DD294568A5

DD294568A5 - METHOD FOR DETERMINING C REACTIVE PROTEIN

Info

Publication number: DD294568A5
Application number: DD33081089A
Authority: DD
Inventors: Wolf Buerger; Erika Ritter
Original assignee: Humboldt-Universitaet,Direkt. F. Forsch.,De; Humboldt-Universitaet,Bereich Medizin (Charite),De
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1989-07-14
Publication date: 1991-10-02

Abstract

Beschrieben wird ein neuartiges Verfahren zur labordiagnostischen Bestimmung von C-reaktivem Protein mittels Agglutinationsreaktion, das dadurch gekennzeichnet ist, dasz mit einem Liganden konjugierte Teilchen-Suspensionen durch C-reaktives Protein (CRP) und Antikoerper gegen CRP agglutiniert werden. Das CRP besitzt Bindungszellen fuer den Liganden. Als Teilchen werden vorwiegend Latexsuspensionen, als Liganden Phosphorylverbindungen, als Antikoerper spezifische poly- bzw. monoklonale Antiseren benutzt. Die Konstruktion des Tests bewirkt, dasz falsch positive Reaktionen, wie sie bei herkoemmlichen Agglutinationstesten durch Rheumafaktoren (Autoantikoerper gegen IgG) stattfinden, nicht mehr vorkommen koennen. Weiterhin ist die Konstanz der Reaktanden bei Lagerung verbessert. Die Erfindung ist im Labormaszstab erprobt.{C-reaktives Protein; CRP; Konzentrationsbestimmung; Agglutination; Latex; Ligand; Phosphorylverbindung; labordiagnostische Bestimmung}A novel method for laboratory diagnosis of C-reactive protein by means of an agglutination reaction is described, which is characterized in that ligand-conjugated particle suspensions are agglutinated by C-reactive protein (CRP) and antibodies to CRP. The CRP has binding cells for the ligand. As particles predominantly latex suspensions are used, as ligands phosphoryl compounds, as antibodies specific poly- or monoclonal antisera. The construction of the test causes false positive reactions, such as those that occur in conventional agglutination tests by rheumatoid factors (autoantibodies to IgG), to no longer occur. Furthermore, the constancy of the reactants in storage is improved. The invention has been tested in the laboratory scale. {C-reactive protein; CRP; Concentration determination; Agglutination; Latex; ligand; phosphoryl; laboratory diagnostic determination}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an C-reaktivem Protein (CRP) mittels Agglutinationsreaktion. Es können sowohl semiquantitative Teste (Tropfentest auf Glasplatte) als auch quantitative Messungen (Trübungsmessungen mit Eichkurve) durchgeführt werden. Die Konzentration des CRP im Serum und anderen Körperflüssigkeiten erhöht sich bei bakteriellen Infektionen, Verletzungen, nach chirurgischen Eingriffen, Verbrennungen, Gewebsuntergängen.The invention describes an improved method for the determination of the content of C-reactive protein (CRP) by means of agglutination reaction. Both semiquantitative tests (drop test on glass plate) and quantitative measurements (turbidity measurements with calibration curve) can be carried out. The concentration of CRP in the serum and other body fluids increases with bacterial infections, injuries, after surgery, burns, tissue subsidence.

Durch die Bestimmung der Konzentration des CRP erhält der Kliniker Hinweise auf den Zustand des Patienten, da bei Gesundung Normalwerte erreicht werden. Hauptsächliche Anwendungen sind z. Z. Erkennen und Beurteilen von Heilungsverläufen nach chirurgischen Eingriffen und Verletzungen, Sepsis bei Neugeborenen, Nachwois von Infarkten und Nekrosen, Zustand bei chronischen Entzündungen, Verläufe und Differentialdiagnose bei akuten bakteriellen und viralen Infektionen. Anwendungsgebiet ist daher die klinische Laboratoriumsdiagnostik.By determining the concentration of the CRP, the clinician receives information about the condition of the patient, since normal values are reached when recovering. Main applications are z. Z. Recognition and assessment of healing progress after surgical procedures and injuries, neonatal sepsis, post-infarction and necrosis, condition of chronic inflammation, course and differential diagnosis in acute bacterial and viral infections. The field of application is therefore clinical laboratory diagnostics.

Characteristic of the known state of the art

Agglutinationstechniken besitzen den Vorzug einfacher Testdurchführung sowie kurzer Reaktionszeiten. Diese Methoden werden in der Regel mit Teilchen (Latexpartikel bzw. Erythrozyten) durchgeführt, an deren Oberfläche adsorptiv oder kovalent Antikörper gegen das zu bestimmende Antigen gebunden worden sind. Zur Agglutination während des Tests kommt es durch Bindung der Antikörper verschiedener Teilchen an ein Antigen. Die ersten Agglutinationsteste waren Methoden zur Bestimmung von Rheumafaktoren (a- IgG -Autoantikörper), bei denen Teilchen mit IgG (nativ oder aggregiert) an der festen Phase durch erhöhte Rheumafaktortiter in den Proben spontan aggregiert wurden. Diese Reaktion ist natürlich nicht abhängig von der Spezifität der Antikörper, daher ist diese Fehlerquelle falsch positiver Reaktionen bei diesen Testen immer vorhanden. Die beschriebene Problematiktritt vor allem auf bei Patienten mit Autoimmunkrankheiten und Infektionen. Da dies der Patientenkreis ist, bei dem die CRP - Bestimmung von besonderem Interesse ist, sind RF - unabhängige Bestimmungstechniken wünschenswert. Auf diese Fragen (CRPbei hohen RF-Titern) gehen ein: J. Highton u. P. Hessian in J. Immunol. Meth. 88 [1984], 185-192, K. Norregard-Hansen, J. Hangaard u. B. A. Norgaard-Pedersen in Scand. J. din. Lab. Invest. 44 (1984], 99-103, J. Sjöquist u. A.Larsson in CMn. Chem. 34 [1988], 767-769, M.Mirshaki, J. Soria u. C. Soria in Thromb. Res. 44 (1986), 71E-127.) Nun ergibt sich durch das Prinzip der Ligandbindung, vergl. hierzu die Patente DD-WP 259045 und DD-WP 259046, die Möglichkeit, Unspezifitäten bei der CRP-Bestimmung zu vermeiden, indem auf Antikörper an der festen Phase verzichtet wird. Es zeigte sich jedoch, daß die einfache Übertragung der Anwendung von Ligand-Träger-Konjugaten, wie sie in den Patenten beschrieben ist, nicht möglich ist. Dadurch wird es notwendig, ein völlig neues Prinzip der Ligandbindung ^u finden und zu entwickeln, das in diesem Papier dargestellt wird.Agglutination techniques have the advantage of simple test execution and short reaction times. These methods are usually carried out with particles (latex particles or erythrocytes), on whose surface adsorptive or covalent antibodies have been bound against the antigen to be determined. Agglutination during the assay occurs by binding the antibodies of different particles to an antigen. The first agglutination tests were methods for the determination of rheumatoid factors (a-IgG autoantibodies) in which particles with IgG (native or aggregated) on the solid phase were spontaneously aggregated in the samples by increased rheumatoid factor titers. Of course, this reaction is not dependent on the specificity of the antibodies, so this source of false positive reactions is always present in these assays. The described problem occurs mainly in patients with autoimmune diseases and infections. Since this is the group of patients for whom CRP determination is of particular interest, RF - independent detection techniques are desirable. These are questions (CRPs with high RF titers): J. Highton et al. P. Hessian in J. Immunol. Meth. 88 [1984], 185-192, K. Norregard-Hansen, J. Hangaard et al. B. A. Norgaard-Pedersen in Scand. J. din. Lab. Invest. 44 (1984), 99-103, J. Sjöquist and A.Larsson in CMn Chem 34 [1988], 767-769, M.Mirshaki, J. Soria and C. Soria in Thromb Res. 1986), 71E-127.) Now, the principle of ligand binding, see, for example, the patents DD-WP 259045 and DD-WP 259046, the opportunity to avoid unspecificities in the CRP determination by antibodies to the solid Phase is omitted. However, it has been found that the facile transfer of the use of ligand-carrier conjugates as described in the patents is not possible. This makes it necessary to find and develop a completely new principle of ligand binding, which is presented in this paper.

Die Konstruktion des Tests gewährleistet, daß die Ergebnisse konstant richtig bleiben bei längerer Lagerung der Teilchen-Konjugate, da das kontinuierliche Abgeben der adsorptivoder kovalent gebundenen Antikörper von derTeilchenoberfläche, wie beim herkömmlichen Verfahren, nicht vorkommen kann.The design of the assay ensures that the results remain consistently correct with prolonged storage of the particle conjugates since the continuous release of the adsorptively or covalently bound antibodies from the particle surface can not occur as in the conventional process.

Die verwendeten Teilchen-Ligand-Konjugate werden aus Latexsuspensionen und Liganden gebildet, zu denen CRP eine oder mehrere Bindungsstellen besitzt. Geeignete Liganden sind Phosphorylverbindungen, wenn sie mit der Phosphorylcholinbindungsstelle des CRP reagieren können. Die Antikörper gegen CRP sind in spezifischen poly- bzw. monoklonalen Antiseren enthalten.The particle-ligand conjugates used are formed from latex suspensions and ligands to which CRP has one or more binding sites. Suitable ligands are phosphoryl compounds if they can react with the phosphorylcholine binding site of the CRP. The antibodies against CRP are contained in specific poly- or monoclonal antisera.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, die labordiagnostische Bestimmung der Konzentration von C-reaktivem Protein zu verbessern und die Nachteile der bisherigen Agglutinationstechniken, insbesondere bei Problemseren, durch ein neues Reaktionsprinzip zu vermeiden.The aim of the invention is to improve the laboratory diagnostic determination of the concentration of C-reactive protein and to avoid the disadvantages of the previous agglutination techniques, especially in problem areas, by a new reaction principle.

-2- 294 568 Darlegung des Wesens der Erfindung-2- 294 568 Presentation of the Essence of the Invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von C-reaktivem Protein zu entwickeln. Hierbei sollen vor allem die Nachteile der existierenden Agglutinationsteste vermieden werden, die vor allem bei Problemseren existieren. Derartige Problemseren sind in erster Linie Seren von Patienten mit Autoimmunkrankheiten und Infektionen, da diese oftmals erhöhte Konzentrationen an Rheumafaktoren (Autoantikörper mit Reaktivität gegen IgG) bzw. unspezifisch reagierende Antikörper besitzen, die zu falsch positiven Agglutinationsreaktionen Anlaß geben. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein neues Prinzip der A ^glutinationsreaktion entwickelt und angewendet wurde. Hierbei werden bei der Reaktion Latex-Teilchen eingesetzt, an die natürliche Liganden mit Bindungsaffinit.it gegen CRP angekoppelt worden sind. Der Test beruht darauf, daß zu einer Suspension dieser konjugierten Teilchen Antikörper gegen das CRP in die Testlösung gegeben werden und diese Mischung als eigentliche Reagenzlösung benutzt wird. Bei Zugabe einer CRP-haltigen Lösung kommt es zu gleichzeitiger Bindung des CRP an die Teilchen-Konjugate und Vernetzung über die Antikörper in Lösung.The object of the invention is to develop a new method for determining the concentration of C-reactive protein. Here, especially the disadvantages of the existing agglutination tests are to be avoided, which exist especially in problem areas. Such problems are primarily sera from patients with autoimmune diseases and infections, as they often have elevated levels of rheumatoid factors (autoantibodies with reactivity to IgG) or non-specifically reactive antibodies, which give rise to false-positive agglutination reactions. According to the invention the object has been achieved in that a new principle of the A ^ glutinationsreaktion was developed and applied. In this reaction, latex particles are used in the reaction, to which natural ligands have been coupled with binding affinity to CRP. The test is based on adding antibodies to the CRP to the test solution in a suspension of these conjugated particles and using this mixture as the actual reagent solution. Addition of a CRP-containing solution results in simultaneous binding of the CRP to the particle conjugates and crosslinking via the antibodies in solution.

Dieses Verfahren unterscheidet sich grundlegend von bisherigen Methoden, bei denen die Antikörper an die Teilchen gebunden werden und die Vernetzung durch Mehrfachbindung an das in Lösung vorhandene Protein erfolgt. Als Anwendungsverfahren stehen in erster Linie die Latexagglutination auf Glasplatte mit anschließender optischer Auswertung mittels Lupe oder Mikroskop (als semiquantitatives Verfahren oder cut-off-Test) zur Verfügung und quantitative Methoden, bei denen entweder Veränderung der Trübung durch nepholometrische oder turbidimetrische Messung oder Auswertung der Veränderung der Teilchenzahl mittels Teilchenzahlgerät erfolgt. Unspezifische Agglutination durch hohe Titer von Antikörpern gegen den Liganden in der Probe können bei bestimmten schweren baktei teilen Infekten vorkommen und werden durch den gleichen Test ohne Zugabe von Antikörpern zu der Testlösung sicher erfaßt.This method differs fundamentally from previous methods in which the antibodies are bound to the particles and cross-linked by crosslinking to the protein present in solution. As application methods are primarily the latex agglutination on glass plate with subsequent optical evaluation by means of a magnifying glass or microscope (as semiquantitative method or cut-off test) available and quantitative methods in which either change in turbidity by nepholometric or turbidimetric measurement or evaluation of the change the number of particles is done by means of particle counting device. Non-specific agglutination by high titres of antibodies to the ligand in the sample may be present in certain severe bacterial infections and are safely detected by the same assay without the addition of antibodies to the test solution.

Ausführungsbeispielembodiment

(Latexagglutination auf Glasplatte mit visueller Auswertung)(Latex agglutination on glass plate with visual evaluation)

Latexpartikel, an die kovalent über Spacermoleküle ein Phosphorylcholinderivat gekoppelt wurde, werden mit Glycinpuffer (0,1 m Glycin/0,15mNaCI/pH = 8,2) gewaschen und auf eine Konzentration von 0,5% (w/w) gebracht. Diese Suspension wird vor dem Test mit einem spezifischen a-CRP-Serum (ein Fünfzigstel des Volumens) versetzt.Latex particles to which a phosphorylcholine derivative has been covalently coupled via spacer molecules are washed with glycine buffer (0.1 M glycine / 0.15m NaCl / pH = 8.2) and brought to a concentration of 0.5% (w / w). This suspension is supplemented with a specific a-CRP serum (one-fiftieth of the volume) prior to testing.

Der eigentliche Test geht so vonstatten, daß 10μΙ Teilchensuspension auf einen Objektträger getropft werden und jeweils 10 μΙ einer Patientenserumverdünnung in Ca++- Glycinpuffer (0,05m CaCI/0,1 m Glycin/0,15m NaCI/pH = 8,2), die 1:2/1:4/1:8/1:16 angefertigt wird, dazugegeben und vermischt wird. Nach 20min in einer feuchten Kammer wird optisch (Lupe/Mikroskop) durch Betrachten über schwarzem Grund die Agglutination beurteilt. Bei vorliegender Reaktion wird die Suspension flockig. Die Reaktanden werden so eingestellt, daß bei einer Probenverdünnung von 1:2 eine positive Reaktion oberhalb einer Konzentration von 8Mg/ml CRP in der Probe stattfindet (cut off- Methode). Eine semiquantitative Einschätzung höherer Konzentrationen ermöglicht die Auswertung der anderen Verdünnungen. Liegt z. B. erst Agglutination der 1:8-Stufe vor, so muß die Konzentration mindestens 32Mg/ml CRP betragen.The actual test proceeds in such a way that 10 μl of particle suspension are dropped onto a microscope slide and 10 μl each of a patient serum dilution in Ca ++ glycine buffer (0.05m CaCl / 0.1m glycine / 0.15m NaCl / pH = 8.2) 1: 2/1: 4/1: 8/1: 16, added and mixed. After 20 minutes in a moist chamber, the agglutination is assessed optically (magnifying glass / microscope) by observation over a black background. In the present reaction, the suspension becomes flaky. The reactants are adjusted so that at a sample dilution of 1: 2, a positive reaction above a concentration of 8Mg / ml CRP in the sample takes place (cut-off method). A semiquantitative assessment of higher concentrations allows the evaluation of the other dilutions. Is z. B. only agglutination of the 1: 8 stage, the concentration must be at least 32Mg / ml CRP.

Claims

1. A method for the determination of C-reactive protein (CRP) in serum and other body fluids by agglutination reaction suitable particle suspensions, characterized in that particle-ligand conjugates are used, the ligand component of which CRP has one or more binding sites.

2. The method according to claim 1, characterized in that agglutinates are formed by binding of the CRP both to an antibody which is directed against binding sites of the CRP, and to the particle-ligand conjugate.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the particle-ligand conjugates in its particle component usually made of latex particles and in their ligand component preferably consist of phosphoryl compounds.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the agglutination reaction to a suitable carrier, for. As a glass plate, is carried out with visual evaluation or by measuring the optical density as turbidity measurement or by automatic determination of the number of particles.