DD261503A3 - Process for the preparation of Yep-type yeast vectors - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein gentechnologisches Verfahren zur Herstellung eines neuartigen episomalen Traegerreplikons fuer Hefe, vorzugsweise fuer Saccharomyces cerevisiae. Sie verfolgt das Ziel, auf der Basis dieses Traegerreplikons neue YEp-Hybridvektoren herzustellen. Die diesem Ziel zugrunde liegende Aufgabe wird in der Weise geloest, dass unter Verwendung von Abschnitten gentechnologischer Standardmethoden aus der nativen 2 mm-DNA ein den Rep3-Locus und den Replikationsursprung enthaltendes DNA-Fragment entnommen wird, und daraus zusammen mit einer prokaryontischen DNA-Sequenz, die das Tetracyclin-Resistenzgen und den ColE1-Replikationsursprung von Plasmid pBR322 traegt, sowie einem Hefe-DNA-Anteil, welcher das LEU2-Gen als selektierbaren Marker fuer Transformationen in Hefe enthaelt, besagte Hybridvektoren konstruiert werden. Der in einer bevorzugten Ausfuehrungsform erhaltene YEp-Vektor pVU3 zeigt in den Hefestaemmen DC5 &cir ! und DC5 &cir! eine mitotisch stabile Vererbung und liegt mit einer Kopiezahl von 50 Plasmidmolekuelen pro Hefezelle vor.The invention relates to a genetic engineering process for the preparation of a novel episomal traeger replicon for yeast, preferably for Saccharomyces cerevisiae. Its goal is to create new YEp hybrid vectors based on this replica of replicators. The object underlying this aim is achieved by extracting, using sections of standard genetic engineering techniques from the native 2 mm DNA, a DNA fragment containing the Rep3 locus and the origin of replication, together with a prokaryotic DNA sequence carrying the tetracycline resistance gene and the ColE1 origin of replication of plasmid pBR322, as well as a yeast DNA portion containing the LEU2 gene as a selectable marker for transformations in yeast, said hybrid vectors are constructed. The YEp vector pVU3 obtained in a preferred embodiment shows in the yeast strain DC5 & cir! and DC5 & cir! a mitotically stable inheritance and is present with a copy number of 50 Plasmidmolekuelen per yeast cell.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von episomalen Hybridvektoren (YEp-Vektoren) für Hefen, vorzugsweise für Saccharomyces cerevisiae.The invention relates to a process for the production of episomal hybrid vectors (YEp vectors) for yeasts, preferably for Saccharomyces cerevisiae.
Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der Gentechnik und nachgelagert in der mikrobiologischen Industrie, insbesondere in Verfahren zur Expression rekombinanter DNA in Hefen.The field of application of the invention lies in genetic engineering and downstream in the microbiological industry, in particular in methods for the expression of recombinant DNA in yeasts.
Bekannt ist, daß der Einsatz rekombinanter DNA-Techniken an Hefen grundsätzlich auf der Basis von 3 Vektortypen erfolgen kann, die sich hinsichtlich ihrerZusammensetzung unterscheiden (E.-L Winnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, Weinheim, . 1985):It is known that the use of recombinant DNA techniques on yeasts can basically be carried out on the basis of three vector types which differ in their composition (E.-L Winnacker, Gene and Klone, Verlag Chemie, Weinheim, 1985):
1) integrierende Ylp-Vektoren1) integrating Ylp vectors
2) durch chromosomale ARS-Elemente replizierende YRp-Vektoren2) YRp vectors replicating chromosomal ARS elements
3) episomaleYEp-Vektoren.3) Episomal YEp vectors.
YEp-Vektoren finden, bedingt durch ihre hohe Kopiezahl, ihre mitotische Stabilität und ihre gute Reisolierbarkeit, bevorzugte Anwendung. Neben einer E. coli-DNA-Sequenz, die mindestens ein Antibiotikaresistenzgen und ein Replikationsorigin kodiert (Hefe-E. coli-shuttle-Vektor), sowie neben einem homologen Hefemarker enthalten diese Vektoren als Hauptbestandteil die 2 ΊμΓτι-DNA oder eine Teilsequenz davon.YEp vectors find, due to their high copy number, their mitotic stability and their good Reisolierbarkeit, preferred application. In addition to an E. coli DNA sequence which encodes at least one antibiotic resistance gene and a replication origin (yeast E. coli shuttle vector), and in addition to a homologous yeast marker, these vectors contain as main constituent the 2 ΊμΓτι DNA or a partial sequence thereof.
Die 21.^m-DNA ist ein episomales, autonomes 6318 bp großes, doppelsträngiges DNA-Plasmid, welches in den meisten Saccharomyces cerevisiae-Stämmen mit einer Kopiezahl von 50 bis 100 Molekülen pro Zelle vorkommt (J. R. Broach, Cell 28, 1982,203; G. Clark-Walker u. G. L. Mikios, Eur. J. Biochem. 41,1974, 359; Patentschrift DD 207220; Patentschrift DD 218118). Hefestämme, die endogene 21,/Am-DNA enthalten, werden mit [cir+] und plasmidfreie Stämme mit [cir°] bezeichnet. Die 21. μηπ-DNA ist zum großen Teil im Zellkern lokalisiert und teilweise in „Minichromosom"-ähnlichen Chromatinstrukturen organisiert (D. M. Livingston, Genetics 86,1977,73). Als chromosomales Replikon repliziert die 2 \;ttm-DNA dem Zellzyklus angepaßt einmalig in der frühen S-Phase unter Ausnutzung des chromosomalen Replikationsapparates. Die vollständige Sequenzierung erfolgte 1980 (J. Hartley u. J. G. Donelson, Natur 286,1980,860). Die autonome Replikation der 2 \^m-DNAermöglicht ein 350 bp umfassender Replikationsursprung (J. R. Broach u. J. B. Hicks, Nucl. Acids. Res. 7,1980,1513). Bislang sind vier offene Leserahmen der „Region D", der Gene Rep1, Rep2 und FLP bekannt (vgl. Abb. 1), deren Transkriptions- und Translationsprodukte unlängst isoliert und zugeordnet werden konnten (J. R. Broach u. J. B. Hicks, Cell 21,1980, 501; J. R. Broach u. A. Sutton, Molec. and Cell. Biol. 5,1985,2770). Das Expressionsprodukt des FLP-Gens, eine ortsspezifische Rekombinase (FLP-Rekombinase), vermittelt intra- und intermolekulare Rekombinationsereignisse zwischen endogener 2\μΓη-ϋΝΑ bzw. auch zwischen Hybridvektoren mit oder ohne „fremde(r)" DNA, wenn diese die Erkennungssequenz für die FLP-Rekombinase mit enthalten. Diese liegt innerhalb der invertierten repetitiven Sequenzen, die das Gesamtplasmid in zwei fast gleich große Abschnitte unterteilt, und sie konnte für eine 50bp-Sequenz, jeweils um den Xbal-Ort gelegen, genau definiert werden (J. Brenda et al., Cell 40,1985,795; F. J. Senecoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82,1985,7270).The 21 ^ m DNA is an episomal autonomous 6318 bp double-stranded DNA plasmid found in most Saccharomyces cerevisiae strains with a copy number of 50 to 100 molecules per cell (JR Broach, Cell 28, 1982, 203 G. Clark-Walker and GL Mikios, Eur. J. Biochem 41, 1974, 359, patent specification DD 207220, patent specification DD 218118). Yeast strains containing endogenous 21, / Am DNA are designated [cir + ] and plasmid-free strains are [cir °]. The 21st μηπ DNA is largely localized in the cell nucleus and partially organized in "minichromosome" -like chromatin structures (Livingston, Genetics, 86, 1977, 77) As a chromosomal replicon, the 2 \ tmt DNA replicates the cell cycle once Full sequencing was performed in 1980 (J.Hartley and JG Donelson, Nature 286, 197980860). Autonomous replication of the 2 \ m DNA allows for a 350 bp replication origin ( JR Broach and JB Hicks, Nucl. Acids. Res., 7, 1980, 1513) So far, four open reading frames of "Region D," the genes Rep1, Rep2, and FLP are known (see Fig. 1), whose transcription and translation products have recently been isolated and assigned (JR Broach and JB Hicks, Cell 21, 1980, 501; JR Broach et al., Sutton, Molec., and Cell Biol., 5, 1985, 2770). The expression product of the FLP gene, a site-specific recombinase (FLP recombinase), mediates intra- and intermolecular recombination events between endogenous 2 \ μΓη-ϋΝΑ or between hybrid vectors with or without "foreign" DNA, if this the recognition sequence for This lies within the inverted repetitive sequences, which subdivide the whole plasmid into two nearly equal sections, and could be precisely defined for a 50bp sequence located around the XbaI site (J.Brenda et al., Cell 40, 1985, 955; FJ Senecoff et al., Proc. Natl. Acad., USA 82, 1985, 7270).
Ein plasmidkodiertes Stabilitätssystem, an dem nach der sog. „Vier-Faktoren-Hypothese" (M. Jayaram, A. Sutton u. J. R. Broach, Molec. and Cell. Biol. 5,1985,2466) die Expressionsprodukte der Gene Rep1 und Rep2 (trans-aktiv) bzw. der Rep3-Locus und der Replikationsursprung (cis-aktiv) beteiligt sind, gewährleistet die konstante Kopiezahl und gleichermaßen die hohe mitotische Stabilität der 2\/u.m-DNA. Dieses System realisiert zwei Teilfunktionen:A plasmid-coded stability system in which, according to the so-called "four-factor hypothesis" (M.Jayaram, A. Sutton and JR Broach, Molec., And Cell Biol., 5, 1985, 24466), the expression products of the genes Rep1 and Rep2 (trans-active) or the Rep3 locus and the origin of replication (cis-active), ensures the constant copy number and likewise the high mitotic stability of the 2 μm DNA.
1) die gleichmäßige Verteilung der Plasmide auf die Tochterzellen während der Zellteilung sowie1) the uniform distribution of the plasmids on the daughter cells during cell division as well
2) die Kontrolle der Kopiezahl und die Fähigkeit zur Plasmidamplifikation im Falle ihres Absinkens.2) control of copy number and ability to plasmid amplification in case of its sinking.
Da die Vorstellungen über die Funktionsweise des Stabilitätssystems noch sehr neu sind und zum Teil noch hypothetischen Charakter tragen, wurde bislang bei YEp-Vektor-Konstruktionen die Funktion dieses Systems meist nur empirisch ausgenutzt. Die zwei cis-aktiven Komponenten Origin und Rep3-Locus gelten als essentielle Bestandteile eines YEp-Vektors und werden bei der Verwendung des kleinen EcoRI-Fragmentes der 2*\./xm-DNA (2,2 kb) für YEp-Vektor-Konstruktionen mit erfaßt (J. R. Broach et al., Gene 8,1979,121; M. R. Chevallieret al., Gene 11,1980,11; Patentschrift EP 73635; Patentschrift DD 240029). Die Wechselwirkung zwischen den zwei trans-aktiven Rep1-und Rep2-Proteinen und dem Rep3-Locus, dessen exakte Ausdehnung noch nicht bekannt ist, bildet das grundlegende Prinzip des sich selbst regulierenden 2\^m-DNA-Stabilitätssystems. Die zentrale (294bp umfassende, zwischen den Restriktionsorten Hpal und Aval gelegene) Region des Rep3-Locus besteht aus fünf je 62 bp langen repetitiven Sequenzen, die insgesamt als potentielle Bindungsdomäne der Rep-Proteine gelten. Diese bewirken offensichtlich eine Interaktion des Spindelapparates mit dem Rep3-Locus (Verteilerfunktion) und kontrollieren in einer zweiten Funktion die Plasmidamplifikation. Bei Abwesenheit der zwei trans-aktiven Proteine Rep1 undRep2 ist die Verteilerfunktion nicht mehr gegeben, die Plasmidamplifikation aber aktiv.Since the ideas about the functioning of the stability system are still very new and partly still have a hypothetical character, so far in YEp vector constructions the function of this system has been exploited only empirically. The two cis-active components Origin and Rep3 locus are considered essential components of a YEp vector and are generated using the small EcoRI fragment of the 2 * \ / xm DNA (2.2 kb) for YEp vector constructs (JR Broach et al., Gene 8, 1979, 121; MR Chevallier et al., Gene 11, 1980, 11; Patent EP 73635, Patent DD 240029). The interaction between the two trans-active Rep1 and Rep2 proteins and the Rep3 locus, whose exact extension is not yet known, forms the basic principle of the self-regulating 2 \ m DNA stability system. The central (294bp, located between the restriction sites Hpal and Aval) region of the Rep3 locus consists of five repeating sequences each 62 bp in length, which are considered as potential binding domain of the Rep proteins. These apparently cause an interaction of the spindle apparatus with the Rep3 locus (distributor function) and in a second function control the plasmid amplification. In the absence of the two trans-active proteins Rep1 and Rep2, the distribution function is no longer present, but the plasmid amplification is active.
Von YEp-Vektoren, die Rep1- und Rep2-negativ sind, ist eine höhere Kopiezahl in [cir0]- gegenüber [cir+]-Hefewirten bekannt (J. R. Broach, Methods in Enzymology 101,1983,307). Jene minimale Teilsequenz der 21^m-DNA, welche die stabile Erhaltung des jeweils hergestellten YEp-Vektors noch gewährleistet, ist bisher nicht bestimmt worden. Die bisher bekannten Konstruktionen für YEp-Vektoren sind nachteilig somit dadurch charakterisiert, daßYEp vectors that are Rep1 and Rep2 negative are known to have a higher copy number in [cir 0 ] versus [cir + ] yeast hosts (JR Broach, Methods in Enzymology 101, 1983, 307). The minimal partial sequence of the 21 ^ m DNA which still ensures the stable maintenance of the YEp vector produced in each case has not yet been determined. The previously known constructions for YEp vectors are thus disadvantageously characterized in that
a) sie unnötig große Abschnitte (im Sinne von überflüssigen Sequenzen) der 2 "L^m-DNA enthalten und daßa) they contain unnecessarily large sections (in the sense of superfluous sequences) of the 2 "L ^ m DNA and that
b) auf ihnen insbesondere die vollständige FLP-Erkennungssequenz der 2 \^m-DNA vorliegt, wodurch für diese Vektoren eine Inkonstanz sowohl der genetischen als auch der mitotischen Stabilität resultiert, was hinsichtlich des jeweils transferierten Gens rekombinative Austauschreaktionen nach sich ziehen kann.b) they have in particular the complete FLP recognition sequence of the 2 \ m DNA, resulting in an inconsistency of both genetic and mitotic stability for these vectors, which may result in recombinant exchange reactions with respect to each transferred gene.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, für die Gentechnologie neue Hefe-Vektoren des YEp-Typs, d. h. neue episomale Hefe-Hybridvektoren, bereitzustellen.The invention pursues the goal of introducing new YEp-type yeast vectors for genetic engineering, i. H. new episomal yeast hybrid vectors.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches gentechnologisches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe es möglich wird, neue episomale Hefe-Hybridvektoren mit erhöhter mitotischer Stabilität zu konstruieren.The invention has for its object to describe a simple genetic engineering method by means of which it is possible to construct new episomal yeast hybrid vectors with increased mitotic stability.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe unter Nutzung von Standardschritten der gentechnischen DNA-Rekombination wie folgt gelöst:According to the invention, this object is achieved by using standard steps of genetic DNA recombination as follows:
In an sich bekannter Weise wird zunächst aus einem Saccharomyces cerevisiae-Stamm das native 2iU,m-DNA-PlasmidIn a manner known per se, first of all a Saccharomyces cerevisiae strain becomes the native 2iU, m-DNA plasmid
bereitgestellt. DieseT27i^DN7MvgT.~Abb. ΐ) wird'durch Parallelverdauung mit den Restriktionsenzymen Pstl und Xbal(irn weiteren abgekürzt zu "Pstl/Xbal-Parallelverdauung") ein 1293 bp großes Pstl-Xbal-Fragment entnommen, welches sowohl den Rep3-Locus als auch den Replikationsursprung komplett sowie weiterhin ca. 200 bp der einen anliegenden repetitiven Sequenz des 2^m-DNA-Plasmides enthält. Dieses Fragment wird mit dem — gleichfalls durch Pstl/Xbal-Parallelverdauung — in seinem Polylinker geöffneten E. coli-Vektor pUC19 ligiert, und das bei dieser Ligationsreaktion resultierende rekombinante Zwischenplasmid pVU1 wird dann in Ampicillin-sensitiven E. coli-Stämmen kloniert und selektioniert (Verfahrensschritt I). Im Anschluß an diese Umklonierung wird dem Vektor pVU1 (4081 bp) die 2itm-DNA-Komponente nunmehr als 1327 bp großes Pstl-EcoRI-Fragment (vgl. wiederum Abb. 1) entnommen. Dieses 1327 bp-Fragment wird mit einem 3613bp großen DNA-Fragment ligiert, welches durch Pstl/EcoRI-Parallelverdauung des literaturbekannten E. coli-Vektors pBR322 bereitgestellt wird und sowohl den prokaryontischen ColE1-Replikationsursprung als auch einen phänotypischen Marker, nämlich das Gen, welches das die Antibiotika-Resistenz TetR vermittelnde Enzym kodiert, trägt. Das bei dieser Ligationsreaktion resultierende rekombinante Zwischenplasmid pVU2 wird dann in an sich bekannter Weise in Tetracyclin-sensitiven E. coli-Stämmen kloniert und selektioniert (Verfahrensschritt II).provided. DieseT27i ^ DN7MvgT. ~ Fig. Parallel) by parallel digestion with the restriction enzymes Pstl and Xbal (in the following abbreviated to "Pstl / Xbal parallel digestion") a 1293 bp Pstl-XbaI fragment is taken, which contains both the Rep3 locus and the origin of replication and continue approx 200 bp containing an attached repetitive sequence of the 2 ^ m DNA plasmid. This fragment is ligated with the - also by Pstl / XbaI parallel digestion - opened in his polylinker E. coli vector pUC19, and the resulting in this ligation reaction recombinant intermediate plasmid pVU1 is then cloned in ampicillin-sensitive E. coli strains and selected ( Process step I). Following this recloning, the 2itm DNA component is now taken from the pVU1 vector (4081 bp) as a 1327 bp PstI-EcoRI fragment (see in turn Fig. 1). This 1327 bp fragment is ligated with a 3613 bp DNA fragment provided by Pst I / Eco RI parallel digestion of the literature-known E. coli vector pBR322 and both the prokaryotic ColE1 origin of replication and a phenotypic marker, namely the gene which encodes the antibiotic resistance Tet R mediating enzyme carries. The resulting in this ligation reaction recombinant intermediate plasmid pVU2 is then cloned in a conventional manner in tetracycline-sensitive E. coli strains and selected (step II).
Das Verfahren wird in seinem Grundzug abgeschlossen, indem der in seinem singulären Pstl-Spaltort geöffnete Vektor pVU2 (4940 bp) mit einer als Pstl-Pstl-Fragment bereitgestellten homologen DNA-Sequenz, die den phänotypischen Hefemarker LEU2, d. h. das Gen für das Enzym ß-lsopropylmalat-Dehydrogenase, trägt, ligiert wird. Das hierbei anfallende Ligationsgemisch wird zur Suche nach DNA-lnsert-tragenden YEp-Vektoren der pVU-Serie in Tetracyclin-sensitiven, Leucin-auxotrophen E. coli-Stämmen, wie sie beispielsweise in den Rezipienten E. coli HB101 und E. coli GM2159 vorliegen, kloniert und in an sich bekannter Weise selektioniert (Verfahrensschritt III).The process is completed in its basic feature by the vector pVU2 (4940 bp), which is opened in its singular PstI cleavage site, with a homologous DNA sequence provided as PstI-PstI fragment which comprises the yeast phenotypic marker LEU2, d. H. the gene for the enzyme β-isopropylmalate dehydrogenase, is ligated. The resulting ligation mixture is used to search for DNA insert-bearing YEp vectors of the pVU series in tetracycline-sensitive, leucine-auxotrophic E. coli strains, as present for example in the recipient E. coli HB101 and E. coli GM2159 , cloned and selected in a manner known per se (process step III).
Zur Komplettierung der erfinderischen Lösung wird für die erhaltenen YEp-shuttle-Vektoren der pVU-Serie in an sich bekannter Weise noch der Wirtsbereich ermittelt. Diese Prüfung führte zu dem Ergebnis, daß für jeden verfahrensgemäß erhaltenen YEp-Vektor der pVU-Serie als Hefe-Wirt ein Leucin-auxotropher Stamm aus einer der Gattungen Saccharomyces oder Candida einsetzbar ist. Wie in diesem Zusammenhang insbesondere bestätigt werden konnte, sind für die YEp-Vektoren der pVU-Serie als Hefewirte vor allem auch die Leucin-auxotrophen Stämme aus den Arten Sacc. cerevisiae, Sacc. carlbergensis sowie Y. lipolytica, darunter die bekannte Rezipientenstämme wie Sacc. cerevisiae DC5 [cir°] bzw. DC5 [cir+] verwendbar. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das beschriebene Herstellungsverfahren darüber hinaus durch die folgenden speziellen Merkmale gekennzeichnet:To complete the inventive solution, the host range is determined in a manner known per se for the YEp shuttle vectors of the pVU series obtained. This test led to the conclusion that a leucine auxotrophic strain of one of the genera Saccharomyces or Candida can be used as the yeast host for each YEp vector of the pVU series obtained according to the method. As was particularly confirmed in this context, the yeast YEp vectors of the pVU series are mainly the leucine auxotrophic strains of the species Sacc. cerevisiae, Sacc. carlbergensis and Y. lipolytica, including the known recipient strains such as Sacc. cerevisiae DC5 [cir °] or DC5 [cir + ]. In a preferred embodiment, the described manufacturing method is further characterized by the following special features:
Die2jnm-DNAwirdausdem Donorstamm Sacc. cerevisiae DC5 [cir+] isoliert, und die Klonierung derZwischenplasmidepVUI einer- sowie pVU2 andererseits in den Verfahrensschritten I und Il wird jeweils in einem sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclinsensitiven E. coli-Rezipienten wie Stamm JM101 oder Stamm TG1 vorgenommen.The 2jnm DNA is extracted from the donor strain Sacc. cerevisiae DC5 [cir + ], and the cloning of the intermediate plasmids pVUI of one as well as pVU2 on the other hand in the process steps I and II is carried out respectively in an ampicillin and tetracycline-sensitive E. coli recipient such as strain JM101 or strain TG1.
In Verfahrensschritt III wird die Konstruktion eines YEp-Vektors der pVU-Serie in der Weise komplettiert, daß ein 4161 bp großes Pstl-Pstl-Fragment, welches das LEU2-Gen trägt, aus dem literaturbekannten Hefe-Vektor CV13 mit dem Pstl-geöffneten Vektom pVU2 ligiert wird. Durch diese Ligationsreaktion wird konkret der neue YEp-Vektor pVU3 (9101 bp) konstruiert, zu dessen Klonierung undSelektionierung derTetracyclin-sensitive, Leucin-auxotrophe E. coli Stamm HB101 herangezogen wird. Bei der Suche nach rekombinanten HB101-Transformanten wird in diesem Teilschritt des Verfahrens vorteilhaft der Umstand ausgenutzt, daß das LEU2-Gen auch funktionell in dem gewählten E. coli-Rezipienten exprimiert wird, d.h. in Stamm HB101 durch Transformation mit einem LEU2+-rekombinanten YEp-Vektor wie pVU3 eine Komplementation seiner LeuB6-Mutation erreichbar ist. Nach Transformation des voranstehend hergestellten Ligationsgemisches in HB101 sowie nach Selektion auf Tetracyclin-Resistenz werden die den konstruierten YEp-Vektor enthaltenden Transformantenklone deshalb auf Minimalmedium ohne Leucin überimpft und auf die Komplementation der LeuB6-Mutation von HB101 geprüft. Hieran wird schließlich noch eine Restriktionskartierung der gewonnenen rekombinanten Vektor-DNA angeschlossen. Mittels SaII-Verdauung wird in diesem Zusammenhang insbesondere die Orientierung des aus CV13 stammenden Pstl-Pstl-Fragmentes in der Vektor-DNA bestimmt, und genau jeder YEp-Vektor, der dieses Pstl-Insert mit dem Leu2-Marker in der Orientierung gemäß Abb. 1 aufweist, wird als Trägerreplikon pVU3 bezeichnet.In step III, the construction of a vector YEp pVU series is completed in such a way that a 4161 bp Pstl-Pstl fragment carrying the LEU2 gene, from the literature-known yeast vector CV13 with the PstI-open vector pVU2 is ligated. This ligation reaction concretely constructs the new YEp vector pVU3 (9101 bp), for the cloning and selection of which the tetracycline-sensitive, leucine-auxotrophic E. coli strain HB101 is used. In the search for recombinant HB101 transformants, advantage is taken in this sub-step of the process of the fact that the LEU2 gene is also expressed functionally in the selected E. coli recipient, ie in strain HB101 by transformation with a LEU2 + recombinant YEp Vector as pVU3 complementation of its LeuB6 mutation is achievable. After transformation of the above-prepared ligation mixture into HB101 as well as selection for tetracycline resistance, the transformant clones containing the engineered YEp vector are therefore seeded on minimal medium without leucine and tested for complementation of the LeuB6 mutation of HB101. Finally, this is followed by restriction mapping of the recombinant vector DNA obtained. In this connection, the orientation of the CV13-derived PstI-PstI fragment in the vector DNA is determined in particular by means of SalI digestion, and exactly each YEp vector which contains this PstI insert with the Leu2 marker in the orientation according to FIG. 1, is referred to as a carrier replica pVU3.
Mit dem genannten Marker kann beispielsweise eine Selektion von DC5: pVU3-Transformanten infolge Komplementation der Leu2-Doppelmutation auf dem Chromosom Il dieses Hefe-Wirtes durchgeführt werden.For example, a selection of DC5: pVU3 transformants as a result of complementation of the Leu2 double mutation on the chromosome II of this yeast host can be carried out with said marker.
Eine kontaminationsfreie Probe des E. coli-Stammes HB101 V(pVU3) ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11 unter der Registrier-Nr. ZIMET11203 hinterlegt worden.A contamination-free sample of the E. coli strain HB101 V (pVU3) is in the depository for microorganisms, Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the Academy of Sciences, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11 under the registration no. ZIMET11203 has been deposited.
Der verfahrensgemäß hergestellte YEp-Vektor pVU3 enthält das prokaryontischeReplikon und das Tetracyclinresistenz-Gen von pBR322, den Rep3-Locus sowie den Replikationsursprung der2/j.m-DNAundchromosomale Hefe-DNA aus CV13 mit dem Gen für die ß-lsopropylmalat-DehydrogenaseThe YEp vector pVU3 prepared according to the method contains the prokaryotic replicon and the tetracycline resistance gene of pBR322, the Rep3 locus as well as the replication origin of the 2 / j.m DNA and chromosomal yeast DNA from CV13 with the gene for the β-isopropylmalate dehydrogenase
Das Plasmid besteht aus folgenden Elementen: The plasmid consists of the following elements:
— einem 1293bpgroßen Pstl-Xbal-Fragmentder2^m-DNA,A 1293bp PstI-XbaI fragment of the 2 ^ m DNA,
— einem 3613bp großen EcoRI-Pstl-Fragment aus pBR322 undA 3613bp EcoRI-PstI fragment from pBR322 and
— einem 4161 bp großen Pstl-Fra^ment aus CV13, welches zwischen demXhol-und dem Sall-OrtdasGenfürdießlsopropylmalat-Dehydrogenase enthält.A 4161 bp PstI fragment from CV13 containing between the XhoI and Sall sites the gene for the isopropylmalate dehydrogenase.
Das Molekulargewicht des Plasmides pVU3 beträgt 5,86MD; die Größe ist 9,1 kb. Die Kopiezahl liegt bei ca. 50 Kopien pro Zelle sowohl in E. coli als auch in Hefen bei Anzucht unter selektiven Bedingungen.The molecular weight of the plasmid pVU3 is 5.86MD; the size is 9.1 kb. The copy number is about 50 copies per cell in both E. coli and yeasts grown under selective conditions.
Die Plasmid-DNAvon pVU3 enthält zwei unikale Spaltorte für Hindlll undXbal. Der Xbal-Spaltort kann als potentieller Klonierungsort verwendet werden.The plasmid DNA of pVU3 contains two unique cleavage sites for HindIII and XbaI. The XbaI cleavage site can be used as a potential cloning site.
Die Plasmid-DNAvon pVU3 enthält weiterhin je zwei Restriktionsspaltorte für die Enzyme EcoRI, Pstl, Sail und BamHI. Diese wurden durch Restriktionsanalyse überprüft.The plasmid DNA from pVU3 also contains two restriction sites each for the enzymes EcoRI, PstI, Sail and BamHI. These were checked by restriction analysis.
Die Restriktionsorte für EcoRI, Pstl, Sail und BamHI haben im Uhrzeigersinn folgende Abstände vom unikalen Hindlll-Spaltort:The restriction sites for EcoRI, PstI, Sail and BamHI have the following distances from the unique HindIII site in a clockwise direction:
EcoRI: 1770 bp bzw. 9070 bpEcoRI: 1770 bp and 9070 bp, respectively
Pstl: 3590 bp bzw. 7751 bpPstl: 3590 bp and 7751 bp, respectively
Sail: 632 bp bzw. 3259 bpSail: 632 bp or 3259 bp
BamHI: 345 bp bzw. 9050 bp.BamHI: 345 bp and 9050 bp, respectively.
Das Plasmid wird in E. coli-Zellen durch das Vorhandensein des Replikons von pBR322 repliziert. In Hefe-Zellen gewährleistet das 2/*m-DNA-Replikon die Replikation des angegebenen Plasmides.The plasmid is replicated in E. coli cells by the presence of the replicon of pBR322. In yeast cells, the 2 / * m DNA replicon ensures replication of the indicated plasmid.
Der Nachweis der mitotischen und genetischen Stabilität des verfahrensgemäß hergestellten neuen Trägerreplikons pVU3 erfolgt durch Bestimmung der Plasmidsegregationsrate unter nicht-selektiven Bedingungen bei bestmöglichen Wachstumsverhältnissen in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase im YEPD-Vollmedium. Sie beträgt in der Hefe Sacc.Proof of the mitotic and genetic stability of the novel carrier replicon pVU3 produced according to the method is carried out by determining the plasmid segregation rate under non-selective conditions with the best possible growth conditions in the mean logarithmic growth phase in YEPD complete medium. It is in the yeast Sacc.
cerevisiae DC5 [cir°] 60% und in DC5 [cir+] 82% nach 20 Generationen. Damit liegt mit pVU3 ein neuer YEp-Vektor vor, der durch eine hohe mitotische Stabilität gekennzeichnet ist.cerevisiae DC5 [cir °] 60% and in DC5 [cir + ] 82% after 20 generations. Thus, pVU3 is a new YEp vector characterized by high mitotic stability.
Mittels Gelelektrophorese, Extinktionsmessungen bei 260nm und E. coli-Retransformation von Hefe-Plasmidisolationen aus DC5 [cir°]:pVU3 und DC5 [cir+]:pVU3 ist eine Abschätzung der Kopiezahl des in Hefe transformierten Vektors pVU3 möglich. Sie liegt in dem Kopiezahlbereich der endogenen 2^m-DNA, also 50 Kopien pro Zelle, und ist in DC5 [cir°] signifikant höher als in DC5By means of gel electrophoresis, absorbance measurements at 260 nm and E. coli retransformation of yeast plasmid isolations from DC5 [cir °]: pVU3 and DC5 [cir + ]: pVU3, it is possible to estimate the copy number of the yeast-transformed pVU3 vector. It is in the copy number range of the endogenous 2 ^ m DNA, ie 50 copies per cell, and is significantly higher in DC5 [cir °] than in DC5
Ein Verlust der phänotypischen Marker von pVU3, d.h. des TetR-Gens, der Replikons für E. coli und Hefe, des Leu2-Gens sowie der Rep3-Funktion, tritt nach Passagen durch E. coli- oder Hefe-Wirte nicht auf.Loss of the phenotypic markers of pVU3, ie the Tet R gene, the replicon for E. coli and yeast, the Leu2 gene and the Rep3 function, does not occur after passage through E. coli or yeast hosts.
Das EcoRI-Verdauungsmuster von Plasmidisolationen aus E. coli- oder Hefe-Transformanten zeigt keine strukturellen Veränderungen der Plasmid-DNA von pVU3.The EcoRI digestion pattern of plasmid isolations from E. coli or yeast transformants shows no structural changes in the plasmid DNA of pVU3.
Gemäß der Erfindung zeigen pVU3-tragende Hefetransformanten ein günstiges Wachstumsverhalten in Minimalmedium unter Selektionsdruck.According to the invention pVU3-bearing yeast transformants show a favorable growth behavior in minimal medium under selection pressure.
Die maximale Zelldichte zu Beginn der stationären Phase beträgtfürDC5[cir°]:pVU31,8 x 108Zellen/mlundfürDC5[cir+]:pVU3 2,2 χ 108Zellen/ml (vgl. Abb.2).The maximum cell density at the beginning of the stationary phase for DC5 [cir °] is: pVU31.8 x 10 8 cells / ml and for DC5 [cir + ]: pVU3 2.2 x 10 8 cells / ml (see Fig. 2).
Die Verdopplungsrate beträgt in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase für DC5 [cir°]:pVU3 0,4 Verdopplungen pro Stunde und für DC5 [cir+]:pVU3 0,5 Verdopplungen pro Stunde (Abb.2).The doubling rate in the middle of the logarithmic growth phase for DC5 [cir °]: pVU3 is 0.4 doublings per hour and for DC5 [cir + ]: pVU3 0.5 doublings per hour (Figure 2).
Alle E. coli-Stämme, die rekombinante Plasmid-DNA von pVU3 enthalten, sind durch folgende allgemeine Merkmale gekennzeichnet:All E. coli strains containing recombinant plasmid DNA from pVU3 are characterized by the following general features:
— Morphologische Merkmale- Morphological characteristics
Gestreckte, stäbchenförmige, gramnegative, nichtsporulierende ZellenElongated, rod-shaped, Gram-negative, non-sporulating cells
— Kulturmerkmale \ - cultural features \
Die Zellen zeigen ein gutes Wachstum in gewöhnlich verwendeten Nährmedien. Auf 1,5%igem Nähragar „Difco" sind die Kolonien glatt, grau, glänzend, rund mit ebenem Rand.The cells show good growth in commonly used nutrient media. On 1.5% nutrient agar "Difco" the colonies are smooth, gray, shiny, round with a flat margin.
Bei Anzucht in flüssigen YT- und LB-Medien bildet sich eine gleichmäßige intensive Trübung. ""When grown in liquid YT and LB media, a uniform intense turbidity forms. ""
— Physiko-biochemische Merkmale Optimale Kultivierungstemperatur: 37°C, pH-Optimum: 6,8 bis7,5.- Physico-biochemical characteristics Optimum cultivation temperature: 37 ° C, pH optimum: 6.8 to 7.5.
Als Kohlenstoffquelle werden verschiedene Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole benutzt; als Stickstoffquelle dienen mineralische Salze (in Ammonium- oder Nitratform) sowie organische Verbindungen (in der Form von Pepton, Trypton, Aminosäuren).The carbon source used is various carbohydrates, organic acids and alcohols; The source of nitrogen is mineral salts (in ammonium or nitrate form) and organic compounds (in the form of peptone, tryptone, amino acids).
— Resistenz gegenüber Antibiotika- Resistance to antibiotics
Eine Resistenz gegenüber Tetracyclin wird zwischen 5,0 und 50/u.g/ml, gegen Ampicillin zwischen 15 und 50//.g/ml ausgeprägtTetracycline resistance is expressed as between 5.0 and 50 μg / ml and against ampicillin between 15 and 50 μg / ml
Alle Hefe-Stämme, die das Plasmid pVU3 tragen, sind durch folgende allgemeine Merkmale gekennzeichnet: All yeast strains carrying the plasmid pVU3 are characterized by the following general features:
— Morphologische Merkmale- Morphological characteristics
Runde bis ovale, nur unter Hungerbedingungen sporulierende Zellen mit Sprossungen (Tochterzellen).Round to oval, only under starvation conditions sporulating cells with budding (daughter cells).
— Kulturmerkmale- Cultural characteristics
Die Zellen wachsen gut in gewöhnlich verwendeten Nährmedien. Auf 2- bis 2,5%igem Nähragar „Difco" sind die Kolonien glatt und weiß, mit ebenem Rand. Bei Anzucht in flüssigen YEPD- und YNB-Medien bildet sich eine gleichmäßig intensive Trübung.The cells grow well in commonly used nutrient media. On 2 to 2.5% nutrient agar "Difco", the colonies are smooth and white, with a flat margin, when grown in liquid YEPD and YNB media, a uniformly intense turbidity forms.
— Physiko-biochemische Merkmale- Physico-biochemical features
Optimale Kultivierungstemperatur: 28 bis 30°C pH-Optimum: 5,6Optimal cultivation temperature: 28 to 30 ° C pH optimum: 5,6
Als Kohlenstoffquelle werden vorzugsweise Glucose und in einigen Fällen Alkohole verwendet; als Stickstoffquelle dienen (NHJ2SO4 und organische Verbindungen in der Art von Pepton oder Aminosäuren. Das neuartige Trägerreplikon in Form des shuttle-Vektors pVU3 zeichnet sich durch folgende Eigenschaften aus:The carbon source used is preferably glucose and, in some cases, alcohols; serve as a nitrogen source (NHJ 2 SO 4 and organic compounds in the manner of peptone or amino acids.) The novel carrier replicon in the form of the shuttle vector pVU3 is characterized by the following properties:
1) mitotische Stabilität von 60% in [cir°]- und 82% in [cir+]-Hefe-Wirten,1) mitotic stability of 60% in [cir °] and 82% in [cir + ] yeast hosts,
2) gute Transformierbarkeit in E. coli und in Hefe,2) good transformability in E. coli and in yeast,
3) günstige Wachstumseigenschaften unter Selektionsdruck,3) favorable growth characteristics under selection pressure,
4) hohe Kopiezahl von =50 Kopien pro Zelle und4) high copy count of = 50 copies per cell and
5) Einbau einer nur 1,3kb großen 2^m-DNA-Sequenz.5) Incorporation of a only 1.3kb 2 ^ m DNA sequence.
Die Vorteile des vorliegenden Verfahrens bestehen im Vergleich zu bekannten Verfahren zur Konstruktion von YEp-Vektoren im folgenden:The advantages of the present method are as compared to known methods for constructing YEp vectors in the following:
1) Verwendung eines sehr kurzen, im wesentlichen nur auf den Rep3-Locus und den Replikationsursprung beschränkten 2/Ltm-DNA-Anteils, so daß pVU-Hybridplasmide von YEp-Typ mit günstiger Gesamtgröße resultieren,1) Use of a very short 2 / Ltm DNA portion restricted essentially only to the Rep3 locus and the origin of replication so that YEp-type pVU hybrid plasmids result in a favorable total size,
2) verbesserte mitotische Stabilität in [cir°]- und [cir+]-Hefe-Wirten, *2) improved mitotic stability in [cir °] and [cir + ] yeast hosts, *
3) erhöhte genetische Stabilität bezüglich der FLP-Rekombinationsereignisse in [cir+]-Hefe-Wirten (da, bedingt durch die Xbal-Klonierung der nativen 2^m-DNA-Sequenz, in YEp-Vektoren der pVU-Serie keine intakte Erkennungssequenz für die FLP-Rekombinase mehr vorliegt).3) increased genetic stability with respect to the FLP recombination events in [cir + ] yeast hosts (since, due to XbaI cloning of the native 2 ^ m DNA sequence, in pVU series YEp vectors, no intact recognition sequence for the FLP recombinase is present more).
Die Erfindung soll anschließend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail by an embodiment.
1 a) Isolierung des 1293bp großen 2μηη-0ΝΑ-Ρ^ΓηβηΙβ3 aus endogener 2^m-DNA:1 a) Isolation of the 1293bp 2μηη-0ΝΑ-Ρ ^ ΓηβηΙβ3 from endogenous 2 ^ m DNA:
Die 2μ-ϋΝΑ wird durch alkalischen SDS-Aufschluß von Hefezellen de"s Stammes DC5 [cir+] gewonnen.The 2μ-ϋΝΑ is obtained by alkaline SDS digestion of yeast cells of the DC5 strain [cir + ].
Hefezellen einer 250-ml-Kultur (YEPD-Vollmedium) werden dazu aus der mittleren log-Phase durch 5minütiges Zentrifugieren bei 3000 U/min gewonnen und einmal mit Aqua dest. gewaschen.Yeast cells of a 250 ml culture (complete YEPD medium) are obtained from the middle log phase by centrifuging for 5 minutes at 3000 U / min and once with distilled water. washed.
Die Zellen werden 10 Minuten bei Raumtemperatur in folgendem Puffer inkubiert: 0,64M ß-Mercapto-Ethanol; 0,1 M EDTA, pH8,0; 0,1 MTrisHCI. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert und mehrmals in folgendem Puffer gewaschen: 0,126M Na2PO4; 0,65 M (NH4J2SO4; 0,062 M Zitrat und in demselben Puffer resuspendiert. Es erfolgt eine einstündige Inkubation bei 28°C in Anwesenheit von 10 mg Arthrobacter-Enzym/109 Zellen. Die Protoplasten werden durch Zentrifugation geerntet, 2mal mit 1 M Sorbitol gewaschen und in einem Volumen von 10ml Sorbitol aufgenommen. Aus dieser Suspension wird durch alkalischen SDS-Aufschluß in an sich bekannter Weise die Plasmid-DNA isoliert.The cells are incubated for 10 minutes at room temperature in the following buffer: 0.64M β-mercapto-ethanol; 0.1 M EDTA, pH 8.0; 0.1 MTrisHCI. The cells are then centrifuged off and washed several times in the following buffer: 0.126M Na 2 PO 4 ; 0.65 M (NH 4 J 2 SO 4 ; 0.062 M citrate and resuspended in the same buffer, followed by incubation at 28 ° C. in the presence of 10 mg Arthrobacter enzyme / 10 9 cells for 1 hour, the protoplasts are harvested by centrifugation, Washed twice with 1 M sorbitol and taken up in a volume of 10 ml of sorbitol from which the plasmid DNA is isolated by alkaline SDS digestion in a conventional manner.
Die durch die vergleichsweise geringe Kopiezahl bedingte niedrige Ausbeute an Plasmid-DNA schloß eine Reinigung durch CsCI-Gradientenzentrifugationaus. Mittels einer intensiven RNase- und ProteinaseK-Behandlung, nachfolgender Extraktion mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln und deren Gemischen wie Phenol (mit 0,1 M Tris HCI; pH7,5; gesättigt), Phenol-Chloroform, Chloroform-Isoamylalkohol und Butanol sowie abschließender Dialyse wird eine weitestgehende Eliminierung hefespezifischer Verunreinigungen der 2/j,m-DNA-Fraktion mit Polysacchariden und Glykoproteinen erreicht. Mit diesen Reinigungsschritten sind die notwendigen Voraussetzungen für die Spaltbarkeit der 2^m-DNA mit den (für die nachfolgende Klonierung notwendigen) Restriktionsendonuklasen Xbal und Pstl gegeben. 'The low yield of plasmid DNA due to the relatively low copy number precluded purification by CsCl gradient centrifugation. By means of an intensive RNase and ProteinaseK treatment, subsequent extraction with various organic solvents and their mixtures such as phenol (with 0.1 M Tris HCl, pH 7.5, saturated), phenol-chloroform, chloroform-isoamyl alcohol and butanol, and final dialysis achieved the greatest possible elimination yeast-specific impurities of the 2 / j, m-DNA fraction with polysaccharides and glycoproteins. With these purification steps, the necessary conditions for the cleavability of the 2 ^ m DNA with the (for the subsequent cloning necessary) restriction endonucleases Xbal and Pstl are given. '
1 b) Konstruktion des Trägerreplikons in Form des Hefe-Ε. coli-shuttle-Vektors pVU3 Die Klonierung des 2/nm-DNA-Xbal-Psti-Fragmentes und nachfolgende Konstruktion des Vektors pVU3 ist im Konstruktionsschemader Abbildung 1 dargestellt.1 b) Construction of the carrier replica in the form of yeast Ε. coli shuttle vector pVU3 The cloning of the 2 / nm DNA XbaI PstI fragment and subsequent construction of the pVU3 vector is shown in the construction scheme Figure 1.
Durch Parallelverdauung αβΓ2μπν0ΝΑη-ιϊΐαβη Restriktionsendonukleasen Pstl und Xbal wird ein 1293 bp großes DNA-Fragment erhalten, nach Agarosegelelektrophorese mittels Elektroelution isoliert und in an sich bekannter Weise mit dem Xbal/Pstl-geschnittenen KlonierungsvektorpUC19zur Ligation gebracht. Die Transformation erfolgt in den E. coli-StammTG1 mit anschließender Selektion auf Amplicillin-Resistenz unter Verwendung der XGal-Farbreaktion. Die Suche nach rekombinanten Klonen wird durch die Anwendung dieser Farbreaktion wesentlich vereinfacht. Die transformierten E. coli-Zellen werden auf Agarplatten ausgespatelt, die 50/ng/ml Ampicillin; 0,2mM IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalaktopyranosid) und40^g/ml XGaI (5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-ß-Galaktopyranosid) enthalten. Von den weißen Kolonien wird durch Restriktionsanalyse ein inserttragender Klon identifiziert. Der so konstruierte 4081 bp große Vektor pVU1 wird durch Spaltung mit den Enzymen Xbal, Pstl, Hindill, Aval, BamHI und EcoRI charakterisiert.By parallel digestion αβΓ2μπν0ΝΑη-ιϊΐαβη restriction endonucleases Pstl and Xbal a 1293 bp large DNA fragment is obtained, isolated by agarose gel electrophoresis by electroelution and brought in a conventional manner with the XbaI / PstI-cut cloning vector pUC19 for ligation. The transformation takes place in the E. coli strain TG1 with subsequent selection for amplicillin resistance using the XGal color reaction. The search for recombinant clones is greatly simplified by the application of this color reaction. The transformed E. coli cells are spiked onto agar plates containing 50 / ng / ml ampicillin; 0.2mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) and 40 ^ g / ml XGal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside). From the white colonies, an insert-carrying clone is identified by restriction analysis. The thus constructed 4081 bp vector pVU1 is characterized by cleavage with the enzymes XbaI, PstI, HindIII, Aval, BamHI and EcoRI.
Aus dem Vektor pVU1 wird die 2/x,m-DNA-Sequenz als EcoRI/Pstl-Fragment gewonnen und in an sich bekannter Weise mit dem EcoRI/Pstl-geschnittenen Plasmid pBR322 ligiert. Das Ligationsgemisch wird anschließend in den E. coli-Stamm TG1 transformiert mit Selektion auf Tetracyclin-Resistenz.From the vector pVU1 the 2 / x, m-DNA sequence is obtained as EcoRI / PstI fragment and ligated in a conventional manner with the EcoRI / PstI-cut plasmid pBR322. The ligation mixture is then transformed into E. coli strain TG1 with selection for tetracycline resistance.
In den unikalen Pstl-Ort des so erhaltenen Vektors pVU2 wird abschließend in an sich bekannterWeisedas4,1 kb große Pstl-Fragment aus dem YEp-Vektor CV13 kloniert.Finally, the 4.1 kb PstI fragment from the YEp vector CV13 is cloned into the unique PstI site of the resulting vector pVU2 in a manner known per se.
Die Transformation der ligierten Pstl-DNA-Fragmente erfolgt in den E. coli-Stamm HB101 bei Selektion auf Tetracyclin-Resistenz. Die Tetracyclin-resistenten Klone werden anschließend auf Minimalmedium ohne Leucin überimpft und auf die Komplementation der LeuB6-Mutation von HB101 überprüft.The transformation of the ligated PstI DNA fragments takes place in E. coli strain HB101 when selected for tetracycline resistance. The tetracycline-resistant clones are then inoculated on minimal medium without leucine and checked for the complementation of the LeuB6 mutation of HB101.
Aus den so selektierten Klonen erfolgt eine Charakterisierung derTransformanten durch Restriktionskartierung. 1 c) Verfahren zur Bestimmung der mitotischen und genetischen Stabilität des konstruierten YEp-Vektors pVU3 in den Hefewirten DC5 [cir°] und DC5 [cir+]From the thus selected clones, the transformants are characterized by restriction mapping. 1 c) Method for determining the mitotic and genetic stability of the engineered YEp vector pVU3 in the yeast hosts DC5 [cir °] and DC5 [cir + ]
Der YEp-Vektor pVU3 wird in Hefezellen des Stammes DC5 [cir°] und DC5 [cir+] (leu 2,3; leu 2-112; his 3; MATa; can 1-11) transformiert, die mittels der nachstehenden Methode kompetent gemacht werden:The YEp vector pVU3 is transformed into yeast cells of the strain DC5 [cir °] and DC5 [cir + ] (leu 2,3; leu 2-112; his 3; MATa; can 1-11), which become competent by the following method be made:
Eine Hefekolonie wird von einer Vollmedium-Platte in 50ml YEPD-Vollmedium überführt und bei 28°C über Nacht inkubiert. Die Kultur wird zentrifugiert und das Pellet einmal mit folgendem Puffer gewaschen: 0,01 M Tris HCI, pH7,4; 0,1 M EDTA. Die gewaschenen Zellen werden in 50 ml desselben Puffers resuspendiert, der jetzt 0,1 M LiCI enthält und 1 Stunde bei 28°C inkubiert. Nach Zentriefugation werden die Zellen in 500μΙ LiCI-Puffer suspendiert. Es werden 20/u,g Plasmid-DNA pVU3 in 40μΙ Volumen zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei 28°C bebrütet. Anschließend wird 1 ml 50%ige PEG4000-Lösung (in Wasser gelöst) zugegeben. Nach sorgsamem Durchmischen der Suspension erfolgt eine 30minütige Inkubation bei 370C und danach ein 5minütiger Hitzeschock bei 42°C. Die Zellen werden zentrifugiert und 3mal mit Wasser gewaschen.A yeast colony is transferred from a full medium plate into 50 ml YEPD complete medium and incubated at 28 ° C overnight. The culture is centrifuged and the pellet washed once with the following buffer: 0.01 M Tris HCl, pH 7.4; 0.1 M EDTA. The washed cells are resuspended in 50 ml of the same buffer, which now contains 0.1 M LiCl and incubated for 1 hour at 28 ° C. After centrifugation, the cells are suspended in 500 μL LiCl buffer. 20μg of plasmid DNA pVU3 in 40μΙ volume are added and the mixture is incubated at 28 ° C for 30 minutes. Subsequently, 1 ml of 50% PEG4000 solution (dissolved in water) is added. After thorough mixing of the suspension, a 30 minute incubation at 37 0 C and then a 5 minute heat shock at 42 ° C. The cells are centrifuged and washed 3 times with water.
Die gewaschenen DC5-Zellen werden in 500μΙ Wasser gelöst und zu jeweils 100μ.Ι auf Platten mit Selektionsagar (0,67% YNB; 2% Glucose; 20μΙ Histidin; 2% Agar) ausplattiert und bei 280C inkubiertThe washed DC5 cells are dissolved in 500μΙ water and plated out to 100μ.Ι on plates with selection agar (0.67% YNB, 2% glucose, 20μΙ histidine, 2% agar) and incubated at 28 0 C.
Transformationskolonien sind 3 bis 4 Tage nach den Ausplattieren erkennbar. Transformation colonies are evident 3 to 4 days after plating.
Die Kenntnis der Verdopplungsrate der Hefetransformanten ist Voraussetzung für die Bestimmung der mitotischen Stabilität. Sie beträgt in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase für DC5 [cir°]:pVU3 0,9/h und für DC5 [cir]:pVU3 0,75/h. Mit dem Wissen der Verdopplungszeiten werden beide rekombinante Hefestämme für 20 Generationen durch fünfmaliges Überimpfen und ständige Zellzahlkontrolle unter logarithmischen und damit optimalen Wachstumsbedingungen in YEPD-Flüssigmedium ohne Selektionsdruck kultiviert.Knowledge of the doubling rate of yeast transformants is a prerequisite for the determination of mitotic stability. It is in the middle of the logarithmic growth phase for DC5 [cir °]: pVU3 0.9 / h and for DC5 [cir]: pVU3 0.75 / h. With the knowledge of the doubling times, both recombinant yeast strains are cultured for 20 generations by five times inoculation and constant cell number control under logarithmic and thus optimal growth conditions in YEPD liquid medium without selection pressure.
Nach der Kultivierung werden von den untersuchten Subklonen sowohl für DC5 [cir°] als auch für DC5 [cir+] eine definierte Zellzahl auf Minimalmedium mit und ohne Leucin ausgespatelt.After culturing, a defined number of cells on minimal medium with and without leucine are screened out of the investigated subclones for both DC5 [cir °] and DC5 [cir + ].
Aus der Differenz der Koloniezahl kann die Plasmidsegregationsrate pro Generation ermittelt werden. Sie beträgt nach 20 Generationen für DC5 [cir°]:pVU3 60% und für DC5 [cir+]:pVU3 82%.From the difference in the colony number, the plasmid segregation rate per generation can be determined. It is 60% after 20 generations for DC5 [cir °]: pVU3 and 82% for DC5 [cir + ]: pVU3.
Eine Untersuchung auf strukturelle Konstanz des Vektors pVU3 nach Passagen durch Hefewirte und damit mögliche Rückschlüsse auf die genetische Stabilität in der Hefezelle ermöglicht die Retransformation von Hefe-Plasmid-DNA-Isolaten in E. coli:A study on the structural constancy of the vector pVU3 after passage through yeast hosts and thus possible conclusions about the genetic stability in the yeast cell allows the retransformation of yeast plasmid DNA isolates into E. coli:
Plasmid-DNA wird analog dem Verfahren zur präparativen Isolierung der 2μιη-0ΝΑ aus Hefe aus dem Stamm DC5 [cir+]:pVU3 gewonnen und in den E. coli-Stamm HBI01 (rec A") transformiert. Von einer Auswahl (12 Klone) der Tetracyclin-resistenten Transformanten werden Mini-DNA-Präparationen gewonnen und mit EcoRI verdaut. Die gespaltenen und ungespaltenen DNA-Proben werden gemeinsam mit pVU3/EcoRI-Standard gelelektrophoretisch analysiert. Ein Vergleich der Spaltmuster läßt keine strukturelle Veränderung der Plasmid-DNA erkennen.Plasmid DNA is obtained from the strain DC5 [cir + ]: pVU3 analogous to the method for the preparative isolation of 2μιη-0ΝΑ from yeast and transformed into E. coli strain HBI01 (rec A ") From a selection (12 clones) of the tetracycline-resistant transformants, mini-DNA preparations are recovered and digested with EcoRI The cleaved and uncleaved DNA samples are analyzed by gel electrophoresis together with pVU3 / EcoRI standard A comparison of the cleavage patterns reveals no structural change in the plasmid DNA.
1 d) Bestimmung des Wachstumsverhaltens von pVU3-tragenden Hefetransformanten unter selektiven Bedingungen Von den rekombinanten Hefe-Stämmen wurden die Wachstumskurven unter Selektionsdruck in Minimalmedium ohne Leucin aufgenommen. Als Vergleich dienten CVlS-Transformanten und plasmidfeie Hefe des gleichen Stammes DC5. Die Wachstumskurven sind in Abbildung 2 wiedergegeben. Daraus ist ersichtlich, daß DC5 [cir+]:pVU3 unter selektiven Bedingungen ein besseres Wachstumsverhalten hinsichtlich Verdopplung pro Stunde und maximaler Zellzahl in stationärer Phase gegenüber DC5 [cir°]:pVU3 zeigt.1 d) Determination of the growth behavior of pVU3-bearing yeast transformants under selective conditions From the recombinant yeast strains, the growth curves were recorded under selection pressure in minimal medium without leucine. As a comparison served CVlS transformants and plasmid yeast of the same strain DC5. The growth curves are shown in Figure 2. It can be seen that DC5 [cir + ]: pVU3 shows a better growth behavior in terms of doubling per hour and maximum cell number in stationary phase compared to DC5 [cir °]: pVU3 under selective conditions.
In Gegenwart von endogener 2/*m-DNA wurde eine um ca. 20% kürzere Verdopplungszeit ermittelt.In the presence of endogenous 2 / * m DNA, a doubling time was approximately 20% shorter.
Dieser Unterschied zwischen [cir°]- und [cir+]-Stämmen war bei CV13-Transformanten nicht gegeben. Die maximale Zellzahl lag für DC5:pVU3 über den Werten von DC5:CV13, und zwar bei [cir0]- um 23% und bei [cir+]-Stämmen sogar um 37% höher.This difference between [cir °] and [cir + ] strains was absent in CV13 transformants. The maximum number of cells for DC5: pVU3 was above the values of DC5: CV13, namely by 23% for [cir 0 ] - and even 37% higher for [cir + ] strains.
Aus diesem Ergebnis ist ersichtlich, daß die rekombinanten Hefestämme DC5 [cir°]:pVU3 und DC5 [cir+]:pVU3 unter selektiven Bedingungen ein vorteilhaftes Wachstumsverhalten zeigen.From this result it can be seen that the recombinant yeast strains DC5 [cir °]: pVU3 and DC5 [cir + ]: pVU3 exhibit a favorable growth behavior under selective conditions.
1 e) Verfahren zur Abschätzung der Kopiezahl von pVU3 im Hefewirt durch Agarosegelelektrophorese und Retransformation in1 e) Method for estimating the copy number of pVU3 in the yeast host by agarose gel electrophoresis and retransformation in
E. coli von Hefe-Plasmid-IsolationenE. coli from yeast plasmid isolations
Die Kopiezahl von 2//.m-DNA-Hybridvektoren (YEp-Vektoren) liegt zwischen 50 und 100 Molekülen pro Zelle. (Diese Angabe wird allerdings durch wirtsabhängigen Schwankungen modifiziert.)The copy number of 2 // m DNA hybrid vectors (YEp vectors) is between 50 and 100 molecules per cell. (However, this information is modified by host-dependent fluctuations.)
Ausgehend vom Vergleichsvektor CV13 mit einer Kopiezahl von etwa 50 kann eine Abschätzung der Kopiezahl für pVU3 im [eirund im [cir+]-Wirt vorgenommen werden:Starting from the comparison vector CV13 with a copy number of about 50, an estimate of the copy number for pVU3 can be made in the [eir and in the [cir + ] host:
Aus je einer 200-ml-Hauptkultur (log-Phase) werden unter Kenntnis der exakten Zellzahl die Zellen von DC5 [cir°]:CV13 und DC5 [cir+]:DV13 (als Standard) sowie von DC5[cir°]:pVU3 und DC5 [cir+]:pVU3 gewonnen. Um vergleichbare Aussagen über die Kopiezahl treffen zu können, werden alle folgenden DNA-Konzentrationswerte auf eine einheitliche Zellzahl normiert. Die Plasmid-DNA wird aus den genannten vier Hefestämmen unter möglichst identischen Bedingungen präparativ isoliert. Die DNA-Reinigung erfolgt durch zweimalige Phenol-Extraktion, RNase- und Proteinase-Behandlung, erneute Phenol-Extraktion, Fällung sowie abschließende Dialyse. Die Gesamtplasmidfraktionen werden in je 1 ml Aqua bidest. aufgenommen. Je 20μΙ davon werden zusammen mit 2/u.m-DNA-, CV13- und pVU3-Standard bekannter DNA-Konzentration durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Bei diesem Vorgehen sind zunächst nur bei den Auftragungen der [cir+j-Hefetransformanten Plasmidbanden zu erkennen. Durch EcoRI-Verdauung von je 40μΙ der Plasmidisolationen war eine bessere Auftrennung (und somit Zuordnung) der Banden möglich.From one 200 ml main culture (log phase), the cells of DC5 [cir °]: CV13 and DC5 [cir + ]: DV13 (as standard) and of DC5 [cir °]: pVU3 are known with the exact number of cells and DC5 [cir + ]: pVU3 won. In order to be able to make comparable statements about the copy number, all subsequent DNA concentration values are normalized to a uniform cell number. The plasmid DNA is preparatively isolated from the four yeast strains mentioned under identical conditions. The DNA purification is carried out by two phenol extraction, RNase and proteinase treatment, renewed phenol extraction, precipitation and final dialysis. The Gesamtplasmidfraktionen are redistilled in 1 ml of water. added. 20 μΙ of each are separated by agarose gel electrophoresis together with 2 μM DNA, CV13 and pVU3 standard of known DNA concentration. In this procedure, only the plots of the [cir + j yeast transformants can initially be seen as plasmid bands. By EcoRI digestion of 40μΙ each of the plasmid isolations a better separation (and thus allocation) of the bands was possible.
Aus dem Vergleich der Bandenintensitäten ließ sich abschätzen, daß pVU3 ungefähr in derselben Konzentration wie die 2μνη-DNA und CV13-DNA im Hefewirt DC5 [cir+] vorliegt. Diese Tatsache weist auf eine pVU3-Kopiezahl von 50 Plasmidkopien pro Zelle hin.From the comparison of the band intensities, it could be estimated that pVU3 is approximately at the same concentration as the 2μνη DNA and CV13 DNA in the yeast host DC5 [cir + ]. This fact indicates a pVU3 copy number of 50 plasmid copies per cell.
Einen spezifischeren Plasmid-DNA-Konzentrationsvergleich ermöglicht die Retransformation der Hefeausschlüsse in den E. coli-Stamm JM101. Dabei wird ausschließlich die CV13- bzw. pVU3-DNA als Anzahl derTetracyclin-resistenten Klone bestimmt, wobei für den angestrebten Vergleich die Einhaltung möglichst identischer Transformationsbedinguhgen erforderlich ist. Je 1 μ\ der Hefeplasmidf raktionen werden in E. coli-Zellen gleicher Kompetenz transformiert. Die Ergebnisse der Transformationen sind in Tabelle 1 dargestellt. Aus dem Vergleich der Daten ist ersichtlich, daßA more specific plasmid-DNA concentration comparison allows the re-transformation of the yeast exclusions into the E. coli strain JM101. Only the CV13 or pVU3 DNA is determined as the number of tetracycline-resistant clones, whereby compliance with as identical transformation conditions as possible is required for the desired comparison. 1 μ \ of the yeast plasmid interactions are transformed into E. coli cells of the same competence. The results of the transformations are shown in Table 1. From the comparison of the data, it can be seen that
— pVU3 mindestens in dem Kopiezahlbereich von CV13, also 50 Kopien pro Zelle, liegen muß und- pVU3 must be at least in the copy number range of CV13, ie 50 copies per cell, and
— sowohl bei CV13 als auch bei pVU3 die Plasmid-DNA-Konzentrationen in [cir°]-Hefewirten deutlich größer sind als in [cir+]-Wirten.- In both CV13 and pVU3 the plasmid DNA concentrations in [cir °] yeast hosts are significantly larger than in [cir + ] hosts.
Tabelle: Retransformation derHefeplasmid-lsolationen in E. coli JM101Table: Retransformation of yeast plasmid isolations in E. coli JM101
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oder
Candida
einsetzt.Saccharomyces
or
Candida
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Sacc. carlbergensisSacc. cerevisiae
Sacc. carlbergensis
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