DD273443A1

DD273443A1 - Verfahren zur herstellung von 3'-karboxyl-substituierten oligodesoxynukleotiden

Info

Publication number: DD273443A1
Application number: DD31732488A
Authority: DD
Inventors: Peter Westermann; Carola Hoffmann; Gottfried Herrmann
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1988-06-29
Filing date: 1988-06-29
Publication date: 1989-11-15

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 3-karboxyl-substituierten Oligodesoxynukleotiden. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Molkularbiologie. Erfindungsgemaess wird bei der nach dem bekannten Phosphoramidit-Verfahren durchgefuehrten Herstellung ein Spacer verwendet, der eine interne Esterbindung und eine endstaendige primaere Hydroxylgruppe enthaelt. Damit werden erstmalig 3-karboxyl-substituierte Oligodesoxynukleotide synthetisiert, die zur Herstellung von Affinitaetstraegern und von kovalenten Konjugaten mit Polyaminosaeuren oder Proteinen genutzt werden koennen.

Description

von

der Erfindung,

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nur Herstellung von 3'-terminal durch eine Kar bc»:yl gruppe modi finer ien Oll godesoüynukleotiden. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Molekularbj ologie.

GÜ§ü.äL.i§r_i§t:i.k des bekannten Standes der ТесЬпгЛ

Die Mocij f inierung von 01 igodesoxynukleatiden am 5'-terminalen Ende wird nach Abschluß der Synthese durch Kondensation der 5 '-terminalen Hydroxylgruppe über mehrere Synthesestu-fen durchgeführt: (L, Wächter, J,-A. Jablonski, K.L.Ramachandran, Nucleic Acids Res.. 14 U986) 7985-79^4? J.N.Kremsky, J.L

Jooters, J. I-¹. Dougherty, R.E. Meyers, M- Collins, E.L. Brown, Nuclei с Acids Res. 15 ( ХЧВП 2891 -290^е?) .

Eine Modifizierung von Oligodesoxynukleotidon am З'-fcerminalen Ende durch езіпе Aminogruppen wurde durch den Einsatz eines Efchylendi aimndiTi vats des /ytidins als Btarternukl solid <P. Li, F.P. Mendon, D.C» Bkingle, J„A. Lanser, R.H. Symons, Nucleic Acid^ Res. 15 (1987) 5275 ) bnw. durch Kondensation von 01igothvmidin mit Hexamethylendiamin <T. LaDoan, L. Perronault, M. Chassignol, N. Г. Fhuong, C. Helene, Nucleic Acids Res. 15 <І987> 8643 ) erreicht. Eine 3'-terminal ρ Modifizierung ;um Zweck der Verknüpfung des 01 ignciesaxynukleot ids mit Poly-I-lysin wurde durch ennymatischc? Kondensation mit einem Ribonukleosiddiphosphat unter Verwendung von T4~RNA-Liq£tse, Hydrolyse des З'-Phophats mit alkalischer Phosphatase, Oxydation mit Perjodat und Kondensation mit Poly-L—lysin durchgeführt worden (M. LemaJ, tre, b. Bayard, B. Lebieu, f-roc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 648-652). Das Verfahren bedingt eine mehrtägige Reaktion mit T4--RNA-Li gase, resultiert in unvollständiger Ligierung und bedingt einen zweiten enrymutisehen und einen oxydativon Schritt und entsprechende Zwischenreinigungen. 3 '—Karboxylsuhbtituiortp 011godesoxynukleotide sind bisher nicht bekannt.

.?!§! äSI Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, in einfacher Weise 01igodesoxynukleotide beliebiger Sequent herzustellen, die am ?.'-tm minalen Ende eine Karboxylgruppe¹ tragen.

Wesens der Er £i_ndung

Erf ι ndungsgemaß we den S ' -kar boxyl-s.ubsti tuierte 01 lgodesoxynul^leotids der allgemeinen Formel I

O il

Ol ι godesox ynuk 1 eo 11 d -3 ' -0-P-O- (CH₁₃) „--Nh-CO-CH₃-CH₃-COOH (I),

l_ 0

wobei das 01 igonukleotid bis zu 70 Nucleotide lang ist und η = 2 ~ 6, hergestellt, indem гиг 01igodesoxynukleotidsynthese ein trägergebundener Spacer verwendet» der eine interne Esterbindung und eine endständige primäre Hydroxylgruppe besitzt (s. Abb. 1>. Der für die 01igodesoxynukleotidsynthese notwendige Au-fbau eines Spacers wird so modifiziert, daß an Stelle eines Diamins ein Aminoalkohol mit der trägergebundenen Succinyl ami nopropyl -Gruppe kondensiert wird <Abb- 1, Reaktion A). Anschließend wird succinyliert (Reaktion B), verbleibende Hydroxylgruppen werden mit Acetanhydrid blockiert (Reaktion C) und die freie Karbo>:ylgruppe wiederum mit dem Aminoalkohol kondensiert (Reaktion D). Die erhaltene Hydroxyverbindung kann als solche oder als 4.4'-Dimethoxytrityl—Derivat (Reaktion E) oder als Dimethoxytrityl-substituiertes, geschütztes Desoxyribonukleosid--3 '-phosphat-Deri vat гиг 01 igodesoxynukleoti'dsynthese verwendet werden. Bei der 01igodesoxynukleotidsynthese werden nach dem bekannten Phosphoremidit-Verfahren in einem Syntheseautomaten oder manuell die.» der gewünschten Sequenz entsprechenden geschützten Nukleosid-phopehoramidi te nacheinjnder ankondensiert. Nach der Synthese des 01igodesoxynukieotids wird der Spacer durch 48std. Reaktion mit Triethylamin-Wasser-Gemisch bei 37⁰C hydrolysiert, dadurch die Karboxylgruppe freigesetzt und das 01igodesoxynukleotid vom Träger abgelöst. Die Abspaltung der übrigen Schutsgruppen erfolgt danach durch 4std. Erhitzen in konzentriertem, wässrigem Ammoniak bei 56⁰C.

Die hergestellten 01igodesoxynukleotide mit einer Kettenlänge zwischen 20 und 70 Nukleotiden werden durch Sequenzieren überprüft und das Vorhandensein der Karboxylgruppe wird durch Kondensation mit Poly-L-lysin nachgewiesen

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es erstamis möglich, 3'--karboxyl -substi tui erte öli godesoxynukleoti de beii ebi ger Saquens in einfacher Weise herzustellen.

Die erhaltenen 3'—k<arboxyl—substituierten 01igodesoxynukleo— tide können zu.r Herstellung von Affinitätsträgern oder von kovalenten Konjugaten mit Polyaminosäuren oder Proteinen eingesetzt werden.

Synthese des Spacer«⁷

Beschreibung der Reaktionen A bi*s E entsprechend der Abb. 1 ausgeführt nach bekannten Verfahren

A) Das trockene Succinylaminopropyl-Blas (1 g, 83 uMol/g Träger) hergestellt nach M.D. Matteuchi und M.H. Caruthers (J

Amer. Chem. Soc. 103(1981)3185-3191) aus porösem Blas (СРВ, 1000 A, Serva) wird in 3 ml über Calciumhydrid getrocknetem Pyridin mit 0,35 mMol Aminoethanol (0,021 пи ) , 0,5 mMol DCC (0,103 g) und 0,1 mMol DMAP (O,,O12 g) 20 Std. bei Raumtemperatur geschüttelt und danach mit Pyridin gewaschen.

B) Das Pyridin-feuchte Glas wird mit 5 mMol Bernsteinsäureanhydrid (0,5 g) und 0,02 g DMAP in 4 ml Pyridin 20 Std. bei Raumtemperatur geschüttelt und danach auf der Fritte mit Pyridin und Methanol ^ gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Bestimmung der Ausbeute erfolgte nach M.D. Matteuchi und M.H. Caruthers (J. Amer. Chem. Soc. 103(1981)3185-3191) durch Verestern mit p~Nitrophenol und anschließende Verseifung und ergab eine Beladung mit Karboxylgruppen von 47 uMol/g_Träger.

C) Die Blockierung verbleibender Hydroxylgruppen erfolgte durch 4 Std. Schuttein von I g Glas (aus Reaktion B) mit 0,5 ml Acetanhydrid und 0,02 g DMAP in 4 ml Pyridin bei 20^eC und anschließendes Waschen mit Pyridin.

D) 1 g 81as див der Reaktion C wird analog zu A umgesetzt.

E) 0 3 g Blas aus der Reaktion D wird mit 0,2 g Dimethoxytrit/1Chlorid, 2 ml Pyridin, 0,2 ml Col Ii din und 0,02 g DMAP 2 Tage geschüttelt. Danach wird mit Pyridin und Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Die Ausbeute άπ Dimethoxytritylqruppen wird nach Hydrolyse mit Trichloressigsaure in Methylenchlorid spektrophotometrisch zu 8,1 uMol/q Träger bestimmt.

Synt hese der 011godesox ynuk1eotι de

Die Synthese der 01igodesoxynukläotide kann mit dem nach E) hergestellten Dimethoxytrltyl-Spacer oder bei entsprechend modifiziertem Programm mit dem nach C) erhaltenen Hydr o>:yl -Spacer er-folgen. Dazu werden mit einem Syntheseautomaten der Fa. Applied Biosystems die der geforderten {-Sequenz entsprechendem Nukleosid- Phosphor amidi te nacheinander ankondensiert. Nach beendeter Synthese wtrd die 5'-terminale Di methox /tr ι tyl gruppe abgespalten, dit? Esterbindung des Spacers durch 4Bstd. Erwarmen auf 3"7"C hydrolysiert und schließlich werden die Basenschutagruppen durch 4std. Erwarmen auf ü6°C in konzentriertem Ammoniak abgespalten

Die in einer k*»ttenlange von 20 bis 7o Nukleotiden hergestellten öl ι giidesoxynukl eoti de wurden nach Maxam und Gilbert sequentiert.Das Vorhandensein der Karboxylgruppe wurde durch Kondensation der 3'-karboxyl-substituierten 01 igodesoi:ynukleotide mit Poly-L-lysin in Gegenwart von 1-Ethyl-3-dimethylaminopropyl-carbodiι mid nachgewiesen.

Abb. i

Schema der Reaktionen A bis E

CH₃-Si -CH_nS I 0

I G-O-Si - (CHa) .-s-NH-CO- (CHs₅)

*-*H:2j:**"4J A "*"wH^5

CH₃

-COOH + NHa-(CHa)_n-OH * DCC, DMAP

-CO-NH-(CHa)_n-OH + CH2--CH2

i I CO CO ^X0

Reaktiör

Reaktion β

4f DMAP "CO-NH (СН_Я) r.-0-CO™ (CH₃) а-СООН

ψ Ac₅₂O, DMAP

4, MH₃₅-(CHa)_n-OH, DCC, DMAP -CO-NH- (CH₃) „-Q-CO- (CH₅J) J₈-CO-NH-

ψ DMT-Cl, DMAP -CO-NH- (CHs) „-0-C0- (CHa) a-CO-NH- (CHs-) _n-O«-Tr i ty 1

Reaktion С

Reaktion 2>

Reaktion

e - poröses Glas (CP8, jlOOO Ä)

η = 2 - 6 Ac₃O = Acetanhydrid

DCC - Di cyclohexyl carbodi imid DMT = 4. 4 '-Dimetho>:ytri tyl-DMAP - 4-Dimethylaminopyridin

Claims

Verfahren zur Herstellung von 3'-karboxyl-substituierten 01igodesoxynuk1eotiden der allgemeinen Formel I

01 i godesox ynuk 1 eot i d~3 ' -0--P-0- (СИ») „~NH-C0-CH_a-CH;a~C00H (1·) ,

wobei das 01igodesoxynuk1eotid bis zu 70 NuMeotide lang ist und η = 2 - 6,

gekennzeichnet dadurch, daft bei der nach dem bekannten iPhosphoramidit~Verfahren durchgeführten 01igodesoxynukleotidsynthese ein trägergebundener *3pacer folgender Struktur verwendet wird :.

-CO-NH- (CHa) n-0-CO- <CH₃₅) ^-CO-NH- (CH₂.) „-OR

η = 2 - 6

R = H- , 4»4'-Dimetho>iytrityl-

oder ein 5'-O-<4.4'-Dimetnoxуtrityl)-substituiertes, geschütztes DesoNyribonuklQosi d-3'-phosphat