DD276482A1 - METHOD FOR PRODUCING NEW CHOLECYSTOKININ SEQUENCES - Google Patents

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DD276482A1 DD32106788A DD32106788A DD276482A1 DD 276482 A1 DD276482 A1 DD 276482A1 DD 32106788 A DD32106788 A DD 32106788A DD 32106788 A DD32106788 A DD 32106788A DD 276482 A1 DD276482 A1 DD 276482A1
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Peter Henklein
Wolf-Rainer Halatsch
Rudolf Morgenstern
Heike Ronneberger
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Univ Berlin Humboldt
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Antagonisten des Cholecystokinins der Formel I, AcylTyr(SE)XGlyTrpYNHAd I,in der Acyl z. B. Asparaginsaeure, Bernsteinsaeure oder eine Schutzgruppe, wie BOC oder Z sein kann, SE einen Sulfatesterrest bedeutet, X fuer Thr, Nle, Leu oder Met und Y fuer Met, Nle, Leu, Met-Asp, Nle-Asp oder Leu-Asp stehen. L-Trp in Formel I kann durch D-Trp ersetzt sein. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Forschung und die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a process for the preparation of novel antagonists of cholecystokinin of the formula I, acylTyr (SE) XGlyTrpYNHAd I, in the acyl z. Aspartic acid, succinic acid or a protecting group such as BOC or Z, SE is a sulfate ester residue, X is Thr, Nle, Leu or Met and Y is Met, Nle, Leu, Met-Asp, Nle-Asp or Leu-Asp stand. L-Trp in formula I can be replaced by D-Trp. Areas of application of the invention are medical research and the pharmaceutical industry.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuartigen acylierten Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formel,The invention relates to a process for the preparation of novel acylated cholecystokinin sequences of the general formula

Acyl-Tyr(SE)-X-Gly-Trp-Y-NH-Ad,Acyl-Tyr (SE) -X-Gly-Trp-Y-NH-Ad,

in der Acyl einen Aminosäurerest, vorzugsweise Asparaginsäure, oder einer Carbonsäurerest, vorzugsweise Bernsteinsäure, oder eine in der Peptidchemie gebräuchliche Schutzgruppe wie t-Butyloxycayrbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) darstellt und SE einen Sulfatesterrest am Tyrosin bedeutet. X steht für einen Aminosäurerest, vorzugsweise Thr, Nie, Leu oder Met und Y für Met, Nie, Leu, Met-Asp, Nle-Asp oder Leu-Asp. Zur besseren enzymatischen Stabilität kann L-Trp durch D-Trp ersetzt worden. Derartige Peptide stellen neuartige, hochwirksame Antagonisten des Cholecystokinins dar und sind wertvolle Hilfsmittel für pharmakologische Untersuchungen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Forschung und die pharmazeutische Industrie.in which acyl is an amino acid residue, preferably aspartic acid, or a carboxylic acid residue, preferably succinic acid, or a protecting group commonly used in peptide chemistry, such as t-butyloxycarbonyl (Boc) or benzyloxycarbonyl (Z), and SE is a sulfate ester residue on tyrosine. X is an amino acid residue, preferably Thr, No, Leu or Met and Y is Met, No, Leu, Met-Asp, Nle-Asp or Leu-Asp. For better enzymatic stability, L-Trp may have been replaced by D-Trp. Such peptides are novel, highly effective antagonists of cholecystokinin and are valuable tools for pharmacological studies. Areas of application of the invention are medical research and the pharmaceutical industry.

Charakteristik der bokannten technischen LösungenCharacteristic of the named technical solutions Das gastrointestinale Peptidhormon Cholbr.ystokinin (CCK) existiert in verschiedenen molekularen Formen, unter anderem alsThe gastrointestinal peptide hormone Cholbr.ystokinin (CCK) exists in various molecular forms, including as CCK-39, CCK-33, CCK-12 und CCK-8 (v. Mutt und E. Jorpe?, Biochem. Journal 125,57 1971).CCK-39, CCK-33, CCK-12 and CCK-8 (by Mutt and E. Jorpe, Biochem Journal 125, 57, 1971). Es zeigt eine Reihe wichtiger Effekte im Gastrointestinal-, Pankreas- und hepatobilären System. So stimuliert es dieIt shows a number of important effects in the gastrointestinal, pancreatic and hepatobiliary system. So it stimulates the Gallo'iblasenkontraktion und bewirkt die Relaxation des Sphincter oddi (Übersichten siehe J.F.Morley, Life Sei. 30,479,1982Gallo'iblasenkontraktion and causes the relaxation of the sphincter oddi (for reviews see J.F.Morley, Life Sci 30,479,1982

und Niebcr, K.; Henklein, P.; Ott, T. und P.Oehme Z. gesamte inn. Med. 42 (1987) 501).and Niebcr, K .; Henklein, P .; Ott, T. and P.Oehme Z. Gesam inn. Med. 42 (1987) 501).

Nach dem Auffinden von CCK im ZNS wurden weitere Effekte entdeckt. So spielt CCK unter anderem eine Rolle bei derAfter finding CCK in the CNS, further effects were discovered. For example, CCK plays a role in the Appetitsregulation, Analgesic, Ptosis oder Katalepsie.Appetite regulation, analgesic, ptosis or catalepsy. Zur pharmakologischen Untersuchung all dieoor Effekte sind Antagonisten wichtige Hilfsmittel. Die gegenwärtig bekanntenAntagonists are important tools for the pharmacological investigation of all these effects. The currently known Antagonisten des Cholecystokinins sind Derivate der Glutaminsäure- Proglumid - (A. L. Rovati, Minerva Medica 1967,58,3651;Antagonists of cholecystokinin are derivatives of glutamic acid proglumide - (A.L. Rovati, Minerva Medica 1967, 58, 651; Macovec et al., Eur. J. Med. Chem.-cMm. Ther. 21 (1986) 9), des Tryptophane - Benzotript- (Hahne, W.F.Jensen, T; Lemp G. F.Macovec et al., Eur. J. Med. Chem.-cMm. Ther. 21 (1986) 9), the tryptophan benzotriptone (Hahne, W.F. Jensen, T; Lemp G.F.

und J. D. Gardner 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1987) 0304) bzw. verkürzte oder cyclische Sequenzen des Cholecystokinins (Spanarkel et al., J. Biol. Chem. 258,674611983); M. Ch. Galas Am. J. Physiol. 254, G176 (1988) sowie R. N. Freidinger et al., Proc.and J.D. Gardner 1983, Proc. Natl. Acad. Be. 78 (1987) 0304) or truncated or cyclic sequences of cholecystokinin (Spanarkel et al., J. Biol. Chem. 258, 674611983); M. Ch. Galas Am. J. Physiol. 254, G176 (1988) and R.N. Freidinger et al., Proc.

19th. Europ. Peptid Syrrp. 1986 Porto Carras Griechenland, EP-PS 0132919).19th. Europ. Peptide syrrp. 1986 Porto Carras Greece, EP-PS 0132919).

Neuerdings fand man, daß 3substituierte Benzodiazepine ebenfalls peripher eine hohe antagonistische Aktivität besitzen (ChangRecently, it has been found that 3-substituted benzodiazepines also have high peripheral antagonist activity (Chang R. U. Science 230 (1985) 177). Variationen der Substituents führten zur weiteren Wirkungsverstärkung (Evans, B. E., Proc. Natl.R.U. Science 230 (1985) 177). Variations of the substituents resulted in further enhancement of action (Evans, B.E., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, (1986) 4918; US PS 4554272, USPS 4563451, US-PS 4559338, EPPS 166353, EP-PS 166354, EP-PS 167920,Acad. Be. USA 83, (1986) 4918; US Pat. No. 4,554,272, US Pat. No. 4,563,451, US Pat. No. 4,559,338, EPPS 166353, EP Pat. No. 166,354, EP Pat.

EP-PS 170024).EP-PS 170024).

Kürzlich wurden auf der Basis von verkürzten Sequenzen neue wirksame Antagonisten entwickelt. Alle bisher gefundenenRecently, new potent antagonists have been developed based on truncated sequences. All found so far Antagonisten auf Peptidbasis wiesen eine noch zu geringe antagnostische Aktivität auf (ICM-Werte 10"· bis 10"' Mol).Peptide-based antagonists had still too low an antagonistic activity (IC M values 10 "to 10" mol). Derivate des Benzodiazepine wirken nur peripher.Derivatives of benzodiazepines are only peripheral. Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, neuartige Antagonisten des Cholecystokinins auf Peptidbasis herzustellen, die eine höhere antagonistische Aktivität besitzen als die vergleichbaren bekannten Antagonisten.The aim of the invention is to produce novel antagonists of cholecystokinin peptide-based, which have a higher antagonist activity than the comparable known antagonists.

Darlegung dos Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt aie Aufgabe zugrunde. Verfahren zu entwickeln, nach denen sich neuartige Sequenzen des Cholecystokinins (CCK) mit antagonistischen Eigenschaften horsteilen lossen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß C-terminal verkürzte Sequenzen synthetisiert wurden, denen die C-terminalen Aminosäuren Phenylalanin oder Phenylalanin und Asparaginsäure fehlen. Die endständige Aminosäure Y wurde in das 1 -Adamantylamid umgewandelt. Die so erhaltenen verkürzten CCK-Sequenzen zeigen überraschenderweise keinerlei agonistische Eigenschaften mehr, sind jedoch in der Lage, Cholecystokinin in Konzentrationen von 10~7 bis 10"' Mol/l zu hemmen. Die neuartigen Verbindungen wurden peptidchemisch in üblicher Weise entweder stufenweise od6r durch Fragmentkondensation unter Verwendung bekannter Schutzgruppen, beginnend vom BOC-Y-NH-Adamatyl, aufgebaut. Anschließend wird das geschützte Peptid von den Schutzgruppen befreit, acyliert und danach mit Pyridiniumacetylsulfat sulfatiert. Die Endreinigung erfolgt durch präparative HPLC an RP-18 isokratisch mit 25% Acetonitril/ 0,05n Ammoniumacetatlösung pH6,5The invention is based on the task. To develop methods according to which novel sequences of cholecystokinin (CCK) with antagonistic properties horsteilen. The object has been achieved by synthesizing C-terminally truncated sequences lacking the C-terminal amino acids phenylalanine or phenylalanine and aspartic acid. The terminal amino acid Y was converted to the 1-adamantylamide. The thus obtained truncated CCK sequences surprisingly show no agonist properties more but are able to inhibit cholecystokinin in concentrations of 10 ~ 7 to 10 "'mol / l. The novel compounds have been peptide-chemically in a conventional manner in stages od6r by either fragment condensation The protected peptide is then deprotected, acylated, and then sulfated with pyridinium acetyl sulfate, and finally purified by preparative HPLC on RP-18 isocratic with 25% acetonitrile. 0.05n ammonium acetate solution pH6.5

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsb&ispielen näher erläutert. The invention will be explained in more detail by means of exemplary embodiments.

AusführungtbeispleleAusführungtbeisplele Beispiel 1example 1 Suc-TyrlSEI-Met-Gly-Trp-Met-Asp-NH-AdamantylSuc-TyrlSEI-Met-Gly-Trp-Met-Asp-NH-adamantyl Boc-Trp-Met-OH wird mit H-Asp(otBu)-NH-Ad zum Boc-Trp-Met-Asp(Ot8u)-NH-Ad umgesetzt.Boc-Trp-Met-OH is reacted with H-Asp (otBu) -NH-Ad to form Boc-Trp-Met-Asp (Ot8u) -NH-Ad. Nach Abspalten der Boc- und der OtBu-Esterschutzgruppe wird dos Tripeptid H-Trp-Met-Asp-NH-Ad mit Boc-Tyr-Mot-Gly-ONBAfter cleavage of the Boc and OtBu ester protecting groups, the tripeptide becomes H-Trp-Met-Asp-NH-Ad with Boc-Tyr-Mot-Gly-ONB

zum Hexapeptid verlängert. Erneutes Abspalten der Boc-Schutzgruppe und Acylierung mit Bernsteinsäureanhydrid führen zumextended to hexapeptide. Renegotiation of the Boc protecting group and acylation with succinic anhydride lead to

Suc-Tyr-Met-Trp-Met-Asp-NH-Ad.Suc-Tyr-Met-Trp-Met-Asp-NH-Ad. Sulfatierung mit Pyridiniumacetylsulfat und Reinigung mittels präparativer HPLC 0,05n Ammoniumacetat/25% CH1CN pH0,5Sulfation with pyridinium acetyl sulfate and purification by preparative HPLC 0.05 N ammonium acetate / 25% CH 1 CN pH 0.5

liefern Suc-TyrlSEl-Met-Gly-Trp-Met-Asp-i-Adamantylamid.provide Suc-TyrlSEl-Met-Gly-Trp-Met-Asp-i-adamantylamide.

Fp. 205-21 TC Ia]J0 « -42,34(C = 1,022,DMF)Mp. 205-21 TC Ia] J 0 "-42.34 (C = 1.022, DMF) HPLC: SHuIe ODS-Hypersil5|Jm 2,1 x 100mmHPLC: SHuIe ODS-Hypersil5 | Jm 2.1 x 100mm

0,01 mol H,P04/Acetonitril 28%-^2% (6 min)0.0 mol 1 H, P0 4 / acetonitrile 28% - ^ 2% (6 min)

Rt -2,218 einheitlichRt -2.218 uniform Beispiel 2Example 2 Am Isolierten Meerschweinchenileum antagonisiert Suc-TyrlSEI-Mot-Gly-Trp-Met-Asp-NH-Adamantyl dieOn isolated guinea pig ileum, Suc-TyrlSEI-Mot-Gly-Trp-Met-Asp-NH-adamantyl antagonizes the

kontraktionsauslösende Wirkung von CCK-8 kompetitiv. Bis zu einer Konzentration von 10"* Mol/l zeigte die Substanz keinerlei kontrahierende Eigenwitkung.Contraction-inducing effect of CCK-8 competitive. Up to a concentration of 10 "* mol / l, the substance showed no contracting Eigenwitkung.

Der pA2-Wert von Suc-Tyr(SE)-Mot-Gly-Trp-Met-Asp-NH-Adamantyl liegt bei 7,20 ± 0,15 (n = 8).The pA 2 value of Suc-Tyr (SE) -Mot-Gly-Trp-Met-Asp-NH-adamantyl is 7.20 ± 0.15 (n = 8).

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung neuer Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formel I,1. A process for the preparation of new cholecystokinin sequences of general formula I, Acyl-Tyr(SE)-X-Gly-Trp-Y-NH-Ad I,Acyl-Tyr (SE) -X-Gly-Trp-Y-NH-Ad I, in der Acyl einen Aminosäurerest A oder einen Carbonsäurerest oder eine Schutzgruppe darstellt, SE für einen Sulfatesterrest am Tyrosin, X für einen Aminosäurerest B und Y für einen Aminosäurerest C stehen, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen der Formel I stufenweise oder durch Fragmentkondensation aufgebaut und nach Abspaltung der Schutzgruppen acyliert und sulfatiert werden.in which acyl represents an amino acid residue A or a carboxylic acid residue or a protecting group, SE stands for a sulfate ester moiety on tyrosine, X stands for an amino acid residue B and Y stands for an amino acid residue C, characterized in that the compounds of formula I are built up stepwise or by fragment condensation and after Cleavage of the protecting groups are acylated and sulfated. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese unter Verwendung von Schutzgruppen und beginnend von BOC-Y-NH-Adamantyl erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that the synthesis is carried out using protective groups and starting from BOC-Y-NH-adamantyl. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest A vorzugsweise aus Asparaginsäure, der Carbonsäurerest vorzugsweise aus Bernsteinsäure, die Schutzgruppen z. B. aus t-Butyloxycarbonyl (BOC) oder Benzyloxycarbonyl (Z) bestehen, der Aminosäurerest B vorzugsweise für Thr, Nie, Leu oder Met und der Aminosäurerest C für Met, Nie, Leu, Met-Asp, Nle-Asp oder Leu-Asp stehen.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the amino acid residue A preferably from aspartic acid, the carboxylic acid residue preferably from succinic acid, the protective groups z. B. from t-butyloxycarbonyl (BOC) or benzyloxycarbonyl (Z), the amino acid residue B preferably for Thr, Nie, Leu or Met and the amino acid residue C for Met, No, Leu, Met-Asp, Nle-Asp or Leu-Asp stand. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I L-Trp durch D-Trp ersetzt werden kann.4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that in the compounds of formula I L-Trp can be replaced by D-Trp.
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