DD285374A5

DD285374A5 - METHOD FOR PRODUCING A PROKARYOTIC VECTOR PLASMIDE

Info

Publication number: DD285374A5
Application number: DD33011789A
Authority: DD
Inventors: Helmut Tschaepe; Erhard Tietze; Ulrich Wobus; Ute Heim; Winfriede Weschke
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr; Inst Experimentelle Epidemiolo
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1990-12-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines prokaryotischen Vektorplasmids zur UEbertragung von Fremdgenen, deren Expression durch ein antibiotisches Resistenzgen als Marker nachgewiesen werden soll, das ebenfalls Bestandteil des Vektorplasmids ist. Anstelle der bekannten Antibiotikaresistenzen soll ein Marker verwendet werden, der oekologisch und epidemiologisch unbedenklich ist und keine besondere Vorsicht im Gebrauch erfordert. Das erfolgt dadurch, dasz das von dem Resistenzgen kodierte Protein ein wegen seiner Toxizitaet nicht verwendbares Antibiotikum inaktiviert. Es wird ein Gen verwendet, das fuer eine Resistenz gegen Streptothrizine vermittelnde Streptothrizinazetyltransferase kodiert. Fig. 1{Vektorplasmid; antibiotisches Resistenzgen; oekologisch unbedenklich; Streptothrizinresistenz}The invention relates to a method for producing a prokaryotic vector plasmid for the transfer of foreign genes whose expression is to be detected by an antibiotic resistance gene as a marker, which is also part of the vector plasmid. Instead of the known antibiotic resistances, a marker is to be used which is ecologically and epidemiologically safe and requires no special care in use. This is because the protein encoded by the resistance gene inactivates an antibiotic that is unusable because of its toxicity. A gene encoding Streptothric acid acetyltransferase resistance to streptothricin is used. Fig. 1 {vector plasmid; antibiotic resistance gene; ecologically harmless; Streptothrizinresistenz}

Description

Hierzu 3 Seiten ZeichnungenFor this 3 pages drawings

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines prokaryotischen Vektorplasmids zur Übertragung von fremden Genen und deren Expression nach Transfer in einem Empfänger-Organismus, wobei der Nachweis der Expression an phänotypisch leicht erkennbaren Merkmalen durch Verwendung eines antibictischen Resistenzgens als Marker geführt wird, mit dem das Vektorplasmid außerdem versehen ist.The invention relates to a method for producing a prokaryotic vector plasmid for the transfer of foreign genes and their expression after transfer in a recipient organism, wherein the detection of the expression of phenotypically easily recognizable features by using an antibiotic resistance gene is performed as a marker with which the vector plasmid is also provided.

Characteristic of the known state of the art

Derartige Verfahren sind seit langem bekannt. Die Ausstattung des Vektorplasmids mit einem solchen Marker dient einmal dazu, die Anwesenheit des Veklorplasmids im Empfänger-Organismus zu erkennen, aufrechtzuerhalten ode:-durch Selektion-zu erzwingen, oder zum anderen einen gelungenen Insert bei in vitro durchgeführten Rekombinationen durch Insertionsmutagenese zu erkennen. Besonders verbreitet ist die Anwendung von Antibiotika-Resistenzen, weil dabei diese Aufgabe relativ einfach und sicher gelöst werden können. Allerdings ist der Einsatz derartiger Marker nicht unproblematisch, weil die zur Verfügung stehenden Antibiotika durchweg auch in der Human- und/oder Veterinärmedizin im - therapeutischen Gebrauch sind. Deshalb ist es unter ungünstigen Umständen nicht duszuschließen, daß human- oder veterinärmidizinisch pathogene Bakterienstämme durch Verbreitung über In-vitro-Rekombination der manipulierten Empfänger-Organismen gegen diese Antibiotika resistent werden und klinisch nicht mehr behandelt werden können.Such methods have been known for a long time. The equipping of the vector plasmid with such a marker serves once to detect, maintain, or to enforce the presence of the vectic plasmid in the recipient organism or, secondly, to detect a successful insert in recombinations carried out in vitro by insertion mutagenesis. The use of antibiotic resistance is particularly widespread, because this task can be solved relatively easily and safely. However, the use of such markers is not without problems, because the available antibiotics are consistently also in human and / or veterinary medicine in - therapeutic use. Therefore, under unfavorable circumstances, it can not be ruled out that strains of human or veterinary pathogens can become resistant to these antibiotics by spreading via in vitro recombination of the manipulated recipient organisms and can no longer be clinically treated.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, für den Gentransfer in einen beliebigen Empfänger-Organismus mittels eines prokaryotischen Vektorplasmids einen geeigneten Marker zur Verfügung zu stellen, der einfach isoliert und gehandhabt werden kann.The invention aims to provide a suitable marker for gene transfer into any recipient organism by means of a prokaryotic vector plasmid, which can be easily isolated and handled.

-2- 285 374 Darlegung des Wesens der Erfindung-2- 285 374 Explanation of the essence of the invention

Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, einen Marker dieser Art anzugeben, dessen Gebrauch in einem beliebigen Empfänger-Organismus die dargelegten ökologischen und epidemiologischen Gefahren nicht heraufbeschwört und bei dessen Einsatz und Nachwels mithin keinerlei besondere Vorsichtsmaßnahmen ergriff in werden müssen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das von dem Resistenzgen kodierte Protein ein wegen seiner Toxizität in der human· und veterinärmedizinischen Therapie nicht verwendbares Antibiotikum inaktiviert. Im einzelnen wird vorteilhaft aus einem Transposon Tn 182S oder einem Transposon Tn 1826 ein DNS-Fragment mit einer DNS-Sequenz entsprechend Anlage 1 oder Anlage 2 isoliert, welches wie bereits bekannt/1 / ein Gen enthält, das für eine Resistenz gegen Streptothrizine vermittelnde Streptothrizinazetyltransferase kodiert. Es ist dabei möglich, daß entweder das DNS-Fragment mit dem eigenei ι Promotor des Resistenzgens in ein prokaryotisches Vektorplasmid oder daß das DNS-Fragment aus dem Transposon Tn 1825 ohne eigenen Promotor des Resistenzgens in ein prokaryotisches Vektorplasmid, exprimiert im Polylinker durch einen Fremd-Promotor, vorzugsweise den lac-Promotor, Moniert wird. Die Verwendung eines bekannten Vektorplasmids pUC 19/2/-DNS-Fragment mit dem - und eines weiteren bekannten Vektorplasmids pUC8/3/ - DNS-Fragment ohne den eigenen Promotor des Resistenzgens- hat sich dabei als besonders günstig herausgestellt. Zusätzlich lsi es vorteilhaft, wenn das entstandene rekombinante Plasmid entweder zur Klonierung bei Insertions-Inaktivierung des DNS-Fragments oder zur Expression von Monierten fremden Genen über den Promotor des DNS-Fragments benutzt wird.Accordingly, the invention has set itself the task of specifying a marker of this kind, the use of which in any recipient organism does not evoke the environmental and epidemiological dangers set out and consequently no special precautions have to be taken in its use and Nachwels. According to the invention, the object is achieved in that the protein encoded by the resistance gene inactivates an antibiotic which is unusable because of its toxicity in human and veterinary therapy. In detail, it is advantageous to isolate from a transposon Tn 182S or a transposon Tn 1826 a DNA fragment having a DNA sequence corresponding to Appendix 1 or Appendix 2 which, as is already known, contains / 1 / a gene which is Streptothricacyl transferase conferring resistance to streptothrizines coded. It is possible that either the DNA fragment with the eigenei ι promoter of the resistance gene in a prokaryotic vector plasmid or that the DNA fragment from the transposon Tn 1825 without its own promoter of the resistance gene in a prokaryotic vector plasmid expressed in Polylinker by a foreign Promoter, preferably the lac promoter, is cloned. The use of a known vector plasmid pUC19 / 2 / DNA fragment with the - and another known vector plasmid pUC8 / 3 / - DNA fragment without its own promoter of the resistance gene has proven to be particularly favorable. In addition, it is advantageous if the resulting recombinant plasmid is used either for cloning in the case of insertion-inactivation of the DNA fragment or for expression of cloned foreign genes via the promoter of the DNA fragment.

Durch di'j Erfindung werden die beschriebenen Schwierigkeiten in überraschend einfacher Weise beseitigt. Die Beschaffung des Markers bereitet keinerlei experimentelle Schwierigkeiten, seine Gebrauchseigenschaften stehen den bisher verwendeten Antibiotika-Resistenzen nicht nach und der Umgang mit den Empfänger-Organismen gestaltet sich problemlos.By di'j invention, the difficulties described are eliminated in a surprisingly simple manner. The procurement of the marker poses no experimental difficulties, its performance properties are not the existing antibiotic resistance and the handling of the recipient organisms designed easily.

embodiment

Weitere Vorteile und die näheren Einzelheiten der Erfindung werden nachstehend an Hand der Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. In der Zeichnung ist die Konstruktion des erfindungsgemäßen Markers dargestellt. Es zeigenFurther advantages and the detailed details of the invention are explained in more detail below with reference to the drawing of an embodiment. In the drawing, the construction of the marker according to the invention is shown. Show it

1: the isolation of a promoterless gene sat-1 in a DNA fragment from the transposon Tn 1825 and its

Klonierung in ein Vektorplasmid, Fig. 2: die Konstruktion zweier rekombinanter Plasmide, bei denen das Gen sat-1 einschließlich der Promotorregion in derCloning into a vector plasmid, Fig. 2: the construction of two recombinant plasmids in which the gene sat-1 including the promoter region in the

jeweils entgegengesetzter! Orientierung eingebaut ist, und Fig. 3: die Isolierung oines kompletten Gens sat-2 in einem DNS-Fragment aus dem Transposen Tn 1826 und dessen Klonierung in einem Vektorplasmid.each opposite! Fig. 3: the isolation of a complete gene sat-2 in a DNA fragment from the transposon Tn 1826 and its cloning in a vector plasmid.

The numbers indicate the coordinates, relative to the corresponding transposon.

Die bereits vorbeschriebenen Plasmide pOIE38 (CoIE 1: :Tn 1825 Delta EcoRI) und pOIE39 (CoIE 1: :Tn 1826 Delta EcoRD/1/ tragen die mit sat-1 und sat-2 bezeichneten Gene, die in erfindungsgemäßer Weise als Marker verwendet werden sollen. Wie in Fig. 1 zu erkennen ist, wird zunächst das Gen sat-1 als BcI I-DNS-Fragment von 1 kb aus dem Plasmid pOIE 38 isoliert und danach in den BamH I-Restriktionsort eines Vektorplasmids pUC8 durch Ligation mit T4-DNS-Ligase und anschließende Transformation eines Bakterienstammes JM83 von Escherichia coli/3/ Moniert. Das dabei entstehende, Resistenz gegen Streptothrizin vermittelnde rekombinante Plasmid pOIE4 enthält das Gen sat-1, flankiert von Restriktionsorten des Polylinkers, und kann so gut als Ausgangspunkt für weitere Manipulationen dienen.The previously described plasmids pOIE38 (CoIE 1:: Tn 1825 Delta EcoRI) and pOIE39 (CoIE 1:: Tn 1826 Delta EcoRD / 1 / carry the genes designated sat-1 and sat-2, which are used in accordance with the invention as markers As can be seen in Figure 1, the gene sat-1 is first isolated as BcI I DNA fragment of 1 kb from the plasmid pOIE 38 and then into the BamH I restriction site of a vector plasmid pUC8 by ligation with T4- DNA ligase and subsequent transformation of a bacterial strain JM83 of Escherichia coli / 3 / Moniert The resulting resistance to streptothricin-mediated recombinant plasmid pOIE4 contains the gene sat-1, flanked by restriction sites of the polylinker, and can thus be used as a starting point for further manipulations serve.

Mittels der Restriktionsendonukleasen EcoR I und Hind III läßt sich das Gen sat-1 in ein vorher mit diesen Restriktionsendonukleason behandelte Plasmid pBR322/4/ Monieren. Das so konstruierte rekombinante Plasmid plE864 ist streptothrizin-sensibel, da sich kein Promotor vor dem Gen sat-1 befindet. Nach Spaltung des geninternen Ava I-Restriktionsortes und des Ava I-Restriktionsortes des Polylinkers wird das Ava I-DNS-Fragment an den Restriktionsenden mit Desoxynukleotiden und Polymerase I (Klenow) aufgefüllt und mit BamHI-Linkern versehen. Nach Klonierung in den BamHI·Restriktionsort eines Suspenzierungsvektors M 13mp 10/5/ kann die DNS-Sequenz mittels Didesoxy-Sequenzanalyse/6/ ermittelt werden. Parallel dazu kann ein EcoRI/Htndlll-DNS-Fragment nach erfolgter Glättung der Enden in den Sma I-Restriktionsort des Sequenzierungsvsktors M 13mp 10 Moniert werden. Die Vielzahl der Restriktionsorte des Polylinkers erlaubt weitere Ansätze. Das Gen sat-1 kann auch entsprechend Fig. 2 durch Verdauung mit der Restriktionsendonuklease BgI I aus dem Plasmid pOIE 38 gewonnen werden. Das BgI I-DNS-Fragment von 2,5kb wird anschließend nach Verkürzung durch limitierte Verdauung mit der Restriktionsendonuklease Bal31 (etwa 200 Basenpaare können auf jeder Seite des DNS-Fragments entfernt werden, ohne daß dadurch die Expression des Gens sat-1 beeinflußt würde) und nach Auffüllung der Enden in einen glatte Enden aufweisenden Restriktionsorteines beliebigen Vektorplasmids, in Fig. 2 in das mit der Restriktionsendonuklease Hindll verdaute Vektorplasmid pUC19, Moniert. Die auf diese Weise konstruierten rekombinanten Plasmide plE942 und plE945 enthalten den erfindungsgemäßen Marker einschließlich seiner Promotorregionen in den entgegengesetzten Orientierungen und sind streptothrizinresistent.By means of the restriction endonucleases EcoR I and Hind III, the gene sat-1 can be cloned into a plasmid pBR322 / 4 / previously treated with this restriction endonuclease. The recombinant plasmid plE864 constructed in this way is streptothricin-sensitive, since there is no promoter in front of the sat-1 gene. After cleavage of the in-gene Ava I restriction site and the Ava I restriction site of the polylinker, the Ava I DNA fragment is filled in at the restriction end with deoxynucleotides and polymerase I (Klenow) and provided with BamHI linkers. After cloning into the BamHI restriction site of a suspending vector M 13mp 10/5 /, the DNA sequence can be determined by dideoxy sequence analysis / 6 /. In parallel, an EcoRI / Htndlll DNA fragment can be cloned into the Sma I restriction site of the M 13mp 10 sequencing vector after the ends have been blunted. The variety of restriction sites of the polylinker allows further approaches. The gene sat-1 can also be obtained according to FIG. 2 by digestion with the restriction endonuclease Bgl I from the plasmid pOIE 38. The BgI I DNA fragment of 2.5 kb is subsequently removed after restriction digestion with the restriction endonuclease Bal31 (approximately 200 base pairs can be removed on each side of the DNA fragment without affecting the expression of the sat-1 gene). and, after filling the ends, into a blunt-ended restriction site of any vector plasmid, in Figure 2 into the restriction endonuclease HindIII-digested vector plasmid pUC19. The recombinant plasmids plE942 and plE945 constructed in this manner contain the marker of the invention including its promoter regions in the opposite orientations and are resistant to streptothricin.

In Fig.3 ist die Isolierung eines Gens sat-2 aus einem Plasmid pOIE39/1/ und die Konstruktion des rekombinanten Plasmids plE 935 zu erkennen. Wie bei der oben beschriebenen Verfahrensweise bei dem Gen sat-1 wird mittels Spaltung mit der Restriktionsendonuklease BgII, daran anschließender Inkubation bei Gegenwart der Restriktionsendonuklease Bal31 und schließlicher Glättung seiner Enden das das Gen sat-2 enthaltende DNS-Fragment in den Hindll-Restriktionsort eines Vektorplasmids pUC19 Moniert.In Figure 3, the isolation of a gene sat-2 from a plasmid pOIE39 / 1 / and the construction of the recombinant plasmid plE 935 can be seen. As with the procedure described above for the sat-1 gene, cleavage with the restriction endonuclease BgII followed by incubation in the presence of the restriction endonuclease Bal31 and eventual end-smoothing of the DNA fragment containing the sat-2 gene results in the HindIII restriction site of a vector plasmid pUC19 Moniert.

Über die flankierenden unikalen BamH I-Hind Ill-Restriktionsorte ist eine Subklonierung des Insertes in die speziell für eine Tn9-verrnittelte ln-vivo-Deletionserzeugung/7/ konstruierten Plasmide pAA-PZ718 und pAA-PZ719/8/ möglich. Von den so erzeugten Plasmiden pZ718-935 und pZ719-935/ beziehungsweise deren Deletionsderivaten wird die in Anlage 2 wiedergegebene Nukleotidsequenz mittels Didesoxysequenzierung/6/, ausgehend von einem IS1-Primer/7/, ermittelt.Subcloning the insert into plasmids pAA-PZ718 and pAA-PZ719 / 8 / specifically designed for Tn9-mediated in vivo deletion generation / 7 / is possible via the flanking unique BamH I-Hind III restriction sites. Of the thus generated plasmids pZ718-935 and pZ719-935 / or their deletion derivatives, the nucleotide sequence reproduced in Appendix 2 is determined by dideoxy sequencing / 6 /, starting from an IS1 primer / 7 /.

Besonders einfach können die erfindungsgemäßen Marker selbstverständlich auch aus den rekombinanten Plasmiden plE942, plE 945 oder plE 935, deren Konstruktion oben erläutert worden ist, durch Reaktion mit zwei der flankierenden Restriktionsendonukleaeen (siehe Fig. 1 bis 3, bis auf die Restriktionsendonukleasen BamH I, Sph I und Ava I in den rekombinanten Plasmiden plE942 und plE945 beziehungsweise Sph I in dem rekombinanten Plasmid plE935) isoliert werden. Mit den rekombinanten Plasmiden plE942 und plE945 ist es möglich, eine Ins«, rtions-lnaktivierung einer sat-1-Determinante effektiv zu erzeugen. Die Insertion eines BamHI-DNS-Fragmentes in das rekom! inante Plasmid plE 942 führt zur Inaktivierung der sat-1-Determinante, weil das entsprochende DNS-Fragment anstelle des durch die Spaltung mit der Restriktionsendonuklease BamH I deletierte Promotors sowie 5'-flankierender Bereiche des Gens sat-1 eingebaut wird. Benutzt man stattdessen das rekombinante Plasmid plE945, so wird das Gen sat-1 durch das entsprechende DNS-Fragment ersetzt und dadurch inaktiviert. Ebenso kann man diese Konstruktionen und analog dazu das sat-1 -promotorlose rekombinante Plasmid pOIE4 durch Klonierung eines DNS-Fragmentes in den BamH I-Restriktionsort zum Test geeigneter Promotoren beziehungsweise zur Expression geeigneter Gene über den Promotor des Gens sat-1 benutzen. Verschiedene unikale Restriktionsorte in den rekombinanten Plasmiden plE942, plE945 und pOIE4 vergrößern noch die Möglichkeiten von weiteren Manipulationen (Subklonierungen) durch Insertion in das Gen sat-1.Of course, the markers according to the invention can also be prepared particularly simply from the recombinant plasmids pI942, pIl 945 or pIl 935, the construction of which has been described above, by reaction with two of the flanking restriction endonucleases (see FIGS. 1 to 3, except for the restriction endonucleases BamH I, Sph I and Ava I in the recombinant plasmids pI942 and pI945 and Sph I in the recombinant plasmid pI935). With the recombinant plasmids plE942 and plE945, it is possible to effectively generate insulin inactivation of a sat-1 determinant. The insertion of a BamHI DNA fragment into the rekom! inante Plasmid plE 942 leads to the inactivation of the sat-1 determinant, because the complementary DNA fragment is inserted instead of the promoter deleted by the cleavage with the restriction endonuclease BamH I and 5'-flanking regions of the gene sat-1. If one instead uses the recombinant plasmid pI945, the gene sat-1 is replaced by the corresponding DNA fragment and thereby inactivated. It is also possible to use these constructions and, analogously, the sat-1-promoterless recombinant plasmid pOIE4 by cloning a DNA fragment into the BamH I restriction site to test suitable promoters or to express suitable genes via the promoter of the sat-1 gene. Several unique restriction sites in the recombinant plasmids pEL942, pEL945 and pOIE4 further increase the possibilities of further manipulations (subcloning) by insertion into the gene sat-1.

Die rekombinanten Plasmide plE942, plE945 und plE935 haben darüber hinaus noch einen unikalen NcoI-Restriktionsort in der 5'-flankierenden Region des Gens sat-1 beziehungsweise sat-2 im Insert, der für Klonierungen ohne Insertions-Inaktivierung genutzt werden kann.The recombinant plasmids plE942, plE945 and plE935 also have a unique NcoI restriction site in the 5'-flanking region of the sat-1 or sat-2 gene in the insert, which can be used for cloning without insertion inactivation.

Literaturliterature

/1/ TieUe, E. et 81.,J₁BaSIcMlCrObIoI. 28 (1988), Seiten 129-136./ 1 / TieUe, E. et 81., J ₁ BaSIcMlCrObIoI. 28 (1988), pages 129-136.

/2/ Vieira. J./Messtng. J., Gene 19 (1982), Seite 269./ 2 / Vieira. J./Messtng. J., Gene 19 (1982), page 269.

/3/ Yanlsch-Peron,C.etal.,Gene33(1985),Se!te 103./ 3 / Yanlsch-Peron, C. et al., Gene 33 (1985), p. 103.

/4/ Bolivar, F. et al., Gene 2 (1977), Selten 95-113./ 4 / Bolivar, F. et al., Gene 2 (1977), Rare 95-113.

/6/ Norrander, J. et al., Gene 28 (1983), Seite 101./ 6 / Norrander, J. et al., Gene 28 (1983), page 101.

/6/ Sanger, F. et al., Proc. Nail. ScI. Acad. USA 74 (1977), Seiten 5463-5487./ 6 / Sanger, F. et al., Proc. Nail. ScI. Acad. USA 74 (1977), pages 5463-5487.

/7/ Ahmed, A., Gene 39 (1985), Selten 305-310./ 7 / Ahmed, A., Gene 39 (1985), Rarely 305-310.

/8/ SequeNest II, Gold BioTechnology, Inc., St. Louis (Mo), USA./ 8 / SequeNest II, Gold BioTechnology, Inc., St. Louis (Mo), USA.

Anlage 1Attachment 1

GGATCATTCA GCACTGAAAG GGGACATGAG AGGGGCAAAC CGTAAAAATT GCGTCATATG ATGCTGAGAA GACCAAGGCT TTACATCTCG TCATCGACCA GATCTAGCCT AGGAGTCGCG GACAGCTCCT TGCAATTTGT CACGTATAAA ACTGGTTCTC ACCGCTTCGC GGTGATCGCC AGCGCCATCT GTGGATGGCG GACCGTAAGG

Anlage 2Annex 2

GCTACATGTC ACTGCCCATG TAATCCAGTG CGCATATCCG CTCCTTGTCT AAAAAAGTGC TTTAATTTAA TAATGTGCAT AGAGTGTCTT TAATTAACGG AAATGTGAGG AAACATTGGA CACCTATCCG

C^GGAAGGATC ^ GGAAGGAT

ATGGCGCATT ACATGGAACG CGGCACGGAG AAGCGATTCG TTGCATCATG GTCATATCTA ACTCGCTGCG AAGATTTCGG CCATTTCATT TTGAACTATC GATGATCACT AGAGCTTGTC CTATCGAACA CACAGTCTCA TGGCATACGA ACGCAAAATG ACTAGACCTC GGGAGCACAG GGCGCGGCTT GAAGTATCGA CGAACCGACG GCCTGAAGCC CTTGATGAAA TGCTGTTTGC GTCTGAGGAT CAGGTAAGTT TGCGTATAGA TGCAACTGTC CTGTTTTTTA TGCTAAATAA

CGT6CAAGCACGT6CAAGCA

GTATTTTTAA TAAGCATCAG CGTCATATGA TGCTGAGAAC ACCAAGGCTT TACATCTCGG CATCGACCAA ATCTAGCCTC GATCCTGTAC TGGTTCAAAA AAGACTGGCC TCGGTTGCAC CTCGCAATTT TGATCCCTGA GTTCGTGAAG TACCAGAAGT CTGATGAAGA GGGAAGATTG CATTGTTGTG TCGAATTTGC TTAGAGACAC TGGCTTTACT AAGTCTCGAA GATGACGCCT AATTCAGGAG CTCAACTATC TTGCTGGCCG ACACAGTGAT CAACGCGGCG TAAG CTGGAT GACGTTTTTT TTTTCAGTTT ATTTAAAAAT TGCCTATACA CGCCTAGAGA ATTAAAATGT GGATAGACGG AGAAAGTCTA CGGGTGACAA AGATTTCGGT CATTTCATTG TGAACTATCT ATGATGACTC GAGCTTGTCG TATCGAACAC TTCCTTATGT ATGCTGACAC GAGGATTATC CGTACAACAA TCCGGTGAGC GCAGGTGGCG TGTTCGATGT GTGAGCCCCT CTCTGCTTGC AACTCAACTC TCGCACACGC GAAAAAGTGG AAACGAACAA CTCGGCGGCA CGAAACAGCG AACAATTCAT TTAAACATCA AGAGGTAGTT TACATTTGTA ATTGATTTGC AGCTTTGATC AAAAACAGCC GTGAAACAGA TCAGCGCATA GGACTGTTAG GCCTATTCTA TGCTTGTTTA TATGAGTTCT CATGCACGAT. TTTAATACAA AACGAGCATG GATCCCTGAG TTCGTGAAGT ACCAGAAGTG TGATGAAGAC GGAAGATTGA ATTGTTGTGT GCATGGGTTG TCGAAGGCAC CAGGCGATTA GTTGCTGCAC AAGGCGTTAG GAAACATTGG GCACCTATCC ACCGGAAGGA TATGGCGCAT AACATGGAAC ACCGAGGCAA GCACTAAGCA TGTACCTGCC TTGACCTGTT ATGTACTGGT TCAAGCCGAC TGAGGGAAGC GGCGTCATCG CGGCTCCGCA TGGTTACGGT TGACCTCTTC ATAAAACGCT ACCTTTTTGT ACATAAAACG GCTGGGATTT CCGGTAGAGT TTGGGTGAGA TTGTAATAAC GTGATTATAT CTTACTAATA CAGGTGGCGG GTTCGATGTG TGAGCCCCTA TCTGCTTGCT ACTCAACTCA CGCACACGCA CCGAGGCAAA CACTAAGCAG GTACCTGCCT TGACCTGTTC TGTACTGGTA CAAGCCGACA GAGGGAAGCG GCGTCATCGA GGCTCCGCAG GGTTACGGTG GGAGTCGCGC ACAGCTCCTT GCAATTTGTA ACGTATAAAA CTGGTTCTCG CCGCTTCGCG GTGATCGCCG GCGCCATCTC TGGATGGCGG ACCGTAAGGC ACAGTCTCAT GGCATACGAT CGCAAAATGT CTAGACCTCA GGAGCACAGG GCGCGGCTTA AAGTATCGAC GAACCGACGT CCTGAAGCCA TTGATGAAAC CGAATTTGCG TAGAGACACA GGCTTTACTC AGTCTCGAAC ATGACGCCTA ATTCAGGAGT TCAACTATCA TGCTGGCCGT CACAGTGATA

AACGCGGCGAACGCGGCG

aaaaagtggg aacgaacaat tcggcggcat gaaacagcga acaattcatt taaacatcat gaggtaghg acatttgtac ttgatttgctaaaaagtggg aacgaacaat tcggcggcat gaaacagcga acaattcatt taaacatcat gaggtaghg acatttgtac ttgatttgct

Claims

A process for the preparation of a prokaryotic vector plasmid for the transfer of foreign genes and their expression after transfer into a recipient organism, wherein the detection of the expression of phenotypically easily recognizable features is performed by using an antibiotic resistance gene as a marker, which also provides the vector plasmid and which can be used to introduce and maintain recombinant plasmids in a production strain of a microorganism, characterized in that protein encoded by the resistance gene inactivates an antibiotic which is not useful because of its toxicity in human and veterinary therapy.

2. The method according to claim 1, characterized in that from a transposon Tn 1825 or Tn 1826 a DNA fragment with a DNA sequence according to Appendix 1 or Appendix 2 is isolated, which as known per se contains a gene which is resistant to Streptothrizine-mediating Streptothrizinazetyltransferase encoded.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the DNA fragment is cloned with its own promoter of the resistance gene in a prokaryotic vector plasmid.

4. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the DNA fragment from the transposon Tn 1825 is cloned without its own promoter of the resistance gene into a prokaryotic vector plasmid expressed in the polylinker by a foreign promoter, preferably the iac promoter.

5. The method according to claim 1 to 3, characterized in that a vector plasmid pUC 19 is used.

6. The method according to claim 1,2 and 4, characterized in that a vector plasmid pUC8 is used.

7. The method according to claim 1 and 2 and one of claims 3 and 4, characterized in that the resulting recombinant plasmid

for cloning in insertion-inactivation of the DNA fragment or

- Is used for the expression of cloned foreign genes via the promoter of the DNA fragment.