DD260293A5 - Tissue plasminogen activator (Tpa) derivative and its preparation - Google Patents
Tissue plasminogen activator (Tpa) derivative and its preparationInfo
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Abstract
Erfindungsgemaess wird ein neues Gewebs-Plasminogen-Aktivator (tPA)-Darivat hergestellt, das eine Aminosaeuresequenz aufweist, die der des natuerlichen tPA entspricht, in der jedoch die die EGF-Domaene bildenden Aminosaeuren des natuerlichen tPA-Molekuels fehlen und mindestens einer der Kringel I oder II, die Verbindungsregion, die katalytische Region und der Fibrinfinger vorhanden sind; insbesondere koennen zusaetzlich die daran anschliessenden Aminosaeuren bis mindestens zur ersten Disulfidbruecke der Domaene des Kringels I oder die gesamte Aminosaeuren der Domaene des Kringels I bis zur ersten Disulfidbruecke der Domaene des Kringels II oder Kringel II fehlen. Das neue Derivat laesst sich beispielsweise herstellen indem man aus der tPA-cDNA denjenigen Abschnitt, der die dem Derivat im Vergleich zum kompletten tPA-Molekuel fehlenden Aminosaeuresequenz kodiert, mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen herausschneidet, die das gewuenschte tPA-Derivat kodierenden Abschnitte verbindet, die so erhaltene tPA-Derivat-cDNA ueber einen geeigneten Vektor in Prokaryonten einschleust und darin exprimiert.According to the invention, a novel tissue plasminogen activator (tPA) derivative is prepared which has an amino acid sequence corresponding to that of the natural tPA but which lacks the amino acids of the natural tPA molecule forming the EGF domains and at least one of the rings I or II, the linking region, the catalytic region and the fibrin finger are present; In particular, the amino acids adjoining thereto may additionally be absent at least to the first disulfide bridge of the domain of kringle I or the entire amino acids of the domain of kringle I to the first disulfide bridge of the domain of kringle II or Kringel II. For example, the new derivative can be prepared by excising from the tPA cDNA the portion encoding the amino acid sequence lacking the derivative relative to the complete tPA molecule with the appropriate restriction endonucleases linking the desired tPA derivative-encoding portions tPA derivative cDNA introduced via a suitable vector into prokaryotes and expressed therein.
Description
Hierzu 4 Seiten ZeichnungenFor this 4 pages drawings
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer tPA-Derivate.The invention relates to a process for the preparation of novel tPA derivatives.
Die Hauptkomponente der Proteinmatrix von geronnenem Blut ist polymeres Fibrin. Diese Proteinmatrix wird durch Plasmin gelöst, das aus Plasminogen über Aktivierung durch die sogenannten Plasminogen-Aktivatoren gebildet wird, z.B. durch tPA (Gewebs-Plasminogen-Aktivator, tissue-type plaminogen activator). Die enzymatische Aktivität von natürlichem oder aus Eukaryonten gentechnologisch gewonnenem tPA (katalytische Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin) ist in Abwesenheit von Fibrin oder Fibrinspaltprodukten (FSP) sehr gering, kann aber in Gegenwart dieser Stimulatoren wesentlich gesteigert werden (um mehr als den Faktor 10).The major component of the coagulated blood protein matrix is polymeric fibrin. This protein matrix is solubilized by plasmin, which is formed from plasminogen via activation by the so-called plasminogen activators, e.g. by tPA (tissue plasminogen activator, tissue-type plaminogen activator). The enzymatic activity of natural or eukaryotic genetically engineered tPA (catalytic activation of plasminogen to plasmin) is very low in the absence of fibrin or fibrin cleavage products (FSP) but can be significantly increased (more than a factor of 10) in the presence of these stimulators.
Der Wirkmechanismus von tPA in vivo ist beispielweise in Korniger und Collen, Thromb. Hämostasis 46,561-565 (1981) beschrieben. Danach wird tPA durch im Blut vorhandene Proteasen an der in Figur 1 b durch großen Pfeil markierten Stelle in die A- und B-Kette gespalten und aktiviert. Dabei bleiben die beiden Teilketten über eine Cystein-Brücke verbunden. Die Stimulierbarkeit der Aktivität ist ein entscheidender Vorteil von tPA gegenüber anderen bekannten Plaminogen-Aktivatoren, wir z. B. Urokinase oder Streptokinase (vgl. z. B. B. M. Hoylaerts et al, J. Biol. Chem. 257 (1982), 2912-2919; W. Nieuwenhuizen et al, biochemica et Biophysica Acta 755 (1983), 531-533).The mechanism of action of tPA in vivo is, for example, in Korniger and Collen, Thromb. Haemostasis 46, 561-565 (1981). Thereafter, tPA is cleaved and activated by proteases present in the blood at the point marked by a large arrow in FIG. 1 b into the A and B chains. The two partial chains remain connected via a cysteine bridge. The stimulability of the activity is a decisive advantage of tPA over other known plaminogen activators. Urokinase or streptokinase (see, eg, B.M. Hoylaerts et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), 2912-2919; W. Nieuwenhuizen et al., Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983), 531-533).
Ein wesentlicher Nachteil von tPA ist jedoch seine geringe Halbwertszeit. Aus D. Collen et al., Cicurlation 72 (1985), 384-388 ist bekannt, daß die Halbwertszeit von tPA bei ca. 2 Minuten liegt. Dies gilt sowohl für den ungespaltenen Aktivator als auch für die Α-Kette allein (D. C. Rijken et al., Haemostasis 1985, Abstract 0358). Es wird vermutet, daß tPA in der Leber rasch aufgenommen und abgebaut wird (H.E. Fuchs et al., Blood 65 [1985], 539-544). Durch diese geringe Halbwertszeit sind für eine therapeutische Anwendung von tPA sehr hohe Dosen erforderlich, was zu hohen Behandlungskosten führt. Außerdem besteht die Befürchtung, daß tPA in derart hohen Dosen als Immunogen wirken könnte.A major disadvantage of tPA, however, is its low half-life. It is known from D. Collen et al., Cicurlation 72 (1985), 384-388 that the half-life of tPA is about 2 minutes. This applies to both the uncleaved activator and the Α-chain alone (D.C. Rijken et al., Haemostasis 1985, Abstract 0358). It is believed that tPA is rapidly absorbed and degraded in the liver (H.E. Fuchs et al., Blood 65 [1985], 539-544). This low half-life requires very high doses for therapeutic use of tPA, resulting in high treatment costs. In addition, there is a fear that tPA could act as an immunogen in such high doses.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von tPA-Derivaten, welche gegenüber dem natürlichen tPA eine wesentlich verlängerte Halbwertszeit aufweisen und die charakteristischen biologischen tPA-Eigenschaften, nämlich die proteolytische Aktivität und die Stimulierbarkeit der Aktivität durch Fibrin immernoch aufweisen.The aim of the invention is to provide tPA derivatives which have a substantially prolonged half-life compared to the natural tPA and which still have the characteristic biological tPA properties, namely the proteolytic activity and the stimulability of the activity by fibrin.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue tPA-Derivate mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.The invention has for its object to find new tPA derivatives with the desired properties and processes for their preparation.
Erfindungsgemäß wird ein tPA-Derivat hergestellt, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die der des natürlichen tPA entspricht, in der jedoch die die EGF-Domäne bildenden Aminosäuren des natürlichen tPA-Moleküls mindestens teilweise fehlen und mindestens einer der Kringel I oder II, die Verbindungsregion, die katalytische Region und die Fibrinfinger vorhanden sind. Im erfindungsgemäßen tPA-Derivat ist daher die Aminosäurekette des natürlichen tPA vom NH2-Ende bis einschließlich des Fibrinfingers direkt oder über Spacer mit der Aminosäurekette des tPA hinter der EGF-Domäne insbesondere der Kringel-Il-Domäne bis zum COOH-Ende verbunden. Außer der EGF-Domäne kann auch einer der Kringel I oder Il ganz oder teilweise fehlen.According to the invention, a tPA derivative is prepared which has an amino acid sequence which corresponds to that of the natural tPA but in which the EGF domain-forming amino acids of the natural tPA molecule are at least partially absent and at least one of the rings I or II, the linking region, the catalytic region and the fibrin fingers are present. In the tPA derivative according to the invention, therefore, the amino acid chain of the natural tPA from the NH 2 end up to and including the fibrin finger is connected directly or via spacers to the amino acid chain of the tPA behind the EGF domain, in particular the Kringel II domain, up to the COOH end. In addition to the EGF domain, one of the rings I or II may be missing in whole or in part.
Im biologisch aktiven tPA ist die Aminosäurekette in charakteristischer Weise gefaltet und durch Disulfidbrücken intramolekular verbunden unter Bildung von charakteristischen Domänen, die vom NH2-Ende her beginnend als Fibrinfinger-Domäne (Aminosäuren 1 bis 49), EGF-Domäne (epidermal growth factor like-Domäne) (Aminosäuren 50 bis 87), Kringeldomäne I (Aminosäuren 88 bis 176), Kringeldomäne Il (Aminosäuren 177 bis 262), Verbindungsregion und katalytische Region bezeichnetIn the biologically active tPA, the amino acid chain is characteristically folded and intramolecularly linked by disulfide bonds to form characteristic domains starting from the NH 2 end as fibrin finger domain (amino acids 1 to 49), EGF domain (epidermal growth factor like). Domain) (amino acids 50 to 87), kringle domain I (amino acids 88 to 176), kringle domain II (amino acids 177 to 262), junction region and catalytic region
werden, wie in Figur 1 a dargestellt. Das erfindungsgemäße Derivat ist nunmehr dadurch gekennzeichnet, daß die sogenannte EGF-Domäne zumindest teilweise fehlt-und außerdem die Kringeldomäne I oder II, ganz oder teilweise ebenfalls fehlen kann. Vorzugsweise fehlt der überwiegende oder vollständige Rest der Aminosäuren der Kringeldomäne I bis zur 1. Disulfidbrücke der Kringeldomäne II. Die Fibrinfingerdomäne, welche die Aminosäuren 1 bis49destPA-Moleküls umfaßt, kann gekürzt sein, derart daß die Aminosäuren 44 bis 49 ganz oder teilweise fehlen. Figur 1 b zeigt das vollständige tPA unter Angabe der Aminosäuresequenz und der Stellen, wo in der codierenden DNA Introns herausgeschnitt werden (Pfeile mit Buchstaben), wobei am NH2-Ende eine aus 35 Aminosäuren bestehende Leadersequenz dargestellt ist, welche bei tPA-Bildung in Eukaryonten in dem zuerst entstehenden tPA-Vorläufervorliegt.be as shown in Figure 1 a. The derivative according to the invention is now characterized in that the so-called EGF domain is at least partially absent and also the kringle domain I or II, wholly or partly also missing. Preferably, the majority or all of the amino acids of kringle domain I are missing up to the first disulfide bridge of kringle domain II. The fibrin finger domain comprising amino acids 1 to 49 of the destPA molecule may be truncated such that all or part of amino acids 44 to 49 are absent. Figure 1 b shows the complete tPA indicating the amino acid sequence and the sites where introns are cut out in the coding DNA (arrows with letters), wherein at the NH 2 end of a 35 amino acid leader sequence is shown, which in tPA formation in Eukaryotes in the first resulting tPA precursor.
Ausgedrückt unter Bezugnahme auf die Nummerierung der Aminosäuren in der vollständigen tPA-Sequenz fehlen beim erfindungsgemäßen tPA-Derivat diejenigen Aminosäuren, die einen Abschnitt bilden, der mit einer der Aminosäuren 44 bis 72 beginnt und mit einer der Aminosäuren 87 bis 179 endet. Hierbei wird die in Nature, 301 (1983)214-221 vom Pennica aufgestellte Nomenklatur verwendet. Vorzugsweise endet der entfernte Abschnitt mit einer der Aminosäuren 113 (hier liegt die 1. Disulfidbrücke des Kringels I) bis 179. Falls Kringel Il teilweise oder ganz fehlt sind im erfindungsgemäßen Derivat im Vergleich zu tPAzwei Abschnitte der Aminosäurekette entfernt, nämlich EGF-Domäne und der Kringel Il-Teil während der dazwischenliegende Kringel I vorhanden ist.Expressed with reference to the numbering of the amino acids in the complete tPA sequence, the tPA derivative according to the invention lacks those amino acids which form a portion starting with one of the amino acids 44 to 72 and ending with one of the amino acids 87 to 179. Hereby, the nomenclature set forth in Nature, 301 (1983) 214-221 by Pennica is used. Preferably, the distal portion terminates with one of amino acids 113 (here is the first disulfide bridge of Kringle I) through 179. If Kringel II is partially or wholly absent, two portions of the amino acid chain, namely EGF domain, and the Kringel II part while the intervening kringle I is present.
Das erfindungsgemäße tPA-Derivat besitzt überraschenderweise eine wesentlich höhere Halbwertszeit im Organismus als das natürliche tPA und besitzt gleichzeitig die erwähnten biologischen Eigenschaften, insbesondere dessen enzymatische Aktivität und Stimulierbarkeit des tPA in unvermindertem Außmaß. Damit wird es möglich, die durch tPA hervorgerufenen therapeutischen Effekte mit wesentlich geringeren Mengen an erfindungsgemäßen tPA-Derivat zu erzielen. Besonders gute Eigenschaften ergeben sich dabei bei tPA-Derivaten, denen die Aminosäuren 45 bis 179 bzw. 50 bis 87, bzw. 50 bis 175 des kompletten tPA-Moleküls fühlen (Molekulargewicht von etwa 43000 D).The tPA derivative according to the invention surprisingly has a much higher half-life in the organism than the natural tPA and at the same time has the biological properties mentioned, in particular its enzymatic activity and stimulability of the tPA to an undiminished extent. This makes it possible to achieve the tPA-induced therapeutic effects with significantly lower levels of tPA derivative of the present invention. Particularly good properties result in the case of tPA derivatives which the amino acids 45 to 179 or 50 to 87 or 50 to 175 of the complete tPA molecule sense (molecular weight of about 43,000 D).
Die Herstellung der neuen tPA-Derivate kann dadurch erfolgen, daß auf cDNA-Ebene mit geeigneten Restriktionsendonukleasen geschnitten und anschließend wieder ligiert wird. Diese modifizierte cDNA wird dann über einen geeigneten Vektor in Prokaryonten oder Eukaryonten eingeschleust und exprimiert. Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung verfährt man so, daß man aus der tPA-cDNA denjenigen Abschnitt, der die dem Derivat im Vergleich zum kompletten tPA-Molekül fehlende Aminosäuresequenz kodierte, mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen herausschneidet, die das gewünschte tPA-Derivat kodierenden Abschnitte verbindet, die so erhaltene tPA-Derivat-cDNA über einen geeigneten Vektor in Prokaryonten einschleust und darin exprimiert. Als Restriktionsendonukleasen sind insbesondere solche Enzyme geeignet, welche nur in dem Bereich von bp 315 bis bp 726 der cDNA-Sequenz (vgl. Pennica, Nature 301 [1983], 214-221) schneiden. Besonders geeignet sind die Restriktionsendonukleasen-Kombinationen Dralll und Mae III zur Entfernung der Aminosäuren 44 bis 179oderDdel und MnI I zur Entfernung der Aminosäuren 44 bis 171 sowie Dde I für die Aminosäuren 44 bis 174 und Fnu4H zur Entfernung der Aminosäuren 52-168 und Rsalzur Entfernung von den Aminosäuren 67-162. Sofern Restriktionsendonukleasen verwendet werden müssen, welche die cDNA auch außerhalb des erwähnten Bereichs schneiden, kann über die Einwirkzeit eine Steuerung erreicht werden. Die entstehenden Enden der DNA-Fragmente müssen durch geeignete Auffüllung oder durch Verdau mit Sl-Nuklease oder Einfügung von Linkern so modifiziert werden, daß eine phasengerechte Verknüpfung der verbleibenden Aminosäuren-Tripletts möglich wird.The preparation of the new tPA derivatives can be carried out by cutting at the cDNA level with suitable restriction endonucleases and then re-ligating. This modified cDNA is then introduced and expressed via an appropriate vector in prokaryotes or eukaryotes. In this embodiment of the method of the invention, the procedure is to cut out from the tPA cDNA that portion which encodes the amino acid sequence lacking the derivative compared to the complete tPA molecule with the corresponding restriction endonucleases encoding the desired tPA derivative-encoding portion connects, which introduces tPA-derivative cDNA thus obtained via a suitable vector in prokaryotes and expressed therein. Particularly suitable restriction endonucleases are enzymes which only cut in the range from bp 315 to bp 726 of the cDNA sequence (compare Pennica, Nature 301 [1983], 214-221). Particularly suitable are the restriction endonuclease combinations Dralll and Mae III for removing amino acids 44 to 179 or Ddel and MnI I for removing amino acids 44 to 171 and Dde I for amino acids 44 to 174 and Fnu4H for removing amino acids 52-168 and Rsalzur removal of amino acids 67-162. If restriction endonucleases must be used which also cut the cDNA outside of the mentioned range, control can be achieved over the reaction time. The resulting ends of the DNA fragments must be modified by appropriate filling or by digestion with Sl-nuclease or insertion of linkers so that a phase-correct linkage of the remaining amino acid triplets is possible.
Zur Behandlung mit Restriktionsendonukleasen und anschließender Ligierung ist die cDNA bevorzugt in einen Vektor eingebaut. Geeignete Vektoren sind beispielsweise pBR322, pKK223-3, pACYC177, pRSF1010, eukaryontische Vektoren, wie Bovine papilloma virus oder Shuttle-Vektoren, wie pKCR. Zur Wiederverknüpfung im Vektor werden die bekannten Methoden, vorzugsweise unter Verwendung von Lindern, angewendet.For the treatment with restriction endonucleases and subsequent ligation, the cDNA is preferably incorporated into a vector. Suitable vectors are, for example, pBR322, pKK223-3, pACYC177, pRSF1010, eukaryotic vectors, such as Bovine papilloma virus or shuttle vectors, such as pKCR. For recombination in the vector, the known methods, preferably using alleviators, are used.
Anschließend werden diese Vektoren in Prokaryonten und Eukaryonten nach den bekannten Verfahren eingeführt und die tPA-Derivate exprimiert. Dabei wird vorzugsweise bei Verwendung von Prokaryonten eine Steuerung der Expression in an sich bekannter Weise vorgesehen, z.B. durch Verwendung des Systems lac-Promotor (oder Derivat davon wie tac-Promotor) und lac-Repressor, oder trp-Promotor und trp-Repressor oder lambda-Promotor und lambda-Repressor.Subsequently, these vectors are introduced into prokaryotes and eukaryotes by the known methods and the tPA derivatives are expressed. Preferably, when using prokaryotes, control of expression is provided in a manner known per se, e.g. by using the system lac promoter (or derivative thereof such as tac promoter) and lac repressor, or trp promoter and trp repressor or lambda promoter and lambda repressor.
Ebenso kann zur Herstellung der Derivate von der vollständigen DNA, welche Introns enthält, ausgegangen werden. Hierzu wird die tPA-DNA aus der Maniatis-Genbank isoliert, in Vektoren eingesetzt. Dies erfolgt über gezielte Deletion der für die im erfindungsgemäßen tPA-Derivat im Vergleich zu tPA fehlenden Aminosäuren codierenden Tripletts und der dazwischen positionierten Introns mittels Oligonukleotiden. Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung verfährt man so, daß man tPA-DNA in einen geeigneten Vektor einführt, den erhaltenen Vektor dann mit einem Oligonukleotid hybridisiert, welches mit den Basensequenzen, die zu beiden Seiten an die aus dem tPA-DNA Molekül zu entfernenden Basensequenzen anschließen, komplementäre Basensequenz aufweist, einer Reparatur-Mutagenese unterwirft, den so mutierten Vektor dann in eine geeignete Zelle einführt und amplifiziert, diejenigen amplifizierten Vektoren gewinnt, welche mit dem Oligonukleotid hybridisieren und in dafür geeignete Prokaryonten eingeführt und exprimiert. Das Oligonukleotid sollte vorzugsweise aus 18 bis 26 Nukleotiden bestehen. Von diesen Nukleotiden sollten vorteilhaft je die Hälfte mit den zu erhaltenen Nukleotiden der davor und dahinter liegenden Tripletts übereinstimmen. Dieses Verfahrensprinzip der „gappedduplex"-Synthese ist in Morinaga et al Biotechnology 2 (1984), 634-639 und Nagal et al. Nature 309 (1984) 810 ausführlich beschrieben. Des weiteren kann aus tPA-produzierenden Zellinien (Literatur Pennica, loc. cit.) die m-RNA isoliert werden und durch Größenfraktionierung aufgetrennt werden. Durch natürliche Splice-Artefakte können die m-RNA-Derivate entstehen, die verkürzt sind. Durch c-DNA-Herstellung daraus und Untersuchung der entstandenen Klone können die Klone gefunden werden, welche die codierende Region für die Aminosäuren, die dem tPA-Derivat im Vergleich zu tPA fehlen, insbesondere die Aminosäuren 49 bis 175, nicht mehr enthalten. Dazu werden Klone ausgewählt, die mit entsprechend konstruierten Oligonukleotiden, passend für die entfernte Region, nicht mehr hybridisieren. Solche verkürzten cDNA-Moleküle können auch durch Fehler bei der cDNA-Herstellung aus intakter oder partiell deletierter mRNA prinzipiell entstehen und durch Hybridisierung und Sequenzierung aufgefunden werden.Likewise, for the preparation of the derivatives of the complete DNA, which contains introns, can be assumed. For this purpose, the tPA DNA is isolated from the Maniatis library, used in vectors. This is done by targeted deletion of the triplet coding for the tPA derivative missing in the tPA derivative according to the invention lacking amino acids and the introns positioned therebetween by means of oligonucleotides. In this embodiment of the method of the invention, the procedure is to introduce tPA-DNA into a suitable vector, then to hybridize the resulting vector to an oligonucleotide containing the base sequences to be removed on both sides of those from the tPA-DNA molecule Connect base sequences, having complementary base sequence, subjecting to repair mutagenesis, then introducing and amplifying the thus-mutated vector into a suitable cell, recovering those amplified vectors which hybridize with the oligonucleotide and introduced and expressed in suitable prokaryotes. The oligonucleotide should preferably consist of 18 to 26 nucleotides. Of these nucleotides, half of each should advantageously correspond to the nucleotides of the preceding and following triplets to be obtained. This process principle of "gapped duplex" synthesis is described in detail in Morinaga et al Biotechnology 2 (1984), 634-639 and Nagal et al., Nature 309 (1984) 810. Further, from tPA-producing cell lines (literature Pennica, loc. The mRNA can be isolated and fractionated by size fractionation Natural splice artifacts can be used to create the mRNA derivatives that are truncated, and clones can be found by c-DNA production and analysis of the resulting clones which no longer contain the coding region for the amino acids lacking the tPA derivative compared to tPA, in particular amino acids 49 to 175. To do this, clones are selected which are not compatible with appropriately engineered oligonucleotides suitable for the remote region Such shortened cDNA molecules can also arise in principle by errors in the cDNA production from intact or partially deleted mRNA and you Hybridization and sequencing can be found.
Ebenso kann tPA-Derivatisierung auf Aminosäureebene erfolgen. tPA, beispielsweise gentechnologisch hergestellt und gereinigt, wird dann mit Proteasen, welche im Bereich zwischen den Aminosäuren 43 und 72 und zwischen 87 und 179 schneiden, geschnitten und wieder zusammengefügt. Die zu vereinigenden Fragmente lassen sich durch Gelelektrophorese oder andere Größenfraktionierung von anderen Fragmenten isolieren.Similarly, tPA derivatization can occur at the amino acid level. For example, tPA, for example, engineered and purified, is cut and rejoined with proteases that cut between amino acids 43 and 72 and between 87 and 179. The fragments to be combined can be isolated by gel electrophoresis or other size fractionation of other fragments.
Bei den erfindungsgemäßen tPA-Derivaten kann es vorteilhaft sein, den Abstand Fibrinfinger— Kringel Il — zu optimieren, um die tPA-charakteristische enzymatische Wirksamkeit des Moleküls maximal zur Wirkung zu bringen. Dies kann z. B. durch Einbau kurzer Aminosäureketten oder anderer Distanzglieder (Spacer) zwischen Fibrinfinger-Domäne und Kringel-Il-Domäne erfolgen.In the case of the tPA derivatives according to the invention, it may be advantageous to optimize the distance fibrin finger Kringel II - in order to maximize the effect of the tPA-characteristic enzymatic activity of the molecule. This can be z. B. by incorporation of short amino acid chains or other spacers (spacers) between fibrin finger domain and Kringel II domain done.
Besonders bevorzugt ist ein tPA-Derivat, bei dem die Aminosäuren 45 bis 179 fehlen. Dieses kann beispielsweise auf cDNA-Ebene hergestellt werden, durch Schnitt mit den Restriktionsendonukleasen Dralll und Mae III und Verdau der überstehenden Einzelstrangenden mit Nuclease SI. Anschließend wird mit Ligase ligiert. Dann wird mit einem geeigneten Vektorsystem, wie es z.B. in der deutschen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen P 3613401.5 beschrieben ist, in Prokaryonten oder Eukaryonten exprimiert. Das bei der Expression in Pro- oder Eukaryonten entstandene tPA-Derivat hat ein Molekulargewicht von ca. 43 000 D.Particularly preferred is a tPA derivative lacking amino acids 45 to 179. This can be prepared, for example, at the cDNA level, by cutting with the restriction endonucleases Dralll and Mae III and digesting the supernatants with nuclease SI. It is then ligated with ligase. Then, with a suitable vector system, e.g. in the German patent application with the file reference P 3613401.5 is expressed in prokaryotes or eukaryotes. The resulting in the expression in prokaryotes or eukaryotes tPA derivative has a molecular weight of about 43 000 D.
Das in Eukaryonten entstandene Derivat ist zusätzlich glycolisiert und wandert daher in der SDS-Elektrophorese etwas verlangsamt.The derivative formed in eukaryotes is additionally glycolized and therefore migrates somewhat slower in SDS electrophoresis.
Ein weiteres, besonders bevorzugtes tPA-Derivat unterscheidet sich vom tPA durch Fehlen der Aminosäuren 50 bis 175. Zur Herstellung eignet sich die oben beschriebene tPA-DNA Methode der „gapped-duplex"-Synthese besonders, weil sie nicht das Vorhandensein von Restriktionsschnittstellen an den gewünschten Positionen der Sequenz voraussetzt.Another especially preferred tPA derivative differs from tPA by the lack of amino acids 50 to 175. For preparation, the tPA-DNA method of gapped duplex synthesis described above is particularly suitable because it does not lend itself to the presence of restriction sites on the requires desired positions of the sequence.
Die Erfindung schafft neue pharmakologisch wirsame Proteine die sich vom tPA ableiten, aber eine verbesserte Kombination von Eigenschaften aufweisen, verglichen mit tPA sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.The invention provides novel pharmacologically active proteins derived from tPA but having an improved combination of properties compared to tPA and methods for their production.
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert:The invention is explained in more detail below with reference to some examples:
Deletion der die Halbwertszeit bestimmenden Domänen von tPADeletion of the half-life determining domains of tPA
1a) Konstruktion des tPA-Mutein-Gens1a) Construction of the tPA mutein gene
Als Ausgangsplasmid dient das Plamid pBT95 (DSM 3611 P, DE 3545126), aus dem das Plamid pePa 98.1 auf folgende Weise hergestellt wurde: Das Plamid wird mit dem Enzym BgIII gespalten und mit der Nuclease SI nachbehandelt. Durch weitere Spaltung mit dem Enzym Seal läßt sich ein Fragment a präparativ erhalten, das ca. 760 Basenpaare groß ist und diefürtPA kodierende Nucleotid-Sequenz 192-952 (Pennica loc. cit.) enthält. Ein Fragment b wird ebenfalls aus pBT95 erhalten durch Spaltung mit Seal und Hind III;, dadurch erhält man ein Fragment von etwa 1200 Basenpaaren, das dietPA-Nucleotid-Sequenz 953-2165 enthält. Ein Partner c wird als Linker synthetisch hergestellt und enthält die folgende Sequenz:The starting plasmid used is the p-amide pBT95 (DSM 3611 P, DE 3545126), from which the plamide pePa 98.1 was prepared in the following manner: The plamid is cleaved with the enzyme BglII and after-treated with the nuclease SI. By further cleavage with the enzyme Seal, a fragment a can be preparatively obtained which is about 760 base pairs in size and contains the nucleotide sequence 192-952 (Pennica loc. Cit.) Coding for tPA. Fragment b is also obtained from pBT95 by cleavage with Seal and Hind III; thereby yielding a fragment of about 1200 base pairs containing the dietPA nucleotide sequence 953-2165. A partner c is synthesized as a linker and contains the following sequence:
ö'GAATTCTTATGTCS' 3'GAATACAGo'ö'GAATTCTTATGTCS '3'GAATACAGo'
Als Partner d in der Konstruktion wird das Plasmid pKK233-3 (DSM 3694P) mit den Enzymen Eco RlundHindlllim Polylinker gespalten. Die Partner a-d werden zusammen ligiert. Der Ligationsansatz wird nach üblicher Technik mit T4-Ligase behandelt und anschließend in E.coli-Zellen (DSM 3689) transformiert. Die transformierten Zellen werden auf Medium unter Zusatz von 50 μg/ml Ampicillin kultiviert. Aus den erhaltenen Klonen werden diejenigen ausgewählt, die das Plasmid pePa98.1 tragen, das sich von den Ausgangsplasmiden pBT95 und pKK223-3 dadurch unterscheidet, daß es im Polylinker des Plasmides pKK223-3 zwischen der Eco RI und Hind Ill-Spaltstelle die tPA-Nucleotid-Sequenz 192-2165 in richtiger Reihenfolge enthält. Aus diesem Plasmid pePa 98.1 wurde das tPA-codierende Fragment mit dem tac-Promotor über die Xholl-Spaltung erhalten. Dieses Fragment ist etwa 1,85kb groß und wird an den überstehenden Enden durch Behandlung mit Klenow-Enzym, in Gegenwart von allen vier Desoxynukleosidtriphosphaten vollständig aufgefüllt. In einem Schritt A wird dieses Fragment mit dem Enzym Dra IiI geschnitten und die überstehenden Enden mit der Nuclease SI abgedaut. Gelelektrophoretisch wird das Fragment der Größe von ca. 370 Basenpaaren gewonnen. In einem Schritt B wird das gleiche Xho Il Ausgangsfragment mit dem Enzym Mae III geschnitten und ebenfalls mit SI nachverdaut. Anschließend wird dieser Ansatz zusätzlich mit dem Enzym Sac I behandelt. Gelelektrophoretisch wird daraus ein Fragment der Größe von ca. 700 Basenpaaren isoliert. In einem Ansatz C wird das Vektorplasmid pePa98.1 mit dem Enzym BamHI geschnitten und die überstehenden Enden mit dem Klenow-Enzym, unter Einsatz von allen vier Desoxynukleosidtriphosphaten aufgefüllt und mit dem Enzym Sac I nachgespalten. Gelelektrophoretisch wird anschließend das größte Fragment aus diesem Ansatz gewonnen. In einem Ligierungsansatz werden die gewonnenen Fragmente aus den Ansätzen A, B und C vereinigt und unter Zusatz von DNA-Ligase ligiert. Die Ligierungsmischung wird in E. coli-Zellen (DSM 3689), welche ein Iaclq-Plasmid enthalten, transformiert und die^ntstehenden Transformanten auf Nährmedium mit 50μg/ml Ampicillin selektioniert. Aus den so erhaltenen Klonen werden diejenigen ausgewählt, die das gewünschte Plasmid pePa 129 enthalten, das sich vom Ausgangsplasmid pePa98.1 dadurch unterscheidet, daß es die DNA-Sequenz zwischen dertPAcDNA-Sequenz Pos.301 bis 726 nicht mehr enthält. Figur 2 zeigt die Nucleotidsequenz des so erhaltenen Muteins und die daraus erhaltene Aminosäuresequenz, in der die Aminosäuren 45 bis 179 des tPA fehlenAs partner d in the construction, the plasmid pKK233-3 (DSM 3694P) is cleaved with the enzymes Eco RlundHindlllim polylinker. The partners ad are ligated together. The ligation mixture is treated by conventional technique with T4 ligase and then transformed into E. coli cells (DSM 3689). The transformed cells are cultured on medium with addition of 50 μg / ml ampicillin. From the clones obtained, those are selected which carry the plasmid pePa98.1, which differs from the starting plasmids pBT95 and pKK223-3 in that, in the polylinker of the plasmid pKK223-3, between the Eco RI and Hind III cleavage sites, the tPA- Contains nucleotide sequence 192-2165 in the correct order. From this plasmid pePa 98.1, the tPA-encoding fragment was obtained with the tac promoter via the Xholl cleavage. This fragment is about 1.85kb in size and is completely filled at the overhanging ends by treatment with Klenow enzyme in the presence of all four deoxynucleoside triphosphates. In a step A, this fragment is cut with the enzyme Dra IiI and the protruding ends are covered with the nuclease SI. Gelelektrophoretisch the fragment of the size of about 370 base pairs won. In a step B, the same starting Xho II fragment is cut with the enzyme Mae III and also nachverdaut with SI. Subsequently, this approach is additionally treated with the enzyme Sac I. Gelelektrophoretisch a fragment of the size of about 700 base pairs is isolated. In a batch C, the vector plasmid pePa98.1 is cut with the enzyme BamHI and the protruding ends are filled up with the Klenow enzyme, using all four deoxynucleoside triphosphates and after-cleaved with the enzyme Sac I. Gelelektrophoretisch then the largest fragment is obtained from this approach. In a ligation mixture, the fragments obtained from the batches A, B and C are combined and ligated with the addition of DNA ligase. The ligation mixture is coli cells in E. (DSM 3689), which contain a lacI q plasmid transformed and ^ ntstehenden transformants selected on nutrient medium with 50 ug / ml ampicillin. From the clones thus obtained, those are selected which contain the desired plasmid pePa 129, which differs from the starting plasmid pePa98.1 in that it no longer contains the DNA sequence between the tPAcDNA sequence Pos.301 to 726. Figure 2 shows the nucleotide sequence of the mutein thus obtained and the resulting amino acid sequence lacking amino acids 45 to 179 of tPA
b) Konstruktion eines Expressionsvektors für das Mutein zur Expression in E. coli Aus dem nach 1a) hergestellten Plasmid pePa129 wird durch Verdau mit den Restriktionsenzymen Bam Hl und Pvul das tPA-codierende Fragment erhalten. Das Plasmid pACYC177 (DSM 3693P) wird ebenfalls mit Bam Hl und limitiert mit Pvul gespalten. Beide Fragmente werden zusammenligiert und in E.coli-Zellen (DSM 3689), welche ein Iaclq-Plasmid enthalten, transformiert. Durch Selektion auf Kanamycin und Ampicillin mitje25bzw. 50μg/ml erhält man Transformanten, unter denen diejenigen ausgewählt werden, die das Plasmid pePa 137 enthalten. Dieses unterscheidet sich von den Ausgangsvektoren dadurch, daß es das Mutein-Genfragment aus pePa 129 und die Sequenz des Plasmides pACYC177 jeweils enthält. Eine Restriktionsschnittstellenkarte des Plasmides pePa 137 zeigt Figur 3.b) Construction of an expression vector for the mutein for expression in E. coli From the plasmid pePa129 prepared according to 1a), the tPA-encoding fragment is obtained by digestion with the restriction enzymes Bam HI and Pvul. The plasmid pACYC177 (DSM 3693P) is also cleaved with Bam HI and limited with Pvul. Both fragments are ligated together and in E. coli cells (DSM 3689), which contain a lacI q plasmid transformed. By selection on kanamycin and ampicillin with je25bzw. 50μg / ml are obtained transformants, among which those are selected which contain the plasmid pePa 137. This differs from the parent vectors in that it contains the mutein gene fragment from pePa 129 and the sequence of the plasmid pACYC177, respectively. A restriction site map of plasmid pePa 137 is shown in FIG. 3.
1 c) Konstruktion eines Expressionsvektors für das Mutein zur Expression in Pseudomonas putida Als Vektor für Pseudomonas putida wird ein Derivat des Plasmides pRSF 1010 verwendet, welches zusätzlich ein Kanamycin-Resistenzgen aus pACYC177 enthält. Dieser Vektor führt die Bezeichnung pREM3061 (DSM 3692P). Dieses Plasmid wird durch Verwendung des Restriktionsenzyms Hpal linerisiert. Aus den nach 1 a) hergestellten Vektor pePa 129 wird durch Xho Il-Spaltung ein ca. 1,45 kb großes Fragment gewonnen, das den tac-Promotor und die vollständige Mutein-Gensequenz enthält. Durch Behandlung mit Klenow-Fragment, in Gegenwart von allen vier Desoxynukleosidtriphosphaten werden die Xho !!-Schnittstellen vollständig aufgefüllt. Das so behandelte Fragment wird mit dem linearisierten Vektor pREM 3061 ligiert und in E.coli-Zellen (DSM 3698), transformiert. DieTransformanten werden auf Medium mit25pg/ml Kanamycin selektioniert. Transformanten, die das Plasmid pePa 143 enthalten, werden ausgewählt. Dieses Plasmid unterscheidet sich vom Ausgangsvektor pREM3061 dadurch, daß es die vollständige Mutein-Gensequenz mit tac-Promotor enthält. Dieses Plasmid wird isoliert und durch Transformation in Zellen des Stammes Pseudomonas putida, DSM2106, eingeführt. Die Transformanten werden auf Medium Γηίί25μ/ηιΙ Kanamycin selektioniert und anschließend analysiert. Sie enthalten das Plasmid pePa 143. Zusätzlich kann in diese Transformanten-Zellen ebenfalls durch Transformation ein Plasmid pePa119 (DSM 3691 P) eingeführt werden, das mit pePa 143 kompatibel ist und das lacl^Gen enthält. Dieses Plasmid ist ein Derivat von Plasmid RP4. Die Anwesenheit dieses Plasmides unterdrückt die Produktion des Muteins in den Zellen durch Produktion des lac-Repressor-Proteins. Dieses kann die Transkription vom tac-Promotor aus reprimieren.1 c) Construction of an expression vector for the mutein for expression in Pseudomonas putida The vector used for Pseudomonas putida is a derivative of the plasmid pRSF 1010, which additionally contains a kanamycin resistance gene from pACYC177. This vector is called pREM3061 (DSM 3692P). This plasmid is linearized by using the restriction enzyme Hpal. From the vector pePa 129 prepared according to 1 a), an approximately 1.45 kb fragment is obtained by Xho I cleavage, which contains the tac promoter and the complete mutein gene sequence. By treatment with Klenow fragment, in the presence of all four deoxynucleoside triphosphates, the Xho !! sites are completely filled. The fragment thus treated is ligated with the linearized vector pREM 3061 and transformed into E. coli cells (DSM 3698). The transformants are selected on medium with 25pg / ml kanamycin. Transformants containing the plasmid pePa 143 are selected. This plasmid differs from the starting vector pREM3061 in that it contains the complete tac promoter mutein gene sequence. This plasmid is isolated and introduced by transformation into cells of the strain Pseudomonas putida, DSM2106. The transformants are selected on medium Γηίί25μ / ηιΙ kanamycin and then analyzed. They contain the plasmid pePa 143. In addition, into these transformant cells can also be introduced by transformation, a plasmid pePa119 (DSM 3691 P), which is compatible with pePa 143 and contains the lacl ^ gene. This plasmid is a derivative of plasmid RP4. The presence of this plasmid suppresses production of the mutein in the cells by production of the lac repressor protein. This can repress transcription from the tac promoter.
Konstruktion von Vektoren, die das tPA-Muteingen mit Leader-Sequenz zur Sekretion enthalten und für die Expression in CHO-Zellen geeignet sind.Construction of vectors containing tPA secretion-leader leader sequence and suitable for expression in CHO cells.
Verwendet wird der Vektor pKCR. Ein Plasmid, das die vollständige tPA cDNA enthält, ist das Plasmid pBT95. Dieses Plasmid wird mit dem Restriktionsenzym Pstl limitiert gespalten, so daß ein Fragment gewonnen wird, das die tPA-Sequenz von der cDNA, Nucleotidposition 205-1312, nicht mehr enthält. Aus dem nach 1a) hergestellten Plasmid pePa129, das das Muteingen enthält, wird durch limitierte Pstl-Spaltung das Fragment gewonnen, das die Nucleotidposition 205-1312 enthält, aber eine Deletion ausweist für die Sequenz von 322-726. Diese so gewonnenen Fragmente werden gemeinsam ligiert und in E.coli-Zellen (DSM 3689), transformiert. Unter Zusatz von 50 μg/ml Ampicillin werden Transformanten gewonnen und die Klone ausgewählt, die das Muteinfragment in richtiger Orientierung inseriert bekommen haben. Diese Plasmide werden mit pePa 144 bezeichnet. Sie werden in CHO-Zellen, die DHFR~ sind, nach der Methode von R.Kaufmann und P.SharpI. Mol. Biol. 15,601-621 (1982) eingeführt. Unter den dort beschriebenen Bedingungen wird tPA-exprimiert und analysiert (Molec. Cell. Biol. 5,1750-1759 (1985).The vector pKCR is used. A plasmid containing the complete tPA cDNA is plasmid pBT95. This plasmid is cleaved with the restriction enzyme PstI limited, so that a fragment is recovered, which no longer contains the tPA sequence of the cDNA, nucleotide position 205-1312. From the plasmid pePa129 prepared according to 1a), which contains the mutein gene, the fragment which contains the nucleotide position 205-1312 but has a deletion for the sequence of 322-726 is obtained by limited PstI cleavage. These fragments thus obtained are ligated together and transformed into E. coli cells (DSM 3689). With the addition of 50 μg / ml ampicillin, transformants are obtained and the clones are selected which have the mutein fragment inserted in the correct orientation. These plasmids are designated pePa 144. They are expressed in CHO cells that are DHFR ~ by the method of R.Kaufmann and P.SharpI. Mol. Biol. 15, 601-621 (1982). Under the conditions described therein, tPA is expressed and analyzed (Molec., Cell, Biol., 5, 1750-1759 (1985).
Expression des tPA-Muteins in E. coli-ZellenExpression of the tPA mutein in E. coli cells
Das nach 1a) und 1b) hergestellte Plasmid pePa 137wird in E.coli-DSM 3698transformiert,derein Iac Iq-Plasmid enthält. Die Transformanten werden auf Medium mit 50 μg Ampicillin selektioniert. Die Zellen, die dieses Plasmid tragen, werden in Nährboulillon bis zu OD5S0nm = 0,4 unter Belüftung gezüchtet und dann unter Zusatz von 0,2% Lactose oder 10 mmol/l IPTG induziert. Die Bebrütung geschieht jeweils bei 37°C. Nach 4 Stunden Bebrütung unter Belüftung werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen. Dazu werden sie für 15 Minuten auf EismitO,5mg/ml Lysozym behandelt (Zellkonzentration 10 OD/ml). Verwendet wird Tris-Puffer, pH 8,6 (0,1 mol/ITris HCL mit 10 mmol/l EDTA und 100 mmol/l NaCI).The plasmid pePa 137 prepared according to 1a) and 1b) is transformed into E. coli DSM 3698 containing an Iac I q plasmid. Transformants are selected on medium containing 50 μg ampicillin. The cells carrying this plasmid are cultured in nutrient broth to OD5S0nm = 0.4 with aeration and then induced with the addition of 0.2% lactose or 10 mmol / l IPTG. The incubation occurs at 37 ° C. After 4 hours of incubation with aeration, the cells are harvested and disrupted. For this they are treated for 15 minutes on EismitO, 5 mg / ml lysozyme (cell concentration 10 OD / ml). Tris buffer, pH 8.6 (0.1 mol / ITris HCL with 10 mmol / l EDTA and 100 mmol / l NaCl), is used.
Danach werden die Zellen durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird für 10 Minuten bei 20 000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment enthält das tPA-Mutein in inaktiver Form. Dieses kann nach der in DE 3537708 beschriebenen Methode gelöst und reaktiviert werden. Das gewonnene Pellet kann auch durch Zusatz von 1 % SDS und 100mmol/l Mercaptoethanol gelöst werden und in einem SDS Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt werden. Durch Anfärbung der Proteine nach erfolgter Elektrophorese mittels Coomassie-blue können die Proteinbanden sichtbar gemacht werden. Der Extrakt enthält gem. dieser Analyse hauptsächlich ein Protein des Molekulargewichts von ca. 43000 Dalton. DastPA-Mutein ist, wie erwartet, kleiner als das aus analog behandelten Zellen mitpePa 133 gewonnene intakte tPA (Molekulargewicht ca. 57000 Dalton). Sowohl tPA-Mutein als auch tPA können auch Westernblot-Verfahren mit Anti-tPA PAK-Konjugat aus Ziege als immunologisch gleichwertig nachgewiesen werden.Thereafter, the cells are disrupted by sonication. The suspension thus obtained is centrifuged for 10 minutes at 20,000 g and the supernatant discarded. The sediment contains the tPA mutein in an inactive form. This can be dissolved and reactivated by the method described in DE 3537708. The pellet obtained can also be dissolved by the addition of 1% SDS and 100 mmol / l mercaptoethanol and electrophoresed in an SDS polyacrylamide gel. By staining the proteins after electrophoresis with Coomassie blue, the protein bands can be visualized. The extract contains gem. This analysis mainly a protein of molecular weight of about 43,000 daltons. As expected, DastPA mutein is smaller than the intact tPA (molecular weight about 57,000 daltons) obtained from similarly treated cells with peptide 133. Both tPA mutein and tPA can also be detected as immunologically equivalent Western blot methods with goat anti-tPA PAK conjugate.
Vergleich von Mutein und t-PA bezüglich der proteolytischen Aktivität und der Stimulierbarkeit durch Fibrin. Gem. Beispiel 2 wird aus Bakterien, die das Plasmid pePA 137 oder pePa 133 enthalten, das Mutein oder tPA gewonnen. Nach dem in DE 3537708 beschriebenen Verfahren wird entsprechend aktives Mutein oder tPA erhalten. Alle Proteine liegen in einkettiger Form in Lösung vor. Dabei erhält man vergleich bare· Ausbeuten bezogen auf die Proteinausgangskonzentration (Tabelle 1). Im Test auf proteolytische Aktivität werden für beide Präparationen vergleichbare Werte erhalten (Tabelle 1). Die proteolytische Aktivität wird hierbei wie in DE 3537708 bestimmt. Der Vergleich der Aktivität, die man mit und ohne Zusatz von Fibrin-Fragmenten erhält, zeigt vergleichbare Werte für beide Präparationen (Tabelle 1). Demnach ist das Mutein so von tPA nicht zu unterscheiden, sondern identisch in seinen enzymatischen Eigenschaften.Comparison of mutein and t-PA with respect to proteolytic activity and stimulability by fibrin. According to Example 2, the mutein or tPA is obtained from bacteria containing the plasmid pePA 137 or pePa 133. According to the method described in DE 3537708 corresponding active mutein or tPA is obtained. All proteins are in single-chain form in solution. This gives comparable yields with respect to the starting protein concentration (Table 1). In the test for proteolytic activity, comparable values were obtained for both preparations (Table 1). The proteolytic activity is determined here as in DE 3537708. The comparison of the activity obtained with and without the addition of fibrin fragments shows comparable values for both preparations (Table 1). Thus, the mutein is indistinguishable from tPA, but identical in its enzymatic properties.
tPA MuteintPA Mutein
mg-Proteinausbeute 234,0 75,0mg protein yield 234.0 75.0
Davon mg-mit Aktivität 11,6 5,6Of which mg with activity 11,6 5,6
FaktorderStimulier- 11,0 21,6 barkeitFactor stimulation 11.0 21,6 availability
Bestimmung der Halbwertszeit.Determination of the half-life.
Das nach Beispiel 1-3 hergestellte Mutein hat eine höhere Halbwertszeit im biologischen Test. Präparationen von tPA und Mutein, die nach Beispiel 3 erhalten wurden, wurden dazu im Maus-Test-System verglichen. Verwendet wurde das von Fuchset al beschriebene Verfahren (Blood 65 [1985], 539-544).The mutein prepared according to Example 1-3 has a higher half-life in the biological test. Preparations of tPA and mutein obtained according to Example 3 were compared in the mouse test system. The method described by Fuchset al (Blood 65 [1985], 539-544) was used.
- ö - - ö -
Gefunden wurden vergleichbare Werte für die Plasmaclearence für tPA. Das Mutein hingegen wurde langsamer aus dem Blut entfernt, nachgewiesen durch TCA-präzipitierbares 125l-Mutein. Die Akkumulation in der Leber war deutlich herabgesetzt, erst nach 20 bis 30 min. wurden Werte gemessen, die für tPA schon nach 5 min. erreicht worden waren.Comparable values for plasma clearance for tPA were found. The mutein, on the other hand, was removed more slowly from the blood as detected by TCA-precipitable 125 I mutein. The accumulation in the liver was significantly reduced, only after 20 to 30 min. values were measured, which after 5 min. had been achieved.
Deletion der die Halbwertszeit bestimmenden Domänen von t-PA mittels Oligo-Nukleotid induzierter Mutagenese.Deletion of the half-life determining domains of t-PA by oligo-nucleotide-induced mutagenesis.
6a) Herstellung des t-PA-Vektors pePa 1336a) Preparation of the t-PA vector pePa 133
Aus dem gemäß Beispiel 1 a) hergestellten Plasmid pePa98.1 wird durch Spaltung mit dem Enzym Xho Il ein ca. 1,85kb großes Fragment erhalten und präparativ isoliert. Dieses Fragment enthält die tac-Promoter- und lac-Operator-Region mit einem ATG Startcodon und der t-PA-Nukleotid-Sequenz 192-1809 in richtiger Reihenfolge. Das Plasmid pKK 223-3 (DSM 3694 P) wird mit dem Enzym Bam Hl gespalten, das größere Fragment präparativ gewonnen und mit dem Xho II-FragmentauspePa 98.1 vereinigt und unter Zusatz von DNA-Ligaseligiert. Die Ligierungsmischung wird in E.coli-Zellen (DSM 3689), welche ein Iac Iq-Plasmid enthalten, transformiert und die entstehenden Transformanten auf Nährmedium mit 50pg/ml Ampicillin selektioniert. Aus den so erhaltenen Klonen werden diejenigen ausgewählt, die das gewünschte Plasmid pePa 126 enthalten. Dieses unterscheidet sich vom Ausgangsplasmid pePa 98.1 dadurch, daß mit Bam Hl-und Hind Ill-Spaltung ein ca. 1,85kb großes Fragment neben einem ca. 4,4kb großen Fragment erhalten wird. Aus diesem Plasmid pePa 126 wird durch Verwendung mit den Enzymen Bam Hl und Pvu i ein Fragment erhalten, das ca. __2,9kb groß ist und die t-PA codierende Sequenz enthält. Das Plasmid pACYC 177 (DSM 3693 P) wird ebenfalls mit Bam Hl und limitiert mit Pvul gespalten. Das dabei entstehende größere Fragment wird zusammen mit dem t-PA codierenden Fragment aus pePa 126 unter Zusatz von T4-Ligase ligiert und in E.coli-Zellen (DSM 3689), welche ein Iaclq-Plasmid enthalten, transformiert. Durch Selektion auf Nährmedium mit Kanamycin und Ampicillin mit je 25 bzw. 50 Mg/ml erhält man Transformanten, unter denen diejenigen ausgewählt werden, die das Plasmid pePa 133 enthalten. Dieses unterscheidet sich von den Ausgangsvektoren dadurch, daß es das ca. 1,85kb große t-PA-Genfragment (nach Spaltung mit Bam Hl und Hind III) aus pePa 126, die Sequenz des Plasmids pACYC 177 enthält.From the plasmid pePa98.1 prepared according to Example 1 a), an approximately 1.85 kb fragment is obtained by cleavage with the enzyme Xho II and isolated by preparative means. This fragment contains the tac promoter and lac operator region with an ATG start codon and the t-PA nucleotide sequence 192-1809 in the correct order. The plasmid pKK 223-3 (DSM 3694 P) is cleaved with the enzyme Bam HI, the larger fragment is obtained by preparative means and combined with the Xho II fragment output 98.1 and ligated with the addition of DNA ligase. The ligation mixture is transformed into E. coli cells (DSM 3689) containing an Iac I q plasmid, and the resulting transformants are selected on nutrient medium containing 50 μg / ml ampicillin. From the clones thus obtained, those containing the desired plasmid pePa 126 are selected. This differs from the starting plasmid pePa 98.1 in that with Bam HI and Hind III cleavage a ca. 1.85 kb fragment is obtained next to an approximately 4.4 kb fragment. From this plasmid pePa 126 is obtained by use with the enzymes Bam Hl and Pvu i a fragment which is about __2,9kb large and contains the t-PA coding sequence. The plasmid pACYC 177 (DSM 3693 P) is also cleaved with Bam HI and limited with Pvul. The resulting larger fragment is ligated together with the t-PA-encoding fragment from pePa 126 with the addition of T4 ligase and in E. coli cells (DSM 3689), which contain a Iacl q plasmid transformed. By selection on nutrient medium with kanamycin and ampicillin at 25 and 50 mg / ml, transformants are obtained, among which those are selected which contain the plasmid pePa 133. This differs from the parent vectors in that it contains the approximately 1.85 kb t-PA gene fragment (after cleavage with Bam HI and Hind III) from pePa 126, the sequence of plasmid pACYC 177.
6b) Deletion der'EGF-Kringel I-Domänen aus pePa 1336b) Deletion of EGF kringle I domains from pePa 133
Prinzipiell wird die Methode von Morinaga et al Biotechnology 2 (1984) 634-639 verwendet. Es werden zwei Spaltenansätze von pePa 133 hergestellt. Ansatz a wird mitEco Rl gespalten und das größte Fragment isoliert. Ansatz b wird mit Xho I gespalten und so das Produkt linearigiert. Man vereinigt das Fragment aus Ansatz a mit Ansatz b (je ca. 150fmol) und denaturiert beide DNAs durch kurzes Erhitzen auf 95°C. Anschließend wird diese Mischung bei 6O0C für ca. 30' inkubiert. Zusätzlich wird ein Oligo-Nukleotid (75fmol) dazugefügt. Seine Sequenz lautet:In principle, the method of Morinaga et al Biotechnology 2 (1984) 634-639 is used. Two column approaches of pePa 133 are prepared. Approach a is cleaved with Eco RI and the largest fragment isolated. Batch b is cleaved with Xho I, thus linearizing the product. The fragment from approach a is combined with approach b (about 150 fmol each) and denatures both DNAs by brief heating to 95 ° C. Subsequently, this mixture is incubated at 6O 0 C for about 30 '. In addition, an oligo-nucleotide (75fmol) is added. His sequence is:
5'GCCTGTCAAAGGAAACAGTGAs'5'GCCTGTCAAAGGAAACAGTGAs'
Nach Abkühlung der Mischung auf 12°C werden hinzugefügt. Desoxynucleotidtriphosphate (0,25mM), ATP (1 mM), NaCI (10OmM),Tris-HCI pH 7,5 (6,5mM), MgCI2 (8mM), ß-Mercaptoäthanol (1 mM), Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aus E. coli (0,125 U/μΙ Ansatz), T4-Ligase (0,0625 U/μΙ Ansatz). Die Mischung wird für 4 Stunden bei 12°C belassen. Anschließend wird dieser Ansatz in E.coli-Zellen (DSM 3689), welche ein Iac Iq-Plasmid enthalten, transformiert. Durch Selektion auf Kanamycin und Ampicillin mit je 25 bzw. 50 μg/ml Nährmedium erhält man Transformatoren. Unter diesen werden diejenigen ausgewählt, die das Plasmid pREM 7685 enthalten. Dieses unterscheidet sich vom Ausgangsvektor dadurch, daß es mit dem genannten Oligo-Nukleotid spezifisch hybridisiert (Waschtemperatur 500C) und ein verkürztes Eco Rl-Fragment enthält. Statt eines ca. 0,61 kb Fragment in pePa 133 ist nur ein 0,23kb Fragment neben den übrigen Eco Rl-Fragmenten nachweisbar.After cooling the mixture to 12 ° C are added. Deoxynucleotide triphosphates (0.25 mM), ATP (1 mM), NaCl (10 mM), Tris-HCl pH 7.5 (6.5 mM), MgCl 2 (8 mM), β-mercaptoethanol (1 mM), Klenow fragment of the DNA Polymerase from E. coli (0.125 U / μΙ batch), T4 ligase (0.0625 U / μΙ batch). The mixture is left for 4 hours at 12 ° C. Subsequently, this approach is transformed into E. coli cells (DSM 3689) containing an Iac I q plasmid. By selection on kanamycin and ampicillin with 25 and 50 ug / ml nutrient medium obtained transformers. Among them, those containing the plasmid pREM 7685 are selected. This differs from the starting vector characterized in that it contains with said oligo-nucleotide hybridizes specifically (washing temperature 50 0 C) and a truncated Eco RI fragment. Instead of an approximately 0.61 kb fragment in pePa 133, only one 0.23 kb fragment is detectable in addition to the other Eco RI fragments.
Das so erhaltene t-PA-Muteingen kann wie in Beispiel 3 beschrieben, exprimiert und ein Protein der Größe ca. 4300Od, welches die Sequenz eines natürlichen tPA aufweist in welcher die Aminosäuren 50 bis 175 fehlen, d.h. die Aminosäuren 49 und 176 miteinander verknüpft sind, nachgewiesen werden. Wie in Beispiel 4 beschrieben, kann es ebenfalls als aktives Mutein erhalten werden. Seine Werte sind nicht unterschiedlich von den in Tabelle 1 beschrieben. Wie in Beispiel 5 . beschrieben, wird im Maus-Test-System eine ebenso verlangsamte Plasmaclearence und deutlich herabgesetzte Leber-Akkumulation gefunden.The resulting t-PA mutein gene can be expressed as described in Example 3 and a protein of size ca. 4300 Od having the sequence of a natural tPA in which amino acids 50 to 175 are absent, i. amino acids 49 and 176 are linked together. As described in Example 4, it can also be obtained as an active mutein. Its values are not different from those described in Table 1. As in example 5. described in the mouse test system also a slowed plasma clearance and significantly reduced liver accumulation found.
Deletion der EGF-Domäne aus pePa 133Deletion of the EGF domain from pePa 133
Aus dem gemäß Beispiel 6 a hergestellten t-PA-Vektor pePa 133 werden gemäß Beispiel 6 b) die Spaltansätze a) und b) hergestellt und wie dort behandelt. Zusätzlich wird dem dort beschriebenen Gemisch jedoch folgendes Oligonukleotid (75μιτιοΙ) zugefügt:From the prepared according to Example 6a t-PA vector pePa 133, the cleavage approaches a) and b) are prepared according to Example 6 b) and treated as there. In addition, however, the following oligonucleotide (75μιτιοΙ) is added to the mixture described there:
5' GCCTGTCAAAACCAGGGCC 3'5 'GCCTGTCAAAACCAGGGCC 3'
Alle weiteren Schritte werden wie in Beispiel 6 b) beschrieben, durchgeführt. Es werden diejenigen Klone ausgewählt, die das gesuchte Plasmid pREM 7732 enthalten. Dieses unterscheidet sich vom Ausgangsvektor durch ein verkürztes EcoRI-Fragment, statt ca. 0,61 kb ist dieses nur noch ca. 0,46 kb groß.All further steps are carried out as described in Example 6 b). Those clones which contain the desired plasmid pREM 7732 are selected. This differs from the starting vector by a truncated EcoRI fragment, instead of about 0.61 kb this is only about 0.46 kb in size.
Das so erhaltene Muteingen kann wie in Beispiel 3 beschrieben exprimiert und als Protein der Größe ca. 49 000 d mit der Seuqenz eines natürlichen tPA-Moleküls in welcher die Aminosäuren 50 bis 87 fehlen, d. h. die Aminosäuren 49 bis 88 miteinander verknüpft sind nachgewiesen werden. Wie in Beispiel 4 beschrieben, kann es als ebenfalls aktives Mutein erhalten werden.The resulting mutein gene can be expressed as described in Example 3 and as a protein of size ca. 49,000 d with the sequence of a natural tPA molecule in which amino acids 50 to 87 are absent, i. H. the amino acids 49 to 88 are linked together. As described in Example 4, it can be obtained as also active mutein.
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