DD260292A1

DD260292A1 - PROCESS FOR THE ISOLATION AND PURIFICATION OF BETA LACTAMASES

Info

Publication number: DD260292A1
Application number: DD30227187A
Authority: DD
Inventors: Manfred Kuehn; Guenter Kettner
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-04-30
Filing date: 1987-04-30
Publication date: 1988-09-21

Abstract

Erfindungsgemäß werden beta-Lactamasen enthaltende Lösungen mit wasserunlöslichen, makroporösen Trägern im Batch- oder Kolonnenverfahren in Kontakt gebracht. Die makroporösen Träger setzen sich aus einem anorganischen, organischen oder geeigneten bioorganischen Trägermaterial und einen bioaffinen Liganden zusammen. Die am Träger mit dem bioaffinen Liganden gebundenen beta-Lactamasen werden durch Elition freigesetzt. Durch Dialyse und Lyophilisation können die beta-Lactamasen mit erhöhter spezifischer Aktivität in fester und stabiler Form gewonnen werden.{Isolierung, Reinigung, Affinitätschromatographie, beta-Lactamasen, makroporöse Träger, bioaffine Liganden, Elution}According to the invention, solutions containing beta-lactamases are brought into contact with water-insoluble, macroporous carriers in a batch or column process. The macroporous carriers are composed of an inorganic, organic or suitable bioorganic carrier material and a bioaffinity ligand. The beta-lactamases bound to the carrier with the bioaffinity ligand are released by elution. By dialysis and lyophilization, the beta-lactamases with increased specific activity can be obtained in solid and stable form {isolation, purification, affinity chromatography, beta-lactamases, macroporous carriers, bioaffine ligands, elution}

Description

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein affinitätschromatographisches Verfahren zur Isolierung und Reindarstellung von ß-Lactamasen bereitzustellen, das die Nachteile der bisher beschriebenen chromatographischen Methoden nicht besitzt.The object of the invention is to provide an affinity chromatographic method for the isolation and purification of β-lactamases which does not possess the disadvantages of the previously described chromatographic methods.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Anwendung von unterschiedlichstem Trägermaterial mit leicht zugänglichen biospezifischen Liganden ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von ß-Lactamasen zu entwickeln.The invention has for its object to develop a method for the isolation and purification of ß-lactamases using a variety of carrier material with readily available biospecific ligands.

Erfindungsgemäß werden ß-Lactamasen enthaltende Lösungen mit wasserunlöslichen, makroporösen Trägern der allgemeinen StrukturAccording to the invention, solutions containing β-lactamases with water-insoluble, macroporous supports of the general structure

A-3-NH-CH-CM,-A-3-NH-CH-CM, -

COOHCOOH

im Batch- oder Kolonnenverfahren bei Temperaturen von 2°C-30°C und bei einem pH-Wert im Bereich 6,0-7,5 in Kontakt gebracht.brought into contact in a batch or column process at temperatures of 2 ° C-30 ° C and at a pH in the range 6.0-7.5.

Asteht für das Trägerskelett eines unlöslichen und makroporösen Trägers auf der Basis eines anorganischen, organischen oder geeigneten bioorganischen Trägermaterials, B für eine Kettenverlängerung aus einer Alkyl- oder Alkoxyalkylkette mit darin eingebauten Heteroaromaten und der Rest der Struktur für den bioaffinen Liganden für die ß-Lactamasen in einer Konzentration von 10 μιηοΙ-1,5 mmol pro Gramm trockenen Träger. Anschließend werden die am Trägermaterial mit dem bioaffinen Liganden gebundenen ß-Lactamasen durch Elution mit Salz- oder Pufferlösungen oder Gemischen beider Lösungen vom pH-Wert 6,0-7,5 und einer Konzentration von 10~³mol/l-3mol/l freigesetzt.A stands for the carrier skeleton of an insoluble and macroporous carrier based on an inorganic, organic or suitable bioorganic carrier material, B for chain extension of an alkyl or alkoxyalkyl chain with heteroaromatics incorporated therein and the remainder of the structure for the bioaffinity ligand for the β-lactamases a concentration of 10 μιηοΙ-1.5 mmol per gram of dry carrier. Subsequently, the β-lactamases bound to the carrier material with the bioaffinity ligand are liberated by elution with salt or buffer solutions or mixtures of both solutions of pH 6.0-7.5 and a concentration of 10 ^-3 mol / l- ³ mol / l ,

Besonders bewährt haben sich die beschriebenen Sorbentien aber zur Höchstreinigung kommerziell erhältlicher ß-Lactamasepräparate mit geringerer enzymatischer Aktivität. Zu diesem Zweck werden die ß-Lactamasepräparate in Salz- oder Pufferlösungen niedriger lonenstärke (10~³-10~⁵mol/l) gelöst, gegebenenfalls gegen die gleichen Lösungen dialysiert, und die Enzymlösungen werden mit dem bioaffinen Träger in Kontakt gebracht. Die Sorption und Desorption kann sowohl in Kolonnen als auch nachdem Batchverfahren in pH-Bereichen um den Neutralpunkt durchgeführt werden. Nach der Sorption der ß-Lactamasen werden die Sorbentien zum Entfernen von Fremdstoffen gewaschen, und ihre Desorption erfolgt im nächsten Schritt in einfacher Weise durch Erhöhung der lonenstärke in den Elutionslösungen. Dabei empfiehlt es sich, die Elution der ß-Lactamasen in Gegenwart von Stabilisierungsmitteln vorzunehmen, die in Abhängigkeit von der Art der zu isolierenden ß-Lactamase Metallionen wie Zn²⁺ oder SH-Reagentien sein sollten. Aus den Elutionslösungen gewinnt man die ß-Lactamasen nach bekannten Verfahren, z. B. durch Aussalzen oder Ultrafiltration und sich anschließender Lyophilisierung. Da die zur Immunobilisierung angewandten Methoden zu einer festen Bindung zwischen dem bioaffinen Liganden und dem porösen Trägermaterial führen, besteht die Möglichkeit der mehrfachen Sorption und Desorption der ß-Lactamasen. Die erfindungsgemäß eingesetzten bioaffinen Träger zur Isolierung und/oder Reindarstellung von ß-Lactamasen, d. h. die Immobilisierung niedermolekularer bioaffiner Liganden an wasserunlöslichen und makroporösen Trägern, können auf aus der organischen Chemie her bekannten, jedoch aber polymeranalogen Wegen synthetisiert werden. Am einfachsten stellt man sie her durch polymeranaloge Umsetzungen des aminogruppenhaltigen Aminobenzylpenicillins mit alkylierend wirkenden, unlöslichen und makroporösen Trägermaterialien in organischen Lösungsmitteln oder mit aktivierten und gegenüber primären Aminogruppen reaktiven Trägermaterialien mit gleichen chemischen und morphologischen Eigenschaften in wäßrigen Pufferlösungen. Aber auch der Syntheseweg mit alkylierend wirkenden Penicillinderivaten und aminogruppenhaltigen Trägermaterialien kann zur Herstellung oben gezeigter Strukturen gewählt werden.However, the described sorbents have proven particularly useful for the maximum purification of commercially available β-lactamase preparations with lower enzymatic activity. For this purpose the beta-Lactamasepräparate low ionic strength in salt or buffer solutions (10 ^-3 -10 ^-5 mol / l) are dissolved, optionally dialyzed against the same solution and the enzyme solutions are brought into contact with the bioaffinity carrier. The sorption and desorption can be carried out in columns as well as after batch processes in pH ranges around the neutral point. After sorption of the β-lactamases, the sorbents are washed to remove impurities, and their desorption is readily accomplished in the next step by increasing the ionic strength in the elution solutions. It is advisable to carry out the elution of the β-lactamases in the presence of stabilizing agents which, depending on the nature of the β-lactamase to be isolated, should be metal ions such as Zn ²⁺ or SH reagents. From the elution solutions, the β-lactamases are recovered by known methods, e.g. B. by salting out or ultrafiltration and subsequent lyophilization. Since the methods used for immunobilization lead to a firm bond between the bioaffinity ligand and the porous carrier material, there is the possibility of multiple sorption and desorption of the β-lactamases. The bioaffinity carriers used according to the invention for the isolation and / or purification of β-lactamases, ie the immobilization of low molecular weight bioaffinity ligands on water-insoluble and macroporous carriers, can be synthesized by methods known from organic chemistry, but which are polymer-analogous. Most easily prepared by polymer analogous reactions of amino-containing Aminobenzylpenicillins with alkylating, insoluble and macroporous carrier materials in organic solvents or with activated and primary amino reactive carrier materials having the same chemical and morphological properties in aqueous buffer solutions. However, the synthetic route with alkylating penicillin derivatives and support materials containing amino groups can also be chosen for the preparation of the structures shown above.

Für die Synthese der bioaffinen Sorbentien haben sich besonders solche Trägermaterialien, deren Trägerskelett A anorganischer Natur ist wie z. B. in den porösen Gläsern oder aber organischer Natur ist wie z. B. in makroporösen Derivaten der Akryl- bzw. Methakrylsäure aber auch bioorganischer Natur wie in der Zellulose in perlförmiger und poröser Form ist, bewährt. Diese Trägermaterialien erfüllen die erhöhten Forderungen für einen praktischen Einsatz hinsichtlich leichter chemischer Modifizierbarkeit, guter hydrodynamischer Eigenschaften und erhöhter Stabilität gegenüber schwankenden pH-Werten und Pufferkapazitäten sowie höheren Temperaturen wesentlich besser als solche Trägermaterialien auf der Basis vernetzter Agarosen oder Dextrane.For the synthesis of bioaffinity sorbents have particularly such support materials whose carrier skeleton A is inorganic in nature such. B. in the porous glasses or organic nature such. B. in macroporous derivatives of the acrylic or methacrylic acid but also bioorganic nature as in the cellulose in beaded and porous form, proven. These support materials meet the increased requirements for practical use in terms of ease of chemical modifiability, good hydrodynamic properties and increased stability to fluctuating pHs and buffer capacities and higher temperatures, much better than those support materials based on crosslinked agaroses or dextrans.

Die Kettenverlängerung B kann unterschiedlichster chemischer Natur sein, besteht im allgemeinen aber aus Alkyl- oder Alkoxyalkylketten mit darin eingebauten Heteroatomen oder Heteroaromaten. die neuartigen und gegenüber ß-Lactamasen affinen Sorbentien besitzen eine hohe Spezifität. Deshalb eignen sie sich zur Isolierung und Reinigung von ß-Lactamasen aus Lösungen unterschiedlichster Herkunft.The chain extension B can be of very different chemical nature, but generally consists of alkyl or alkoxyalkyl chains with heteroatoms or heteroaromatics incorporated therein. the novel and β-lactamases affine sorbents have a high specificity. Therefore, they are suitable for the isolation and purification of ß-lactamases from solutions of different origin.

Die Ausbeuten bei dem erfindungsgemäßen chromatographischen Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von ß-Lactamasen betragen 60%^-75%, und die Aktivitäten steigen in Abhängigkeit von der Art und Reinheit der Ausgangsmaterialien um den Faktor 10-100The yields in the chromatographic process of the present invention for isolating or purifying β-lactamases are 60% -75%, and the activities increase by a factor of 10-100, depending on the kind and purity of the starting materials

Anschließend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert. Subsequently, the invention will be explained in more detail by examples.

-ό- £Λ3Μ £.73C-ό- £ Λ3Μ £ .73C

example 1

5g eines nach der DD-PS 157340 mitToluensulfochlorid modifizierten porösen Kopolymeren aus Hydroxyäthylmethacrylat-co-Äthylendimethacrylat werden in 25 ml frisch destilliertem Dimethylformamid 12 Stunden gequollen, und danach wird die restliche Luft durch Anlegen eines Vakuums aus den Poren des Trägers entfernt. Zu der Suspension werden 300 mg • Aminobenzylpenicillin addiert, und unter Rühren mit geringen Umdrehungszahlen wird die Suspension 24 Stunden bei 30⁰C aufbewahrt. Danach wird der Träger von der Lösung abgetrennt, sorgfältig mit 50 ml Dimethylformamid und ausreichend viel Wasser gewaschen. Das Sorbent enthält 0,36mMol kovalent gebundenen bioaffinen Liganden pro Gramm trockenen Träger. Das noch feuchte Sorbent wird in eine Kolonne gefüllt und mit einer Natriumchloridlösung der Konzentration 10~³ mol/l äquilibriert. Danach werden 10ml ß-Lactamaselösung auf die Kolonne aufgetragen, die aus einer Bacillus cereus ß-Lactamase und einer 10~³ mol/l Natriumchloridlösung und nachfolgender Dialyse gegen die gleiche Natriumchloridlösung hergestellt wurde. Diese Enzymlösung enthielt vor dem Auftragen auf die Kolonne eine Enzymaktivität von 2,5 Einheiten pro Milliliter. Der Kolonneninhalt wird mit der genannten Natriumchloridlösung gewaschen, bis die Proteinabsorption in der Lösung bei280nm verschwunden ist. Die ß-Lactamase wird eluiert danach mit einer Lösung, bestehend aus Natriumchlorid (1 mol/l) und Zinksulfat (10"⁵ mol/l). Die Ausbeute auf der Basis der Aktivität betrug 78%, und die Aktivität erhöhte sich um den Faktor 75.5 g of a porous copolymer of hydroxyethyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate modified according to DD-PS 157340 with toluene sulphonyl chloride are swollen in 25 ml of freshly distilled dimethylformamide for 12 hours, after which the remaining air is removed by applying a vacuum from the pores of the support. To the suspension 300 mg • aminobenzylpenicillin are added and under stirring at low rotational speeds, the suspension is kept for 24 hours at 30 ⁰ C. Thereafter, the carrier is separated from the solution, washed thoroughly with 50 ml of dimethylformamide and sufficient water. The sorbent contains 0.36 mmol of covalently bound bioaffinity ligands per gram of dry carrier. The still moist sorbent is filled into a column and equilibrated with a sodium chloride solution of concentration 10 ~ ³ mol / l. Thereafter, 10 ml of β-lactamase solution are applied to the column, which was prepared from a Bacillus cereus β-lactamase and a 10 ^-3 mol / l sodium chloride solution and subsequent dialysis against the same sodium chloride solution. This enzyme solution contained an enzyme activity of 2.5 units per milliliter prior to application to the column. The contents of the column are washed with the said sodium chloride solution until the protein absorption in the solution at 280 nm has disappeared. The ß-lactamase is then eluted with a solution consisting of sodium chloride (1 mol / l) and zinc sulphate (10 ^"5 mol / l). The yield on the basis of the activity was 78%, and the activity increased by a factor of 75th

Example 2

5g nach Literaturvorschriften mit Aminopropyltriäthoxysilan silanisiertes poröses Glas werden in einem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit Glutaraldehyd aktiviert. Der Träger wird mit dem gleichen Puffer zur Entfernung überschüssigen Glutaraldehyds sorgfältig gewaschen. 300mg-Aminobenzylpenicillin werden in Phosphatpuffer (10ml, pH7,0,10~² mol/l) gelöst, und die Lösung wird zum aktivierten, porösen Glas addiert. Die Suspension wird 12 Stunden im Dunkeln bei 4°C geschüttelt. Der Träger wird abgetrennt, gewaschen mit destilliertem Wasser, in eine Kolonne gefüllt und mit einer 10~³ mol/l Natriumchloridlösung äquilibriert. 25mg ß-Lactamasepulver, isoliert aus Bacillus subtillis-Kulturlösung, mit einer spezifischen Aktivität von 0,04 Einheiten pro Milligramm Protein werden in 10ml Natriumchloridlösung (10~³ mol/l) gelöst und gegen die gleiche Natriumchloridlösung dialysiert. Diese Lösung wird filtriert und zu dem bioaffinen Träger in einem verschließbaren Gefäß addiert. Die Suspension wird 12 Stunden bei 4°C geschüttelt, und der Träger wird danach auf einer Fritte abgetrennt und proteinfrei gewaschen. Die Elution und Isolierung der ß-Lactamase erfolgt durch Eintragen des Trägers in 1 mol/l Natriumchloridlösung, Sammeln der flüssigen Phase und Aufarbeiten durch Ultrafiltration und Lyophilisation. Nach diesem Verfahren werden 1,2mg Protein mit einer spezifischen Aktivität von 32 Einheiten pro Milligramm Protein gewonnen.5 g according to literature procedures with aminopropyltriethoxysilane silanized porous glass are activated in a phosphate buffer of pH 7.0 with glutaraldehyde. The support is washed thoroughly with the same buffer to remove excess glutaraldehyde. 300 mg Aminobenzylpenicillin are dissolved in phosphate buffer (10 ml, pH7.0, 10 ~ ² mol / l) and the solution is added to the activated, porous glass. The suspension is shaken for 12 hours in the dark at 4 ° C. The carrier is separated, washed with distilled water, placed in a column and equilibrated with a 10 ~ ³ mol / l sodium chloride solution. Twenty-five mg of β-lactamase powder isolated from Bacillus subtillis broth, having a specific activity of 0.04 units per milligram of protein, are dissolved in 10 ml of sodium chloride solution (10 ^-3 mol / l) and dialyzed against the same sodium chloride solution. This solution is filtered and added to the bioaffine carrier in a sealable vessel. The suspension is shaken for 12 hours at 4 ° C, and the carrier is then separated on a frit and washed protein-free. The elution and isolation of the β-lactamase is carried out by introducing the carrier in 1 mol / l sodium chloride solution, collecting the liquid phase and working up by ultrafiltration and lyophilization. According to this method, 1.2 mg of protein with a specific activity of 32 units per milligram of protein are obtained.

Claims

Process for the isolation and purification of β-lactamases by affinity chromatography, characterized in that insoluble and macroporous carriers of the structure

wherein A is the carrier skeleton of an insoluble and macroporous carrier based on an inorganic, organic or suitable biorganischen carrier material, B for a chain extension of an alkyl or alkoxyalkyl chain with heteroaromatic or heteroaromatic incorporated therein and the rest of the structure for the bioaffinity ligand for the ß-lactamases in a concentration of 10μητιοΙ-1,5ιτιιτιοΙ per gram of dry carrier in a batch or column process at temperatures of 2 ° C-30 ° C with ß-lactamases containing salt or buffer solutions or mixtures of both solutions with a concentration of 10 ~ ³ -10 ~ ⁵ mol / l and a pH in the range of 6.0-7.5 are brought into contact and then bound to the carrier material with the bioaffinity ligand ß-lactamases by elution with salt or buffer solutions or mixtures Both solutions of pH 6.0-7.5 and a concentration of 10 ~ ³ mol / l-3mol / l are released.

Field of application of the invention

The invention relates to a process for the isolation and purification of β-lactamases. Applications include medicine, analytical chemistry, enzyme manufacturing and biochemistry.

Characteristic of the known state of the art

The β-lactamases (EC 3.5.2.6 and EC 3.5.2.8) - also called penicillinases - are enzymes which have acquired particular importance in recent years for the development of biosensors (FW Scheller et al., In "Biosensors", 1 [1985 With the help of such biosensors, penicillin can be quantitatively determined in food or feed or fermentation solutions, and this enzyme is the subject of intensive basic research in the investigation of the resistance phenomena of various antibiotics such as penicillins or cephalosporins These applications are called for enzyme preparations of high degree of purification and high specific enzyme activity.

As sources for the isolation of the β-lactamases for practical purposes are primarily microorganisms in question. And for the recovery and purification of these enzymes various methods have been described in the literature (Methods in Enzymology, Vol.43 [1975], 640-698), which include mainly precipitation reactions and / or chromatographic steps. However, enzyme preparations with comparatively low enzyme activities and also with undesired secondary enzymatic activities (e.g., proteolytic) are obtained.

One of the most effective chromatographic methods for the purest representation of biologically active preparations is currently the affinity chromatography, which is now also developed so far that with their help insulation and purification steps on an industrial scale are feasible. This method relies in its main applications on enzymes, on the highly specific and reversible interactions of the enzymes with their immobilized inhibitors or coenzymes, but in some special cases also with their substrates and their products formed during the enzyme reaction. Such affinity chromatographic methods for isolating and representing the β-lactamases in pure form are described in the literature (S.J. Cartwright, S. G. Waley, in Biochem J.221 [1984] 505-512). These methods are based on the biospecific binding of the β-lactamases to phenylboronic acid-modified agarose. However, a broad application of this purification process is made very difficult because the starting materials for the preparation of this biospecific sorbent are not generally accessible or difficult to prepare. However, the bioorganic carrier material for the covalent binding of the biospecific ligand also has a number of disadvantages, such as no optimal hydrodynamic properties, especially at elevated pressures or reduced stability to fluctuating pH values and buffer capacities or to higher temperatures and organic solvents.