DD257645A5 - Process for the preparation of a plasminogen activator - Google Patents
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Abstract
Das erfindungsgemaesse Verfahren zur Herstellung eines Plasminogenaktivators durch Expression einer diesen Aktivator codierenden c-DNA, welche in einem fuer die Wirtszelle geeigneten Vektor eingebaut vorliegt, in einer Prokaryontenzelle wird in dieser Weise ausgefuehrt, dass man einen Vektor verwendet, der entweder strikter Kontrolle unterliegt und dessen Replikation somit von der Replikation des Chromosoms der Wirtszelle nicht oder nur voruebergehend entkoppelbar ist und die Zuechtung unter Bedingungen durchfuehrt, bei denen keine relaxierte Kontrolle auftritt, oder dessen Promotor derart reguliert wird, dass die m-RNA-Bildung bei entkoppelten Plasmiden nicht groesser ist als bei den strikter Kontrolle unterliegenden Plasmiden.The process according to the invention for producing a plasminogen activator by expression of a c-DNA encoding this activator, which is incorporated in a vector suitable for the host cell, in a prokaryotic cell is carried out in such a way that either a vector is used which is subject to strict control and its Replication is thus not or only temporarily decoupled from the replication of the chromosome of the host cell and performs the breeding under conditions in which no relaxed control occurs, or its promoter is regulated such that the m-RNA formation in decoupled plasmids is not greater than in the case of strictly controlled plasmids.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Plasminogenaktivators durch Expression einer diesen Aktivator codierenden c-DNA, welche in einem für die Wirtszelle geeigneten Vektor eingebaut vorliegt, in einer Prokaryontenzelle. Plasminogenaktivatoren sind in humanen und tierischen Geweben und Körperflüssigkeiten weit verbreitet. Sie spielen bei der Fibrinolyse eine zentrale Rolle und wandeln Plasminogen in Plasmin um. Plasmin ist wiederum für die Gerinnselauflösung von Bedeutung. Daher sind Plasminogenaktivatoren für die klinische Behandlung von Gefäßverschlüssen durch Blutgerinnsel von großem Interesse.The invention relates to a method for producing a plasminogen activator by expression of a c-DNA encoding this activator, which is incorporated in a suitable vector for the host cell, in a prokaryotic cell. Plasminogen activators are widely used in human and animal tissues and body fluids. They play a central role in fibrinolysis and convert plasminogen to plasmin. In turn, plasmin is important for clot dissolution. Therefore, plasminogen activators are of great interest for the clinical treatment of vascular occlusions by blood clots.
Bekannte Plasminogenaktivatoren sind beispielsweise Pro-Urokinase (u-PA) sowie tissue Plasminogenaktivator (t-PA). Pro-Urokinase ist eine Serin-Protease in einkettiger Form, die durch Plasmin aktiviert wird (Eur. J. Biochem. 150 [1985], 183-188, EP-AI 0092182).Known plasminogen activators are, for example, pro-urokinase (u-PA) and tissue plasminogen activator (t-PA). Pro-urokinase is a serine protease in a single-chain form which is activated by plasmin (Eur. J. Biochem 150 [1985], 183-188, EP-AI 0092182).
t-PA ist ebenfalls eine Serin-Protease, welche in verschiedenen Modifikationen vorkommt (Arteriosclerosis 4 [1984], 579-585). Aus Gewebe oder Zellkulturen isolierter t-PA liegt in gering aktiver (zymogener) Form als einkettiger t-PA glycosiliert vor (Molekulargewicht ca. 70000 Dalton). Durch limitierte Einwirkung von Plasmin, Trypsin oder Kallikrein auf das Zymogen, wird dieses in den vollaktiven Zustand (zweikettiger t-PA) übergeführt. Dabei wird die Bindung zwischen Arg 275 und He 276 gespalten. Es entsteht eine schwere Kette (Α-Kette) sowie eine leichte Kette (B-Kette, Proteasendomäne). Beide Ketten bleiben über eine Disulfidbrücke verbunden (J. Biol.Chem. 256 [1981], 7035-7041).t-PA is also a serine protease, which occurs in various modifications (Arteriosclerosis 4 [1984], 579-585). T-PA isolated from tissue or cell cultures is glycosylated in a slightly active (zymogenic) form as a single-chain t-PA (molecular weight about 70,000 daltons). Due to the limited effect of plasmin, trypsin or kallikrein on the zymogen, this is converted into the fully active state (two-chain t-PA). The bond between Arg 275 and He 276 is split. The result is a heavy chain (Α chain) and a light chain (B chain, protease domain). Both chains remain connected via a disulfide bridge (J. Biol. Chem. 256 [1981], 7035-7041).
Von t-PA sind außerdem sich geringfügig unterscheidende natürliche Derivate bekannt. So beginnen ca. 50% der Moleküle mit Gly-Ala-Arg-Ser-Tyr-Gln (L-Kette), während bei den anderen ca. 50% von t-PA Gly-Ala-Arg fehlt und die Aminosäure-Sequenz mit Gly/Ser-Tyr-Gln (S-Kette) beginnt. Schließlich kann noch an der Position L-4 bzw. S-1 ein Austausch von Gly/Ser erfolgen (FEBS Letters 156 [1983], 47-50). Diese geringfügigen Modifikationen haben jedoch keinen Einfluß auf die biologische Wirksamkeit von t-PA.In addition, slightly different natural derivatives of t-PA are known. Thus, about 50% of the molecules start with Gly-Ala-Arg-Ser-Tyr-Gln (L-chain), while in the other 50% of t-PA Gly-Ala-Arg is missing and the amino acid sequence with Gly / Ser-Tyr-Gln (S chain) begins. Finally, an exchange of Gly / Ser can still take place at the position L-4 or S-1 (FEBS Letters 156 [1983], 47-50). However, these minor modifications do not affect the biological effectiveness of t-PA.
Da natürliche Plasminogenaktivatoren in der Natur nur in äußerst geringen Mengen (t-PAz. B. ca. 6ng/mi in Plasma) vorkommen, werden die für die klinische Anwendung und wissenschaftliche Zwecke benötigten Mengen an diesen Aktivatoren vorteilhaft gentechnologisch hergestellt. Beispielsweisesindfürt-PAsowohl Methoden für die Klonierung und Expression in Prokaryonten (Pennica et al., Nature 301 [1983], 214-221) als auch für die Expression in Eukaryonten (Biotechnology, Dezember 84,1058-1062) beschrieben. Während die in Eukaryonten exprimierten Plminogenaktivatoren glycosiliert sind, fehlt bei der Expression in Prokaryonten die Glycosilierung.Since natural plasminogen activators occur only in extremely small amounts in nature (t-PAz. B. about 6ng / mi in plasma), the amounts of these activators required for clinical application and scientific purposes are advantageously produced by genetic engineering. For example, t-PA has both described methods for cloning and expression in prokaryotes (Pennica et al., Nature 301 [1983], 214-221) and for expression in eukaryotes (Biotechnology, December 84, 1058-1062). While the expressed in eukaryotes plminogen activators are glycosylated, lacking in expression in prokaryotes glycosylation.
Es ist anzunehmen, daß die in Prokaryonten exprimierten Plasminogenaktivatoren biologisch ebenso wirksam sind, wie die glycosilierten natürlich vorkommenden Aktivatoren, weil beispielsweise bei t-PA nach Abspaltung der Kohlehydrat-Kette (Biochemistry 23 [1984], 6191-6195) oder Inhibierung der Glycosilierung (Thrombosis and Haemostasis 54 [1985], 788-791) ein so hergestellter nicht glycosilierter t-PA identische Eigenschaften mit dem glycosilierten natürlichen t-PA aufweist. Auf Grund der unproblematischen Fermentation von Prokaryonten und der zu erwartenden hohen Ausbeuten besteht demzufolge ein großes Interesse an einem Verfahren zur Expression von Plasminogenaktivatoren in Prokaryonten. Die bisher bekannten Verfahren (vgl. fürt-PA beispielsweise Nature 301 [1983], 214-221 und EP 0093619) haben jedoch den Nachteil, daß überwiegend ein Protein exprimiert wird, welches nicht die gewünschte Kettenlänge hat. So wurde festgestellt, daß bei der Expression von t-Pa c-DNA in E.coli mit pBR322 als Vektor mehr als 80% des exprimierten Proteins ein Molekulargewicht von nur 32-3600Od aufweist und demzufolge aus Abbauprodukten von t-PA besteht. Weniger als 20% des exprimierten Proteins ist einkettigert-PA, dessen Molekulargewicht 5700Od betragen sollte (entsprechend der in Nature, s.o., angegebenen Sequenz). Die Aufreinigung eines Gemisches von derart ähnlichen Verbindungen ist jedoch unwirtschaftlich und aufwendig. Die beobachtete Bildung von t-PA-Abkömmlingen hat Ähnlichkeit mit einem seit langem bekannten Phänomen bei der Expression von rekombinanten Proteinen in Prokaryonten. Für verschiedene derartige Proteine wurde nämlich berichtet, daß das Protein zwar vollständig exprimiert werde, seine Halbwertszeit in der Wirtszelle aber nur gering sei, weil es einer Proteolyse unterliegt (Trends in Biotechnology, 1 [1983], 109-113). Um diesen proteolytischen Abbau zu vermeiden, wurden verschiedene Wege vorgeschlagen. Ein solcher Weg ist die Verwendung von Wirtszellen, bei denen das für die Spaltung verantwortliche proteolytische System fehlt. Beispielsweise kann eine lon-Mutante von E.coli als Wirtszelle verwendet werden. Derartige Mutanten sind defizient bzgl. einer der im Wildtyp vorkommenden Protease. Da allerdings in E.coli mindestens sieben weitere Proteasen vorliegen (J. Bacteriol. 149 [1982], 1027-1033), wäre das Verfahren nur dann geeignet, wenn das zu exprimierende Protein von diesen anderen Proteasen nicht gespalten wird. Außerdem ist die Auswahl von geeigneten Wirtszellen sehr beschränkt.It can be assumed that the plasminogen activators expressed in prokaryotes are biologically as effective as the glycosylated naturally occurring activators because, for example, in t-PA after cleavage of the carbohydrate chain (Biochemistry 23 [1984], 6191-6195) or inhibition of glycosylation ( Thrombosis and Haemostasis 54 [1985], 788-791), a non-glycosylated t-PA prepared in this way has identical properties to the glycosylated natural t-PA. Due to the unproblematic fermentation of prokaryotes and the expected high yields, there is consequently a great interest in a method for the expression of plasminogen activators in prokaryotes. However, the previously known methods (see for-PA, for example Nature 301 [1983], 214-221 and EP 0093619) have the disadvantage that predominantly a protein is expressed which does not have the desired chain length. Thus, it was found that in the expression of t-Pa c DNA in E. coli with pBR322 as a vector more than 80% of the expressed protein has a molecular weight of only 32-3600 Od and thus consists of degradation products of t-PA. Less than 20% of the expressed protein is a single-chain PA whose molecular weight should be 5700 Od (according to the sequence given in Nature, supra). However, the purification of a mixture of such similar compounds is uneconomical and expensive. The observed formation of t-PA derivatives is similar to a long-known phenomenon in the expression of recombinant proteins in prokaryotes. Namely, for various such proteins, it has been reported that although the protein is completely expressed, its half-life in the host cell is low because it undergoes proteolysis (Trends in Biotechnology, 1 [1983], 109-113). To avoid this proteolytic degradation, various routes have been proposed. One such approach is the use of host cells lacking the proteolytic system responsible for cleavage. For example, an E. coli ion mutant can be used as the host cell. Such mutants are deficient with respect to one of the wild-type proteases. However, since at least seven other proteases are present in E. coli (J. Bacteriol 149 [1982], 1027-1033), the method would only be suitable if the protein to be expressed is not cleaved by these other proteases. In addition, the selection of suitable host cells is very limited.
Eine Proteinspaltung könnte auch dadurch vermieden werden, daß im Protein durch Aminosäurenaustausch (auf c-DNA-Ebene) die Proteasenschnittstelle entfernt wird. Dazu müßte allerdings diese Schnittstelle erst durch aufwendige Verfahren bestimmt werden. Außerdem kann der Aminosäurenaustausch die Aktivität und die immunologischen Eigenschaften des Proteins drastisch verändern.Protein cleavage could also be avoided by removing the protease cleavage site in the protein by amino acid exchange (at the c-DNA level). However, this interface would have to be determined only by complex procedures. In addition, the amino acid exchange can drastically alter the activity and immunological properties of the protein.
Es ist weiter bekannt, in den Klonierungsvektor ein Antiproteasen-Gen des Phagen T4 einzubauen (Proc. Natl. Acad. Sei. 80 [1983], 2059-2062). Au'ch dieses Verfahren ist nurfür bestimmte rekombinante Proteine geeignet und führt zudem nurzu einer unbefriedigenden Unterdrückung der Proteolyse.It is also known to incorporate into the cloning vector an antiprotease gene of phage T 4 (Proc Natl Acad, M. 80 [1983], 2059-2062). This method is suitable only for certain recombinant proteins and, moreover, only leads to an unsatisfactory suppression of proteolysis.
Weiter wurde vorgeschlagen, die Expression durch die Erhöhung der Kopienzahl des Expressionsvektors soweit zu steigern, daß die Proteasen durch eine riesige Menge an rekombinantem Protein überschwemmt werden und demzufolge ihre Wirkung im Verhältnis nur bei einem geringen Prozentsatz des rekombinanten Proteins entfalten. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, daß die Expression innerhalb von nur 1-2 Geherationen immens gesteigert werden muß und nicht längere Zeit durchgeführt werden kann (Trends in Biotechnology loc.cit.).It has also been proposed to increase the expression by increasing the copy number of the expression vector to such an extent that the proteases are inundated by a huge amount of recombinant protein and consequently develop their effect in proportion only in a small percentage of the recombinant protein. The disadvantage of this method, however, is that the expression must be increased immensely within only 1-2 geherationen and can not be carried out for a long time (Trends in Biotechnology loc.cit.).
Ein weiteres Verfahren zur Vermeidung der Proteolyse besteht darin, daß ein rekombinantes Protein bereits auf c-DNA-Ebene durch Fusion mit einem weiteren Protein geschützt wird. Dieses Verfahren wurde beispielsweise für die Peptidhormone Insulin und Somatostatin beschrieben, wobei als Fusionspartner /3-Galactosidase verwendet wird (Science 198 [1977], 1056-1063). Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß das Schutzprotein mitexprimiertwird und bei der Aufreinigung erst wieder abgespalten und entfernt werden muß, was einen hohen zusätzlichen Aufwand bedeutet. Keines der bisher vorgeschlagenen Verfahren zur Verhinderung des Abbaus von gentechnologisch hergestellten Proteinen erscheint daher geeignet, das Problem bei der Bildung von Proteingemischen derart hergestellten Pa (Plasminogenaktivatoren) zu lösen.Another method of avoiding proteolysis is to protect a recombinant protein already at the c-DNA level by fusion with another protein. This method has been described, for example, for the peptide hormones insulin and somatostatin using as fusion partner / 3-galactosidase (Science 198 [1977], 1056-1063). However, this method has the disadvantage that the protective protein is co-expressed and must first be split off and removed during the purification, which means a high additional expense. None of the hitherto proposed methods for preventing the degradation of genetically engineered proteins therefore appears to be suitable for solving the problem of the formation of protein mixtures of such produced Pa (plasminogen activators).
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung eines Plasminogenaktivators.The aim of the invention is to provide an improved process for the preparation of a plasminogen activator.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfugung zu stellen, welches die Expression von vollständigen, im wesentlichen einheitlichen Plasminogenaktivatoren in Prokaryonten gestattet und die Nachteile der oben genannten Verfahren zur Vermeidung einer Produktspaltung nicht aufweist.The invention has for its object to provide a method which allows the expression of complete, substantially uniform plasminogen activators in prokaryotes and does not have the disadvantages of the above-mentioned methods for avoiding product cleavage.
Es wurde nun gefunden, und hierauf beruht die Erfindung, daß bei der Verwendung von Expressionsvektoren, deren Replikation von der Replikation des Chromosoms der Wirtszelle nicht oder nur vorübergehend entkoppelbar ist, so daß die Bildung von m-RNA wesentlich vermindert wird oder von Vektoren, deren Promotorso reguliert wird, daß die m-RNA-Bildung ebenfalls auf das verminderte Niveau herabgesetzt wird bei der Expression in Prokaryonten einkettiger Plasminogenaktivator in hoher Reinheit entstehtIt has now been found, and the invention is based thereon, that when using expression vectors whose replication is not or only temporarily decoupled from the replication of the chromosome of the host cell, so that the formation of m-RNA is substantially reduced or of vectors whose Promotorso is regulated that the m-RNA production is also reduced to the reduced level upon expression in prokaryotes one-chain plasminogen activator in high purity arises
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Plasminogenaktivators durch Expression einer diesen Aktivator codierenden c-DNA, welche in einem für die Wirtszelle geeigneten Vektor eingebaut vorliegt, in einer Prokaryontenzelle, ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man einen Vektor verwendet, der strikter Kontrolle unterliegt und dessen Replikation somit von der Replikation des Chromosoms der Wirtszelle nicht oder nur vorübergehend entkoppelbar ist und die Züchtung unter Bedingungen durchführt, bei denen keine relaxierte Kontrolle auftritt oder dessen Promotor derart reguliert wird, daß die m-RNA-Bildung bei entkoppelten Plasmiden nicht größer ist als bei den strikter Kontrolle unterliegenden Plasmiden. Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß die unerwünschte Bildung eines Proteingemisches auf das Auftreten einer Mischung von m-RNA-Ketten verschiedener Zusammensetzungen zurückzuführen ist und durch Einstellung einer entsprechend niedrigen Transkriptionsrate verhindert werden kann.The process according to the invention for producing a plasminogen activator by expression of a c-DNA encoding this activator, which is incorporated in a vector suitable for the host cell, in a prokaryotic cell is therefore characterized by the use of a vector which is subject to strict control and its replication Thus, it is not or only temporarily decoupled from the replication of the chromosome of the host cell and performs the cultivation under conditions in which no relaxed control occurs or the promoter is regulated such that the m-RNA formation in decoupled plasmids is not greater than in the strictly controlled plasmids. The invention is based on the surprising discovery that the undesirable formation of a protein mixture is due to the occurrence of a mixture of m-RNA chains of different compositions and can be prevented by setting a correspondingly low transcription rate.
Vektoren, die strikter Kontrolle unterliegen, erhöhen in derfrühstationären Phase des Wachstums der Wirtszelle ihre Kopienzahl um nicht mehr als den Faktor 10, vorzugsweise um nicht mehr als den Faktor 3. Sie werden als „low copy "-Plasmide bezeichnet, im Gegensatz zu den üblicherweise in der Gentechnologie verwendeten relaxiert kontrollierten Multicopy-Plasmiden. Solche für das Verfahren der Erfindung geeignete Vektoren können gefunden werden, indem man überprüft, ob sie aktive Proteinbiosynthese oder eine DNA-Polymerase I für ihre Vermehrung benötigen.Vectors under strict control increase their copy number by no more than a factor of 10, preferably by no more than a factor of 3, in the early stationary phase of the growth of the host cell. They are referred to as "low copy" plasmids, in contrast to those commonly used Relaxed controlled multicopy plasmids used in genetic engineering Such vectors useful in the method of the invention can be found by checking whether they require active protein biosynthesis or DNA polymerase I for their proliferation.
Aus J. Bacteriol. 110 [1972], 667-676) ist bekannt, daß durch Zusatz von Hemmstoffen der Proteinbiosynthese, wie Chloramphenicol oder Spectinomycin, die Plasmidreplikation von der Replikation der Chromosomen bei den relaxiert kontrollierten Vektoren (z. B. Vektoren des CoI E I-Typs, pBR 322) entkoppelt und die Kopienzahl der Vektoren beispielsweise auf mehr als 100 bis 1 000 amplifiziert werden kann. Diese Eigenschaft begründet die bevorzugte Verwendung dieser Vektoren für Synthesezwecke wesentlich mit. Die für die erfindungsgemäße Verwendung geeigneten Vektoren, die strikter Kontrolle unterliegen, lassen sich durch diese Verfahren jedoch um nicht mehr als den Faktor 10, vorzugsweise um nicht mehr als Faktor 3 auf eine Kopienzahl von max. etwa 50 amplifizieren.From J. Bacteriol. 110 [1972], 667-676), it is known that, by addition of inhibitors of protein biosynthesis, such as chloramphenicol or spectinomycin, plasmid replication depends on the replication of the chromosomes in the relaxably controlled vectors (eg, vectors of the CoI E I type, pBR 322) and the copy number of the vectors can be amplified to more than 100 to 1,000, for example. This property essentially accounts for the preferred use of these vectors for synthesis purposes. However, the vectors which are suitable for the use according to the invention and which are subject to strict control can not be reduced by more than a factor of 10, preferably by not more than a factor of 3, to a copy number of max. amplify about 50.
Vor Beginn des Wachstums liegen die Vektoren in einer Kopienzahl von 1-50 Kopien pro Zelle, vorzugsweise 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 Kopien vor. Sofern die Anfangskopienzahl des Vektors im unteren Bereich (unter oder gleich 10) liegt, sind auch solche Vektoren bevorzugt, deren Amplifikationsfaktor an der oberen Grenze des Bereichs (nahe 10) liegt. Sofern die Anfangskopienzahl bereits bei ca. 20-50 liegt, sollte der Amplifikationsfaktor vorteilhaft möglichst gering sein. Besonders geeignet sind dann Amplifikationsfaktoren gleich oder unter 3.Before the onset of growth, the vectors are present at a copy number of 1-50 copies per cell, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10 copies. If the initial copy number of the vector is in the lower range (less than or equal to 10), those vectors whose amplification factor is at the upper limit of the range (near 10) are also preferred. If the initial copy number is already around 20-50, the amplification factor should advantageously be as low as possible. Amplification factors are then equal to or below 3.
Als Vektoren geeignet sind die bevorzugten prokaryontischen Plasmidvektoren, Phagenvektoren und Kombinationen von beiden.Suitable vectors are the preferred prokaryotic plasmid vectors, phage vectors, and combinations of both.
Bevorzugte Plasmidvektoren, die strikter Kontrolle unterliegen, sind pRSF 1010, pKN 402 und pACYC 177 sowie hiervon abgeleitete Plasmide, welche vorteilhaft deren charakteristische Sequenz als Ori tragen. Besonders bevorzugt sind die Plasmide pKN 402 und pACYC 177. Die Replikation von pKN 402 läßt sich durch Temperaturerhöhung von der Replikation des Chromosoms entkoppeln. Dadurch kann die Kopienzahl auf einfache Weise erhöht werden. Hierbei zeigt sich dann aber ein drastischer Anstieg an nicht einkettigem Pa. Daher muß eine Temperatur, bei der keine Entkoppelung erfolgt, für die Züchtung gewählt werden. Tabellen 1 und 2 zeigen für einige Vektoren, die strikter oder relaxierter Kontrolle unterliegen, Kopienzahl und Bildung einkettiger Pa in % der durch diese Vektoren exprimierten Proteine.Preferred plasmid vectors which are strictly controlled are pRSF 1010, pKN 402 and pACYC 177 and plasmids derived therefrom which advantageously carry their characteristic sequence as Ori. Particularly preferred are the plasmids pKN 402 and pACYC 177. The replication of pKN 402 can be decoupled by increasing the temperature of the replication of the chromosome. This can easily increase the copy number. However, this shows a drastic increase in non-single-chain Pa. Therefore, a temperature at which no decoupling takes place must be selected for breeding. Tables 1 and 2 show copy number and single-chain Pa formation in% of the proteins expressed by these vectors for some vectors which are subject to strict or relaxed control.
Alternativ läßt sich die angestrebte niedrige Bildung von m-RNA-Abschriften des t-PA-Chromosoms bei Verwendung von Vektoren, die in hoher Kopienzahl vorliegen (high-copy-Vektoren) dadurch erreichen, daß man ihren Promotor so reguliert, daß die m-RNA-Bildung (Transkription) zu einer verringerten m-RNA-Bildung führt in gleicher Größenordnung wie bei den oben abgehandelten Vektoren, die strikter Kontrolle unterliegen. Bei Verwendung von derartigen high-copy-Vektoren mit starkem Promotor wird erfindungsgemäß der Promotor daher nur schwach induziert, so daß nur eine niedrige Transkription des t-PA-Gens in die m-RNA erfolgt. Beispielsweise lassen sich hierzu Wirtszellen verwenden, die einen Repressor bilden, der den Promotor des igh-copy-Vektors entsprechend hemmt, wobei diese Hemmung aber durch Zugabe eines Induktors in entsprechend geringer Menge überwunden werden kann. Hierfür sind beispielsweise E.coli-Mutanten geeignet, die keine lac-Permease produzieren und sich so transformieren lassen, daß sie lac-Repressor überproduzieren. Verwendet man sie daher in Verbindung mit einem high-copy-Plasmid mit dem starken lac-Promotor, so wird dieser so stark reprimiert, daß die m-RNA-Bildung unterdrückt wird. Durch Zusatz eines Induktors kann dann eine angestrebte geringe m-RNA-Bildung erzielt werden. Ein typisches Beispiel für eine derartige Mutante ist der E.coli K*12-Stamm, DSM 2102 oder DSM 2093. Wird dieser mit dem Plasmid pePa 119 (DSM 3691 P) transformiert, so handelt es sich um einen lac-Repressor-Überproduzenten. Er kann bei einem high-copy-Plasmid, dessen t-PA-Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors liegt, zu der gewünschten m-RNA-Bildung verwendet werden, indem benötigte Induktoren in entsprechender Unterdosierung zugesetzt werden, beispielsweise IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactosid), oder bei einer lac-Permease Mangelmutante, Lactose. Im letzten Fall erfolgt die Unterdosierung des Induktors Lactose durch dessen stark verlangsamte Penetration in die Zelle.Alternatively, the desired low formation of m-RNA transcripts of the t-PA chromosome can be achieved using high copy vectors (high-copy vectors) by adjusting their promoter such that the m- RNA formation (transcription) to a reduced mRNA formation results in the same order of magnitude as in the above-discussed vectors, which are subject to strict control. When using such high-copy vectors with a strong promoter, the promoter is therefore only weakly induced according to the invention, so that only a low transcription of the t-PA gene into the m-RNA takes place. For example, it is possible to use host cells which form a repressor which inhibits the promoter of the high-copy vector correspondingly, but this inhibition can be overcome by adding an inducer in a correspondingly small amount. E. coli mutants which do not produce lac permease and can be transformed to overproduce the lac repressor are suitable for this purpose. Therefore, when used in conjunction with a high-copy plasmid with the strong lac promoter, it is so strongly repressed that m-RNA production is suppressed. By adding an inducer then a desired low m-RNA formation can be achieved. A typical example of such a mutant is the E. coli K * 12 strain, DSM 2102 or DSM 2093. If this is transformed with the plasmid pePa 119 (DSM 3691 P), it is a lac repressor overproducer. In the case of a high-copy plasmid whose t-PA gene is under the control of the lac promoter, it can be used for the desired formation of mRNA by adding required inducers in an appropriate underdosing, for example IPTG (isopropyl alcohol). β-D-thiogalactoside), or in a lac permease deficient mutant, lactose. In the latter case, the underdosing of the inductor lactose is due to its greatly slowed penetration into the cell.
Verwendet man Promotoren mit geringerer Effizienz als tac, kann bei voller Induktion eine entsprechend höhere Kopienzahl des Vektors erlaubt werden. Die Promoterstärke kann umgekehrt proportional der Kopienzahl gewählt werden oder die Nutzung des Promotors muß durch entsprechend niedrige Induktion eingeschränkt werden.Using promoters with lower efficiency than tac, full induction may allow a correspondingly higher copy number of the vector. The promoter strength can be chosen inversely proportional to the copy number or the use of the promoter must be limited by correspondingly low induction.
Der durch Limitierung des Kopienzahl der Expressionsvektors erreichbare Effekt, daß keine t-PA Bruchstücke produziert werden, kann auch auf folgende Weise erreicht werden:The effect achievable by limiting the copy number of the expression vector so that no t-PA fragments are produced can also be achieved in the following way:
Verwendet man einen high-copy-Expressionsvektor mit starkem Promoter (tac) in einem Stamm mit Lac-Repressorüberproduktion (Iac lq), so muß durch Zugabe von Induktor (IPTG, Lactose o. ä.) die t-PA-Synthese induziert werden. Dies gelingt mit Mengen von 0,5 bis 5mM IPTG im Medium vollständig. Verwendet man hingegen Iow-copy-Vektoren im gleichen System (tac-Promoter, Iac lq) beobachtet man zwar die Bildung von refractile bodies aber keine Inkorporation von Bruchstücken des t-PA in den refractile bodies bei gleicher IPTG-Mengenzugabe. Verringert man die IPTG-Zugabe bei high-copy-Vektoren auf 0,01 mM, so erhält man die gleichen reinen refractile bodies wie im Iow-copy-System bei voller IPTG-Induktion. Dieser Effekt wird mit schlechteren Promotern als tac analog erreicht. Die Kopienzahl des Vektors kann um den Wert gesteigert werden, um den der Promoter weniger effizient ist als der tac-Promoter. Das heißt bei 1Ao Promotereffizienz mögliche Erhöhungder Plasmidkopienzahl um den Faktor 10 gegenüber den verwendeten low-copy Plasmiden.If a high-copy expression vector with strong promoter (tac) is used in a strain with lac repressor overproduction (lac 1 q ), the addition of inducer (IPTG, lactose or the like) must induce t-PA synthesis , This succeeds completely with amounts of 0.5 to 5 mM IPTG in the medium. If, on the other hand, Iow-copy vectors are used in the same system (tac promoter, lac q ), formation of refractile bodies but no incorporation of fragments of t-PA into the refractile bodies is observed with the same amount of IPTG added. Decreasing the IPTG addition to 0.01mM in high-copy vectors yields the same pure refractile bodies as in the Iow-copy system with full IPTG induction. This effect is achieved analogously with worse promoters than tac. The copy number of the vector can be increased by the value by which the promoter is less efficient than the tac promoter. That is, at 1 Ao promoter efficiency, it is possible to increase the plasmid copy number by a factor of 10 over the low-copy plasmids used.
Unter den beiden Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Verwendung des Iow-copy-Systems bevorzugt. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Iow-copy-Systems mit starkem Promoter ist in der leichteren Handhabbarkeit des Systems in der Fermentation zu finden. Hier ist die Induktion weniger aufwendig durchführbar, da die Menge Induktor nicht durch Regelung scharf kontrolliert werden muß, sondern wie beschrieben, ein Eintopf-System funktioniert. Auch ist diese Induktion über das lac-System einer Steuerung über das trp-System vorzuziehen, da durch Lactose-Einsatz das Wachstum der Zellen mitgesteuert werden kann, was bei der trp-Verarmungstechnik (Genentech.) weniger einfach möglich ist.Among the two variants of the method according to the invention, the use of the Iow-copy system is preferred. The advantage of the Iow-copy system according to the invention with a strong promoter can be found in the easier handling of the system in the fermentation. Here, the induction is less expensive feasible, since the amount of inductor does not have to be controlled by control sharp, but as described, a one-pot system works. Also, this induction via the lac system is preferable to control via the trp system, since the growth of cells can be controlled by lactose use, which is less easily possible with the trp depletion technique (Genentech.).
Das Molekulargewicht der Vektoren beträgt üblicherweise zwischen 106 und 108 Dalton. Die Vektoren können außer der Plasminogenaktivator -c-DNA, z. B. t-PA-c-DNA, vorteilhaft noch Regulations- und Terminationssequenzen sowie Selektionsmarker enthalten. Als Promotoren haben sich insbesondere dertac- und dertrp-Promotor als geeignet erwiesen. Der Einbau der c-DNA in diese Vektoren kann in beliebiger Orientierung erfolgen.The molecular weight of the vectors is usually between 10 6 and 10 8 daltons. The vectors may contain, in addition to the plasminogen activator -c-DNA, e.g. B. t-PA-c-DNA, advantageously still contain regulatory and termination sequences and selection markers. As promoters in particular dertac and dertrp promoter have been found to be suitable. The incorporation of c-DNA into these vectors can be done in any orientation.
Vektorvector
Kopienzahl (Anfang)Copy number (beginning)
(Frühstadium)(Early stage)
%t-PA (einkettig)% t-PA (single-chain)
Wirtszellehost cell
pBR322pBR322
30-6030-60
>100> 100
20%20%
E.coliE.coli
Als Wirtszellen sind Prokaryonten-Zellen geeignet. Vorteilhaft hat sich die Verwendung von E.coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, und Bacillus subtilis erwiesen. Besonders bevorzugt wird von E.coli beispielsweise der Stamm DSM 3689, sowie von Pseudomonas putida der Stamm DSM 2106. Die Wirtszellen werden zweckmäßigerweiseje nach dem verwendeten Vektor so gewählt, daß letzterer im Wirt gut repliziert wird. Geeignete Vektor-Wirt Kombinationen sind dem Fachmann bekannt. Zweckmäßig werden Wirtszellen verwendet, die einen für den jeweils verwendeten Promotor geeigneten Regulator (Repressor), z.B. lac-Repressorfürden Iac-oder tac-Promotor, enthalten.Prokaryotic cells are suitable as host cells. Advantageous has been the use of E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, and Bacillus subtilis. Of E.coli, for example, particularly preferred is the strain DSM 3689, and of Pseudomonas putida the strain DSM 2106. The host cells are suitably chosen according to the vector used so that the latter is well replicated in the host. Suitable vector-host combinations are known to the person skilled in the art. It is expedient to use host cells which have a regulator (repressor) suitable for the particular promoter used, e.g. lac repressor for lac or tac promoter.
Als Plasminogenaktivatoren werden im Rahmen der Erfindung alle eine Plasminogen aktivierende Wirksamkeit im oben definierten Sinne aufweisenden Proteine verstanden, vorzugsweise t-PA und Pro-Urokinase sowie deren Derivate.Within the scope of the invention, plasminogen activators are understood as meaning all the activates of a plasminogen-activating activity in the sense defined above, preferably t-PA and pro-urokinase and their derivatives.
Unter Derivaten werden sowohl die natürlichen Derivate verstanden als auch künstlich hergestellte Derivate, denen z. B. eine oder mehrere Domänenen teilweise bzw. ganz fehlen. Das Verfahren ist ebenso geeignet für Derivate, bei denen eine oderDerivatives are understood as meaning both the natural derivatives and artificially produced derivatives to which, for example, B. one or more domains partially or completely missing. The method is also suitable for derivatives in which one or
mehrere Aminosäuren ausgetauscht sind.several amino acids are exchanged.
Besonders geeignet ist das Verfahren zur Expression von natürlichem t-PA sowie von t-PA-Derivaten, welche sich von dem bekannten natürlichen t-PA-Molekül ableiten (vgl. Figur 1), denen aber ein mit einer der Aminosäuren 43 bis 72 beginnendes und mit einer der Aminosäuren 179 bis 113 endendes Stück der Kette des vollständigen t-PA-Moleküls fehlt, wie sie in der deutschen Patentanmeldung P 3643158.3 beschrieben sind. Diese Nomenklatur ist analog der von Pennica loc.cit. beschriebenenParticularly suitable is the process for the expression of natural t-PA and t-PA derivatives, which are derived from the known natural t-PA molecule (see Figure 1), but which one beginning with one of the amino acids 43 to 72 and with a piece of the chain of the complete t-PA molecule ending in amino acids 179 to 113 is missing, as described in German patent application P 3643158.3. This nomenclature is analogous to that of Pennica loc.cit. described
Nomenklatur.Nomenclature.
Die Einführung der den Plasminogenaktivator codierenden c-DNA in den Vektor erfolgt nach den dem Fachmann hierfür geläufigen Methoden, die hier nicht näher erläutert werden müssen. Soll beispielsweise ein t-PA-Derivat hergestellt werden, dann verfährt man so, daß man aus der t-PA-DNA denjenigen Abschnitt, der die dem Derivat im Vergleich zum kompletten t-PA-Molekül fehlende Aminosäuresequenz kodiert, mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen herausschneidet, die das gewünschte t-PA-Derivat kodierenden Abschnitte verbindet, die so erhaltene t-PA-Derivat-cDNA über einen geeigneten Vektor gemäß der Erfindung in Prokaryonten einschleust und darin exprimiert. Als Restriktionsendonukleasen sind in diesem Falle insbesondere solche Enzyme geeignet, welche nur in dem Bereich von bp 315 bis bp 726dercDNA-Sequenz (vgl. PenniceThe introduction of the c-DNA encoding the plasminogen activator into the vector is carried out according to the methods familiar to a person skilled in the art, which need not be explained in more detail here. If, for example, a t-PA derivative is to be prepared, the procedure is to excise from the t-PA DNA the portion which encodes the amino acid sequence lacking the derivative compared to the complete t-PA molecule with the appropriate restriction endonucleases combining the desired t-PA derivative-encoding portion, the resulting t-PA derivative cDNA via a suitable vector according to the invention in prokaryotes and expresses therein. Restriction endonucleases which are suitable in this case are, in particular, those enzymes which are only in the range from bp 315 to bp 726 of the cDNA sequence (cf., Pennice
Nature 301 [1983], 214-221) schneiden.Nature 301 [1983], 214-221).
Besonders geeignet sind die Restriktionsendonukleasen-Kombinationen Dra III und Mae III zur Entfernung der Aminosäuren 45-179 oder Dde I und MnI I zur Entfernung der Aminosäuren 45-171 sowie Dde I für die Aminosäuren 45-174 und Fnu 4H zur Entfernung der Aminosäuren 52-168 und Rsa I zur Entfernung von den Aminosäureen 67-162.Especially suitable are the restriction endonuclease combinations Dra III and Mae III for removing amino acids 45-179 or Dde I and MnI I for removing amino acids 45-171 and Dde I for amino acids 45-174 and Fnu 4H for removing amino acids 52-179. 168 and Rsa I to remove amino acids 67-162.
Zur Wiederverknüpfung im Vektor werden die bekannten Methoden, vorzugsweise unter Verwendung von Linkern,For reconnection in the vector, the known methods, preferably using linkers,
angewendet.applied.
Anschließend werden diese Vektoren in Prokaryonten nach den bekannten Verfahren eingeführt und dieSubsequently, these vectors are introduced into prokaryotes according to the known methods and the
Plasminogenaktivatoren wie z. B. t-PA-Derivate exprimiert. t Plasminogen activators such. B. t-PA derivatives expressed. t
Ebenso kann zur Herstellung der fertigen Vektoren von der vollständigen DNA, welche Introns enthält, ausgegangen werden.Likewise, to produce the final vectors, one can start from the complete DNA containing introns.
Hierzu wird die DNA, z. B. t-PA-DNA aus der Maniatis-Genbank, isoliert, in den ausgewählten Vektor eingesetzt.For this purpose, the DNA, z. B. t-PA DNA from the Maniatis library, isolated, inserted into the selected vector.
-5- Zb/ Ö4Ö-5- Zb / Ö4Ö
Ferner kann aus ΡΑ-produzierenden Zellinien (Literatur Pennica, loc. cit.) die m-RNA isoliert werden und durch Größenfraktionierung aufgetrennt werden. Durch c-DNA-Herstellung daraus und Untersuchung der entstandenen Klone können die Klone gefunden werden, welche die codierende Region für PA enthalten. Dazu werden Klone ausgewählt, die mit entsprechend konstruierten Oligonukleotiden hybridisieren.Furthermore, the m-RNA can be isolated from ΡΑ-producing cell lines (literature Pennica, loc.cit.) And fractionated by size fractionation. By c-DNA production therefrom and examination of the resulting clones, the clones containing the coding region for PA can be found. For this purpose, clones are selected which hybridize with appropriately designed oligonucleotides.
Besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß ein tPA-Derivat hergestellt, bei dem die Aminosäuren 45-179 fehlen. Dieses kann beispielsweise auf cDNA-Ebene hergestellt werden, durch Schnitt mit den Restriktionsendonukleasen Dra 111 und Mae III und Verdau der überstehenden Einzelstrangenden mit Nuclease SI. Anschließend wird mit Ligase ligiert. Dann wird mit einem erfindungsgemäßen Vektorsystem in Prokaryonten exprimiert. Das bei der Expression in Eukaryonten so entstandene tPA-Derivat hat ein Molekulargewicht von ca. 43000 D.Particularly preferred according to the invention a tPA derivative is prepared in which the amino acids 45-179 are missing. This can be prepared, for example, at the cDNA level, by cutting with the restriction endonucleases Dra III and Mae III and digesting the supernatants with nuclease SI. It is then ligated with ligase. Then is expressed with a vector system according to the invention in prokaryotes. The resulting in expression in eukaryotes tPA derivative has a molecular weight of about 43,000 D.
Erfindungsgemäß erhält man praktisch reinen Plasminogenaktivator hauptsächlich in ungelöster inaktiver Form (refractile bodies), der sich nach Abtrennung in lösliche, aktive Form überführen läßt.According to the invention, virtually pure plasminogen activator is obtained mainly in undissolved inactive form (refractile bodies), which can be converted into soluble, active form after separation.
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below with reference to some examples.
Konstruktion der Expressionsplasmide für tPA:Construction of expression plasmids for tPA:
a) Konstruktion eines Expressionsplasmides unter Verwendung eines Plasmides mit dem pBR 322 on:a) Construction of an expression plasmid using a plasmid with the pBR 322 on:
Als Ausgangsplasmid dient das Plasmid pBT 95 (DSM 3611 P, DE 3545126), aus dem das Plasmid pePa 98.1 auf folgende Weise hergestellt wurde: Das Plasmid wird mit dem Enzym BgI Il gespalten und mit der Nuclease SI nachbehandelt. Durch weitere Spaltung mit dem Enzym Sea I läßt sich ein Fragment a präparativ erhalten, das ca. 760 Basenpaare groß ist und die für tPA kodierende Nucleotid-Sequenz 192-952 (Pennica loc. cit.) enthält. Ein Fragment b wird ebenfalls aus pBT 95 erhalten durch Spaltung mit Sea I und Hind III; dadurch erhält man ein Fragment von etwa 1200 Basenpaaren, das die tPA-Nucleotid-Sequenz 953-2165 enthält. Ein Partner c wird als Linker synthetisch hergestellt und enthält die folgende Sequenz:The starting plasmid pBT 95 (DSM 3611 P, DE 3545126), from which the plasmid pePa 98.1 was prepared in the following manner: The plasmid is digested with the enzyme Bgl II and post-treated with the nuclease SI. By further cleavage with the enzyme Sea I, a fragment a can be preparatively obtained, which is approximately 760 base pairs in size and contains the nucleotide sequence 192-952 (Pennica loc. Cit.) Coding for tPA. Fragment b is also obtained from pBT 95 by cleavage with Sea I and Hind III; This yields a fragment of about 1200 base pairs containing the tPA nucleotide sequence 953-2165. A partner c is synthesized as a linker and contains the following sequence:
5'GAATTCTTATGTCs' GAATACAG5'5'GAATTCTTATGTCs 'GAATACAG5'
Als Partner d in der Konstruktion wird das Plasmid pKK 223-3 (DSM 3694 P) mit den Enzymen Eco Rl und Hind III im Polylinker gespalten. Die Partner a-d werden zusammen ligiert. Der Ligationsansatz wird nach üblicher Technik mitT4-Ligase behandelt und anschließend in E.coli-Zellen (DSM 3689) transformiert. Die transformierten Zellen werden auf Medium unter Zusatz von 50/xg/ml Ampicillin kultiviert. Aus den erhaltenen Klonen werden diejenigen ausgewählt, die das Plasmid pePa 98.1 tragen, das sich von den Ausgangsplasmiden pBT 95 und pKK 223-3 dadurch unterscheidet, daß es im Polylinker des Plasmides pKK 223-3 zwischen der Eco Rl und Hind lll-Spaltstelle die tPA-Nucleotid-Sequenz 192-2165 in richtiger Reihenfolge enthält.As partner d in the construction, the plasmid pKK 223-3 (DSM 3694 P) is cleaved with the enzymes Eco Rl and Hind III in the polylinker. The partners a-d are ligated together. The ligation mixture is treated by conventional technique with T4 ligase and subsequently transformed into E. coli cells (DSM 3689). The transformed cells are cultured on medium with the addition of 50 / xg / ml ampicillin. From the clones obtained, those are selected which carry the plasmid pePa 98.1, which differs from the starting plasmids pBT 95 and pKK 223-3 in that it in the polylinker of the plasmid pKK 223-3 between the Eco Rl and Hind III cleavage site tPA nucleotide sequence 192-2165 in the correct order.
b) Konstruktion eines Expressionsplasmides für tPA mit Temperatur-sensitiver Replikationssteuerung;b) construction of an expression plasmid for tPA with temperature-sensitive replication control;
Aus dem in 1 a) hergestellten Plasmid pePa 98.1 kann durch Spaltung mitXho Il ein etwa 1,85kb großes Fragment gewonnen werden, das für tPA kodiert und den tac-Promotor enthält. In ihm ist die für tPA kodierende Nucleotid-Sequenz 192-1809 unverändert enthalten. Durch Behandlung mit dem Klenow-Enzym in Gegenwartvon allen4 Desoxynucleosidtriphosphaten werden die 5'-überhängenden Enden der Xho Il-Spaltstellen aufgefüllt. Das Empfängerplasmid pREM 2334 (DSM 3690 P), dessen Replikation und damit die Kopienzahl durch Temperatursteuerung beeinflußt werden kann, wird mit dem Enzym CIa I linearisiert und die 5'-überstehenden Enden werden mit dem Klenow-Enzym in Gegenwart von allen 4 Desoxynucleosidtriphosphaten aufgefüllt. Die so vorbereiteten Partnermoleküle werden in einem Ligierungsansatz vereinigt. Nach Transformation in E.coli-Zellen (DSM 3689) werden die Zellen auf Nährmedium mit 25/xg/ml Chloramphenicol gezüchtet. Die Temperatur für die Bebrütung darf nur 30°C betragen. Von den so erhaltenen Klonen werden diejenigen ausgewählt, die das Plasmid pePa 100.1 enthalten. Dieses unterscheidet sich vom Ausgangsplasmid pREM 2334 darin, daß es das Xho Il-Fragment, das fürtPA kodiert, enthält. Dieses wird überprüft, indem man die Plasmide dieser Klone isoliert und mit Bam Hl spaltet. pePa 100.1-Moleküle lassen sich so in 2 Fragmente zerlegen, die ca. 6,85 und 2,15 kb groß sind.From the plasmid pePa 98.1 prepared in 1 a), it is possible by cleavage with Xho II to obtain an approximately 1.85 kb fragment which codes for tPA and contains the tac promoter. It contains the tPA-encoding nucleotide sequence 192-1809 unchanged. Treatment with the Klenow enzyme in the presence of all 4 deoxynucleoside triphosphates replenishes the 5 'overhanging ends of the Xho II cleavage sites. The recipient plasmid pREM 2334 (DSM 3690 P), whose replication and thus the copy number can be influenced by temperature control, is linearized with the enzyme CIa I and the 5 'protruding ends are filled in with the Klenow enzyme in the presence of all 4 deoxynucleoside triphosphates. The prepared partner molecules are combined in a ligation mixture. After transformation into E. coli cells (DSM 3689), the cells are grown on nutrient medium with 25 / xg / ml chloramphenicol. The temperature for incubation may only be 30 ° C. Of the clones thus obtained, those containing the plasmid pePa 100.1 are selected. This differs from the starting plasmid pREM 2334 in that it contains the Xho II fragment encoding tPA. This is checked by isolating the plasmids of these clones and cleaving with Bam HI. PePa 100.1 molecules can thus be broken down into 2 fragments, which are approximately 6.85 and 2.15 kb in size.
c) Konstruktion eines Expressionsvektors für tPA, der sowohl in E.coli wie in Pseudomonas putida verwendet werden kann. Das im Beispiel 1 b) beschriebene Xho Il-Fragment, das mit Klenow-Enzym behandelt worden war, wird wiederum verwendet. Als Empfängerplasmid dient das Plasmid pREM 3061 (DSM 3692 P), das mit Hpa I linearisiert wird. Beide Partnermoleküle werden gemeinsam in einem Ligationsansatz mitT4-Ligase behandelt. Nach Transformation in E.coli-Zellen (DSM 3689) und Züchtung der erfolgreich transformierten Zellen auf Nährmedium mit 25/ag/ml Kanamycin werden Klone erhalten. Aus diesen werden diejenigen Zellen ausgewählt, die das Plasmid pePa 107.8 enthalten. Dieses unterscheidet sich vom Ausgangsvektor pREM 3061 dadurch, daß es das beschriebene Xho Il-Fragment enthält. Das Plasmid wird aus den Zellen gewonnen und mit dem Enzym Bst E Il analytisch gespalten. Man erhält dabei 2 Fragmente der ungefähren Größe von 10,8 und 1,3kb. Dieses Plasmid kann durch Transformation in Zellen des Stammes Pseudomonas putida eingeführt werden. Dazu werden Zellen des Stammes Pseudomonas putida (DSM 2106) zuerst mit dem Plasmid pePa 119 (DSM 3691 P) transformiert und auf Nährmedium mit 25/xg/ml Kanamycin selektioniert. Diese Pseudomonas putida-Zellen enthalten nun ein Plasmid, das in der Lage ist, lac-Repressor in großer Menge zu produzieren.c) Construction of an expression vector for tPA which can be used both in E. coli and in Pseudomonas putida. The XhoI fragment described in Example 1 b), which had been treated with Klenow enzyme, is used again. The recipient plasmid is plasmid pREM 3061 (DSM 3692 P), which is linearized with Hpa I. Both partner molecules are treated together in a ligation mixture with T4 ligase. After transformation into E. coli cells (DSM 3689) and growth of the successfully transformed cells on nutrient medium with 25 / ag / ml kanamycin, clones are obtained. From these, those cells are selected which contain the plasmid pePa 107.8. This differs from the starting vector pREM 3061 in that it contains the described Xho II fragment. The plasmid is recovered from the cells and cleaved with the enzyme Bst E II. This gives 2 fragments of approximate size of 10.8 and 1.3kb. This plasmid can be introduced by transformation into cells of the strain Pseudomonas putida. For this purpose, cells of the strain Pseudomonas putida (DSM 2106) are first transformed with the plasmid pePa 119 (DSM 3691 P) and selected on nutrient medium with 25 / xg / ml kanamycin. These Pseudomonas putida cells now contain a plasmid capable of producing lac repressor in large quantities.
Die pePa 119 enthaltenden Pseudomonas putida-Zellen werden mit dem Plasmid pePa 107.8 transformiert. Die Transformanten werden auf Nährmedium mit 50μg/ml Streptomycin selektioniert und enthalten danach sowohl die Plasmide pePa 119 wie pePa 107.8. Die Anwesenheit des Plasmides pePa 119 unterdrückt die Produktion von tPAin den Zellen durch Produktion des lac-Repressorproteins. Dieses kann die Transkription vom tac-Promotor aus auch im Ps. putida reprimieren.The PePa 119 containing Pseudomonas putida cells are transformed with the plasmid pePa 107.8. The transformants are selected on nutrient medium with 50 μg / ml streptomycin and thereafter contain both the plasmids pePa 119 and pePa 107.8. The presence of the plasmid pePa 119 suppresses the production of tPA in the cells by production of the lac repressor protein. This can also repress transcription from the tac promoter in Ps. Putida.
d) Konstruktion eines Expressionsplasmides für tPA mit dem ori von pACYC 177.d) Construction of an expression plasmid for tPA with the ori of pACYC 177.
Verwendet wird wiederum das ca. 1,85 kb große Xho Il-Fragment, das mit Klenow-Enzym behandelt wurde (aus Beispiel 1 b). Dieses wird Fragment a genannt. Ein Fragment b wird aus pKK 233-3 präpariert und zwar durch Spaltung mit Bam Hl und Behandlung mitSI-Nuclease. Anschließend wird mit dem Enzym Pvu I nachgespalten, man erhält so ein ca. 1,05 kb großes Fragment, das Transkriptionsterminatoren enthält und die 5'-Portion desß-Lactamasegens. Ein Fragment c erhält man durch Spaltung des Plasmides pACYC 177 (DSM 3693 P) mit Bam Hl und anschließendem Sl-Nuclease-Verdau. Dieser Ansatz wird dann partiell mit Pvu I nachgespalten. Präparätiv kann ein ca. 2,9kb großes Fragment erhalten werden. Die Fragmente a, b und c werden in einem Ligationsansatz vereinigt. Nach Behandlung mit T4-Ligase wird dieser Ligationsansatz transformiert in Zellen von E.coli (DSM 3689). Die Zellen werden anschließend auf Nährmedium mit 25/u.g/ml Kanamycin und 50^g/ml Ampicillin plattiert. Von den entstandenen Klonen werden diejenigen ausgewählt, die das Plasmid pePa 133 tragen. Dieses unterscheidet sich von dem Ausgangsplasmid pACYC 177 dadurch, daß es die tPA kodierende Sequenz von Position 192— 1809 unverändert enthält und zusätzlich die Transkriptionsterminatoren aus dem Plasmid pKK 223-3. Das Plasmid wird isoliert und mit dem Enzym Bst E Il analytisch gespalten. Man erhält zwei Fragmente der Größe von cai3,9und 1,9kb.In turn, the approximately 1.85 kb Xho II fragment which has been treated with Klenow enzyme (from Example 1 b) is used. This is called fragment a. Fragment b is prepared from pKK 233-3 by digestion with Bam HI and treatment with SI nuclease. Subsequently, the enzyme Pvu I is post-cleaved to yield a ca. 1.05 kb fragment containing transcription terminators and the 5 'portion of the desß-lactamase gene. A fragment c is obtained by cleavage of the plasmid pACYC 177 (DSM 3693 P) with Bam HI and subsequent SL nuclease digestion. This approach is then partially cleaved with Pvu I. Preparatively, a ca. 2.9kb fragment can be obtained. Fragments a, b and c are combined in a ligation mixture. After treatment with T4 ligase, this ligation mixture is transformed into cells of E. coli (DSM 3689). The cells are then plated on nutrient medium containing 25 μg / ml kanamycin and 50 μg / ml ampicillin. Of the resulting clones, those carrying the plasmid pePa 133 are selected. This differs from the starting plasmid pACYC 177 in that it contains the tPA coding sequence from position 192-1809 unchanged and additionally the transcription terminators from the plasmid pKK 223-3. The plasmid is isolated and digested with the enzyme Bst E II. Two fragments of size cai3.9 and 1.9kb are obtained.
Expression des tPA-Proteins in ProkaryontenzellenExpression of the tPA protein in prokaryotic cells
a) In 1 a), b), c) und d) hergestellte Plasmide werden E.coli (DSM 3689) transformiert, der ein Iac Iq-Plasmid enthält. Die Transformanten werden auf Medien mit 50^g/ml Ampicillin für die Plasmide aus 1 a), c) und d) bzw. 25(U,g/ml Chloramphenicol für das Plasmid aus 1 b) selektioniert. Die Zellen, die also die Plasmide pePa 98.1, pePa 100.1, pePa 107.8, oderpePa 133 enthalten, werden in Nährbouillon bis zu OD55onm = 0,4 unter Belüftung gezüchtet und dann unter Zusatz von 10OmM IPTG induziert. Die Bebrütung geschieht bei 37°Cfürdie Plasmide pePa 98.1, pePa 107.8 und pePa 133, jedoch 3O0C für das Plasmid pePa 100.1. Nach 4 Stunden Bebrütung unter Belüftung in Gegenwart von IPDG werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen. Dazu werden sie für 15 min auf Eis mitO,5μg/ml Lysozym behandelt (Zellkonzentration 10 OD/ml). Verwendet wird ein Tris-Puffer, pH 8,6 (0,1 M/l Tris-HCI mit 100mM/l EDTA und 100mM/l NaCI). Danach werden die Zellen durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird für 10min bei 20000g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment enthält das tPA-Protein in inaktiver Form. Dieses kann nach der in DE 3537708 beschriebenen Methode gelöst und reaktiviert werden. Das gewonnene Pellet kann aber auch durch Zusatz von 1 % SDS und 100mM/l Mercaptoäthanol gelöst werden und in einem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt werden. Durch Einfärbung der Proteine nach erfolgter Elektrophorese mittels Choomassieblue können die Proteinbanden sichtbar gemacht werden. Der Extrakt aus den Zellen, die die Plasmide pePa 100.1,pePa 107.8oder pePa 133 tragen, enthält hauptsächlich 1 Protein des Molekulargewichts von ca. 57000 Dalton, das der Größe des unglykosylierten t-PA-Proteins entspricht. Der Extrakt aus den Zellen, die das Plasmid pePa 98.1 tragen, enthält hauptsächlich Material der Größenordnung 32-34000 Dalton und nur eine geringe Menge der Größe 57000 Dalton. Die identifizierten Proteinbanden können nach dem Western-blot-Verfahren mit Anti-tPA-Korrjugat aus Ziege gleichwertig immunologisch nachgewiesen werden.a) Plasmids prepared in 1 a), b), c) and d) are transformed E. coli (DSM 3689) containing an Iac I q plasmid. The transformants are selected on media with 50 ^ g / ml ampicillin for the plasmids from 1 a), c) and d) and 25 (U, g / ml chloramphenicol for the plasmid from 1 b). The cells, which thus contain the plasmids pePa 98.1, pePa 100.1, pePa 107.8, orpePa 133, are grown in nutrient broth up to OD 55 onm = 0.4 with aeration and then induced with the addition of 10OmM IPTG. The incubation takes place at 37 ° C for the plasmids pePa 98.1, pePa 107.8 and pePa 133, but 3O 0 C for the plasmid pePa 100.1. After 4 hours of incubation with aeration in the presence of IPDG, the cells are harvested and disrupted. For this they are treated for 15 min on ice with O, 5 μg / ml lysozyme (cell concentration 10 OD / ml). A Tris buffer, pH 8.6 (0.1 M / l Tris-HCl with 100 mM / l EDTA and 100 mM / l NaCl) is used. Thereafter, the cells are disrupted by sonication. The resulting suspension is centrifuged for 10 min at 20000g and the supernatant discarded. The sediment contains the tPA protein in an inactive form. This can be dissolved and reactivated by the method described in DE 3537708. However, the pellet obtained can also be dissolved by the addition of 1% SDS and 100 mM mercaptoethanol and separated by electrophoresis in an SDS-polyacrylamide gel. By coloring the proteins after electrophoresis by means of Choomassieblue the protein bands can be visualized. The extract from the cells carrying the plasmids pePa 100.1, pePa 107.8 or pePa 133 mainly contains 1 protein of molecular weight of about 57000 daltons, which corresponds to the size of the unglycosylated t-PA protein. The extract from the cells carrying the plasmid pePa 98.1 contains mainly material of the order of 32-34000 daltons and only a small amount of the size 57000 daltons. The identified protein bands can be immunologically immunologically detected by the Western blot method with goat anti-tPA conjugate.
b) Pseudomonas pudita-Zellen (DSM 2106), die mit den Plasmiden pePA 119 und pePa 107.8 gemäß Beispiel 1 c) transformiert wurden, werden bei 300C in Nährbouillion bis zu oD55onm = 0,4 unter Belüftung gezüchtet und dann unter Zusatz von 1OmM IPTG induziert. Nach 4 Stunden Bebrütung bei 300C unter Belüftung in Gegenwart von IPTG werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen. Im weiteren werden wie unter 2 a) beschrieben verfahren. Nach erfolgter Gelelektrophorese des Zellextraktes und Anfärbung der Proteine durch Coomassie-blue wird im Extrakt hauptsächlich ein Protein des Molekulargewichts von ca. 57000 Daiton gefunden. Dieses Protein ist alstPA-Protein nach dem Western-blot-Verfahren mit Anti-tPA-PAK-Konjugat aus Ziege immunologisch nachweisbar. Proteine, die kleiner sind als 57000 Dalton, sind in der Regel immunologisch auf dem beschriebenen Wege nicht als tPA nachweisbar.b) Pseudomonas pudita cells (DSM 2106) transformed with the plasmids pePa 107.8 pePA 119 and according to Example 1 c), at 30 0 C in Nährbouillion to OD 55 nm o = 0.4 and then cultured under aeration with the addition of 1OmM IPTG induced. After 4 hours of incubation at 30 ° C. with aeration in the presence of IPTG, the cells are harvested and disrupted. In the further procedure described under 2 a). After gel electrophoresis of the cell extract and staining of the proteins by Coomassie blue, a protein with a molecular weight of about 57,000 Daiton is found in the extract. This protein is immunologically detectable for alstPA protein by the Western blot method with goat anti-tPA-PAK conjugate. Proteins smaller than 57000 daltons are generally not immunologically detectable as tPA by the described route.
Vergleich dertPA-Expression mit hoher und niedriger Kopienzahl des Vektorplasmides:Comparison of high and low copy number vector expression of the vector plasmid:
Verwendet wird ein E.coli-Stamm (DSM 3689), der das Plasmid pePa 100.1 enthält. Die Zellen werden in Nährbouillon bis zu oD55onm. = 0,4 unter Belüftung bei 30°C gezüchtet. Durch Zugabe von 1OmM IPTG werden sie anschließend induziert. Der Ansatz wird in 3 gleichgroße Volumenteile geteilt. Jeweils ein Drittel wird weiter bei 300C oder bei 370C oder bei 42°C für 4 Stunden in Gegenwart von IPTG weiter inkubiert. Die Zellen werden anschließend geerntet und wie unter Beispiel 2 beschrieben, aufgeschlossen. Nach SDS-Gelelektrophorese der Extrakte können die tPA-Proteinbanden mit Coomassie-blue sichtbar gemacht werden. Der Extrakt aus dem 30°C-Ansatz enthält hauptsächlich.ein Protein des Molekulargewichts 57000 Dalton. Die Extrakte aus den Ansätzen bei 370C und 420C enthalten nur einen geringen Anteil des Proteins der Größe 57000 Dalton, aber einen sehr großen Anteil der Größenordnung 32000 bis 34000 Dalton. Diese Proteinbanden lassen sich nach den Westernblot-Verfahren mit Anti-tPA-PAK-Konjugat aus Ziege gleichwertig immunologisch nachweisen.An E. coli strain (DSM 3689) containing the plasmid pePa 100.1 is used. The cells are grown in nutrient broth up to 55 dm. = 0.4 with aeration at 30 ° C. By adding 1OmM IPTG they are subsequently induced. The batch is divided into 3 equal parts by volume. One-third is further incubated at 30 0 C or 37 0 C or at 42 ° C for 4 hours in the presence of IPTG on. The cells are then harvested and disrupted as described in Example 2. After SDS gel electrophoresis of the extracts, the tPA protein bands can be visualized with Coomassie blue. The extract from the 30 ° C batch contains mainly a protein of molecular weight 57,000 daltons. The extracts from the batches at 37 0 C and 42 0 C contain only a small proportion of the protein of size 57000 daltons, but a very large proportion of the order of 32,000 to 34,000 daltons. These protein bands can be immunologically immunologically detected by the Western blot method with goat anti-tPA-PAK conjugate.
Das Plasmid pePa 100.1 wird bei höheren Temperaturen stärker repliziert, was zu einer höheren Kopienzahl des Plasmides in den Zellen führt. Diese höhere Kopienzahl wirkt sich nachteilig auf den Erhalt von inaktivem tPA-Protein der Größenordnung 57000 Dalton aus.The plasmid pePa 100.1 is more replicated at higher temperatures, resulting in a higher copy number of the plasmid in the cells. This higher copy number is detrimental to obtaining inactive tPA protein of the order of 57000 daltons.
Renaturierung von tPA-Proteinen aus Prokaryonten.Renaturation of tPA proteins from prokaryotes.
Die gemäß Beispiel 2 und 3 gewonnenen Zellfraktionen, die tPA-Protein enthalten, können nach der in DE 3537708 beschriebenen Methode gelöst und reaktiviert werden. Dabei wird aus Extrakten der Zellen die pePa 107.8 oder pePa 133 oder pePa 100.1 gezüchtet bei 3O0C etwa 10mal mehr aktives tPA erhalten, als aus Zellen, die pePa 98.1 oder aber pePa 100.1 gezüchtet bei 37°C oder 42°C enthalten. Das gewonnene aktive tPA ist jeweils auch durch Fibrin stimulierbar. Die Stimulierbarkeit ist in der Regel größer als 10fach.The cell fractions obtained according to Examples 2 and 3 and containing tPA protein can be dissolved and reactivated by the method described in DE 3537708. In this case, from extracts of the cells, the pePa 107.8 or pePa 133 or pePa 100.1 grown at 3O 0 C about 10 times more active tPA obtained than from cells containing pePa 98.1 or pePa 100.1 grown at 37 ° C or 42 ° C. The recovered active tPA can also be stimulated by fibrin. The stimulability is usually greater than 10 times.
Deletion der die Halbwertzeit bestimmenden Domänen von tPADeletion of Half-Life Determining Domains of tPA
a) Konstruktion des tPA-Mutein-Gensa) Construction of the tPA mutein gene
Als Ausgangsmaterial wird das Plasmid pePa 98.1 verwendet. Aus diesem Plasmid wurde das tPA-codierende Fragment mit dem tac-Promotor über die Xho Il-Spaltung erhalten. Dieses Fragment ist etwa 1,85kb groß und wird an den überstehenden Enden durch Behandlung mit Klenow-Enzym, in Gegenwart von allen vier Desoxinukleosidtriphosphaten vollständig aufgefüllt. In einem Schritt A wird dieses Fragment mit dem Enzym Dra III geschnitten und die überstehenden Enden mit der Nuclease SI abgedaut. Gelelektrophoretisch wird das Fragment der Größe von ca. 370 Basenpaaren gewonnen. In einem Schritt B wird das gleiche Xho Il Ausgangsfragment mit dem Enzym Mae III geschnitten und ebenfalls mit SI nachverdaut. Anschließend wird dieser Ansatz zusätzlich mit dem Enzym Sac I behandelt. Gelektrophoretisch wird daraus ein Fragment der Größe von ca. 700 Basenpaaren isoliert. In einem Ansatz C wird das Vektorplasmid pePa 98.1 mit dem Enzym BamH I geschnitten und die überstehenden Enden mit dem Klenow-Enzym, unter Einsatz von allen vier Desoxinukleosidtriphosphaten aufgefüllt und mit dem Enzym Sac I nachgespalten. Gelektrophoretisch wird anschließend das größte Fragment aus diesem Ansatz gewonnen. In einem Ligierungsansatz werden die gewonnenen Fragmente aus den Ansätzen A, B und C vereinigt und unter Zusatz von DNA-Ligase ligiert.The starting material used is the plasmid pePa 98.1. From this plasmid, the tPA-encoding fragment with the tac promoter was obtained via the XhoII cleavage. This fragment is about 1.85 kb in size and is completely filled at the overhanging ends by treatment with Klenow enzyme in the presence of all four deoxynucleoside triphosphates. In a step A, this fragment is cut with the enzyme Dra III and the protruding ends are digested with the nuclease SI. Gelelektrophoretisch the fragment of the size of about 370 base pairs won. In a step B, the same starting Xho II fragment is cut with the enzyme Mae III and also nachverdaut with SI. Subsequently, this approach is additionally treated with the enzyme Sac I. Gelektrophoretisch a fragment of the size of about 700 base pairs is isolated. In a batch C, the vector plasmid pePa 98.1 is cut with the enzyme BamH I and the protruding ends are filled up with the Klenow enzyme, using all four deoxynucleoside triphosphates and after-cleaved with the enzyme Sac I. Gelektrophoretisch then the largest fragment is obtained from this approach. In a ligation mixture, the fragments obtained from the batches A, B and C are combined and ligated with the addition of DNA ligase.
Die Ligierungsmischung wird in E.coli-DSM 3689, welche ein Iac Iq-Plasmid enthalten, transformiert und die entstehenden Transformanten werden auf Nährmedium mit 50/xg/ml Ampicillin selektioniert. Aus den so erhaltenen Klonen werden diejenigen ausgewählt, die das gewünschte Plasmid pePa 129 enthalten, das sich vom Äusgangsplasmid pePa 98.1 dadurch unterscheidet, daß es die DNA-Sequenz zwischen dertPA cDNA-Sequenz Pos. 301 bis 726 nicht mehr enthält. Figur 1 zeigt die Nucleotidsequenz des so erhaltenen Muteingens.The ligation mixture is transformed into E. coli DSM 3689 containing an Iac I q plasmid, and the resulting transformants are selected on nutrient medium containing 50 / xg / ml ampicillin. From the clones thus obtained, those are selected which contain the desired plasmid pePa 129, which differs from the parent plasmid pePa 98.1 in that it no longer contains the DNA sequence between the tPA cDNA sequence pos. 301 to 726. Figure 1 shows the nucleotide sequence of the mutein gene thus obtained.
b) Konstruktion eines Expressionsvektors für das Mutein zur Expression in E.colib) Construction of an expression vector for the mutein for expression in E. coli
Aus dem nach 1 a) hergestellten Plasmid pePa 129 wird durch Verdau mit den Restriktionsenzymen Bam H I und Pvu I das tPA-codierende Fragment erhalten. Das Plasmid pACYC 177 (DSM 3693 P) wird ebenfalls mit Bam H I und limitiert mit Pvu gespalten. Beide Fragmente werden zusammenligiert und in E.coli-DSM 3689, welche ein Iac Iq-Plasmid enthalten, transformiert. Durch Selektion auf Kanamycin und Ampicillin mit je 25 bzw. 50^g/ml erhält man Transformanten, unter denen diejenigen ausgewählt werden, die das Plasmid pePa 137 enthalten. Diese unterscheidet sich von den Ausgangsvektoren dadurch, daß es das Mutein-Genfragment aus pePa 129 und die Sequenz des Plasmides pACYC 177 jeweils vollständig enthält. Eine Restriktionsschnittstellenkarte des Plasmides pePa 137 zeigt Figur 2.From the plasmid pePa 129 prepared according to 1 a), the tPA-encoding fragment is obtained by digestion with the restriction enzymes Bam HI and Pvu I. The plasmid pACYC 177 (DSM 3693 P) is also cleaved with Bam HI and limited with Pvu. Both fragments are ligated together and transformed into E. coli DSM 3689 containing an Iac I q plasmid. By selection on kanamycin and ampicillin at 25 and 50 ^ g / ml respectively transformants are obtained, among which those are selected which contain the plasmid pePa 137. This differs from the parent vectors in that it completely contains the mutein gene fragment from pePa 129 and the sequence of the plasmid pACYC 177, respectively. A restriction site map of plasmid pePa 137 is shown in FIG. 2.
c) Konstruktion eines Expressionsvektors für das Mutein zur Expression in Pseudomonas putidac) Construction of an expression vector for the mutein for expression in Pseudomonas putida
Als Vektor für Pseudomonas putida wird ein Derivat des Plasmides pRSF 1010 verwendet, welches zusätzlich ein Kanamycin-Resistenzgen aus pACYC 177 enthält. Dieser Vektor führt die Bezeichnung pREM 3061 (DSM 3692 P). Dieses Plasmid wird durch Verwendung des Restriktionsenzyms Hpa I linearisiert. Aus dem nach 1 a) hergestellten Vektor pePa 129 wird durch Xho Il-Spaltung ein ca. 1,45kb großes Fragment gewonnen, das den tac-Promotor und die vollständige Mutein-Gensequenz enthält. Durch Behandlung mit Klenow-Fragment, in Gegenwart von allen vier Desoxinukleosidtriphosphaten werden die Xho !!-Schnittstellen vollständig aufgefüllt. Das so behandelte Fragment wird mit dem linearisierten Vektor pREM 3061 ligiert und in E.coli-Zellen (DSM 3689), transformiert. Die Transformanten werden auf Medium mit25^g/ml Kanamycin selektioniert. Transformanten, die das Plasmid pePa 143 enthalten, werden ausgewählt. Dieses Plasmid unterscheidet sich * vom Ausgangsvektor pREM 3061 dadurch, daß es die vollständige Mutein-Gensequenz mit tac-Promotor enthält. Dieses Plasmid wird isoliert und durch Transformation in Zellen des Stammes Pseudomonas putida, DSM 2106 eingeführt. Die Transformanten werden auf Medium mit 25μg/ml Kanamycin selektioniert und anschließend analysiert. Sie enthalten das Plasmid pePa 143. Zusätzlich kann in diese Transformanten-Zellen ebenfalls durch Transformation ein Plasmid pePa 119 (DSM 3691 P) eingeführt werden, das mit pePa 143 kompatibel ist und das Iac Iq-Gen enthält. Dieses Plasmid ist ein Derivat vom Plasmid RP4. Die Anwesenheit dieses Plasmides unterdrückt die Produktion des Muteins in den Zellen durch Produktion des lac-Repressor-Proteins. Dieses kann die Transkription vom tac-Promotor aus reprimieren.As a vector for Pseudomonas putida, a derivative of the plasmid pRSF 1010 is used which additionally contains a kanamycin resistance gene from pACYC 177. This vector is called pREM 3061 (DSM 3692 P). This plasmid is linearized by using the restriction enzyme Hpa I. From the vector pePa 129 prepared according to 1 a), an approximately 1.45 kb fragment is obtained by Xho II cleavage, which contains the tac promoter and the complete mutein gene sequence. By treatment with Klenow fragment, in the presence of all four deoxynucleoside triphosphates, the Xho !! sites are completely filled. The fragment thus treated is ligated with the linearized vector pREM 3061 and transformed into E. coli cells (DSM 3689). Transformants are selected on medium containing 25 μg / ml kanamycin. Transformants containing the plasmid pePa 143 are selected. This plasmid differs * from the starting vector pREM 3061 in that it contains the complete tac promoter mutein gene sequence. This plasmid is isolated and introduced by transformation into cells of the strain Pseudomonas putida, DSM 2106. Transformants are selected on medium containing 25 μg / ml kanamycin and subsequently analyzed. They contain the plasmid pePa 143. In addition, into these transformant cells also by transformation a plasmid pePa 119 (DSM 3691 P) can be introduced which is compatible with pePa 143 and contains the Iac I q gene. This plasmid is a derivative of plasmid RP4. The presence of this plasmid suppresses production of the mutein in the cells by production of the lac repressor protein. This can repress transcription from the tac promoter.
Expression von intaktem t-PA in E.coli mit high-copy-Vektoren mit starkem Promoter Verwendet wird ein Derivat von E.coli K-12, dereine Mutation im Iac--Gen besitzt und die lac-Permease nicht produzieren kann.Expression of intact t-PA in E. coli with high-copy high-copy vectors A derivative of E. coli K-12 which has a mutation in the lac gene and can not produce the lac-permease is used.
Der Stamm ist ED 8654(DSM 2102) oder C600 (DSM 2093). Von diesem Stamm können Varianten hergestellt werden, die lac-Repressor überproduzieren (siehe 1a) indem sie mit pePa 119(DSM 3691 P) transformiert werden. Transformiert man zudem in diese so erhaltenen Bakterien das Plasmid pePa 98.1 (siehe 1 a) erhält man Bakterien, die lac-Repressor überproduzieren und hier t-PA synthetisieren.The strain is ED 8654 (DSM 2102) or C600 (DSM 2093). Variants can be made from this strain that overproduce the lac repressor (see Figure 1a) by transforming with pePa 119 (DSM 3691P). If, in addition, the plasmid pePa 98.1 (see FIG. 1 a) is transformed into bacteria thus obtained, bacteria which overproduce the lac repressor and synthesize t-PA here.
Man züchtet diese Bakterien wie unter 2 a beschrieben in Nährbouillon bei 37°C unter Belüftung.Cultivate these bacteria as described under 2 a in nutrient broth at 37 ° C with aeration.
a) Bei Erreichen von Od550 = 0,4 wird 0,2% Lactose zum Medium hinzugefügt und die Bebrütung für 4 Stunden fortgesetzt. Durch das Fehlen von lac-Permease erfolgt nur eine langsame Aufnahme der Lactose in die Zellen. Wie unter Beispiel 2 a beschrieben, werden anschließend die Zellen geerntet, aufgeschlossen, die t-PA-Fraktion gewonnen und im SDS-Polyacrylamidgel analysiert.a) When Od 550 = 0.4 is reached, 0.2% lactose is added to the medium and incubation continued for 4 hours. Due to the absence of lac permease, only a slow uptake of lactose into the cells takes place. As described in Example 2 a, the cells are then harvested, digested, the t-PA fraction obtained and analyzed in SDS-polyacrylamide gel.
Man erhält qualitativ und quantitativ die gleichen Ergebnisse für die t-PA-Produktion wie für Extrakte aus vollinduzierten low-copy-Vektoren aus Beispiel 2.The same results are obtained qualitatively and quantitatively for the t-PA production as for extracts from fully induced low-copy vectors from Example 2.
b) Desgleichen kann durch Zusatz von geringen Mengen IPTG zu diesem Zeitpunkt eine entsprechend geringe Induktionsrate für t-PA-Expression erreicht werden. Mit Mengen von 0,05 bis 5 mM IPTG und darüber gelingt eine vollständige Induktion, während mit Mengen zwischen 0,002 und 0,01 mM eine entsprechend niedrigere Induktion erreicht wird. Diese geringe Induktion führt zum qualitativ und quantitativ gleichen Ergebnis wie die volle Induktion von low-copy-Vektoren aus Beispielb) Similarly, by adding small amounts of IPTG at this time, a correspondingly low induction rate for t-PA expression can be achieved. With amounts of 0.05 to 5 mM IPTG and above, a complete induction is achieved, while with amounts between 0.002 and 0.01 mM a correspondingly lower induction is achieved. This low induction leads to the same qualitative and quantitative result as the full induction of low-copy vectors from Example
c) Verwendet man Promotoren mit geringerer Effizienz als tac, kann bei voller Induktion eine entsprechend höhere Kopienzahl des Vektors erlaubt werden. Die Promoterstärke kann umgekehrt proportional der Kopienzahl gewählt werden oder die Nutzung des Promoters muß durch entsprechend niedrige Induktion eingeschränkt werden.c) If one uses promoters with lower efficiency than tac, with full induction a correspondingly higher copy number of the vector can be allowed. The promoter strength can be chosen inversely proportional to the copy number or the use of the promoter must be limited by correspondingly low induction.
Der durch Limitierung der Kopienzahl des Expressionsvektors erreichbare Effekt, daß keine t-PA Bruchstücke produziert werden, kann auch auf folgende Weise erreicht werden: .The effect achievable by limiting the copy number of the expression vector so that no t-PA fragments are produced can also be achieved in the following way:.
Verwendet man einen high-copy-Expressionsvektor mit starkem Promoter (tac) in einem Stamm mit Lac-Repressorüberproduktion (Iac lq), so muß durch Zugabe von Induktor (IPTG, Lactose o. ä.) die t-PA-Synthese induziert werden.If a high-copy expression vector with strong promoter (tac) is used in a strain with lac repressor overproduction (lac 1 q ), the addition of inducer (IPTG, lactose or the like) must induce t-PA synthesis ,
Dies gelingt mit Mengen von 0,5 bis 5mM IPTG im Medium vollständig. Verwendet man hingegen Iow-copy-Vektoren im gleichen System (tac-Promoter, Iac lq) beobachtet man zwar die Bildung von refractile bodies, aber keine Inkorporation von Bruchstücken des t-PA in den refractile bodies bei gleicher IPTG-Mengenzugabe.This succeeds completely with amounts of 0.5 to 5 mM IPTG in the medium. If, on the other hand, Iow-copy vectors are used in the same system (tac promoter, lac q ), the formation of refractile bodies is observed, but no incorporation of fragments of t-PA into the refractile bodies with the same amount of IPTG added.
Verringert man die IPTG-Zugabe bei high-copy-Vektoren auf 0,01 mM, erhält man die gleichen reinen refractile bodies wie im Iow-copy-System bei voller IPTG-Induktion. Dieser Effekt sollte mit schlechteren Promotern als tac analog erreicht werden. Die Kopienzahl des Vektors kann um den Wert gesteigert werden, um den der Promoter wenig effizient ist als der tac-Promoter. D. h.Decreasing the IPTG addition to 0.01mM for high-copy vectors gives the same pure refractile bodies as in the Iow-copy system with full IPTG induction. This effect should be achieved analogously with worse promoters than tac. The copy number of the vector can be increased by the value by which the promoter is less efficient than the tac promoter. Ie.
bei Vio Promotereffizienz mögliche Erhöhung der Plasmidkopienzahl um den Faktor 10 gegenüber den verwendeten low-copy Plasmiden.at Vio promoter efficiency possible increase of the plasmid copy number by a factor of 10 compared to the low-copy plasmids used.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Iow-copy-Systems mit starkem Promoter ist in der leichteren Handhabbarkeit des Systems in der Fermentation zu finden. Hier ist die Induktion weniger aufwendig durchführbar, da die Menge Induktor nicht durch Regelung scharf kontrolliert werden muß, sondern wie beschrieben, ein Eintopf-System funktioniert. Auch ist diese Induktion über das lac-System einer Steuerung über das typ-System vorzuziehen, da durch Lactose-Einsatz das Wachstum der Zellen mitgesteuert werden kann, was bei dertyp-Verarmungstechnik (Genentech) weniger einfach möglich ist.The advantage of the Iow-copy system according to the invention with a strong promoter can be found in the easier handling of the system in the fermentation. Here, the induction is less expensive feasible, since the amount of inductor does not have to be controlled by control sharp, but as described, a one-pot system works. Also, this induction via the lac system is preferable to control over the type system, since by lactose use, the growth of the cells can be mitgesteuert, which is less easily possible in the type depletion technique (Genentech).
21 SerTrpLeuArqProValLeuArqSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGly' 4 0 61 TCATGGCTGCGCCCTGTGCTCAGÄAGCAACCGGGTGGAATATTGCTGGTGCAACAGTGGC 12021 SerTrpLeuArqProValLeuArqSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGly '4 0 61 TCATGGCTGCGCCCTGTGCTCAGÄAGCAACCGGGTGGAATATTGCTGGTGCAACAGTGGC 120
41 ArqAlaGlnCysHisCysTyrPheGlyAsnGlySerAlaTyrArgGlyThr-HisSer-Leu 6041 ArqAlaGlnCysHisCysTyrPheGlyAsnGlySerAlaTyrArgGlyThr-HisSer-Leu 60
121 AGGGCACAGTGCCACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTC 1 SO121 AGGGCACAGTGCCACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTC 1 SO
X- * -X- * -X- X- X- * -X- * -X- X-
61 ThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsnSerMetlleLeuIleGlyLysValTyr 8 061 ThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsnSerMetlleLeuIleGlyLysValTyr 8 0
181 ACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTAC 240 •χ- χ * χ- , χ- -χ-181 ACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTAC 240 • χ- χ * χ-, χ- χ-
81 ThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArqAsn 10 0 241 ACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAAT 30 081 ThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArqAsn 10 0 241 ACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAAT 30 0
101 ProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGlu 120101 ProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGlu 120
301 CCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAG 360301 CCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAG 360
-X- X- * X ' X- X--X- X- * X ' X- X-
121 TyrCysAspValProSerCysSerThrCysGlyLeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPhe 140121 TyrCysAspValProSerCysSerThrCysGlyLeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPhe 140
361 TACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTT 42 0361 TACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTT 42 0
141 ArglleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlallePhe 160 .421 CGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTT 480141 ArglleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlallePhe 160 .421 CGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTT 480
* X -X- X- X- X-* X -X- X- X- X-
161 AlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlylleLeuIleSerSer 180161 AlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlylleLeuIleSerSer 180
481 GCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCC 540481 GCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCC 540
181 CysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeuThr 20 0181 CysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeuThr 20 0
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X- X- X- * -X- X- X- X- X- * -X- X-
201 UaineLeuGlyAi-gThrTyrArgVaiyalProGlyGluGluGluGlnLysPheGluVal 220201 UaineLeuGlyAi-gThrTyrArgVaiyalProGlyGluGluGluGln lysPheGluVal 220
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X X -X- X- X XX X -X- X-X X
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381 ThrftcnTurl pnStnTrn11 pnpn A^dAsnMetAroPrο 400381 ThrftcnTurl pnStnTrn11 pnpn A ^ dAsnMetAroP to 400
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