DD298275A5 - PROCESS FOR REPRESENTING PROTEIN A - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von chemisch reinem Protein A, vornehmlich aus Kulturfiltraten von Fermentationsbruehen bakterieller Produzenten dieses Proteins. Als Anwendungsgebiete des verfahrensgemaesz hergestellten Produkts kommen die Biotechnologie (z. B. Isolierung von Antikoerpern) sowie die Humanmedizin (Therapeutikum; Diagnostikum) in Betracht. Die Erfindung verfolgt das Ziel, fuer diese Verwendungszwecke chemisch reines Protein A bereitzustellen. Die dieser Zielstellung zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem man in einem 3-Schritt-Verfahren mit den Stufen{Gewinnung von chemisch reinem Protein A; bakterielle Produzenten; Kulturfiltrate von Fermentationsbruehen; 3-Schritt-Verfahren; Einsatz von Trichloressigsaeure; UEberstand; Ammoniumsulfat-Zugabe; Dialyse; Lyophilisation}The invention relates to a process for the production of chemically pure protein A, primarily from culture filtrates of fermentation broths of bacterial producers of this protein. Areas of application of the product manufactured according to the method are biotechnology (eg isolation of antibodies) as well as human medicine (therapeutic, diagnostic). The invention aims to provide chemically pure protein A for these uses. The object assigned to this objective is achieved by performing in a 3-step process with the steps {extraction of chemically pure protein A; bacterial producers; Culture filtrates of fermentation broths; 3-step method; Use of trichloroacetic acid; Got over; Ammonium sulfate addition; Dialysis; lyophilization}
Description
zelluläres Protein, welches spezifisch Immunglobuline vom IgG-Typ an ihrem jeweiligen Fc-Abschnitt (Fc- fragment crystalline)zu binden vermag.cellular protein capable of specifically binding immunoglobulins of the IgG type at their respective Fc portion (Fc fragment crystalline).
kovalent gebundenes Protein A Antikörper - auch monoklonal - zu isolieren. Schließlich liegen auch Ansätze zurtherapeutischen Nutzung von trägerfixiertem Protein A bei Autoimmun-Erkrankungen vor.covalently bound protein A antibodies - also monoclonal - to isolate. Finally, there are also approaches for the therapeutic use of carrier-fixed protein A in autoimmune diseases.
verfahrensgemäß hergestellten Produkts kommen die Biotechnologie (z. B. bei der Isolierung von Antikörpern) sowie dieIn accordance with the product produced by biotechnology (eg in the isolation of antibodies) as well as the
Verfahren zur Herstellung von Protein Asind seit 1971 bekannt (siehe A. Arvidson et al., ActaPathol.Microbiol.Scand., 798,1971, 399). Als native Protein Α-Bildner wurden hierbei Staphylococcus aureus-Stämme eingesetzt, und zwar zunächst solche Produzenten, in denen das Produkt nahezu vollständig zellwandgebunden vorliegt. Sehr bald konnte für die Biosynthese aber auch S. aureus-Stammaterial eingesetzt werden, welches das Protein A in das Kulturmedium sezerniert (A. Forsgren et al., J. Bacteriol. 107,1971,245; G.Masuda et al., Infect. Immun. 2,1975,245).Process for the production of protein Asind has been known since 1971 (see A. Arvidson et al., ActaPathol. Microbiol. Scand., 798, 1971, 399). Staphylococcus aureus strains were used as native protein Α-formers, first of all those producers in which the product is almost completely cell wall-bound. Very soon, however, it was also possible to use for the biosynthesis S. aureus parent material which secretes the protein A into the culture medium (A. Forsgren et al., J. Bacteriol., 107, 1971, 245, G. Matasuda et al., Infect Immun., 2, 1975, 245).
M't der Arbeit von S. Löfdahl, M. Uhlen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80,1983,697 wurde erstmals ein Verfahren bekannt gemacht, in dem rokombinante Mikroorganismen-Stämme, und zwar zunächst E. coll-Stämme, zur mikrobiellen Herstellung von Protein A herangezogen worden sind. Inzwischen sind jedoch auch weitere Verfahrenslösungen zur Produktion dieser Substanz unter Rückgriff auf rekombinante Bakterienstämme, so unter Rückgriff auf Bacillus subtills-Stämme, angegeben worden (S. R. Fahnenstock & K. E. Fisher, Appl. Envir. Microbiol., 53,1987,379).M't the work of S. Löfdahl, M. Uhlen et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA, 80,1983,697, a method was first disclosed in which rokombinante microorganism strains, and initially E. coli strains, have been used for the microbial production of protein A. However, other process solutions for the production of this substance have also been reported by recombinant bacterial strains using Bacillus subtill strains (S.R. Fahnenstock & K.E. Fisher, Appl.Envir.Microbiol., 53, 19887, 379).
In allen bisherigen Verfahren zur Gewinnung von Protein A werden im Aufarbeitungs- bzw. Reinigungsabschnitt ausschließlich affinitätschromatographische Methoden verwendet, wobei die Zielsubstanz an Gamma-Globulin, jeweils fixiert an einen festen Träger, im Neutralbereich gebunden wird und anschließend durch Aziditätserniedrigung aufwerte um pH 3,0 eluiert wird (Feinreinigung mittels Affinitätschromatographie an immobilisiertem Gamma-Globulin).In all previous methods for obtaining protein A, exclusively affinity chromatographic methods are used in the work-up or purification section, the target substance being bound to gamma-globulin, each fixed to a solid support, in the neutral range and subsequently raised to pH 3.0 by lowering the acidity eluted (fine purification by means of affinity chromatography on immobilized gamma-globulin).
Diese Aufarbeitungslösungen sind vergleichsweise uneffekf/, da die in ihnen benutzten Träger erst nach einer speziellen Modifizierung, d. h. nach einem Aktivtorungsschritt, einsetzbar sind, weiterhin lediglich eine beschränkte Lebensdauer aufweisen, schwer zu sterilisierer: sowie durch bakterielle Verunreinigungen zerstörbar sind. Außerdem ist ihreThese work-up solutions are comparatively uneffective, since the carriers used in them only undergo a special modification, i. H. can be used after a Aktivtorungsschritt, continue to have only a limited life, difficult to sterilizer: and are destructible by bacterial contaminants. Besides, theirs
Bindungskapazität nicht sehr hoch (1 mg Gamma-Qlobulin kann theoretisch nur 0,3mg Protein A binden; nach der Immobilisierung des Globulins kann häufig nur noch ein Bruchteil dieser theoretischen Kapazität genutzt werden), und bei wiederholter Verwendung der Träger ist ein beständiger Schwund ihrer Bindungskapazität zu registrieren. Weiterhin sind bislang keine 3-Schritt-Aufarbeitungsprozeduren mit den StufenBinding capacity is not very high (1 mg gamma-globulin can theoretically bind only 0.3 mg protein A, after immobilization of the globulin often only a fraction of this theoretical capacity can be used), and with repeated use the carrier is a constant loss of its binding capacity to register. Furthermore, so far there are no 3-step processing procedures with the stages
- Abtrennung eines Rohprodukts aus einer Ausgangslösung durch Bindung an ein Adsorbermaterial,Separation of a crude product from a starting solution by binding to an adsorbent material,
- Ablösung des Zielprodukts vom beladenen Adsorber unter Einsatz von wenigstens einem · ι ganischen Lösungsmittel sowie- separation of the target product from the laden adsorber using at least one · ι ganic solvent, and
- Isolierung von reinem Protein A aus den erhaltenen Eluaten- Isolation of pure protein A from the resulting eluates
bekannt, bei denen in der letzten Stufe Einzelverfahren angewendet werden, welche in markanter Weise von Besonderheiten im Löslichkeitsverhalten von Protein A (im Vergleich zu dem anderer bisher untersuchter Proteine) ausgehen.In the last stage, individual methods are used which emanate markedly from peculiarities in the solubility behavior of protein A (in comparison to other proteins investigated so far).
Die Erfindung verfolgt das Ziel, für die erwähnten Verwendungzwecke chemisch reines Protein A in effektiver Weise herzustellen.The invention aims to produce chemically pure protein A in an effective manner for the mentioned uses.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein physikalisch-chemisches Aufarbeitungsverfahren zu beschreiben, mit dem aus Protein A-haltigen Ausgangslösungen in technologisch unkomplizierter Weise ein chemisch reines Zielprodukt gewonnen werden kannThe invention has for its object to describe a physico-chemical work-up, can be obtained with the protein-containing starting solutions in a technologically straightforward manner, a chemically pure target product
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug in einem 3-Schritt-Verfahren mit den Stufen According to the invention this object is in its basic feature in a 3-step process with the stages
- Abtrennung eines Rohprodukts aus Ausgangslösungen obiger Kennzeichnung, vornehmlich aus Kulturfiltratcn von Fermentationsbrühen bakterieller Protein Α-Produzenten, durch Bindung an ein Adsorbormaterial,Separation of a crude product from starting solutions of the above labeling, mainly from culture filtrates of fermentation broths of bacterial protein Α producers, by binding to an adsorbent material,
- Ablösung des Zielprodukts vom beladenen Adsorber unter Einsatz von wenigstens einem organischen Elutionsmittol sowie- Replacement of the target product from the loaded adsorber using at least one organic eluent and
- Isolierung von hochreinem Protein A aus den erhaltenen EluatenIsolation of high purity protein A from the obtained eluates
in der Weise gelöst, daß den im Mittelabschnitt der Gesamtprozedur gewonnenen Eluaten in der letzten Verfahrensstufe zunächst Trichloressigsäure zugesetzt und der nach Abschluß der (nach dieser Zugabe einsetzenden) Fällungsreaktion entstehende Niederschlag abgetrennt wird. Aus dem nach diesem Abtrennschritt verbloibonden Überstand wird anschließend durch Zugabe von Ammoniumsulfat (Teilschritt a), durch Dialyse des hierbei erhaltenen Präzipitats gegen Ammoniumbikarbonat-Puffer (Teilschritt b), gefolgt von einer Lyophilisation (Teilschritt c), dann chemisch reines Protein A isoliert.solved in such a way that trichloroacetic acid added to the eluates obtained in the middle section of the overall procedure in the last stage of the process and the precipitate formed after completion of the precipitation reaction (after this addition) is separated. From the supernatant which has been removed after this separation step, chemically pure protein A is then isolated by adding ammonium sulfate (substep a), dialyzing the resulting precipitate against ammonium bicarbonate buffer (substep b), followed by lyophilization (substep c).
Das voranstellend offenbarte Aufarbeitungsverfahren zu chemisch reinem Zielprodukt stützt sich auf den überraschenden Befund, daß Protein Avon wäßrigen Lösungen der allgemein als Eiweiß· und Proteinfällungsmittel bekannten Halogenfettsäure Trichloressigsäure (CCI3COOH) im Unterschied zu allen anderen bisher untersuchten Proteinen nicht zur Sedimentation gebracht worden kann. Die letzte Stufe des o.g. 3-Schritt-Verfahrens hat zuzüglich zur Entfernung der zuvor eingesetzten Elutionsmittel die Abtrennung eventuell noch verbliebener Fremdprotein-Restverunreinigungen zu leisten. Zu diesem Zweck kann in der offenbarten Weise vorteilhaft auf Trichloressigsäure-Zusätze zurückgegriffen werden, denn im Ergebnis des beschriebenen Aufarbeitungsverfahrens wird das Zielprodukt Protein A als weiße Substanz erhalten, welche in der SDS-Elektrophorese eine Bande für ein relatives Molekulargewicht von ca. 50000 zeigt (also frei von Verunreinigungen ist). Die bevorzugten Ausftihrungsformen der Erfinduno sinci zusätzlich zunächst dadurch gekennzeichnet, daß den im Mittelabschnitt der gesamten Aufarbeitungsvorschrift gewonnenen Eluaten in der letzten Verfahrensstufe unter Rühren und/ oder Schütteln Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2% bis 5% zugesetzt wird; dabei kann frühestens 30 Minuten nach Prozeßanfang mit der Abtrennung des sich bildenden Niederschlags begonnen werden. Aus den jeweils verbleibenden Überständen wird anschließend gemäß dem oben dargelegten Schlußschritt (Ammoniumsulfat-Zugabe, gefolgt von einer Dialyse gegen Ammoniumbikarbonat-Puffer und einer Lyophilisation) das chemisch reine Zielprodukt erhalten. Gute Aufarbeitungsergebnisse konnten insbesondere dann erreicht werden,The above-disclosed work-up procedure to chemically pure target product is based on the surprising finding that protein Avon aqueous solutions of the generally known as protein and protein precipitating halogenated fatty acid trichloroacetic acid (CCI 3 COOH), unlike all other proteins studied so far, can not be sedimented. The last step of the above-mentioned 3-step process, in addition to the removal of the previously used eluents, is to separate off any remaining foreign protein residual impurities. For this purpose, trichloroacetic acid additives can advantageously be used in the manner disclosed, since the result of the work-up procedure described gives the target product protein A as a white substance which shows a band for relative molecular weight of about 50,000 in SDS electrophoresis ( so is free of impurities). The preferred Ausftihrungsformen the Erfinduno sinci addition initially characterized in that the obtained in the central portion of the entire working-up procedure eluates in the last process stage to a final concentration of 2% to 5% was added with stirring and / or shaking trichloroacetic acid; It can be started at the earliest 30 minutes after the beginning of the process with the separation of the forming precipitate. From the remaining supernatants, the chemically pure target product is then obtained according to the final step set out above (ammonium sulfate addition, followed by dialysis against ammonium bicarbonate buffer and lyophilization). Good reprocessing results were achieved, in particular,
- wenn den genannten Eluaten Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 5% zugesetzt und dem nach der Fällungsreaktion verbleibenden Überstand Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugegeben sowie das hierbei erhaltene Präzipitat gegen 0,01 M Ammoniumbikarbonat-Puffer dialyisiert bzw.trichloroacetic acid was added to said eluates to a final concentration of 5% and ammonium sulfate was added to the supernatant remaining after the precipitation reaction to a saturation of 70% and the resulting precipitate was dialyzed against 0.01 M ammonium bicarbonate buffer or
- wenn den genannten Eluaten Trrhloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2,5% zugesetzt und dem nach der Fällungsreaktion verbleibenden Überstand Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugegeben sowie das hierbei erhaltene Präzipitat gegen 0.02M Ammoniumbikarbonat-Puffer dialysiertif trifluoroacetic acid was added to said eluates to a final concentration of 2.5% and ammonium sulfate was added to the supernatant remaining after the precipitation reaction to a saturation of 70%, and the resulting precipitate was dialyzed against 0.02M ammonium bicarbonate buffer
wurde.has been.
Weiterhin konnten auffallend gute Aufarbeitungsergebnisse dann erzielt werden, wenn für das verfahrensgemäße Vorgehen auf Protein A-haltige Eluate zurückgegriffen werden kann, die nach dem Verfahren einer prioritätsgleich patentierten Erfindung des Zentralinstituts herstellbar sind. Hierbei wird in der Startstufe des o.g. 3-Schritt-Verfahrens die Protein Α-Fraktion mit weitporigen Kieselgelen (mit Porengrößen im Bereich von 10nm bis 50nm) aus den jeweiligen Ausgangslösungen adsorbiert, und von den beladenen Adsorbentien dieser Spezifität wird, erforderlichenfalls nachdem in einem Waschgang im alkalischen Milieu Fremdproteine eliminiert worden sind, mit einer Lösung eines ein- oder mehrwertigen Alkohols, eines Ketons, eines Amins oder eines Amids für die weitere Aufarbeitung ein Protein A-halliges Rohprodukt eluiert.Furthermore, remarkably good work-up results could be achieved if it is possible to resort to protein A-containing eluates for the process according to the invention, which can be prepared by the process of a patented invention of the central institute with patented priority. This is in the starting stage of o.g. 3-step method, the protein Α fraction adsorbed with wide-pore silica gels (with pore sizes in the range of 10nm to 50nm) from the respective starting solutions, and of the loaded adsorbents of this specificity, if necessary, after in a wash cycle in an alkaline medium foreign proteins have been eliminated , eluted with a solution of a monohydric or polyhydric alcohol, a ketone, an amine or an amide for further processing a protein A-reindeer crude product.
In den einzelnen Schrittan des Verfahrens wurde die Protein Α-Konzentration dabei jeweils mittels Mancini-Technik unter Verwendung eines 0,5% Schweinenormalserum enthaltenden Agars ermittelt.In the individual steps of the process, the protein Α concentration was determined in each case by Mancini technique using an agar containing 0.5% porcine normal serum.
Mit der Anwendung der Erfindung werden zusätzlich zum o.g. Hauptbefund die nachstehenden Vorteile gesehen:With the application of the invention, in addition to the o.g. Main findings seen the following advantages:
- Mit dem dargelegten Verfahren können Protein A-haltige Kulturüberstände bzw. Eluate aller Art (ob trüb, verfärbt oder mit Bakterien verunreinigt) sowie in Volumina aller Größenklassen behandelt werden.- The method described protein A-containing culture supernatants or eluates of all kinds (whether cloudy, discolored or contaminated with bacteria) and in volumes of all sizes can be treated.
- Das verfahrensgemäß hergestellte Protein A ist insbesondare auch so arm an Spaltprodukten dieser Substanz, daß die Nachschaltung einer Gelfiltration nicht erforderlich ist.The protein A prepared according to the method is particularly low in cleavage products of this substance, so that the subsequent activation of gel filtration is not required.
-3- 298 275 Ausführungsbeispiele-3- 298 275 embodiments
40 Liter einer nach Fermentation in Hefedialysat-Pepton-Nährboden erhaltenen Kultur von Staphylococcus aureus Cowan l/M werden zur Abtötung für" ü Minuten auf 80°C erhitzt. Anschließend wird im Separator die Biomasse abgetrennt. In den Protein A-haltigen Kulturüberstand werden 600g trockenes weitporiges Kieselgel der Sortenklassifizierung B1 (Feuchtgewicht 1550g) bei Zimmertemperatur gegeben und für 30 Minuten bis 60 Minuten eingerührt. Nach dem Abstellen des Rührers setzt sich das baladene Kieselgel B1 in ca. 5 Minuten quantitativ ab. Der Überstand wird verworfen; das beladene Kieselgel wird intensiv mit Wasser gewaschen und in ein 6-l-Gefäß (etwa Becherglas o.a.) gegeben. Anschließend wird in 3 Portionen nochmals mit je 2 Liter einer 1%igen Soda-Lösung in 15%igem ethanolischem Wasser bei pH 9,0 ± 0,5 unter Rühren gewaschen. Die Protein A-Gesemtmenge bleibt dabei gebunden.40 liters of a culture of Staphylococcus aureus Cowan I / M obtained after fermentation in yeast dialysate-peptone medium are heated to 80 ° C. for 10 minutes, then the biomass is separated off in the separator, 600 g are added to the protein A-containing culture supernatant dry wide-pore silica gel grade B1 (wet weight 1550g) at room temperature and stirred for 30 minutes to 60 minutes After switching off the stirrer, the Baladene Kieselgel B1 quantitatively settles in about 5 minutes The supernatant is discarded, the loaded silica gel is washed intensively with water and placed in a 6 l vessel (for example beaker or similar), followed by 3 portions again with 2 l of a 1% sodium carbonate solution in 15% strength ethanolic water at pH 9.0 ± 0, 5 with stirring, the protein A-Gesemtmenge remains bound.
Die so erhaltenen 1650g an beladenem, feuchtem, gewaschenem weitporigem Kieselgel obiger Sortenklassifizierung werden mit 5 Liter 0,05 M Glycin in 50%igem Ethylenglykol-Wasser bei pH 10,5 auf einer Fritte eluiert, und der Durchlauf wird in Portionen zu je 500 ml aufgefangen (das Protein A befindet sich hierbei in den Eluaten 2 bis 5, die anschließend vereinigt werden). Zu 100ml des so erhaltenen Glykoeluats, welches 0,4mg/ml Protein A enthielt, wird Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 5% zugesetzt. Der anfallende Niederschlag wird abzentrifugiert und verworfen. Der Überstand wird mit Wasser auf das 4fache Volumen verdünnt, sein pH-Wert danach auf pH 5,1 eingestellt und dieser Lösung Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugesetzt. Das Präzipitat wird nach 24 Stunden bei 4°C zentrifugiert, in 10ml 0,01 M Ammoniumbikarbünat aufgenommen sowie gegen diesen Puffer gemäß Standardverfahren dialysiert. Nach einer abschließenden Lyophilisation erhält man 30mg Protein A. Das Produkt war SDS-elektrophoretisch einheitlich bei einem relativen Molekulargewicht von ca. 50000.The thus obtained 1650 g of loaded, wet, washed wide-pore silica gel of above grade classification are eluted with 5 liters of 0.05 M glycine in 50% ethylene glycol water at pH 10.5 on a frit, and the run is carried out in 500 ml portions collected (the protein A is here in the eluates 2 to 5, which are then combined). To 100 ml of the thus-obtained glycoeluate containing 0.4 mg / ml of protein A is added trichloroacetic acid to a final concentration of 5%. The resulting precipitate is centrifuged off and discarded. The supernatant is diluted to four times its volume with water, its pH is then adjusted to pH 5.1, and ammonium sulfate is added to this solution to a saturation of 70%. The precipitate is centrifuged after 24 hours at 4 ° C, taken up in 10 ml of 0.01 M Ammoniumbikarbünat and dialyzed against this buffer according to standard procedures. After a final lyophilization, 30 mg of protein A are obtained. The product was SDS-electrophoretically uniform at a relative molecular weight of about 50,000.
100g beladenes, feuchtes Kieselgel B1, welches wie in Beispiel 1 gewonnen worden war und an das 0,29g Protein A gebunden100g loaded, wet silica gel B1, which had been obtained as in Example 1 and bound to the 0.29 g protein A.
sind, werden mit 3 Portionen (zu je 100ml) 0,1 M Glycin-Puffer; pH 2,0; enthaltend 6M Harnstoff, ausgerührt; und die Überständewerden vereinigt.are, with 3 portions (100ml each) 0.1 M glycine buffer; pH 2.0; containing 6M urea, stirred; and the supernatants are combined.
3fache Volumen Ammoniumsulfat bis zur 70%igen Sättigung zugegeben. Das hierbei entstandene Protein A-haltige Präzipitatwird gegen 0,02 M Ammoniumbikarbonat dialysiert. Nach der abschließenden Lyophilisation wurden 206mg chemisch reines3 times the volume of ammonium sulfate added to 70% saturation. The resulting protein A-containing precipitate is dialyzed against 0.02M ammonium bicarbonate. After the final lyophilization 206mg became chemically pure
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD34415788A DD298275A5 (en) | 1988-05-30 | 1988-05-30 | PROCESS FOR REPRESENTING PROTEIN A |
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| DD298275A5 true DD298275A5 (en) | 1992-02-13 |
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ID=5620509
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| DD34415788A DD298275A5 (en) | 1988-05-30 | 1988-05-30 | PROCESS FOR REPRESENTING PROTEIN A |
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|---|---|
| DD (1) | DD298275A5 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
-
1988
- 1988-05-30 DD DD34415788A patent/DD298275A5/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
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