DD280695A1

DD280695A1 - METHOD FOR PRODUCING IMMUNOSTIMULATING AGENTS

Info

Publication number: DD280695A1
Application number: DD26529784A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Rudolph; Beate Voigt; Barbara Vier; Dieter Urbaneck
Original assignee: Adlw Der Ddr Inst Fuer Impfsto
Priority date: 1984-07-16
Filing date: 1984-07-16
Publication date: 1990-07-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein kostenguenstiges Verfahren zur Herstellung immunstimulierender Mittel aus Mykobakterien. Die immunstimulierenden Mittel werden durch Fraktionierung mit Azeton aus den Lipidextrakten gewonnen und zeichnen sich durch hohe immunologische Aktivitaet und das Fehlen unerwuenschter Nebenwirkungen aus.The invention relates to a cost-effective method for producing immunostimulating agents from mycobacteria. The immunostimulating agents are obtained by fractionation with acetone from the lipid extracts and are characterized by high immunological activity and the absence of undesirable side effects.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft das Herstellungsverfahren für immunstimulierende Mittel, d. h. Mittel, die in unspezifischer Weise die Widerstandsfähigkeit bzw. die Immunreaktion des menschlichen und tierischen Organismus gegenüber verschiedenen pathogenen Einflüssen, z. B. gegenüber Viren, Bakterien oder Parasiten, steigern, ohne daß eine Antigenbeziehung zwischen dem Stimulans und dem infektiösen Erreger besteht. Die rein praktische Nutzanwendung liegt z. B in der Steigerung der Wirksamkeit von Impfstoffen. Es kann aber auch therapeutisch zur Behandlung mangelhafter immunologischer Abwehrreaktionen eingesetzt werden.The invention relates to the production process for immunostimulating agents, d. H. Means which in unspecific manner the resistance or the immune response of the human and animal organism against various pathogenic influences, eg. B. against viruses, bacteria or parasites, increase without an antigenic relationship between the stimulant and the infectious agent. The purely practical application is z. B in increasing the effectiveness of vaccines. However, it can also be used therapeutically for the treatment of deficient immunological defense reactions.

Characteristic of the known solutions

Das bekannteste und besonders in der experimentellen Immunologie weit verbreitete und seit vielen Jahren gebräuchliche immunologische Adjuvans ist das komplette Freundsche Adjuvans. Es besteht aus Mineralöl und Emulgator sowie einem Zusatz von hitzegetöteten Mykobakterien. Ohne Zusatz von Mykobakterien wird es .ils inkomplettes Freundsches Adjuvans bezeichnet. Das Antigen wird in wäßriger Lösung b2w. Suspension mit dem Öladjuvans emnlgiert. Freundsches Adjuvans verstärkt besonders bei schwach immunogenen Proteinantigenen die antigens Wirksamkeit beträchtlich, ist aber besonders durch den Zusatz von Mykobakterien mit starken Nebenwirkungen behaftet, die eine Verwendung als Impfstoffzusatz in der Human- und Veterinärmedizin ausschließen. Die schwerwiegendsten Nachteile sind die Entstehung von Granulomen oder sogar Abszessen an der Impfstelle, die Erzeugung von Tuberkulinsensitivität und eine starke Steigerung der Endotoxiempfindlichkeit. Die stark immunstimulierende Wirkung des kompletten Freundschen Adjuvans ist wesentlich auf den Einsatz von Mykobakterien zurückzuführen, die aber auch weitgehend für die unerwünschten Nebenwirkungen veraniwortlich sind. Es wurde deshalb versucht, aus Mykobakterien immunologisch wirksame Extrakte herzustellen, die die genannten Nebenwirkungen nicht mehr aufweisen.The most well-known immunological adjuvant, which is widely used in experimental immunology and has been used for many years, is Freund's complete adjuvant. It consists of mineral oil and emulsifier as well as an addition of heat-killed mycobacteria. Without the addition of mycobacteria, it is termed incomplete Freund's adjuvant. The antigen is b2w in aqueous solution. Suspension with the oil adjuvant emnlgiert. Freund's adjuvant, especially with poorly immunogenic protein antigens, significantly enhances the antigenic efficacy, but is particularly afflicted by the addition of mycobacteria with strong side effects that preclude use as a vaccine additive in human and veterinary medicine. The most serious drawbacks are the formation of granulomas or even abscesses at the injection site, the generation of tuberculin sensitivity and a marked increase in endotoxic sensitivity. The strong immune-stimulating effect of Freund's complete adjuvant is largely due to the use of mycobacteria, which are also largely responsible for the undesirable side effects. It was therefore attempted to produce from mycobacteria immunologically active extracts that no longer have the said side effects.

In den Patenten DD 101180, US 395S481, US 4001395 und US 4010257 werden Verfahren zur Gewinnung von hydrophilen Fraktionen aus Mykobakterien Geschrieben. Die beschriebenen Verfahren sind jedoch teuei, kompliziert/aufwendig und damit für die Anwendung im Produktionsmaßstab nicht geeignet.Patents DD 101180, US 395S481, US 4001395 and US 4010257 describe methods for obtaining hydrophilic fractions from mycobacteria. However, the described methods are teuei, complicated / expensive and therefore not suitable for use on a production scale.

Neben hydrophilen Stoffen und Stoffgemischen ist auch eine Anzahl von lipophilen Substanzen bekannt, die Bestandteile unspezifisch wirksamer immunstimulierender Mittel sind. In DE 2262426 wird über ein immunstimulierendes Mittel berichtet, das aus tierischen oder mikrowellen Zellen durch Extraktion mit Gemischen aus Chloroform und Methanol isoliert wird. Zum Einsatz kommt die aus dem Lipidextrakt gewonnene Chloroformlösliche Fraktion, die jedoch dan Nachteil aufweist, daß sie den Antikörpertiter des Serums nur minimal steigert, in DE 2009343 und US 4171353 wird außerdem über die Anwendung von Lysolecithinen bzw. Lecithinen als immunstimulieicide Mittel berichtet. Die Anwendung dieser Mittel hat den Nachteil, daß die Gewinnung reiner Lysolecithine oder erzymatischer Verfahren möglich ist. Außerdem wird die therapeutische Anwendung der unspozifisch wirksamen immunstimulie.enden Mittel in der Human- oder Veterinärmedizin generell dadurch eingeschränkt, daß die Mittel toxisch und bei parenteraler Anwendung wenig verträglich s>nd.In addition to hydrophilic substances and mixtures of substances, a number of lipophilic substances are known which are components of unspecifically effective immunostimulating agents. In DE 2262426 there is reported an immunostimulating agent isolated from animal or microwave cells by extraction with mixtures of chloroform and methanol. The chloroform-soluble fraction obtained from the lipid extract is used, but it has the disadvantage that it only slightly increases the antibody titer of the serum. DE 2009343 and US 4171353 also report the use of lysolecithins or lecithins as immunostimulating agents. The use of these agents has the disadvantage that the recovery of pure lysolecithins or erzymatischer method is possible. In addition, the therapeutic use of the unspecifically effective immunostimulatory agents in human or veterinary medicine is generally limited by the fact that the agents are toxic and less compatible with parenteral administration.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung verfolgt das Ziel, immunstimulierende Mittel zu gewinnen, die eine gute Adjuvanswirkung, aber kaum Nebenwirkungen aufweisen, einfach gewinnbar und kostengünstig herzustellen sind.The object of the invention is to obtain immunostimulating agents which have a good adjuvant effect but hardly any side effects, are easy to obtain and are inexpensive to produce.

-2- 280 695 Darlegung des Wesens der Erfindung-2- 280 695 Explanation of the nature of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, immunstimulierende Mittel auf der Basis von mykobakteriellen Biomassen zu gewinner. -:.". eine gute stimulierende Wirkung auf humorale und zelluläre Immunreaktionen haben, keine Tuberkulinsensitivität erzeugen, sowohl als Impfstoffzusatz geeignet als auch bei lokaler Applikation wirksam sind.The object of the invention is to obtain immunostimulating agents based on mycobacterial biomass. have a good stimulating effect on humoral and cellular immune reactions, do not produce tuberculin sensitivity, are both suitable as a vaccine additive and are effective in topical administration.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß aus Mykobakterian mittels Lösungsmittelextraktion ein Lipidextrakt isoliert wird, aus dem durch Acetonbehandlung eine Fraktion bzw. Fraktionen abgetrennt werden, die sich durch eine besonders hohe immunstimulierende Aktivität und geringe Nebenwirkungen auszeichnen. Im einzelnen wird dabei wie folgt verfahren:According to the invention the object is achieved in that a lipid extract is isolated from Mycobacterian by means of solvent extraction, from the acetone treatment a fraction or fractions are separated, which are characterized by a particularly high immunostimulatory activity and low side effects. In detail, the procedure is as follows:

Mykobakterienbiomasse von pathogenen oder apathogenen Stämmen, vorzugsweise von Mycobact. avium, wird mit einem Gemisch aus polaren und unpolaren Lösungsmitteln -vorzugsweise Chloroform und Methanol - bei Raumtemperatur mehrfach extrahiert. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wird als Rückstand ein Lipidextrakt erhalten. Der Lipidextrakt wird in Chloroform gelöst und bei Raumtomperatur mit dem etwa dreifachen Volumen Aceton intensiv vermischt. Die acetonun'öslichen Bestandteile werden abgetrennt, und nach destillativer Entfernung des Lösungsmittels erhält man eine acetonlösliche Fraktion, die sich überraschenderweise durch eine sehr gute immunstimulierende Wirksamkeit auszeichnet. Es ist auch möglich, die Fraktionierung des Lipidextraktes noch zu orweitern, indem man zunächst bei 20 bis 25⁹C die in Aceton unlöslichen Bestandteile isoliert und anschließend bei O⁰C eine weitere acetonunlösliche Fraktion abtrennt. Nach Einengen und Zugabe von Ethanol wird bei O⁰C eine dritte unlösliche Fraktion erhalten. Letztere Fraktionen zeichnen sich ebenfalls durch eine ausgezeichnete immunstimulierende Aktivität aus.Mycobacterial biomass of pathogenic or non-pathogenic strains, preferably of Mycobact. avium, is extracted several times at room temperature with a mixture of polar and non-polar solvents-preferably chloroform and methanol. After distilling off the solvent, a lipid extract is obtained as residue. The lipid extract is dissolved in chloroform and intensively mixed at room temperature with about three times the volume of acetone. The acetone insoluble constituents are separated off, and after distillative removal of the solvent gives an acetone-soluble fraction, which is surprisingly distinguished by a very good immunostimulating activity. It is also possible to orweitern the fractionation of the lipid extract by first isolated at 20 to 25 C ^9, the acetone-insoluble components and then separated at ^{0 0} C, another acetone-insoluble fraction. After concentration and addition of ethanol, a third insoluble fraction is obtained at ⁰ ° C. The latter fractions are also characterized by an excellent immunostimulating activity.

Die erfindungsgemäße Lösung weist eine Reihe von Vorteilen auf. Die Gewinnung des immunstimulierenden Mittels ist einfach und gut reproduzierbar. Als Ausgangsmaterial kann dabei die bei der Gewinnung von Tuberkulin anfallende A'nfallbiom-isse noch zweckmäßig verwertet v/erden. Durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann die immunstimulierende Wirkung des abgetöteten M.butyrikum erreicht oder übertroffen werden, οηπβ daß die damit verbundenen Nachteile der Unverträglichkeit (Abszeßbildung) und Tuberkulinsensibilisierung auftreten. Da das erfindungsgemäße Mittel keine Tuberkulinsensivität hervorruft, ist seine Verwendung in Human- und Veterinärmedizin vielseitig möglich. Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert:The solution according to the invention has a number of advantages. Obtaining the immunostimulating agent is easy and well reproducible. In this case, the starting material used may still be the useful waste produced by the extraction of tuberculin. By the method according to the invention, the immunostimulating effect of the killed M. butyrikum can be achieved or exceeded, that the associated disadvantages of incompatibility (abscess formation) and tuberculin sensitization occur. Since the agent according to the invention does not cause tuberculin sensitivity, its use in human and veterinary medicine is versatile. The invention will be explained in more detail with reference to the following examples:

example 1

100g gefriergetrocknete Bakterienbiomasse (Mycobaccerium avium Stamm D4) wird dreimal mit der lOfachen Menge an Chloroform/Methanol (2:1) extrahiert. Nach destillativer Entfernung dos Extraktionsmittels erhält man ?1g Extrakt, der in 150 ml Chloroform gelöst wird. Die Chloroformlösung läßt man langsam und unter Rühren bei Raumtemperatur in die 3fache Menge Aceton einfließen. Der Niederschlag wird über eine Fritte abgetrennt und mit wenig Aceton gewaschen. Nach Trocknung im Exsikkator erhält man 6g acetonunlösliche Fraktion 1. Das acetonlösliche wird auf etwa 400 ml eingeengt und zur Nachfällung gekühlt. Der Niederschlag wird über eine Kühlfritte abgetrennt und mit wenig gekühltem Aceton gewaschen. Nach Trocknung erhält man 7,3g acetonunlösliche Fraktion 2.100 g freeze-dried bacterial biomass (Mycobaccerium avium strain D4) is extracted three times with 10 times the amount of chloroform / methanol (2: 1). After removal of the extractant by distillation, 1 g of extract is obtained, which is dissolved in 150 ml of chloroform. The chloroform solution is allowed to flow slowly and with stirring at room temperature in 3 times the amount of acetone. The precipitate is separated on a frit and washed with a little acetone. After drying in a desiccator, 6 g of acetone-insoluble fraction 1 are obtained. The acetone-soluble is concentrated to about 400 ml and cooled to reprecipitate. The precipitate is separated via a cooling frit and washed with a little cooled acetone. After drying, 7.3 g of acetone-insoluble fraction 2 are obtained.

Das Acetonlösliche wird auf 100ml eingeengt, mit dem gleichen Volumen Äthanol versetzt und auf O⁰C gekühlt. Nach Abtrennung des Niederschlags über eine Kühlfritte und Waschung und Trocknung im Exsikkator erhält man 1,5g acetonunlösliche Fraktion 3. Aus der Lösung werden nach Entfernung des Lösungsmittels 13,0g einer acetonlöslichen Fraktion 4 erhalten.The acetone-soluble is concentrated to 100ml, mixed with the same volume of ethanol and cooled to ⁰ ° C. After removal of the precipitate via a cooling frit and washing and drying in a desiccator gives 1.5 g acetone-insoluble fraction 3. From the solution, after removal of the solvent, 13.0 g of an acetone-soluble fraction 4 are obtained.

Example 2

Man verfährt wie in Beispiel 1 beschrieben, wobsi aber auf eine fraktionierte Fällung verzichtet wird. Der Extrakt (37g) wird in Chloroform gelöst, und man läßt die Lösung bei Raumtemperatur in Aceton einfließen. Die Abtrennung des Acetonunlöslichen wird über eine Fritte vorgenommen. Es wird mit wenig Aceton nachgewaschen. Nach Trocknung im Exsikkator erhält man 8,2g acetonunlösliche Fraktion 1. Aus der Lösung wurde nach Entfernung des Lösungsmittels 24,4 g acetonlösliche Fraktion isoliert, die den Fraktionen 2-4 des Beispiels 1 entspricht.The procedure is as described in Example 1, but waiving a fractional precipitation. The extract (37 g) is dissolved in chloroform and the solution is allowed to flow in acetone at room temperature. The separation of the acetone insoluble is carried out via a frit. It is washed with a little acetone. After drying in a desiccator, 8.2 g of acetone-insoluble fraction 1 are obtained. From the solution, after removal of the solvent, 24.4 g of acetone-soluble fraction corresponding to fractions 2-4 of Example 1 are isolated.

Die tierexperimentelle Prüfung ergab, daß die immunologisch wirksamen Fraktionen keine Tuberkulinsensitivität herbeiführen.The animal experiment showed that the immunologically active fractions do not cause tuberculin sensitivity.

Die immunstimulierende Wirksamkeit der srfincJungsgemäßen Mittel wurde wie folgt geprüft:The immunostimulatory efficacy of the drugs was tested as follows:

Da die Lipidfraktionen in Wasser nicht oder nur ungenügend löslich sind, wurden die Extrakte in geeigneten Ölen gelöst, die außerdem mit Emulgatoren versetzt waren. Die zu prüfenden Antigene, wie z. B. rote Blutkörperchen, Serumproteine, DNP-Serumproteine, Bakterien oder Vieren, wurden in der wäßrigsn Phase hinzugefügt, so daß eine Wasser-in-ÖI-Emulsion entstand, die an die Versuchstiere, z.B. Mäuse, Meerschweinchen oder Hühner, verimoft wurde. Als Vergloichsbasis wurde die Adjuvanswirkung kompletter abgetöteter Mykobakterien vom Stamm M. butyricum, wie sie z. B. im kompletten Freund'schen Adjuvans verwendet werden, oder von Aluminiumphosphat oder von nichtadjuviertem Antigen herangezogen. Dabei wurde ein deutlicher Stimulierungseffekt gegenüber dem nicht-adjuviorten Antigen und dem mit Aluminiumphosphat versetzten Antigen festgestellt. Im Vergleich zu kompletten M.butyricum wurde ein mindestens gleichguter oder bessere Effekt festgestellt, wobei aber die unerwünschten Nebenwirkungen des M.butyricum, Abszeßbildung und Tuberkulinsensibilisierung, ausblieben.Since the lipid fractions are not or only insufficiently soluble in water, the extracts were dissolved in suitable oils, which were also mixed with emulsifiers. The antigens to be tested, such. Red blood cells, serum proteins, DNP serum proteins, bacteria or viruses were added in the aqueous phase to give a water-in-oil emulsion which wasimproved on the experimental animals, eg mice, guinea pigs or chickens. The adjunctive effect of complete killed mycobacteria of the strain M. butyricum, as described, for example, was found to be true. B. used in complete Freund's adjuvant, or of aluminum phosphate or non-adjuvanted antigen. In this case, a significant stimulating effect on the non-adjuviorten antigen and the aluminum phosphate added antigen was found. Compared to complete M. butyricum, an at least equal or better effect was noted, but the undesirable side effects of M. butyricum, abscess formation and tuberculin sensitization, were absent.

Der immunstimulierende Effekt der erfindungsgemäSen Mittel ist schon bei sehr geringer Dosierung deutlich ausgeprägt und wird in folgenden Beispielen näher erläutert:The immunostimulating effect of the agents according to the invention is clearly pronounced even at very low dosages and is explained in more detail in the following examples:

Example 3

Von den Fraktionen 1-4 wurde in jewe'ls 100ml einer geeigneten Öl-Emulatormischung so viel der betreffenden Fraktion gelöst, wie gemäß den in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Ausbeuten einer Gesamtbakterienmenge von 4 mg Trockengewicht entsprechen. Die gemäß der Versuchstierzahl notwendige Öl-Adjuvansmenge wurde mit so viel Schafblutzellen in physiologischer Kochsalzlösung vermischt, daß pro Injektionsdosis von 0,2 oder 0,5ml stets 5 χ 10⁸ Schafblutkörperchen enthalten waren. 14 Tagenach der Injektion wird den Mäusen Blut entnommen und der Hämaggiulinationstiter im Taktasy-Test bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, ddß die Fraktionen 2,3 und 4 deutlich stärker stimulieren als das in entsprechender Menge eingesetzte M. butyricum.Of the fractions 1-4, as much of the relevant fraction was dissolved in each 100 ml of a suitable oil-emulsifier mixture, as correspond to the yields given in Examples 1 and 2 of a total amount of bacteria of 4 mg dry weight. The amount of oil adjuvant required according to the experimental animal number was mixed with so much sheep blood cells in physiological saline solution that for each injection dose of 0.2 or 0.5 ml, 5 × 10 ⁸ sheep blood cells were always contained. 14 days after the injection, the mice are bled and the hemaggliulatory titer is determined in the tactasy test. The results in Table 1 show that fractions 2, 3 and 4 stimulate significantly more strongly than M. butyricum employed in an appropriate amount.

Example 4

Die Fraktionen 2-4 werden in einem Mischungsverhältnis von 2:1:4 in 5fach höhere Dosis wie in Beispiel 3 in der Öl-Emulgatormischung gelöst. Als Antigene wurden Rindergdmmaglobulin (RGG und DNP-RG) in wäßriger Lösung eingesetzt und mit der Öl-Adjuvancmischung emulgiert. Die Antikörpertiter wurden 2,3 und 4 Wochen nach der Antigeninjektion bestimmt. WieTabelle 2 ausweist, zeigt die Mischung der Fraktionen einen stärkeren Stimulierungseffekt als das in der gleichen Menge wie in Beispiel 3 eingesetzte M. butvricum.The fractions 2-4 are dissolved in a mixing ratio of 2: 1: 4 in 5 times higher dose as in Example 3 in the oil-emulsifier mixture. Bovine immunoglobulin (RGG and DNP-RG) were used as antigens in aqueous solution and emulsified with the oil adjuvant mixture. Antibody titers were determined 2.3 and 4 weeks after antigen injection. As Table 2 indicates, the mixture of fractions shows a stronger stimulating effect than the M. butvricum used in the same amount as in Example 3.

Table 1

Frakt. I Il III IV M.butyr. Dazu 2. Beispiel (Versuch 29)Fracture I II III IV M. Butyr. For this 2nd example (experiment 29) η (Mäuse) 15 15 15 15 15η (mice) 15 15 15 15 15 0 HAH-Titer (geometr. Mittel) 384 891 758 758 2390 HAH titer (geometric mean) 384 891 758 758 239 33 4 Wochen4 weeks Tabelle 2 AntigenTable 2 antigen ÖladjuvansmitÖladjuvansmit 0Titernach20Titernach2 7,2 + 1,1 9,2 ±1,1 6,1 ±1,6 8,6 ± 0,57.2 + 1.1 9.2 ± 1.1 6.1 ± 1.6 8.6 ± 0.5 8,0 ±1,0 9,6 ± 0,0 8,2 ± 0,8 8,7 ± 0,88.0 ± 1.0 9.6 ± 0.0 8.2 ± 0.8 8.7 ± 0.8 RGG DNP-RGGRGG DNP-RGG M.smegm. Extrakt Fr. 2-4 M.smegm. Extrakt Fr. 2-4M.smegm. Extract Fr. 2-4 M.smegm. Extract Fr. 2-4 6,2 ±1,2 6,9 ± 2,3 4,11 ±1,3 5,1 ±3,06.2 ± 1.2 6.9 ± 2.3 4.11 ± 1.3 5.1 ± 3.0

Claims

1. A process for the preparation of immunostimulating agents based on mycobacteria, characterized in that a isolated in a known manner from mycobacteria Li'iidextrakt is dissolved in chloroform and impregnated by incorporation in acetone in an insoluble fraction and only the soluble portion in total or from it isolated fractions are used alone or in grain, "nation.

2. A process for preparing immunostimulating agent according to claim 1, characterized in that lipid extract is dissolved in the 3- to 5-fold parts by weight of chloroform and the insoluble fractions are separated by introducing into 3 times the volume of acetone.

3. The method according to claim 1, characterized in that the lipid extract is introduced at 20 to 25 ° C in acetone.

Λ. An ancestor according to claim 1, characterized in that the acetone-soluble fraction is subjected to further fractionation at a temperature of 0 to 5 ⁰ C and optionally with the addition of ethanol.

5. The method according to claim 1-4, characterized in that Mycobacteria biomass of pathogen and apathogamous mycobacteria, but preferably M.avium, strain D4, M. bovinum, strain AN 5, and M. humanum, strain H 37 Rv, separately or in any Mixing ratio used.