DD278873A1

DD278873A1 - Amperometrischer biosensor fuer den einsatz in organischen loesungsmitteln

Info

Publication number: DD278873A1
Application number: DD32404488A
Authority: DD
Inventors: Uwe Spohn; Peter Miethe; Harald Voss
Original assignee: Univ Halle Wittenberg
Priority date: 1988-12-27
Filing date: 1988-12-27
Publication date: 1990-05-16

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein amperometrischer Biosensor fuer den Einsatz in organischen Loesungsmitteln. Ihr Ziel ist ein Sensor fuer die quantitative Bestimmung von in organischen Loesungsmitteln geloesten oder solubilisierten Substanzen mit vergleichsweise geringem apparativen, zeitlichen und Chemikalienaufwand. Erfindungsgemaess besteht der amperometrische Biosensor aus einem fuer die zu bestimmende Substanz permeablen Stuetzsystem und einem amperometrischen Messsystem, zwischen denen eine duenne, aus einer in der Probenloesung nicht loeslichen und den Biokatalysator enthaltenden lyotropen Mesophase bestehende Katalysatorschicht gelagert ist. Zur Herstellung der Katalysatorschicht werden in einer aus einem ternaeren oder pseudoternaeren System des Typs Tensid/organisches Loesungsmittel/Wasser bestehenden lyotropen Mesophase als Biokatalysator dienende Enzyme, Synzyme, enzymmarkierte Proteine, Mikroorganismen, Zellorganellen, tierische und pflanzliche Zellen solubilisiert. Die zu bestimmende, in der Probenloesung geloesten oder solubilisierten Substanzen diffundieren ueber das permeable Stuetzsystem in die Katalysatorschicht, in der die biokatalysierte Bestimmungsreaktion ablaeuft und die dabei verursachte Aenderung der Konzentration freigesetzter und verbrauchter elektroaktiver Substanzen amperometrisch oder voltametrisch gemessen und mit der Konzentration des Analyten korreliert wird.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen amperometrischen Biosensor für den Einsatz in organischen Lösungsmitteln bei der Lebensmittel-, klinischen, biochemischen und Prozeßanalytik zur Bestimmung gelöster und solubilisierter Substanzen.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Bei den in der Literatur beschriebenen amperometrischen Biosensoren handelt es sich um für die Analyse wäßriger Probenlösungen entwickelte Meßsysteme, die nicht oder nur in Ausnahmefällen in nichtwäßrigen Lösungsmitteln eingesetzt werden könr.en. Die Bestimmung von in organischen Lösungsmitteln gelösten und solubilisierten organischen Substanzen wird bisher durch Flüssigchromatographie, Gaschromatographie, Titrimetrie, Photometrie und Refraktometrie mit relativ großem apparativen, zeitlichen und Chemikalienaufwand durchgeführt. Die genannten Analysenverfahren sind nicht zur In-Situ-Überwachung von in nichtwäßrigen Lösungsmitteln ablaufenden chemischen und biochemischen Reaktionen und Prozessen geeignet.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist ein biokatalytischer Sensor für den Einsatz in organischen Lösungsmitteln und die Bestimmung darin gelösu r oder solubilisierter organischer Substanzen mit vergleichsweise geringem apparativen, zeitlichen und Chemikalienaufwand.

Darlegung des Wesens dar Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist ein amperometrischer Biosensor für den Einsatz in organischen Lösungsmitteln und die Bestimmung darin gelöster oder polubilisiertur Substanzen, wobei die Substanzen Flüssigkeiten, Gase und Feststoffe sein können. Erfindungsgemäß wird zwischen einem für die zu bestimmende Substanz permeablen Stü'zf.ystem und einem Signaltransduktor eine dünne Katalysatorschicht aus einer nicht in der Probenlösung löslichen, chemisch und physikalisch gegenüber dem Lösungsmittel stabilen und einen Biokatalysator oder ein System von Biokatalysatoren enthaltenden lyotropen Mesophase fixiert. Die lyotrope Mesophase kann auf der Basis von ternären oder pseudoternären Systemen des Typs Tensid/ organisches Lösungsmittel/Wasser hergestellt werden. In der Mesophase werden Biokatalysatoren, Kofaktoren, Redoxmediatoren und -Indikatoren, Leitsalze und Puffersysteme solubilisiert.

Als Tensidkomponente werden nichtionische, anionische, kationische, zwitterionische und kombinierte sowie polymere oberflächenaktive Verbindungen eingesetzt.

Geradkettige, verzweigte und zyklische Alkane, Toluen, Benzen, Xylen, Phtalsäureester, Butylacetat sowie deren fluor- und chlorsubstituierte Derivate werden als nicht mit Wasser mischbare Lösungsmittelkomponente der lyotropen Mesophase eingesetzt. Als Biokatalysatoren werden Enzyme, Synzyme, enzymmarkierte Proteine, Mikroorganismen, Zellorganellen, tierische und pflanzliche Zellen in der lyotropen Mesophase solubiiisiert.

Die in der lyotropen Mesophase ablaufenden biokatalytischen Umsetzung werden über freigesetzte bzw. verbrauchte elektroaktive Substanzen amperometrisch oder voltametrisch verfolgt und mit der Konzentration des Analyten korreliert. Das Stützsystem ist so ausgelegt, daß die Katalysatorschicht am Signaltransduktor fixiert ist, eine konstante und definierte Schichtdicke aufweist sowie von der Probenlösung abgetrennt ist. Das für die zu bestimmende Substanz permeable Stützsystem besteht aus einer porösen Schicht, die z. B. aus einer porösen und/oder einer perforierten lösungsmittelbeständigen Membran aus Polytetrafluorethylen, Polyvinylidendifluorid, fluorierten Ethylen/Propylenmischpolymerisaten oder Papier aufgebaut und am Sensorkörper montiert ist, wobei das Stützsystem gegebenenfalls durch Gewebe aus Metalldraht oder Polymerfasern verstärkt wird.

Ausführungsbeispiele

In der zugehörigen Zeichnung zeigen

Fig. 1: die Schnittdarstellung des amperometrischen Biosensors mit der lyotropen Mesophase solubilisierter

Alkoholdehydrogenase und Redoxmediator sowie Fig. 2: die Schnittdarstellung des amperometrischen Biosensors mit interner Abtrennung und Reduktion des durch die lyotrope Mesophase diffundierenden Sauerstoffs durch mittels in dieser Phase immobilisierter Hefe Saccharomyces cerevisiae kolin.

Beispiel 1

Die in Fig. 1 gezeigte Ausführungsform des amperometrischen Biosensors besteht aus der im Sensorkörper 1 eingebauten amperometrisch und voltametrisch zu betreibenden 3-Elektrodenanordnung die die Graphit-Indikator-Elektrode 2 die Ag/AgCI-Gegenelektrode 5 sowie die Ag/AgCI-Referenzelektrode 6 enthält, und der als aktive Sensormembran ausgeführten lyotropen Mesophase 2a, die durch die poröse Polytetrafluorethylen(PTFE)-Membran 3, das Stütznetz 4 aus feinem Stahldraht und die Distanzscheibe 2 b fixiert wird. Das Stütznetz und die poröse PTFE-Membran werden durch den an- und abschraubbaren Haltering 9 am Sensorkörper plaziert. Die Ringkammer 10 dient zur Aufnahme überschüssiger Substanz der lyotropen Mesophase. Der als Dichtung dienende Stauchring 8 aus Weich-PTFE ist in der Ringkammer gelagert.

Die Gegenelektrode und die Referenzelektrode werden durch die aus poröser Magnesiakeramik bestehenden Diaphragmen 7 a und bzw. 7 b von der lyotropen und elektrisch leitenden Mesophase abgetrennt. Der Anschluß der Elektroden an einen zur Signalaufzeichnung dienenden Polarographen erfolgt über die elektrischen Zuleitungen 11,12 und 13, wobei zwischen Leitung 13 und der Indikatorelektrode der Kontaktstecker 14, der Kontaktierungsbolzen 15 und die Kontaktierungsfeder 16 auswechselbar eingebaut sind. Die elektrischen Zuleitungen und du Kontaktierbolzen werden durch die mit den Haltestollen 19 vfirsehene Abschlußkappe 18 festgehalten, die durch den Schraub ing 17 fixiert ist.

An der Indikatorelektrode 1 wird der in der lyotropen Mesophase, bestehend aus 8,55 Ma.-% Polyoxyethylen-7-nonylphenylether, 76,84 Ma.-% η-Hexan, 0,13Ma.-% NAD*, 0,05Ma.-% aus Hefe gewonnener Alkoholdehydrogenase (ADH) und wäßriger 0,1 M Phosphatpufferlösung mit einem pH 7,5-8,0, enthaltene Redoxmediator Kalium-ß-naphtochinon-4-sulfonat Il (0,11 mg/ml Wasser) anodisch nach

^0H OH

+ 2 H⁺ + 2 e"

I II

regeneriert.ß-Naphtochinon-4-sulfonat oxydiert das bei der Alkoholbestimmung.sreaktion nach

R-CHr-OH + NAD* ^ R-Cg + NADH (2)

entstehende NADH entsprechend Reaktion

+ NADH + I I —" 'W~~ /'."ti ~*~ IV-M-* S l*\\

wodurch der Kofaktor NAD⁺ elektrochemisch regeneriert wird. An der in 0,05M KCi eintauchenden Ag/AgCI-Gegenelektrods läuft dabei die Reaktion

AgCI + e -* Ag + Cl" (4)

ab. Durch den zur Meßsignalaufzeichnung verwendeten Polarographen wird zwischen der Indikator- und der ReferenzelekUode eine Polarisationsspannung von +0,06V angelegt und der über die Indikatorelektrode fließende, die Reaktion (1) bewirkende Elektrolysestrom gemessen.

Die Dicke der lyotropen Mesophase 2a wird durch die Distanzscheibe 2b zwischen 0,05 und 0,15mm festgelegt. Der mittlere Porendurchmesser von 5-15 pm in der Membran 3 ermöglicht den für die Funktion des Sensors notwendigen Stoffaustausch zwischen lyotroper Mesophase und der Probenlösung.

Die beschriebene Ausführungsform des biokatalytischen Sensors erlaubt die amperometrische und voltametrische Bestimmung aliphatischen Alkohole mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen in η-Hexan und in anderen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. i Oktan, n-Nonan, n-Heptan und η-Dekan im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1OmM.

Beispiel 2

Die in Fig. 2 gezeigte Ausführungsform des biokataly'ischen Sensors besteht aus einem in den Sensorkörper 1 eingebauten inneren amperometrischen p_o,-Sensor 29 mit einer dünnen homogenen PTFE-Membran 30, der in potontiostatischer 3-Elsktrodenanordnung, bestehend aus einer Pt-Indikator-Elektrode 2, einer Gegenelektrode aus Silber 5 und einer Ag/AgCI-Referonzelektrode 6, ausgeführt ist und der als aktive Sonsormembran gestalteten lyotropen Mesophase 2a.

Die Einstellung der Sensormembrandicke auf 0,1-0,5mm durch die Distanzscheibe 2c und die Fixierung durch die poröse PTFE-Membran 3 (mittlerer Porendurchmesser 10-40Mm), die perforierte Stützmembran aus PTFE 4b sowie den Haltering 9 erfolgt analog wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Lagerring 2c dient die Fixierung des ρο,-Sensors.

Die lyotrope Mesophase setzt sich au·: 8,55Ma.-% Polyethylen-7-nonylphenylether, 76,84Ma.-% η-Hexan und 14,61 Ma.-% Wasser zusammen. Pro ml Wasser enthält die Mesophase 10mg Hefe Saccharomyces Kolin, wobei die Hefemenge auf die Trockenmasse bezogen ist. Die zur Sensormembranherstellung verwendete Hefesuspension wird mit 0,05M Phosphatpufferlösung auf pH 7,7 eingestellt.

Bei der stoffwechselphysiologischen Umsetzung der zu bestimmenden aliphatischen Alkohole wird durch die immobilisierte Hefe Sauerstoff verbraucht, wodurch der Sauerstoffpartialdruck in der aktiven Sensormembran abnimmt. Die Abnahme des Sauerstoffpartialdruckes korreliert mit der durch die poröse PTFE-Membran 3 diffundierenden und in der Probenlösung enthaltenen Alkoholmenge.

Die beschriebene Ausführungsform des biokatalytischen Sensors erlaubt die amperometrische Bestimmung aliphatischer Alkohole mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen in η-Hexan und in i-Oktan.

Claims

Patentanspruch:

1. Amperometrischer Biosensor für den Einsatz in organischen Lösungsmitteln zur Bestimmung von gelösten und von solubilisierten Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen einem für die zu bestimmende Substanz permeablen Stützsystem und einem amperometrischen Meßsystem eine dünne Katalysatorschicht aus einer nicht in der Probenlösung löslichen, chemisch und physikalisch gegenüber dem Lösungsmittel stabilen, den Biokatalysator oder ein System von Biokatalysatoren enthaltenden lyotropen Mesophase fixiert ist.
2. Biokat:<lytischer Sensor gemäß Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der lyotropen Mesophase ternäre oder pseudoternäre Systeme des Typs Tensid/organisches Lösungsmittel/ Wasser dienen, wobei als Tensid- und Lösungsmittelkomponente reine Substanzen oder Stoffgemische verwendet und in der Mesophase Biokatalysatoren, Kofaktoren, Redoxmediatoren und -Indikatoren, Leitsalze und Puffersysteme solubilisiert werden.
3. Biokatalytischer Sensor gemäß Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Tensid nichtionische, anionische, kationische, zwitterionische und kombinierte sowie polymere oberflächenaktive Verbindungen und als organische Lösungsmittel nicht im Wasser mischbare Flüssigkeiten, z. B. auf der Grundlage geradkettiger, verzweigter und zyklischer Alkane, von Toluen, Benzen, Xylen, Phtalsäureester, Butylacetat sowie deren fluor- und chlorsubstituierte Derivate eingesetzt werden.
4. Biokatalytischer Sensor gemäß Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Biokatalysatoren Enzyme, Synzyme, enzymmarkierte Proteine, Mikroorganismen, Zellorganellen, tierische und pflanzliche Zellen in der lyotropen Mesophase solubilisiert werden.
5. Biokptalytischer Sensor gemäß Punkt 1,2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß als amperometrisches Meßsystem eine mit konstanter oder nach einem vorgegebenen Zeitregime veränderter elektrischer Spannung polarisierte 2-, 3-, oder Mehrelektrodenanordnung eingesetzt wird.
6. Biokatalytischer Sensor gemäß Punkt 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das permeable Stützsystem aus einer porösen Schicht besteht und z. B. aus einer porösen und/oder einer perforierten lösungsmittelbeständigen Membran aus Polytetrafluorethylen, Polyvinylidendifluorid, fluorierten Ethylen/Propylenmischpolymerisaten oder Papier aufgebaut und am Sensorkörper montiert ist, wobei das Stützsystem gegebenenfalls durch ein Gewebe aus Metalldraht oder Polymerfasern verstärkt wird.