DD269163A1 - METHOD OF CULTURING EXTREME HALOPHILIC BACTERIA - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von extrem halophilen Bakterien, auf der Grundlage von fluessigen Kohlenstoffquellen. Die Erfindung gehoert in das Gebiet der mikrobiellen Gewinnung von Wertstoffen. Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermoeglicht unter unsterilen Bedingungen und bei Einsatz verschiedener Kohlenstoffquellen Biomasse von extrem halophilen Bakterien in solchen Mengen zu erzeugen, die die Gewinnung von Wertstoffen ermoeglichen. Es wurde gefunden, dass mit den Bakterienstaemmen HB 46 ZIMET 11276 UND HB 47 ZIMET 11277 die Zielstellung realisiert werden kann. Die Staemme werden im fed-batch- oder kontinuierlichen Prozess unter unsterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 30-45C und einem p H-Wert von 5,8-8,5 kultiviert. Als Kohlenstoffquelle dienen niedermolekulare Kohlehydrate, niedere Fettsaeuren, kurzkettige 3wertige Alkohole und aliphatische Tricarbonsaeuren.The invention relates to a method of culturing extremely halophilic bacteria based on liquid carbon sources. The invention belongs to the field of microbial recovery of valuable substances. The object of the invention is to develop a method which, under unsterile conditions and when using different carbon sources, makes it possible to produce biomass of extremely halophilic bacteria in quantities which enable the recovery of valuable substances. It has been found that the target can be achieved with the bacterial strains HB 46 ZIMET 11276 AND HB 47 ZIMET 11277. The stems are cultured in a fed-batch or continuous process under non-sterile conditions at a temperature of 30-45C and a pH of 5.8-8.5. The carbon source are low molecular weight carbohydrates, lower fatty acids, short-chain 3-hydric alcohols and aliphatic tricarboxylic acids.
Description
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Grundlagenuntersuchungen zur Kultivierung von extrem halophilen Bakterien sind aus Veröffentlichungen in Zeitschriften bekannt. Die überwiegende Mehrheit der verwendeter Nährmedien ist sehr komplexer Art. So wird von GOCHN.'.UER, M. B., KUSCHNER, D.J. Can, J. Microb^l. 17 17-23 (1971); ONISHJ, H., McCANCE, M. E., GI3B0NS, N.E. C;.n. J. Microbiol. 11 365-373 (1965) und DUNDAS, I.D., SRINIVASAN, V.R., HALVORSON, H.O. Can. J. Microbiol. 9 619-624 (1963) der Zusatz von ausgewählte,ι Aminosäuren zum Kultivierungsmedium als notwendig beschrieben. Ebenfalls komplexe Medien werden von PAYNE, J.l. Can. J. Microb. 69-15 (1960); FAHMY, F., MAYER, F., CLAUS, D. Arch. Microbiol. 140 338-342 (1985); BORING, Α., KUSHNER, D. J., GIBBONS, N.E. Can J. Microbiol. 9 143 (1963) und SHEGAL, E., KATES, M. und GIBBONS, N.E. Can J. Ci^.iem. Physiol.40 (1962) beschrieben. KATES, M., PALAMETA, B.J. KUSHER, DJ. und GIBBON Biochem. 54092-4099 (1966)geben für verschiedene extrem halophile Stämme Kultivierung.'zeiten von 72-168 Stunden mit einer Zellausbeute von 0,95-1,66g/l an. KUSHNER, D.J. Adv. Appl. Microbiol. 10 73-99 (1968) beschreibt für eine Vielzahl von extrem halophilen Stämmen eine maximale Wachstumsgeschwindigkeit u„,a< = 0,04-0,09h"'. Für den Stamm Halobakterium Salinarium geben RODRIGUEZ-VALERA, F. et al. Appl. Environm. Microbiol. 45 868-871 (1983) als Wachstumsgeschwindigkeit 0,09-0,11 h"1 an. Der Nachteil der veröffentlichten Methoden zur Kultivie ng besteht darin, daß eine Züchtung stets diskontinuierlich und mit Wachstumsgeschwindigkeiten von 0,04-0, Mh"1 erfolgt .' Her diesen Bedingungen ist es nicht möglich, einen hohen Ertrag an Biomasse zu erhalten. Als höchste Erträge werden 5g/l Trockenmasse, entsprechend 1,5g/l salzfreier Biomasse, angegeben. Die Kultivierung wurde nach den beschriebenen Methoden stets steril durchgeführt.Basic studies on the cultivation of extremely halophilic bacteria are known from publications in journals. The vast majority of the nutrient media used are of a very complex nature. Thus, GOCHN '' UER, MB, KUSCHNER, DJ Can, J. Microb. 17, 17-23 (1971); ONISHJ, H., McCANCE, ME, GI3B0NS, NE C; .n. J. Microbiol. 11 365-373 (1965) and DUNDAS, ID, SRINIVASAN, VR, HALVORSON, HO Can. J. Microbiol. 9 619-624 (1963) described the addition of selected, ι amino acids to the culture medium as necessary. Also complex media are from PAYNE, Jl Can. J. Microb. 69-15 (1960); FAHMY, F., MAYER, F., CLAUS, D. Arch. Microbiol. 140 338-342 (1985); BORING, Α., KUSHNER, DJ, GIBBON, NE Can J. Microbiol. 9,143 (1963) and SHEGAL, E., KATES, M. and Gibbons, NE Can J. Ci. Physiol.40 (1962). KATES, M., PALAMETA, BJ KUSHER, DJ. and GIBBON Biochem. 54092-4099 (1966) report cultivation times of 72-168 hours with a cell yield of 0.95-1.66 g / L for various extremely halophilic strains. KUSHNER, DJ Adv. Appl. Microbiol. 10 73-99 (1968) describes a maximum growth rate u ", a < = 0.04-0.09 h" for a multiplicity of extremely halophilic strains. "For the strain Halobacterium salinarium, RODRIGUEZ-VALERA, F. et al., Appl Environm., Microbiol., 45, 868-871 (1983) as the growth rate 0.09-0.11 h -1 . The disadvantage of the published methods for cultivating ng is that a cultivation always occurs discontinuously and with growth rates of 0.04-0, Mh " 1 . According to these conditions, it is not possible to obtain a high yield of biomass.The highest yields are given as 5 g / l of dry matter, corresponding to 1.5 g / l of salt-free biomass.The cultivation was always carried out in a sterile manner according to the methods described.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zur Kultivierung von extrem halophilen Bakterien zu entwickeln, daß es ermöglicht, die Biomasseerträge zu erhöhen.The object of the invention is to develop a method of cultivating extremely halophilic bacteria, which makes it possible to increase the biomass yields.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Dor Erfindung liegt dah jr die Aufgabe zugrunde, extrem halophile Bakterien zu selektieren und einzusetzen, die verschiedene Kohlenstoffquellen verwerten, mit hoher Wachstumsgeschwindigkeit wachsen und vorzugsweise unsteril kultiviert werden können.It is therefore an object of the present invention to select and use extremely halophilic bacteria which utilize various carbon sources, grow at a high growth rate and can preferably be cultivated non-sterile.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zwei speziell selektierte extrem halophile Bakterisnstämme HB46 und HB47 im fed-batch-Verfahren und im kontinuierlichen Prozeß vorzugsweise auf niederen Fettsäuren und Kohlehydraten unter Normaldruck und aeroben Bedingungen in einer streng bilanzierten Nährsalzlösung in einem geeigneten Fermentor kultiviert werden.According to the invention the object is achieved in that two specially selected extremely halophilic bacterial strains HB46 and HB47 are cultivated in a suitable fermenter in the fed-batch process and in the continuous process, preferably on lower fatty acids and carbohydrates under normal pressure and aerobic conditions in a tightly balanced nutrient solution.
Die Stämme wurden aus Proben von Salzgewinnungsanlagen in der VR Vietnam seiektiert und über Anreicherungskulturen isoliert.The strains were seized from samples from salt extraction plants in the PR of Vietnam and isolated by enrichment cultures.
Die Stämme wurden in der Stammsamml jng ces Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegi und tragen die Bezeichnung HB46ZIMET11276 und HB47ZIMET11277.The strains were deposited in the Central Collection of Microbiology and Experimental Therapy of the Academy of Sciences of the GDR and bear the designation HB46ZIMET11276 and HB47ZIMET11277.
Die Zusammensetzung des Anreicherungsmediums war pro Liter aqua destillata folgende:The composition of the enrichment medium per liter of distilled water was as follows:
KH2PO4 35,00 mgKH 2 PO 4 35.00 mg
H3PO4 (85%ig) 0,027 mlH 3 PO 4 (85%) 0.027 ml
MgSO4-7 H2O 23,25 gMgSO 4 -7H 2 O 23.25 g
CuSO4-5 H2O 0,79 mg FeCI2-4 H2O 1,20 mgCuSO 4 -5 H 2 O 0.79 mg FeCl 2 -4 H 2 O 1.20 mg
FeSO4-7 H2O 4F,C0mgFeSO 4 -7H 2 O 4F, C0mg
ZnCI2 0,32 mg MnSO4 -4 H2O 1,83 mgZnCl 2 0.32 mg MnSO 4 -4 H 2 O 1.83 mg
CoSO4 -7 H2O 0,04 mgCoSO 4 -7H 2 O 0.04 mg
CrCI3-6 H2O 0,08 mgCrCl 3 -6H 2 O 0.08 mg
Diese Salze sind ausreichend für 2g Biomassetrockönsubstanz. Die Salzkonzentration im Anreicherungsmodium ist so gewährleistet, daß den Organismen alle essentiellen Ionen angeboten werden.These salts are sufficient for 2 g of biomass dry substance. The salt concentration in the enrichment mode is ensured so that the organisms are offered all the essential ions.
Die mittels konventioneller Selektionsmethoden aus den Anreicherungskulturen selektierten Stämmen HB46ZIMET11276 und HB47ZIMET11277 werden charakterisiert durch:The strains HB46ZIMET11276 and HB47ZIMET11277 selected by conventional selection methods from the enrichment cultures are characterized by:
Zellmorphologiecell morphology
HB46ZIMETHB46ZIMET
Nach einem Wachstum von 10 Tagen auf Magermilchagar pH 8,4 und einer Bebrütungstemperatur von 370C sind die Zellen des Stammes HB46ZIMET11276 schlanke, bewegliche Stäbchen mit einer Größe von 0,6 x 3,1-6,2pm. Die Zellen sind gramnegativ.After growth of 10 days on skimmed milk agar pH 8.4 and an incubation temperature of 37 0 C, the cells of the strain HB46ZIMET11276 are slender, motile rods having a size of 0.6 x 3,1-6,2pm. The cells are gram negative.
HB47ZIMETHB47ZIMET
Der Stamm HB47 ZIMET11277 besteht nach 14 Tagen Bebrütungsdauer unter den oben angegebenen Bedingungen aus Stäbchen mit einer Größe vrn 05 χ 3,1 pm. Er isi in der Lage, sphärische Formen aus; '.!bilden. Die Zellen sind gramnegativ.The strain HB47 ZIMET11277 after 14 days incubation under the conditions given above consists of rods with a size vrn 05 χ 3.1 pm. He is able to form spherical forms; '.!form. The cells are gram negative.
Koloniemorphologiecolony morphology
Nach 10-12 Tagen Wa:hstum auf Magermilchagar entwickelt der Stamm HB46ZIMET112/S kräftig rote, kreisförmige, flach konvexe, ganzrandige Xolonien mit einem Druchmesser von 1-2mm. Die Konsistenz der Kolonien ist butterartig, und die Oberfläche ist glänzend.After 10-12 days of growth on skim milk agar, the strain HB46ZIMET112 / S vigorously develops red, circular, flat-convex, whole-margined xolonias with a diameter of 1-2 mm. The consistency of the colonies is buttery and the surface is shiny.
Die Kultur HB47ZIMET11277 entwickelt nach 10-14 Tagen rosa, kreisförmige bia unregelmäßige, ganzrandige Kolonien mit einem Durchmesser von 1-3mm. Die Konsistenz ist schleimig, und die Oberfläche ist glänzend. Die Form der Kolonien ist flach konvex bis halbkuglig.The culture HB47ZIMET11277 developed pink, circular bia irregular, ganzrandige colonies with a diameter of 1-3mm after 10-14 days. The consistency is slimy and the surface is shiny. The shape of the colonies is flat convex to hemispherical.
Weitere Merkmale:Other features:
Als Kohlenstoffquelle verwerten Stämme HB46ZIMET11276 i'.id HB47 ZIMET11277 z. B. Glucose, Galactose, Fructose, Maltose, Mannose, Glycerin, Acetat und Citmt.As a carbon source, strains utilize HB46ZIMET11276 i'.id HB47 ZIMET11277 z. As glucose, galactose, fructose, maltose, mannose, glycerol, acetate and Citmt.
Die maximalen spezifischen Wachstumsraten betragen für HB46ZIMET11276 0,14 Ir' und HB47 ZIMET11277 C, 16h"'. Unter unsterilen Prozeßbedingungen sind die Organismen in Temperaturbereich 30-45"C, vorzugsweise bei 38-40cC, beieineti pH-Wert von 5,8-8,5, bevorzugt 6,2-7,2 im fed-batch-f'rozeß oder kontinuierlich bei Verweilziiten bis minimal 7 h für HB46ZIMET11276 und 6,5h für HB47ZIMcT11277 kultivierbar. Die Begasung erfolgt mit Luft. Die Regulierung des pH-Wertes wird je nach Substrat und Prozeßführung mit Säure oder Natronlauge vorgenommen. Die Nährlösung wird mit Leitungswasser angesetzt. Dabei werden die Konzentrationen der Bestandteile der Nährlösung so gewählt, daß das Nährs;lzangebot ttets der aktuellen Biomassekonzentration entspricht bzw. nur unwesentlich davon abweicht. Die Natriumchloridkonzentration wird im Bereich von löO-SOOg/lgahalten.The maximum specific growth rates are for HB46ZIMET11276 0.14 Ir 'and HB47 ZIMET11277 C, 16h "'. Under sterile conditions, the process organisms are in the temperature range 30-45" C, preferably at 38-40 C c, pH beieineti of 5, 8-8.5, preferably 6.2-7.2 in fed-batch-f'rozeß or continuously at dwarfing to a minimum of 7 h for HB46ZIMET11276 and 6.5 h for HB47ZIMcT11277 culturable. The fumigation takes place with air. The regulation of the pH is carried out depending on the substrate and process control with acid or sodium hydroxide solution. The nutrient solution is prepared with tap water. The concentrations of the constituents of the nutrient solution are chosen so that the nutrient supply corresponds to the current biomass concentration or deviates only insignificantly from it. The sodium chloride concentration is maintained in the range of 10-SOOg / g.
Unter diesen Bedingungen enthält die Fermentationsbiozönose jeweils 80-90% des extrem nalophilen Bakterienstammes. An nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.Under these conditions, the fermentation biocenosis contains 80-90% of the extremely nalophilic bacterial strain. The following examples illustrate the invention.
Ausführungsbeispiele:EXAMPLES
In einem Airliftfermentor werden 31 vorgezüchtetes Impfmaterial der Kultur HB47ZIMÜ Γ11277 mit einjr Konzentrator von 0,5 jl\ und ι Nährlösung, die folgende Zusammensetzung haue, eingesetzt.In a Airliftfermentor 31 pre-bred inoculum of culture HB47ZIMÜ Γ11277 be used with a concentrator of 0.5 ml and ι nutrient solution, the hue composition used.
Zusammensetzung der u'ährsalzlösung pro Liter aqua destillata:Composition of nutrient solution per liter of distilled water:
Die Temperatui wird auf 38°C und der pH-Wert auf 6,8 eingestellt. Die Natriumchloridkonzentration im Medium beträgt 250g/l. Die Regelung des pH-Wertes erfolgt mittels einer 2%igen Lösung der Essigsäure, die gleichzeitig als zusätzliche Substratmenge dient. Wenn die Biomasse auf eine Konzentration von 2 g/l angewachsen ist, werden 31 Suspension dem Fermentor entnommen und gegen 3I Nährlösung ausgetauscht. Der Austausch kann beliebig oft wiederholt werden. Unter diesen Bedingungen können Biomassekonzentrationen von 2,5g/l (berechnet als salzfreie Biomasse) erreicht werden.The temperature is adjusted to 38 ° C and the pH to 6.8. The sodium chloride concentration in the medium is 250 g / l. The regulation of the pH is carried out by means of a 2% solution of acetic acid, which also serves as an additional amount of substrate. When the biomass has grown to a concentration of 2 g / l, 31 suspensions are removed from the fermentor and replaced with 3 l nutrient solution. The exchange can be repeated any number of times. Under these conditions, biomass concentrations of 2.5 g / l (calculated as salt-free biomass) can be achieved.
Be.'spiel2Be.'spiel2
In einem Airliftfermentor 61 vorgezüchtetes Impfmaterial der Kultur HBΊ6ZIMET11276 mit einer Konzentration von 1 g/l eingesetzt. Die Temperatur wird auf 360C und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Die Natriumchloridkonzentration im Medium beträgt 200g/l. Die Regelung des pH-Wertes erfolgt über eine 2%ige Natronlauge. Die Nährlösung wird für 3g/l Bakterientrockenmasse bilanziert (Zusammensetzung der Nährlösung entsprechend Beispiel 1, jedoch als Kohlenstoffquelle dient Glucose. Sie wird in einer Konzentration von 5g/l der Nährlösung zugesetzt. Nachdem die Biomasse auf 2,5g/l angewachsen ist, wird eine Verweilzeit von 10h eingestellt. Im stabilen Prozeß erhalt man Bakterienkonzentrationen von 2 g/l (berechnet als salzfreie Biomasse).In a Airliftfermentor 61 pre-cultivated inoculum of culture HBΊ6ZIMET11276 used at a concentration of 1 g / l. The temperature is adjusted to 36 ° C. and the pH to 7.0. The sodium chloride concentration in the medium is 200 g / l. The regulation of the pH is carried out via a 2% sodium hydroxide solution. The nutrient solution is weighed for 3 g / l of bacterial dry matter (composition of the nutrient solution according to example 1, but glucose is used as carbon source.) It is added to the nutrient solution at a concentration of 5 g / l After the biomass has grown to 2.5 g / l, a Residence time of 10 h is set in the stable process to obtain bacterial concentrations of 2 g / l (calculated as salt-free biomass).
In einem 1-l-Rührfermentor werden 11 vorgezüchtetes Imp 'material der Kultur HB47 ZIMET11277 mit einer Konzentration von 0,5g/l eingesetz*. DieTempsratur auf 40°C und der pH-Wert auf 6,8 eingestellt. Die Natriumchloridkonzentration im Medium beträgt 300g/l. Die Regelung lies pH-Wertes erfolgt über eine 5%ige Natronlauge. Die Nährlösung wird wie im Beispiel 1 angegeben eingesetzt. Bei einer eingestellten Verweilzeit von 10h erhält man im stabilen Prozeß Bakte'ienkonzentrationen vonIn a 1 l stirred fermentor, 11 pre-grown culture material HB47 ZIMET11277 are used at a concentration of 0.5 g / l *. The temperature is set at 40 ° C and the pH at 6.8. The sodium chloride concentration in the medium is 300 g / l. The regulation read pH value is carried out via a 5% sodium hydroxide solution. The nutrient solution is used as indicated in Example 1. With a set residence time of 10h, the stable process yields bacterial concentrations of
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002048381A2 (en) * | 2000-12-13 | 2002-06-20 | Norbert Hampp | Method for producing biomass |
-
1987
- 1987-12-21 DD DD31090587A patent/DD269163A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002048381A2 (en) * | 2000-12-13 | 2002-06-20 | Norbert Hampp | Method for producing biomass |
| WO2002048381A3 (en) * | 2000-12-13 | 2002-09-19 | Norbert Hampp | Method for producing biomass |
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