DD277088A1 - METHOD OF ISOLATING BENZYLPENICILLIN FROM MICROBIOLOGICAL BREEDING - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung der im Filtrat der Benzylpenicillinkulturbruehe geloesten Eiweissstoffe und der Isolierung des Benzylpenicillin. In einem ersten Schritt wird die Biomasse aus der mikrobiologischen Kulturbruehe mit herkoemmlichen Filtern abgetrennt. Es wurde erfindungsgemaess gefunden, dass die in dem Filtrat der Benzylpenicillinkulturbruehe geloesten Eiweissverbindungen vollstaendig mit Hilfe von Ultrafiltrationsmembran abgetrennt werden koennen. Das Filtrat wird dabei auf mindestens 120 seines Ausgangsvolumens mit Hilfe der Ultrafiltration konzentriert. Nach Erreichen des Konzentratendvolumens wird eine Diafiltration angeschlossen. Aus dem anfallenden Filtrat, welches frei von Eiweissen ist, wird das Benzylpenicillin mit einem organischen Loesungsmittel ohne Emulsionbildung extrahiert.The invention relates to a process for the separation of the proteins dissolved in the filtrate of the benzylpenicillin culture broth and the isolation of the benzylpenicillin. In a first step, the biomass is separated from the microbiological culture broth with conventional filters. It has been found according to the invention that the protein compounds dissolved in the filtrate of the benzylpenicillin culture broth can be completely separated off with the aid of ultrafiltration membrane. The filtrate is concentrated to at least 120 of its initial volume by means of ultrafiltration. After reaching the concentrate final volume a diafiltration is connected. From the resulting filtrate, which is free of proteins, the benzylpenicillin is extracted with an organic solvent without emulsification.
Description
Bei der mikrobiologischen Herstellung von Benzylpenicillin fallen Kulturbrühen an, die neben dem Benzylpenicillin, der Biomasse und Nährbodenresten, auch eine erhebliche Menge an Eiweißverbindungen in gelöster Form enthalten, die bei der Extraktion des Benzylpenicillins mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln aus dem Filtrat der Kulturbrühe oder der Kulturbrühe selbst eine Emulsionsbildung bewirken. Diese Emulsionsbildung kann so stark sein, daß die Extraktion undurchführbar wird.The microbial production of benzylpenicillin produces culture broths which, in addition to the benzylpenicillin, the biomass and nutrient residue, also contain a considerable amount of protein compounds in dissolved form which are obtained by extraction of the benzylpenicillin with the aid of organic solvents from the filtrate of the culture broth or culture broth itself cause an emulsion formation. This emulsion formation can be so strong that extraction becomes impracticable.
Es sind deshalb eine Reihe von Maßnahmen bekannt, die das Ziel haben, eine Emulsionsbildung bei der Extraktion zu verhindern.There are therefore a number of measures known which have the aim to prevent emulsion formation during extraction.
(R.K.Finn, Amer. Pat. Nr.2563779)(R.K. Finn, Amer. Pat. No. 2573779)
So ist bekannt, daß entsprechende Stoffe zugesetzt werden, um eine Emulsionsbildung zu vermeiden. Solche Zusatzstoffe sind sulfonierte höhermolekulare Kohlenwasserstoffe, höhermolekulare Allylester der Sulfobernsteinsäure und dei polyalkylsubstituierten Benzolsulfonsäure. Weiterhin sind als emulsionsverhindernde Zusatzstoffe kationische Ammoniumverbindungen Alk-oxylierter Amine, Alkylammoniumhaloger.ide und Alkylarylsulfonate bekannt.It is known that corresponding substances are added in order to avoid emulsification. Such additives are sulfonated higher molecular weight hydrocarbons, high molecular weight allyl esters of sulfosuccinic acid and polyalkyl-substituted benzenesulfonic acid. Furthermore, cationic ammonium compounds of alkoxylated amines, alkylammonium halide erides and alkylarylsulfonates are known as emulsion inhibiting additives.
Mit einem entsprechend ausgewählten Zusatzstoff läßt sich die Benzylpenioillinextraktion sicher beherrschen, diese Stoffe haben aber jedoch den Nachteil, daß sie zu Abwasserbelastungen führen bzw. die Abwasserreinigung erheblich erschweren.With a suitably selected additive Benzylpenioillinextraktion can certainly dominate, but these substances have the disadvantage that they lead to wastewater pollution and make wastewater treatment considerably more difficult.
Außerdem führt der Zusatz derartiger Stoffe zu einer Verschlechterung des Stoffübergangs. Der Aufwand für die Extraktion muß damit erhöht werden.In addition, the addition of such substances leads to a deterioration of the mass transfer. The effort for the extraction must be increased.
Da sich die Emulsionsbildung durch eine pH-Änderung in den sauren Bereich, wie überwiegend bei der Benzylpenicillinextraktion angewendet, erhöhl, wurden Arbeiten bekannt, die das Ziel haben, die Extraktion bei pH-Werten von 4 bis 6 durchzuführen. Dies wurde durch Zusatz von Amberlite LA-2 zum, als Extraktionsmittel verwendeten, n-Butylacetat erreicht.As emulsification increases due to a pH change in the acidic region, such as predominantly used in benzylpenicillin extraction, work has been reported which aims to perform the extraction at pHs of 4 to 6. This was achieved by adding Amberlite LA-2 to the n-butyl acetate used as extractant.
Der Nachteil dieser Methodik besteht darin, daß das Benzylpenicillin in jedem Fall erst reextrahiert werden muß, bevor es als feste Substanz isoliert werden kann, um den Materialaufwand in Grenzen zu halten.The disadvantage of this method is that the Benzylpenicillin must first be reextracted before it can be isolated as a solid substance in order to keep the cost of materials in limits.
Weiterhin sind verschiedene Zusätze bekannt, d>e das Entfernen der für die Emulsionsbildung verantwortlichen Stoffe in der mikrobiologischen Brühe sorgen soll.Furthermore, various additives are known which are intended to remove the substances responsible for emulsification in the microbiological broth.
Solche Zusätze reichen von hochmolekularen Polyelektrolyten, entsprechenden Enzymen bis zu Aceton und Calciumchlorid.Such additives range from high molecular weight polyelectrolytes, corresponding enzymes to acetone and calcium chloride.
Alle diese Zusatzstoffe zur Entfernung der Eiweiße führen zu einem zusätzlichen Materialaufwand und zu einer erhöhten Abwasserbelastung.All of these additives for removing the proteins lead to an additional cost of materials and to increased wastewater pollution.
Es wurde auch die Koagulation der Eiweiße durch Erhitzen der mikrobiologischen Kulturbrühe beschrieben. Temperaturen über BO0C sind dabei angegeben.Coagulation of the proteins by heating the microbiological culture broth was also described. Temperatures above BO 0 C are indicated.
Diese Methodik führt beim Benzylpenicillin neben einem hohen Energieaufwand dazu, daß ein Teil des Benzylpenicillins auf Grund der hohen Temperaturempfindlichkeit zerstört wird.This methodology leads benzylpenicillin in addition to a high energy expenditure that a part of the benzylpenicillin is destroyed due to the high temperature sensitivity.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines ökonomischen Verfahrens mit verringerter Abwasserbelastung zur Entfernung der emulsionsbegünstigenden Stoffe aus der mikrobiologischen Benzylpenicillinkulturbrühe in einer Form, die die Isolierung der Eiweiße ermöglicht.The object of the invention is to provide an economical process with reduced wastewater load for removing the emulsion-promoting substances from the microbiological Benzylpenicillinkultur broth in a form that allows the isolation of the proteins.
Dio Aufgabe dor Erfindung ist das Auffinden oines Verfahrens zur Abtrennung der in dom Kulturfiltrat der Bonzylponicillinkulturbrühe gelösten Eiweißstoffe, ohne daß zusätzliche Materialion dafür eingesetzt werden, die zu ontsprei.honden Koston führen und das entstehende Abwasser belasten bzw. die Reinigung des Abwassers erschweren. Es soll keine Zerstörung dos Bonzylpenicillins durch thermische Belastungen auftreten.The object of the invention is to find a method for separating the proteins dissolved in the culture filtrate of the Bonzyl ponicillin culture broth without the use of additional material ions which lead to ontsprei.honden Koston and pollute the resulting wastewater or make the purification of wastewater difficult. There should be no destruction of the bonzylpenicillin due to thermal stress.
In bekannter Weise wird in einem ersten Schritt die Biomasse aus der mikrobiologischen Kulturbrühe mit herkömmlichen Filtern abgetrennt. Es ist zweckmäßig dann die gelöston Eiweißverbindungen aus dem dnboi erhaltenen Filtrat zu entfernen. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß die in dem Filtrat der Benzylpenicillinkulturbrühe gelösten Eiweißverbindungen vollständig mit Hilfo von Ultrafiltrationsmembranon abgetrennt worden können.In a known manner, the biomass is separated from the microbiological culture broth with conventional filters in a first step. It is then appropriate to remove the dissolved protein compounds from the filtrate obtained from dnboli. According to the invention, it has been found that the protein compounds dissolved in the filtrate of the benzylpenicillin culture broth can be separated completely by ultrafiltration membrane-on.
Es wurde weiterhin gefunden, daß das Benzylpenicillin von den Ultrafiltrationsmembranen in Abhängigkeit von der Membrandurchlässigkeit in gewissem Umfang konzentriert wird. Es ist somit zweckmäßig, einen relativ durchlässigen Ultrafiltraticnsmembrantyp einzusetzen, zumal gefunden wurde, daß die in der Benzylpenicillinkulturbrühe gelösten Eiweiße unabhängig vom Porendurchmesser der handelsüblichen Ultrafiltrationsmembranen praktisch vollständig zuiückgehalten werden.It was further found that the benzylpenicillin is concentrated by the ultrafiltration membranes depending on the Membrandu r chlässigkeit to some extent. It is thus expedient to use a relatively permeable ultrafiltration membrane type, especially since it has been found that the proteins dissolved in the benzylpenicillin culture broth are virtually completely retained irrespective of the pore diameter of the commercially available ultrafiltration membranes.
Erfindungsgemäß wird das Filtrat auf mindestens V20 seines Ausgangsvolumens mit Hilfe der Ultrafiltration konzentriert. Das dabei anfallende Filtrat ist praktisch frei von Eiweißen und die Extraktion von Benzylpenicillin in ein entsprechendes organisches Lösungsmittel verläuft ohne Emuisionsbildung. Zusätze, die eine Emulsionsbildung verhindern, sind nicht erforderlich.According to the invention, the filtrate is concentrated to at least V20 of its initial volume by means of ultrafiltration. The resulting filtrate is virtually free of proteins and the extraction of benzylpenicillin in a corresponding organic solvent proceeds without Emuisionsbildung. Additives that prevent emulsification are not required.
Erfindungsgemäß wird nach Erreichen des Konzentratendvolumens eine Diafiltration angeschlossen, um das im Konzentrat erhaltene Benzylpenicillin weitestgehend zu entfernen. Die zuzusetzenden Wassermengen betragen < 20% des Ausgangsvolumens.According to the invention, after reaching the concentrate end volume, a diafiltration is connected in order to remove as far as possible the benzylpenicillin obtained in the concentrate. The amounts of water to be added amount to <20% of the initial volume.
Es wurde gefunden, daß das nach der Diafiltration erhaltene Konzentrat geeignet ist, um daraus durch Fällung oder andere bekannte Methoden die Eiweißstoffe zu isolieren und einer Nutzung zuzuführen.It has been found that the concentrate obtained after diafiltration is suitable for isolating and using the proteins by precipitation or other known methods.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden ein eiweißfreies Kulturfiltrat, aus dem überraschenderweise ohne anderweitige Zusätze das Benzylpenicillin auf herkömmliche Art mit einer hohen Stoffübergangsrate extrahiert werden kann, und ein benzylpenicillinarmes Konzentrat aus dem die Eiweißstoffe auf bekannte Art isoliert werden können, erhalten.In the method according to the invention, a protein-free culture filtrate, from which surprisingly without any other additives benzylpenicillin can be extracted in a conventional manner with a high mass transfer rate, and a benzylpenicillinarmes concentrate from which the proteins can be isolated in a known manner.
Zusatzstoffe für die Extraktion werden nicht benötigt.Additives for extraction are not needed.
Die Abwasserbelastung wird dadurch und durch die Entfernung der Eiweißstoffe minimiert.The waste water load is thereby minimized and by the removal of the proteins.
Die Eiweißstoffe können einer volkswirtschaftlichen Nutzung zugeführt werden.The proteins can be used for economic purposes.
Die nachfolgenden Beispiele sollen das erfindungsgomäße Verfahren näher erläutern.The following examples are intended to illustrate the erfindungsgomäße method in more detail.
1001 Kulturfiltrat mit einer Benzylpenicillinkonzentration von 30000IE/ml werden in einer Ultrafiltrationsanlage mit hohen Durchlässigkeitswerten auf 4 bis 51 konzentriert. Das Permeat wird ohne Zusätze und weitere Behandlung in einer Extraktionsanlage zur Benzylpenicillinextraktion eingesetzt. Am Eingang der Extraktionsanlage wird das Permeat auf pH ~ 2 angesäuert. Das Benzylpenicillin wird mit n-Butylacetat aus dem Permeat extrahiert.100 L of culture filtrate having a benzene-benzidine concentration of 30,000 U / ml are concentrated to 4 to 51 in an ultrafiltration plant with high permeability values. The permeate is used without additives and further treatment in an extraction plant for Benzylpenicillinextraktion. At the entrance to the extraction plant, the permeate is acidified to pH ~ 2. The benzylpenicillin is extracted from the permeate with n-butyl acetate.
Nach Erreichen eines Konzentratvolumens von 4 bis 51 werden kontinuierlich 201 Wasser so dem Konzentrat zugesetzt, daß ein Konzentratvolumen von SI nicht überschritter, wird. Das dabei erhaltene Permeat wird mit dem Permeat der Auf konzentrierung vereinigt und verarbeitet.After reaching a concentrate volume of 4 to 51, 201 of water are continuously added to the concentrate so that a concentrate volume of SI is not exceeded. The resulting permeate is combined with the permeate on the concentration and processed.
Sind die 201 Wasser verbracht, wird das Konzentrat mit einer Benzylpenicillinkonzentration von etwa 1500IE/ml in einem Rührbehälter überführt, in dem die Eiweißverbindungen ausgefällt werden.When the water has been removed, the concentrate is transferred at a benzylpenicillin concentration of about 1500 IU / ml in a stirred tank in which the protein compounds are precipitated.
Nach Abtrennung der Biomasse auf einem Vakuumdrehzellenfilter werden 8Ol des erhaltenen Filtrats mit einer Benzylpenicillinkonzentration von 20000IE/ml in einer Ultrafiltrationsanlage mit niedrigen Durchldssigkeitswerten auf <4I konzentriert. Die angewendeten Drücke liegen im für Ultrafiltrationsprozesse üblichen Druckbereiche.After separation of the biomass on a rotary vacuum cell filter, 8Ol of the resulting filtrate with a benzylpenicillin concentration of 20000 IU / ml are concentrated to <4I in an ultrafiltration unit with low throughput values. The applied pressures are in the usual pressure ranges for ultrafiltration processes.
Nach Erreichen eines Konzentratvolumens von < 41 werden kontinuierlich 151 Wasser so zugesetzt, daß ein Konzentratvolumen von 41 nicht überschritten wird. Sind die 1 δ I Wasser verbraucht, so wird das Konzentrat mit einer Benzylpenicillinkonzentration von etwa 3000IE/ml einer Fraktionierung der Eiweißverbindungen zugeführt.After reaching a concentrate volume of <41 151 water are continuously added so that a concentrate volume of 41 is not exceeded. When the 1 δ I of water is consumed, the concentrate with a benzylpenicillin concentration of about 3000 U / ml is subjected to fractionation of the protein compounds.
Die vereinigten Permeate werden entsprechend Beispiel 1 ohne weitere Zusätze einer Benzylpenicillinextraktion zugeführt.The combined permeates are added according to Example 1 without further additions of Benzylpenicillinextraktion.
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1988
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