DD285199A5 - Verfahren zur festphasenbindung von rekombinanten proteinen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Festphasenbindung von rekombinanten Proteinen und die Reindarstellung rekombinanter Antigene aus Kulturen von Bakterien oder Hefen. Mit Hilfe heterologer Nukleinsaeuresequenzen, welche Polypeptide kodieren, wird ein gemeinsamer Polypeptidstrang zur Expression gebracht, so dasz ein bifunktionelles rekombinantes Antigen entsteht. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist via Gentechnik die medizinische Diagnostik (z. B. HIV-Nachweis).{Festphasenbindung; Antigen; rekombinante Antigene; Proteine; rekombinante Proteine; Antigen-Reinigung; Nukleinsaeuresequenzen; Expression; Gentechnik; Medizin; Diagnostik; HIV}

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Bindung von rekombinanten Antigenen an die feste Phase (z. B. Mikrotestplatten) in Systemen zum Nachweis von spezifischen Antikörpern. Das Verfahren ermöglicht die Reindarstellung von rekombinanten Antigonen aus KuIn ren von Bakterien, Hefen oder anderen Zellen, aus denen gentechnische Produkte hergestellt werden können. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Gentechnik und die medizinische, veterinärmedizinische und phytopathologische Diagnostik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Der empfindliche Nachweis von spezifischen Antikörpern wird heute in der klinischen Routinediagnostik mit Hilfe von cLISA bewerkstelligt. Dazu muß in einem ersten Schritt das Antigen, für das die jeweils spezifischen Antikörper z. B. aus dem Patientenserum nachgewiesen werden sollen, an eine feste Phase (z.B. Mikrotestplatten, Polystyrenröhrchen o.a.) gebunden werden. Die Qualitätsparameter des aufzubauenden Tests sind dann jeweils sehr stark abhängig von der Reinheit des verwendeten Antigens (Kießig, S.T.; Jahn.S.; Porstmann, T.; v. Baehr, R.; Strategien beim Testaufbau. Allerg. Immunol. 23 1(1987) 79-87). Dies setzt vor dem Beginn dor Arbeiten zunächst eine zumeist aufwendige Reindarstellung des gewählten Antigens voraus. Dann erst kann es in Konzentrationen von etwa 5-20mg/l z. B. adsorbtiv an die feste Phase gebunden werden. Bei der Verwendung von rekombianten Antigenen, die in der Regel aus entsprechenden Kulturen von. . coli oder Hefezellen oder Zellkulturen gewonnen werden können, werden höchste Anforderungen an eine Reinpräparation der Antigene gestellt, da die obligat vorhandenen Verunreinigungen aus den Wirtszellen sehr häufig von Antikörpern, z. B. aus humanen Seren, erkannt werden können und somit bei einer Vielzahl von Tests falsch positive Ergebnisse vortäuschen könnten. Die Bildung von Antikörpern gegen Proteine aus E. coli oder Candida albicans läßt sich nicht beeinflussen, da diese Keime obligat zur Normalflora, z.B. der Mundhöhle oder des Darmes gehören und somit eine Antikörperbildung stets zu erwarten ist (Boyden, S.V.: Autoimmunity and inflammation. Nature 201 [1964], 200-214).

Eine Form eines Fusionspro. lins ist mit der Ankopplung eines Protein-A-Gens an das Gen des Antigens vorgestellt worden (Moks, T., L. Abrahamsen, B.Österlöf, S. Josephson, M.Östling, S.-O. Enr'ors, I. Persson, B. Nilsson, M. Uhlen: Large-scale purification of human insulin-like growth factor I from culture of Esciierichia coli. Biolechnology 5 (1987), 379-382). Die Selektivität bei der Festphasenbindung wird hier durch die spezifische Reaktion des Protein A mit F_c-Fragmenten des IgG, das zuvor z. 8. adsorptiv immobilisiert wurde, erreicht.

Die Affinitätskonstante ist hier mit etwa 10~⁶!/mol relativ gering. Eine weitere Beschränkung des Einsatzgebietes solcher Fusionsproteine ergibt sich aus der Tatsache, daß das IgG vieler Spezies vom Protein A unspezifisch gebunden wird und damit ein Nachweis antigenspezifischer Antikörper nicht mehr möglich wäre.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die aufwendige Reindarstellung von rekombinanten Antigenen aus Biomassepräparationen zu vereinfachen und der gentechnischen Praxis ein Verfahren zur schnellen und effektiven Bindung der Antigene zur Verfügung zu stellen.

-2- 285 199 Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem sich rekombinante Proteine zur Abwicklung von Enzym- oder Radioimmunoassys binden lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß rekombinante Antigene in Systemen zum Nachweis spezifischer Antikörper in grob gereinigten Biomassepräparationen immunologisch gebunden werden. Durch die Gewinnung und Anwendung bifunktioneller rekombinanter Antigone wird der Nachweis von Antikörpern ermöglicht. Die erfinderische Lösung liegt zunächst darin, daß mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen und DNA-Ligase zwei heterolog9 Nukleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide kodieren, mit einem gentechnischen Vektor verknüpft werden und al.i ein Protein in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen zur Expression gebracht werden. Beide gekoppelten Polypeptide br stimmen in dem gemeinsamen Protein die antigenen Eigenschaften. Über eine der beiden Antigendeterminanten wird dann das rekombinante Antigen mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers (bei Vorhandensein auch mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers) gebunden, so daß die andere Determinante zur Bindung der zu detektierenden Antikörper zur Verfügung steht. Der Nachweis der Bindung des zweiten Antikörpers kann direkt, indirekt oder als Konipetitionstest gestaltet werden.

Durch die hohe Spezifität des ersten Schrittes, der immunologischen Bindung des rekombinanten Antigens mit Hilfe eines Antikörpers, können auch grob aufgereinigte Zellextrakte der antigenproduzierendsn Zellen für den Test verwendet werden.

Dementsprechend sind aufwendige Hochreinigungen zur Gewinnung von rekombiranten Antigenen nicht mehr notwendig. Die bisher notwendige Reinigung der rekombinanten Antigene ergab sich aas dem Vorhandensein von Antikörpern im menschlichen oder tierischen Serum, die spezifisch mit Proteinen der Produzenten rekombinanter Antigene reagieren können.

Dies erklärt sich durch die natürliche Anwesenheit von z. B. E.coli oder Candida albicans im Gastrointestinaltrakt aller höheren Tiere.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wird dem Gen des gewünschton Antigens das Gen der humanen SOD (Superoxiddismutase) hinzugefügt. Das entsprechend Genprodukt ist dann ein Fusionsprotein aus der SOD und dem jeweiligen Antigen.

Dieses ist aus der Biomasse durch Zerstörung der Zellen mittels klassischer Präpararationsverfahren wie Zentrifugation und lonenaustauschchromatographie anzureichern. Sobald es in einer wasserlöslichen Form vorliegt, ist es einer immunologischen Festphasenimmobilisierung zugängig.

Diese wird durch die Verwendung eines neuen hochaffinen monoklonalen anti-SOD-Antikörpers (H-CB-SOD 2 = ZIM-0385) möglich. Dazu wird dieser monoklonale Antikörper adsorptiv an die Polystyrenoberfläche von Mikrotestplatten gebunden. Nach einem Waschschritt mit PBS, 0,1 % Tween 20 stehen die so vorbereiteten Platten (auch nach mehrmonatiger Aufbewahrung bei -2O⁰C) zur weiteren Verwendung zur Verfügung.

Der verwendete monoklonale Antikörper bindet durch seine sehr hohe Affinität (2,7 χ 10~¹²l/mol) zu einer Sequehzdeterminante der SOD das Fusionsprotein aufgrund seines SOD-Anteils.

Damit ist das gewünschte Antigen an der festen Phase immobilisiert und weiteren Immunreaktionen, so z. B. dem Nachweis antigenspezifischer Antikörper, zugängig.

Einer der wesentlichen Vorteile bei der Verwendung von humaner SOD sind:

1. SOD wird all( r Wahrscheinlichkeit nur äußerst selten als Autoantigen erkannt, so daß probandeneigene Antikörper nicht als Störfaktor in ,^:rage kommer..

2. Sonstige unjpezifische Reaktionen aus üblicherweise verwendeten Probenbestandteilen wie freies Biotin oder eine unspezifische Bindung von Antikörpern sind hier nicht zu erwarten.

3. Selbst wenn nach der Bindung des Fusionsproteine (Antigen-SOD) noch freie SOD und freie SOD-Bindungsstellen an der festen Phaso vorhanden sein sollten, so ist aufgrund der unter 1. und 2. dargestellten Verhältnisse keine Beeinflussung der Ergebnisse zu erwarten.

Wird statt der SOD alternativ Protein A, ß-Galactosidase, (Strept-)Avidin, HBsAg (Hepatitis B Oberflächen-Antigen), HIV-p 25 o. ä. verwendet, sind entsprechende Bindungstechniken zu verwenden.

Das ob'jn beschriebene Verfahren kann einerseits im kleinen Maßstab für die Mikrotestplatte zur Festphaseninsolubilisierung von Antigenen für den Nachweis spezifischer Antikörper eingesetzt werden, andererseits bedeutet die Maßstabsvergrößerung eina neue Variante der immunaffinitätschromatografischen Reinigung rekombinanter Antigene. Bedingung ist jetzt r.ur noch das Vorhandensein eines spezifischen Antikörpers, der in der Lage ist, mit dem Teil des Fusionsproteins zu reagieren, welches in der Lage ist, mit dem ersten Teil des bifunktionellen rekombinanten Antigens zu reagieren. Die Größe des zur Bindung notwendigen Teiles wird dabei auf die Größe eines Epitops begrenzt. Der Antikörper wird zum Zwecke der ^solubilisierung kovaient an Zellulose-Perlen o.a. gebunden, so dali säulenchromatografische oder Batch-Verfahren zur weiteren Reinigung verwendet werden können. Damit ist eine immunaffinitätschromatografische Reindarstellung von rekombinanten Antigenen in nur wenigen Schritten möglich geworden, ohne daß zuvor jeweils ein spezifischer monoklonaler Antikörper hergestellt werden muß, da bereits zu Beginn der Hersteilung des rekombinanten Antigens derjenige Teil, der die immunaffinitätschromatografische Reinigung ermöglicht, mit in das rekombinante Genom eingebaut wurde. Damit steht ein universelles Prinzip zur Verfügung.

Ausführungsbeispiel

Beispiel 1

1. Herstellung des Fusionsproteins

Zur Konstruktion eines Vektors zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der Superoxiddismutase und einem Teil des HlV-Oberflächenproteins gp41, werden entsprechend die rekombinanten Plasmide (pUSOD/EMBL8) und pUC 18RR (Motz, M., Soutschek-Bauer, E., Wolf, H.,Abstiactzu Xl. International Congress of Virology, Dresden 1986) genutzt.

Die Konstruktion erfolgt in folgenden Klonierungsschritten:

1. Restriktion des Plasmidos 1. Restriktion des Plasmides pUSOD/EMBLemitBamHI/EcoRI pUCieRRmitBamHI/EcoRI

2. Elution des BamHI/EcoR I Fragments, 2. Elution des Vektorteils, das SOD-Gen beinhaltend.

3. Ligation des restrinercen rekombinanten Plasmides pUC18RR mit dem BamHI/EcoRI DNA-Fragment, das SOD-Gen beinhaltend.

4. Transformation der E.coli-Zelien mit dem Ligationsgemisch und Selektion des neuen rekombinanten Klones nach bekannten gentechnischen Methoden (Maniatis, T., Fritsch, E., Sambrook, J., 1983. Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor). (Abb. 1)

Das neue rekombinante Plasmid pUEMBLSODpg41 wird zur Expression des entstandenen Fusionsproteins SOD-gp41 in E.coli genutzt. Zur Gewinnung des Fusionsproteins wachsen die Bakterienzellen, das rekombinante Protein beinhaltend, in einem Bakterienvollmedium bis zu einer optischen Dichte OD₆₆onm = 0,6 und werden danach 1 bis 3 Stunden durch Zugabe von IPTG bis zu einer finalen Konzentration von 0,5 bis 2 mmol/l induziert. Die Zellen worden goerntet, und entsprechend der Methode zur Gewinnung von Einschlußkörpern (Marstom, F.A.O., Lowe, P.A., Doel, M.T., Schoemaker, J.M., White, S., Angal, S.: Biotechnology 2 [1984], 800-804) werden die unlöslichen Proteine extrahiert. Das Proteinpellet wird durch Zugabe von i,0mg/l in 8mol/l Harnstoff gelöst und auf eine äquilibrierte DEAE-Säule aufgetragen und mit einem linearen NaCI-Gradienten (0,1 mol/l bisO,5mol/l) eluiert.

2. Bindung des Fusionsproteins an feste Phasen

2.1. Mikrotestplatten

Die so gewonnene Fraktion mit angereicherten Furionsproteinen kann im nachfolgenden Schritt an Mikrotestplatten gebunden werden, sofern diese zuvor mit dem anti-SOD-Antikörper in einer Konzentration von 5 mg/l (im 0,1 mol/l Carbonatpuffer, pH 9,6; 24h; 4°C) benetzt und zweimal mit einem 0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH7,3; 0,3mol/l NaCI; 0,1 % Tween 20 (PBS, Tween) gewaschen wurden. Die Festphase-insolubilisierten anti-SOD-Antikörper sind in der Lage, das Fusionsprotein auch aus ungereinigten Lösungen zu erkennen und zu binden, Dazu wird eine Konzentration von 1 mg/l eingestellt und für 90 min (25⁰C) in PBS, Tween in den Mikrotestplatten inkubiert.

2.1.1. Durchführung des Enzymimmunoassays zum Nachweis von anti-gp41 -Antikörpern im Probandenserum Die wie oben vorbehandelten Mikrotestplatten werden erneut zweimal gewaschen und nachfolgend mit den vorbereiteten 1:50-Verdünnungen der Seren in PBS, Tween + 5% Schafserum Well für Well bestückt und 90 min (25⁰C) inkubiert, Danach werden wiederum überschüssige Reaktanten durch Waschen entfernt.

Gebundene HIV-gp41-spezifische Antikörper können jetzt mit einem peroxidasemarkierten anti-human-lgG (Konzentration 0,5mg/l in PBS, Tween + 5Vo Schafserum) nachgewiesen werden. Die gebundene Enzymaktivität, die proportional zur Menge spezifisch gebundener Antikörper ist, läßt sich mit einer Farbreaktion (7 mmol/l ortho-Phenylendiamin, 7 mmol/l H₂Oj in 0,1 mol/l CitratpufferpH5,0;l Reaktionszeit: 20min ± 2 min; Reaktionsabbruch mit 1 mol/l H₂SO₄) bestimmen. Nach der photomritrischen Bestimmung der einzelnen Extinktionen kann anhand eines zuvor bekannten (Cut-Offs und im Test mitgeführter positiver und negativer Kontrollen festgelegt werden, ob die bestimmte Probe spezifische Antikörper enthält. Das Reaktionsvolumen beträgt für alle Schritte 50μΙ.

2.2. CNBr-Sepharose

Das oben beschriebene Prinzip der Herstellung von rekombinanten Fusionsproteinen kann ebenfalls Grundlage zur Feinreinigung rekombinanter Proteine sein. Dazu werden 10 mg monoklonaler anti-SOD-Antikörper nach bekannten Vorschriften an 10g CNBr-Sepharose kovalcnt gebunden.

2.2.1. Feinreinigung von rekombionanten Fusionsproteinen durch immunaffinitätschromatografische Verfahren Die so hergestellte anti-SOD-Sepharose wird dann in eine Säule (40ml) gegossen und mit einem 0,1 mol/l Phosphatpuffer; 0,5 mcl/l NaCI äquilibriert. Das oben beschriebene Bakterienlysat kann nach der Trennung an DfAE-Cellulose über die anti-SOD-Sepharose gegeben werden. Nachfolgend wird mit dem zur Äquilibrierung verwendeten Phosphatpuffer die Säule so lange gespült, bis kein Eiweiß mehr nachweisbar ist (E₂8Onm ^ 0,05; d = 1 cm). Jetzt kann das über den SOD-Anteil gebundene bifunktionelle rekombinante Antigen mit einem Glycin/HCI-Puffer pH 3,0 oder 3 mol/l KSCN eluiert werden.

Claims (5)

1. Verfahren zur Fostphasenbindung von rekombinanten Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß im System zum Nachweis spezifischer Antikörper heterologe Nukleinsäuresequenzen, welche Polypeptide kodieren, mit Hilfe genetischer Vektoren in einem gemeinsamen Polypeptidstrang zur Expression gebracht werden und das entstehende bifunktionelle rekombinante Antigen durch einen immobilisierten Antikörper spezifisch gebunden wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe des immobilisierten, das rekombinante Antigen tragenden Antikörpers die Bindung eines zweiten Antikörpers nachgewiesen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinate Antigen mit Hilfe gentechnischer Vektorsysteme in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen produziert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß für die Bindung des rekombinanten Antigens an den immobilisierten Antikörper Zellextrakte der antigenproduzierenden Zellen genutzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genetischen Vektoren in vitro gekoppelte Gene oder deren Abschnitte beinhalten.