy-)-propylpropyol)-N'-(2-oxyprcpyl)-diethylen-triamin in 100ml Aqua dest. werden zwischen der 22. und der 23. Fermentationsstunde ebenfalls kontinuierlich zugepumpt, so daß die Gesamtmenge an Sterol 30g bei einem Nettovolumen von 3I im Fermentor beträgt. Als Antischaummittel wird das Silikonöl Antaphron (Chemiewerk Nünchritz) eingesetzt. Durch Zudosierung von 1 η NaOH bei Säuerung wird ein unterer pH-Grenzwert von 5,6 eingehalten.The addition of the sterol substrate is carried out by pumping an aqueous suspension into two portions. From the beginning of the fermentation, 15 g of a sitosterol / campesterol mixture (ZZW Wittenberge) in 400 ml of distilled water. pumped in over an hour. Another 15 g of the same mixture in 400 ml of distilled water. and 2.5 ml of the nonionic surfactant polyethylene oxide-polypropylene oxide adduct of N, N'-tetra (-oxy-) propylpropyol) -N '- (2-oxyprcpyl) -diethylenetriamine in 100 ml of distilled water. are also continuously pumped between the 22nd and the 23rd fermentation hour, so that the total amount of sterol is 30g with a net volume of 3I in the fermentor. As an anti-foaming agent, the silicone oil Antaphron (Chemiewerk Nünchritz) is used. By addition of 1 η NaOH with acidification, a lower pH limit of 5.6 is maintained.

Die Fermentation wird nach 96 Stunden beendet. Der im Gesamtansatz enthaltene Adsorber wird durch Sieben abgetrennt und erschöpfend eluiert.The fermentation is stopped after 96 hours. The adsorber contained in the total batch is separated by sieving and exhaustively eluted.

Das Eluat enthält 17,3g ADD und 1,7g AD. Damit beträgt die auf das eingesetzte Sterol bezogene Ausbeute an ADD 83,6Mol-%, die ADD-Produktbildungsrate 1,44g ADD je Liier Nährbrüho und je 24 Stunden und der Anteil an AD, bezogen auf die Gesamtproduktmenge an ADD und AD, liegt bei 8,9%.The eluate contains 17.3g ADD and 1.7g AD. Thus, the yield of ADD applied to the sterol used is 83.6 mol%, the ADD product formation rate is 1.44 g ADD per Liier broth and every 24 hours and the proportion of AD, based on the total product amount of ADD and AD, is 8 , 9%.

Example 3

Anzucht und Vermehrung des Stammes M. vaccae ZIMET11094 bis zur ersten Submerskultur erfolgen wie unter Beispiel 1 angegeben.Cultivation and propagation of the strain M. vaccae ZIMET11094 until the first submerged culture are carried out as indicated under Example 1.

Mit dieser ersten Submerskultur wird in einer 2-l-Steilbrustflasche eine zweite Submerskultur im Verhältnis 1:10 beimpft, deren Nährmedium folgende Zusammensetzung hat:This first submerged culture is used to inoculate a second submerged culture in a ratio of 1:10 in a 2 l chest bottle, the nutrient medium of which has the following composition:

10g Glukose; 12g Hefeextrakt; 0,5g KH₂PO₄; 0,5g K₂HPO₄; 1,5g (NH₄)₂HPO₄; 0,2g MgSO₄ · 7H₂O; 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ 7H₂O; Aqua dest. ad 1000ml; pH7,0.10g glucose; 12g yeast extract; 0.5 g KH ₂ PO ₄ ; 0.5 g K ₂ HPO ₄ ; 1.5 g (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ ; 0.2 g of MgSO ₄ .7H ₂ O; 0.01 g of FeSO ₄ .7H ₂ O; 0.002 g ZnSO ₄ .7H ₂ O; Distilled water ad 1000ml; pH 7.0.

Der Verlauf des pH-Wertes während der Kultivierung bei 28⁰C wird kontrolliert. Nach 42stündigem Schütteln ist die am Ende der aktiven Wachstumsphase zu beobachtende Alkalisierung von dem Minimalwert von pH = 6,4 bis auf einen pH-Wert von 7,2 fortgeschritten. Mit 50CmI dieser Impfkultur wird ein Edelstahl-Glas-Rührfermentor mit 4,51 Bruttovolumen beimpft. Das Fermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:The course of the pH during the culture at 28 ⁰ C is controlled. After shaking for 42 hours, the alkalization observed at the end of the active growth phase has progressed from the minimum of pH = 6.4 to a pH of 7.2. With 50CmI of this seed culture, a 4.51 gross volume stainless steel glass stirred fermentor is inoculated. The fermentation medium has the following composition:

43 g «ines Steroiijumischos mit oincm Gesamtsterolgohalt von 93,5% (ZZW Wittonborgo); 700ml (Schütlvolumon) dee Absorbers aus Beispiel 1; 6,5g des nichtionischen Tensidos aus Boispiol 2; 15g Glukose; 10,75g Dinetrlumnltratdihydrat:43 g ines Steroiijumischos with oincm total sterol content of 93,5% (ZZW Wittonborgo); 700 ml (shake volumone) dee absorber from Example 1; 6.5 g of the nonionic surfactant from Boispiol 2; 15g glucose; 10.75g Dinetrlumnltratdihydrat:

2,0g Sojamehl; 0,44g Harnstoff; 4,42g(NH₄)JSO₄; 2,95g KH₂PO₄; 14,9gK₂HPO₄ 3H₂O₁O₁SgMgSO₄ · 7H₂O · 0,03g FeCI, CH₂O; 0,005g ZnSO, · 7H₂O; Aqua dest. ad 1700ml; pH6,9.2.0g soy flour; 0.44 g of urea; 4.42g (NH ₄ ) JSO ₄ ; 2.95g KH ₂ PO ₄ ; 14.9gK ₂ HPO ₄ 3H ₂ O ₁ O ₁ SgMgSO ₄ .7H ₂ O. 0.03g FeCl, CH ₂ O; 0.005 g of ZnSO 4 .7H ₂ O; Distilled water ad 1700ml; pH6,9.

Das Startvoliimon einschließlich Vorkultur und Adsorber beträgt 2,31. Die Führung der Fermentation bozüglich Rührung und Belüftung orfolgt wio unter Beispiel 2 angegeben. Dabol beträgt die Basisdrehzahl 450 U/min bei unterbrochener Luftzufuhr, die Sprungdrehzahl 700U/min boi einer Bolüftung mit 2I Luft je Liter Formentntionslösung und Minute bis zum Erreichen des pOj-Schwollonwertes von 25%.The starting volume, including preculture and adsorber, is 2.31. The guidance of the fermentation, including agitation and aeration, is given wio under example 2. Dabol is the base speed of 450 rpm with the air supply interrupted, the jump speed 700 rpm boi of a breather with 2 l of air per liter of formant solution and minute until the pOj Schwollonwerts of 25%.

Der Verlnu' dor Fermentation wird anhand des pH-Vorlaufs sowie anhand der Realisiorungshäufigkoit und/oder des Realisierungsniveaus der Stollgliedtätigkeit dor p0₂-Soll-Wort-Rogolung kontrolliert. Nach 21 Stunden worden bis zur 91. Stunde 0,17 g/h Glukose sowio0,0Bg/h (NH₄I₂SO₄ als wäßrigo Lösungon kontinuierlich nachdosiert. Gloichloufond dazu erfolgt zwischen 21 Stundon und 30 Stunden die Zugabe von '^1,5g dos gloichon Sterolgomischos in diskreten Gaben von je etwa 7 g bis 8g.The Verln'dor fermentation is controlled on the basis of the pH advance, as well as on the frequency of realization and / or the level of implementation of the Stoll member activity of the p0 ₂ -soll-word-rogolung. After 21 hours, until the 91st hour, 0.17 g / h of glucose were continuously added in succession as NH ₄ I ₂ SO ₄ as an aqueous solution, and Gloichloufond was added between 21 hours and 30 hours, the addition of '^ 1, 5g dos gloichon Sterolgomischos in discrete gifts of about 7 g each to 8g.

Das Endvolumon nach 91 Stumf. .·,' *· .nentation beträgt 2,41 (ohne Probonvolumon). Als pH-Schwellwort wird 7,0 gewählt. Die Zudosiorung von Natronlauge zur Einhaltung dieses Schwellenwertes dauert von dor 50. Stunde bis zum Abbruch der Fermentation nach 91 Stunden an. Zur Aufarbeitung des gesamten Ansatzes worden sämtliche zur Prozeßkontrolle entnommenen Probon und Vorläufe voreinigt. Dio Abtrennung dos Adsorbers orfolgt durch Filtration.The final volume after 91 stumf. · · · · Mentation is 2.41 (without the certificate volume). The pH threshold is 7.0. The dehydration of sodium hydroxide to maintain this threshold lasts from the 50th hour until the termination of the fermentation after 91 hours. For the processing of the entire approach, all pro bono and preliminary runs taken for process control were pre-approved. Separation of the adsorber is accomplished by filtration.

Im Filtrot wird die nicht umgesetzte Storolmengo analytisch bostimmt. Der Adsorber wird durch Waschen von anhaftenden Verunreinigungen bofroit und mit 4,91 Methanol erschöpfend eluiort. Im Koholuat wird die Monge dor entstandenen Produkte ebenfalls analytisch bostimmt. Nach Abdestillioren dos Lösungsmittel bleiben 31,0g eines hochviskoson, braunen Rückstandes zurück (1. Rohprodukt). Daraus worden nach einer bereits dargologton Methode (DD 248364) die C₂₂-Alkoholo sowie weitere unerwünschte Begloitprodukto entfernt.In Filtrot the unconverted Storolmengo is analyzed analytically. The adsorbent is bofroit exhaustively by washing adhering impurities and exhaustively eluted with 4.91 methanol. In Koholuat, the products of the resulting products are analyzed analytically as well. After Abdestillioren the solvent remain 31.0 g of a highly viscous, brown residue back (1st crude product). From this, according to an already dargologton method (DD 248364), the C ₂₂ -alcoholo and other undesired Begloitprodukto removed.

Dio in insgesamt 23,5 g dos zweiten Rohproduktes vorbliobenon Mengen on ADD und AD werdon wiederum analytisch bestimmt.Dio in a total of 23.5 g of the second crude product vorbliobenon amounts of ADD and AD werdon again determined analytically.

Die entsprechenden Werto sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.The corresponding values are summarized in the table below.

Anal. WorteAnal. words I.RohproduktI.Rohprodukt 2. Rohprodukt2. crude product (Endprobo)(Endprobo) g/ig / i 99 gG MasseDimensions 23,523.5 ADDADD 7,77.7 20,120.1 19,819.8 ADAD 0,90.9 1,71.7 1,61.6 1,4-C₂₂-AIk.1,4-C ₂₂ -AIk. 0,960.96 2,32.3 --

Die im ersten Rohprodukt erreichte analytische Produktbildungsrato für ADD beträgt danach 2,12 g ADD/I χ 24 h, der AD-Anteil 7,8%.The analytical Produktbildungsrato for ADD reached in the first crude product is then 2.12 g ADD / I χ 24 h, the AD content 7.8%.

Der nach der C₂₂-Alkohol-Abtrennung verbleibende braune, hochviskose Rückstand wird unter Erwärmen in '/7 der der analytisch bestimmten Gesamtmenge an ADD und AD entsprechenden Menge Butylacetat gelöst. Unter Rühren und gleichzeitiger Zugabe der gleichen Menge an Cyclohexan kristallisiert das ADD/AD-Gomisch beim Erkalten zu einem dicken Kristallbrei aus. Nach Verdünnen mit Cyclohoxan-Diothylether (1:1) werden die Kristalle abgesaugt, mit dem gloichon Lösungsmittolgomisch gewaschen und anschließend getrocknet.The remaining after the C ₂₂ alcohol separation brown, highly viscous residue is dissolved with heating in '/ 7 of the analytically determined total amount of ADD and AD corresponding amount of butyl acetate. With stirring and simultaneous addition of the same amount of cyclohexane, the ADD / AD gomic crystallizes on cooling to a thick crystal pulp. After dilution with cyclohoxane di-ethyl ether (1: 1), the crystals are filtered off with suction, washed with the gloichon solvent and then dried.

Es werden 16,9g Kristalle erhalten, die 90% ADD und weniger als 1 % AD enthalten. Die Ausbeute an kristallisiertem ADD beträgt 77,5%. Die präparative Gesamtausbeute an ADD, bezogen auf umgesetztes Sterol, liegt boi 39% (56,6% d. Th.).16.9g of crystals are obtained containing 90% ADD and less than 1% AD. The yield of crystallized ADD is 77.5%. The total preparative yield of ADD relative to converted sterol is 39% (56.6% of theory).

Example 4

Die Anzucht von Mycobacterlum vaccae ZIMET11094 bis zur ersten Submerskultur erfolgt analog zu Beispiel 1.The cultivation of Mycobacterium vaccae ZIMET11094 until the first submerged culture is carried out analogously to Example 1.

Die zweite Submerskultur wird in einem gerührten und belüfteten Edolstahl-Glas-Fermentor mit 4,51 Bruttovolumen fermentiert.The second submerged culture is fermented in a stirred and ventilated Edolstahl Glass Fermentor of 4.51 gross volume.

Das Nährmedium der zweiten Submerskultur hat folgende Zusammensetzung:The nutrient medium of the second submersed culture has the following composition:

10g Glukose, 20g Hefeextrakt; 0,5g KH₂PO₄0,5g K₂HPO₄; 1,5g (NH₄I₂HPO₄; 0,2g MgSO₄ · 7H₂O; 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ · 7H₂O; Aqua dest. ad 1000ml; pH7,2.10g glucose, 20g yeast extract; 0.5 g KH ₂ PO ₄ 0.5 g K ₂ HPO ₄ ; 1.5 g (NH ₄ I ₂ HPO _4; 0.2 g MgSO ₄ · 7H ₂ O 0.01 g FeSO ₄ · 7H ₂ O; 0,002g ZnSO ₄ .7H ₂ O; Distilled water ad 1000 ml;. PH 7.2 ,

2 Liter dieses Nährmediums werden mit 200ml der ersten Submerskultur beimpft.2 liters of this nutrient medium are inoculated with 200 ml of the first Submerskultur.

Nach der Beimpfung wird bei einer Prozeßtemperatur von 31 °C dio rel? ο Gelöstsauerstoffsättigung als pO₂-Wert in der gerührten und belüfteten Fermentationsbrühe als 100-%-Wert geeicht, /.is Regelschwelle für den pO₂-Wert werden 75% eingestellt. Die Basisdrehzahl beträgt 500U · min"' bei unterbrochener Luftzufuhr. Bei Unterschreitung der pO₂-Regelschwelle wird die Drehzahl auf 650U min"¹ erhöht, gleichzeitig der Zuluftweg geöffnet und der Ansatz mit einer Luftmenge vonAfter inoculation at a process temperature of 31 ° C dio rel? ο dissolved oxygen saturation is calibrated as pO ₂ value in the stirred and aerated fermentation broth as 100% value, and the control threshold for the pO ₂ value is set to 75%. The basic speed is 500U · min "'when the air supply is interrupted.When the pO ₂ control threshold is undershot, the speed is increased to 650 rpm" ¹ , at the same time the supply air path is opened and the intake with an air quantity of

11 · Γ¹ · min"¹ belüftet. Die Anzahl der parallel erfolgenden Zuschaltungen von Rührung und Belüftung je Zeiteinheit wird elektronisch gezählt und als Meßgröße für die Bestimmung der relativen O₂-Verbrauchsrate benutzt.11 · Γ ¹ · min " ^1. The number of simultaneous activation and ventilation per unit time is counted electronically and used as a parameter to determine the relative O ₂ consumption rate.

Nach 40 bis 41 Fermentationsstunden fällt dieser Wert auf ca. Vw des Maximalwertes; gleichzeitig ist eine Alkalisierung um etwa ΔρΗ = 0,4 zu beobachten. Die Kultivierung der Impfkultur wird nach 41 Stunden beendet.After 40 to 41 fermentation hours, this value drops to approximately Vw of the maximum value; at the same time an alkalization is observed by about ΔρΗ = 0.4. Cultivation of the seed culture is stopped after 41 hours.

Zur Steroltransformation wird ein Edelstahl-Glas-Rührfermentor mit 4,51 Bruttovolumen mit 500ml der zweiten Submerskultur beimpft. Die Zusammensetzung der Nährlösung ist analog zu der in Beispiel 1 angegebenen.For sterol transformation, a 4.51 gross volume stainless steel glass stirred fermentor is inoculated with 500 ml of the second submerged culture. The composition of the nutrient solution is analogous to that given in Example 1.

Die technische Durchführung der Fermentation orfolgt analog zu Beispiel 1. Dabei wird kein weiteres Sterol nachdosiert. Die Fermentation wird nach 70 Stunden beendet.The technical implementation of the fermentation is analogous to Example 1. In this case, no further sterol is added. The fermentation is stopped after 70 hours.

Dio orziolton Er (iebnisso are listed in the following table.

Anal. WorteAnal. words I.RohproduktI.Rohprodukt 2. Rohprodukt2. crude product (Endprobo)(Endprobo) g/ig / i gG gG MassoMasso -- 22,622.6 ADDADD 7,57.5 21,121.1 19,819.8 ADAD 0,60.6 1,71.7 1,71.7 1,4-C₂₂-AIk.1,4-C ₂₂ -AIk. 0,80.8 3,13.1

Dio Im ersten Rohprodukt erroichte analytische Produk'.bildungsrate für ADD beträgt danach 2,89g.ADD - Γ¹ 24h ',der AD-Antoil /,46%.Die weitero Aufarbeitung wird analog zu Beispiel 3 fortgeführt. Es worden danach 17,4g Kristalle erhalten, die 96,6% ADD und wenigor als 1 % AD enthalten. Dio Ausbouto der Kristallisation an ADD beträgt 85%. Die präparative Gosamtausbeute, bozogen auf umgesetztes Storol, liegt bei 49,4Gew.-%, entsprechend 71,6% d. Th.The analytical product production rate for ADD in the first crude product is 2.89 g.ADD - Γ ¹ 24h ', the AD antoel / .46%. Further processing is continued analogously to Example 3. Thereafter, 17.4 g of crystals were obtained containing 96.6% ADD and less than 1% AD. Dio Ausbouto of crystallization on ADD is 85%. The preparative Gosamtausbeute, booge on reacted Storol, is 49.4Gew .-%, corresponding to 71.6% d. Th.

In Betracht gezogene Druckschriften: DD 279901 DD 277697 DD 291342 DD 291341Documents considered: DD 279901 DD 277697 DD 291342 DD 291341

Claims

1. A method for the microbial degradation of sterols to Androst2-1.4-diene-3,17-dione (ADD) by incubation of the microorganism strain Mycobacterium vaccae ZIMET 11094 under aerobic conditions in the fermentation stages preculture and submerged main culture, characterized in that one Main culture fermentation medium per se known composition each inoculated with a seed culture of said strain, which is taken from a preculture, in which a pH change in the direction of alkalization of at least ΔρΗ = 0.3 as an expression of the occurrence of limitations both on freely recoverable carbon - as well as freely usable nitrogen sources.

2. The method according to claim 1, characterized in that one inoculates a fermentation medium of the above-mentioned specification with a seed culture of M. vaccae ZIMET1 iO94, which is taken from a preculture, after in this a pH change of the above nature as an expression of the occurrence of a carbon Imitation occurred before a nitrogen limitation.

3. The method according to claim 2, characterized in that one inoculates a fermentation medium of the above-mentioned specification with a seed culture of M. vaccae ZIMET 11094, which is taken from a preculture, after in this a pH change above texture as an expression of the achievement of a the relations

Concentration of free carbon source Ss 0.1 g / l and

- concentration of free nitrogen source S 1.0% of the maximum usable amount of nitrogen characterized system state has occurred.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that inoculated a fermentation medium of the above-mentioned specification with a seed culture of M. vaccae ZIMET11094, which is taken from a preculture, in which in addition to the pH change of the above nature, a reduction in oxygen consumption on ai 2.0% of the maximum value has occurred.