DE68902392T2

DE68902392T2 - POLYETHYLENIMINE MATERIALS FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY.

Info

Publication number: DE68902392T2
Application number: DE1989602392
Authority: DE
Inventors: Laura J Crane; Sunil V Kakodkar
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 1989-06-20
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2009-06-21
Also published as: DE68902392D1; ATE79053T1

Description

Diese Erfindung fällt in das Gebiet der Affinitäts-Chromatographie und der immoblisierten Enzyme und Affinitätsmatrizen zur Verwendung in der Affinitäts-Chromatographie.This invention falls within the field of affinity chromatography and immobilized enzymes and affinity matrices for use in affinity chromatography.

BACKGROUND OF THE INVENTION

Affinititäts-Chromatographie ist eine Trennungs- und Reinigungstechnik, welche auf einer einzigartigen und fundamentalen biologischen Eigenschaft von biologischen Molekülen basiert, nämlich ihrer selektiven, spezifischen, affinititätsabhängigen Wiedererkennung und einer reversiblen molekularen Wechselwirkung mit anderen Molekülen. Die meisten biologischen Makromoleküle besitzen ein Substrat oder eine funktionelle Bindungsstelle für einen spezifischen Liganden oder ein Effektormolekül, welches selbst ein anderes Protein sein kann.Affinity chromatography is a separation and purification technique based on a unique and fundamental biological property of biological molecules, namely their selective, specific, affinity-dependent recognition and reversible molecular interaction with other molecules. Most biological macromolecules possess a substrate or a functional binding site for a specific ligand or an effector molecule, which itself may be another protein.

Im allgemeinen ist ein spezifischer Ligand an eine feste Trägermatrix gebunden. Eine Probe, welche das biologische Molekül enthält, welches sich spezifisch an den immoblisierten Liganden bindet (absorbiert), wird in Kontakt mit dem immobilisierten Liganden gebracht. Nachdem unabsorbierte und verunreinigende Moleküle entfernt wurden, wird das spezifisch gebundene Molekül von dem festen Träger eluiert, indem die Wechselwirkung zwischen dem spezifisch gebundenen Molekül und dem Liganden durch ein oder mehrere Verfahren zerstört wird, wie beispielsweise durch Ändern der Ionenstärke oder des pH der Elutionspuffer.Generally, a specific ligand is bound to a solid support matrix. A sample containing the biological molecule that specifically binds (absorbs) to the immobilized ligand is brought into contact with the immobilized ligand. After unabsorbed and contaminating molecules are removed, the specifically bound molecule is eluted from the solid support by disrupting the interaction between the specifically bound molecule and the ligand by one or more methods, such as changing the ionic strength or pH of the elution buffers.

In diesem Verfahren können immobilisierte Wirkstoffe, Vitamine, Peptide, Hormone und ähnliche verwendet werden, um entsprechende Rezeptoren oder Transportproteine zu isolieren. Immobilisierte Proteine können zum Isolieren von anderen komplementären oder wechselwirkenden Proteinen dienen. Analog kann ein derartiges Verfahren verwendet werden, um aus Einzelteilchen bestehende biologische Proben, wie Zellmembranen und auch intakte Zellen, welche spezifische Rezeptoren tragen, zu trennen. Die Verwendung eines derartigen Verfahrens ist für die Reinigung von Polynukleotiden, Antigenen, Antikörpern, Viren, Enzymen und ähnlichen verwendbar. Zusätzlich können derartige feste Affinitätsträgermatrizen für die Immobilisierung von Enzymen zur Verwendung in Reaktionen als Katalysatoren und dgl. verwendet werden.In this method, immobilized drugs, vitamins, peptides, hormones and the like can be used to isolate corresponding receptors or transport proteins. Immobilized proteins can be used to isolate other complementary or interacting proteins. Analogously, such a method can be used to isolate biological samples consisting of individual particles, such as cell membranes and to separate intact cells carrying specific receptors. The use of such a method is applicable for the purification of polynucleotides, antigens, antibodies, viruses, enzymes and the like. In addition, such solid affinity support matrices can be used for the immobilization of enzymes for use in reactions as catalysts and the like.

Bis dato besaßen die am meisten verwendeten festen Matrizen für die Affinitäts-Chromatographie Matrizen auf der Basis von Polysacchariden, wie beispielsweise Agarose, Zellulose und quervernetztem Dextrin obwohl quervernetzte Polyacrylamide und Siliziumdioxid oder poröse Glaskugeln ebenfalls verwendet wurden.To date, the most commonly used solid matrices for affinity chromatography have been matrices based on polysaccharides such as agarose, cellulose and cross-linked dextrin, although cross-linked polyacrylamides and silica or porous glass beads have also been used.

Jedoch wird mit den meisten derartigen festen Matrizen, insbesondere mit den festen Matrizen auf der Basis von Siliziumdioxid das feste Basismaterial nicht ausreichend von den Molekülen der interessierenden biologischen Probe abgeschirmt mit dem Ergebnis, daß eine nicht spezifische Bindung in der Art der Absorption mit Materialien, welche anders als der spezifische Bindungspartner des immobilisierten Liganden sind, auftritt. Bei den festen Matrizen auf der Basis von Siliziumdioxid wurden bis dato starke Wasserstoffbindungen verwendet und es tritt eine Absorption an den Silanolgruppen auf und dies stört das Verfahren. Darüber hinaus bewirken die wässrigen Lösungen, welche bei Proteinen oder anderen interessierenden biologischen Materialien angewandt werden müssen, unerwünschte Hydrolyse der Siliziumdioxidmatrizen, laugen unerwünschtes Material aus den Matrizen aus und ergeben instabile Matrizen.However, with most such solid matrices, especially with the solid matrices based on silica, the solid base material is not adequately shielded from the molecules of the biological sample of interest, with the result that non-specific binding occurs in the manner of absorption with materials other than the specific binding partner of the immobilized ligand. With the solid matrices based on silica to date, strong hydrogen bonds have been used and absorption at the silanol groups occurs and this interferes with the process. In addition, the aqueous solutions that must be used with proteins or other biological materials of interest cause undesirable hydrolysis of the silica matrices, leaching undesirable material from the matrices and resulting in unstable matrices.

Die bis dato verwendeten festen Trägermatrizen, welche in der Affinitäts-Chromatographie angewandt wurden, konnte man nur 200 bis 300 Stunden in wässrigen Lösungen und noch weniger in sauren und alkalischen pH-Umgebungen anwenden. Weiters konnten derartige Matrizen nach dem Stand der Technik keiner Aussetzung einer 0,1-molaren NaOH standhalten.The solid support matrices used to date in affinity chromatography could only be used for 200 to 300 hours in aqueous solutions and even less in acidic and alkaline pH environments. According to the state of the art, such matrices cannot withstand exposure to 0.1 molar NaOH.

Folglich wurde die Entwicklung der Affinitäts-Chromatographie in einem großen Umfang durch diese Nachteile der gegenwärtig verwendeten festen Trägermatrizen behindert, insbesondere aufgrund der Absorption von nicht spezifischen Materialien und der Instabilität der Matrizen.Consequently, the development of affinity chromatography has been hampered to a large extent by these disadvantages of the currently used solid support matrices, in particular due to the absorption of non-specific materials and the instability of the matrices.

Es ist daher wünschenswert, daß feste Trägermatrizen für die Affinitäts-Chromatographie zur Verfügung gestellt werden können, welche das Risiko von nicht spezifischen Bindungen eliminieren oder wenigstens wesentlich reduzieren und welche unter einer Vielzahl von pH-Bedingungen und in wässrigen Lösungen stabil sind.It is therefore desirable to be able to provide solid support matrices for affinity chromatography which eliminate or at least substantially reduce the risk of non-specific binding and which are stable under a wide range of pH conditions and in aqueous solutions.

SUMMARY OF THE INVENTION

Es wurde nun gefunden, daß Festphasenträger auf der Basis von kovalent gebundenem, nicht quervernetzten Polyethyleniminkieselgel Affinitäts-Chromatographiematrizen zur Verfügung stellen, welche von einer stark erhöhten Stabilität in wässriger, saurer und alkalischer Umgebung sind und welche die Absorption von nicht spezifischen Molekülen wesentlich reduzieren oder nahezu eliminieren. Die festen Träger auf der Basis von kovalent gebundenem, nicht quervernetzten Polyethyleniminkieselgel, die angewandt werden, um die Affinitiäts- Chromatographiematrizen dieser Erfindung zu ergeben, sind die Reaktionsprodukte von Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan mit teilchenförmigen Kieselgel oder teilchenförmigem, kontrollierten Porenglas und werden durch die FormelIt has now been discovered that solid phase supports based on covalently bonded, non-cross-linked polyethyleneimine silica gel provide affinity chromatography matrices which are of greatly increased stability in aqueous, acidic and alkaline environments and which substantially reduce or virtually eliminate the absorption of non-specific molecules. The solid supports based on covalently bonded, non-cross-linked polyethyleneimine silica gel which are used to provide the affinity chromatography matrices of this invention are the reaction products of polyethyleneiminopropyltrimethoxysilane with particulate silica gel or particulate controlled pore glass and are represented by the formula

Silica-PrSi-PEISilica-PrSi-PEI

bezeichnet.designated.

Der Ausdruck Silica-PrSi-PEI, wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet die kovalent gebundenen, nicht quervernetzten Polyethyleniminfestphasenträger, welche das Reaktionsprodukt von (1) entweder a) teilchenförmigem Kieselgel, welches einen mittleren Teilchendurchmesser von 1 bis 200, vorzugsweise 3 bis 70 um und eine mittlere Porengröße von 0 bis 100 nm 0 bis 1000 Å), vorzugsweise 5 bis 100 nm (50 bis 1000 Å) aufweist, oder b) teilchenförmiges kontrolliertes Porenglas, welches einen mittleren Teilchendurchmesser von etwa 1 bis 200 um und eine mittlere Porengröße von 0 bis 100 nm (0 bis 1000 Å), vorzugsweise 4 bis 100 nm (40 bis 1000 Å), aufweist, mit (2) Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan, welches ein mittleres Molekulargewicht von 400 bis 1800 aufweist, oder des schwach sauren carboxylierten Produktes davon mit einem zweibasigen Säureanhydrid, wobei das carboxylierte Produkt 0,3 bis 1,2 Carboxyl Milliäquivalente pro Gramm aufweist. Derartige Silica-PrSi-PEI-Produkte, ihre carboxylierten Derivate und ihre Herstellung sind in der US- PS 45 40 486 von Hugh Ramsden, ausgegeben am 10.September 1985, beschrieben und beansprucht. Derartige Produkte sind gegenwärtig von J.T.Baker Inc. als BAKERBOND Säulenchromatographiematrizen erhältlich.The term Silica-PrSi-PEI as used in the present invention means the covalently bonded, non-crosslinked polyethyleneimine solid phase supports which the reaction product of (1) either a) particulate silica gel having an average particle diameter of 1 to 200, preferably 3 to 70 µm and an average pore size of 0 to 100 nm (0 to 1000 Å), preferably 5 to 100 nm (50 to 1000 Å), or b) particulate controlled pore glass having an average particle diameter of about 1 to 200 µm and an average pore size of 0 to 100 nm (0 to 1000 Å), preferably 4 to 100 nm (40 to 1000 Å), with (2) polyethyleneiminopropyltrimethoxysilane having an average molecular weight of 400 to 1800, or the weakly acidic carboxylated product thereof with a dibasic acid anhydride, wherein the carboxylated product contains 0.3 to 1.2 carboxyl milliequivalents per gram. Such silica-PrSi-PEI products, their carboxylated derivatives and their preparation are described and claimed in U.S. Patent No. 4,540,486 to Hugh Ramsden, issued September 10, 1985. Such products are currently available from JTBaker Inc. as BAKERBOND column chromatography matrices.

Die Affinitäts-Chromatographiematrizen dieser Erfindung sind derivatisierte Silica-PrSi-PEI-Matrizen, in welchen die primären und sekundären Aminogruppen des Polyethyleniminrestes mit einem reaktiven Rest umgesetzt werden, welcher fähig ist, kovalente Bindungen mit Liganden unter nicht denaturierenden Bedingungen herzustellen, und welcher unter wässrig-hydrolytischen Pufferbedingungen stabil ist.The affinity chromatography matrices of this invention are derivatized silica-PrSi-PEI matrices in which the primary and secondary amino groups of the polyethyleneimine moiety are reacted with a reactive moiety which is capable of forming covalent bonds with ligands under non-denaturing conditions and which is stable under aqueous hydrolytic buffer conditions.

So können die Affinitäts-Chromatographiematrizen dieser Erfindung durch die allgemeine FormelThus, the affinity chromatography matrices of this invention can be described by the general formula

Silica-PrSi-PEI R)xSilica-PrSi-PEI R)x

dargestellt werden, worin R im Fall des nicht schwach-sauren carboxylierten Träger der Rest von jeder chemisch reaktiven Gruppe ist, welche fähig ist, nukleophile Substitutionen an zwei verschiedenen Stellen einzugehen, so daß R kovalent an die primären oder sekundären Aminogruppen des PEI an einer derartigen Stelle gebunden wird, während die andere Stelle für die folgende nukleophile Substitution unter nicht denaturierenden Bedingungen durch einen Affinitäts-Chromatographie-Liganden frei und reaktiv bleibt, um eine zweite kovalente Bindung zu bilden, welche unter wässrig-hydrolytischen Pufferbedingungen stabil ist, und x eine positive ganze Zahl, welche kleiner oder gleich der Gesamtzahl der primären oder sekundären Aminogruppen in dem PEI-Rest ist, und in dem Fall, daß der schwach-saure carboxylierte Träger R der Rest von jeder chemisch-reaktiven Gruppe ist, welche fähig ist, das Carboxyl Hydroxyl leicht nukleophil umzulagern, um eine kovalente Bindung an dem Carboxyl-Kohlenstoffatom zu bilden und hiebei eine ausreichend elektrophile Stelle auszubilden, so daß sie leicht von dem Carboxyl-Kohlenstoffatom durch eine nukleophile funktionelle Gruppe auf einen Affinitäts-Chromatographieleganden umgelagert werden kann, und x eine positive ganze Zahl, welche kleiner oder gleich der Gesamtzahl der Carboxylgruppen in dem carboxylierten PEI-Rest ist, bedeutet. Als Beispiele für R-Reste von Gruppen, welche mit den primären und sekundären Aminogruppen oder Carboxylgruppen des PEI-Restes reaktiv sind und welche den anderen zuvor aufgezählten Bedingungen genügen, können genannt werden: wherein R, in the case of the non-weakly acidic carboxylated support, is the residue of any chemically reactive group capable of undergoing nucleophilic substitution at two different sites, such that R is covalently bound to the primary or secondary amino groups of the PEI at one such site, while the other site is used for the following nucleophilic substitution under non-denaturing conditions by an affinity chromatography ligand remains free and reactive to form a second covalent bond which is stable under aqueous hydrolytic buffer conditions, and x is a positive integer which is less than or equal to the total number of primary or secondary amino groups in the PEI moiety, and in the case that the weakly acidic carboxylated carrier R is the residue of any chemically reactive group which is capable of readily nucleophilically rearranging the carboxyl hydroxyl to form a covalent bond at the carboxyl carbon atom and thereby forming a sufficiently electrophilic site so that it can be readily rearranged from the carboxyl carbon atom by a nucleophilic functional group to an affinity chromatography ligand, and x is a positive integer which is less than or equal to the total number of carboxyl groups in the carboxylated PEI residue. Examples of R residues of groups which are reactive with the primary and secondary amino groups or carboxyl groups of the PEI residue and which satisfy the other conditions listed above are:

welche von: Glutaraldehyd, Cyanurchlorid, Epichlorhydrin, 1,4- Butandioldiglycidylether, p-Nitrophenylchloroformat, Ethylchloracetat, 1,1'-Carbonyldiimidazol, diazotiertes p-Nitrobenzaldehydfluoborat-Salz und diazotiertes p-Nitrobenzoylchloridflouborat-Salz abgeleitet sind.which are derived from: glutaraldehyde, cyanuric chloride, epichlorohydrin, 1,4-butanediol diglycidyl ether, p-nitrophenyl chloroformate, ethyl chloroacetate, 1,1'-carbonyldiimidazole, diazotized p-nitrobenzaldehyde fluoborate salt and diazotized p-nitrobenzoyl chloride fluoborate salt.

Die Affinitätsmatrizen dieser Erfindung können für die Bindung jedes Liganden, welcher sich kovalent an die Affinitätsmatrix bindet, verwendet werden. Die Affinitätsmatrix ist insbesondere für die Umsetzung mit Liganden, welche reaktive Aminogruppen aufweisen, geeignet, jedoch ist sie auch für die Umsetzung mit Liganden, welche andere reaktive Gruppen enthalten, wie beispielsweise Liganden, welche reaktives Hydroxyl, Sulfhydryl und ähnliche Gruppen enthalten, geeignet. Die Affinitätsmatrizen dieser Erfindung können leicht mit derartigen reaktiven Gruppen eines Proteins, eines Enzyms oder einem anderem derartigen Liganden reagieren, um den Liganden auf der Affinitätsmatrix zu immobilisieren. Als Beispiele von Liganden, welche derartige reaktive Gruppen enthalten, welche an den Affinitätsmatrizen dieser Erfindung durch kovalente Bindung fixiert werden können, können beispielsweise Antigene, Antikörper, Enzyme, Inhibitoren, Cofaktoren, Hormone, Vitamine, Toxine, Wachstumsfaktoren, Glykokonjugate, Lezithine, Nukleinsäuren und Proteine, welche in der Technik bekannt sind und in Parikh, I. et al., Affinity Chromatography, C&EN, 17- 24,32, August 26, 1985 definiert sind, angeführt werden. Die ligandengebundenen Affinitätsmatrizen dieser Erfindung können für die Reinigung oder Abtrennung von Substanzen, wie beispielsweise Proteine aus Lösungen, welche derartige Substanzen enthalten, durch Binden oder Adsorbieren der Substanz in Lösung verwendet werden, wobei die Affinitätsmatrix dieser Erfindung einen Liganden kovalent an die Affinitätsmatrix gebunden besitzt. Unter derartigen abzutrennenden oder zu reinigenden Substanzen können beispielsweise Enzyme, Rezeptoren, Antikörper, Antigene, Nukleinsäuren und ähnliche genannt werden.The affinity matrices of this invention can be used to bind any ligand that covalently binds to the affinity matrix. The affinity matrix is particularly suitable for reacting with ligands that have reactive amino groups, but it is also suitable for reacting with ligands that contain other reactive groups, such as ligands that contain reactive hydroxyl, sulfhydryl, and similar groups. The affinity matrices of this invention can readily react with such reactive groups of a protein, enzyme, or other such ligand to immobilize the ligand on the affinity matrix. As examples of ligands containing such reactive groups which can be fixed to the affinity matrices of this invention by covalent bonding, there can be mentioned, for example, antigens, antibodies, enzymes, inhibitors, cofactors, hormones, vitamins, toxins, growth factors, glycoconjugates, lecithins, nucleic acids and proteins which are known in the art and defined in Parikh, I. et al., Affinity Chromatography, C&EN, 17- 24,32, August 26, 1985. The ligand-bound affinity matrices of this invention can be used for the purification or separation of substances such as proteins from solutions containing such substances by binding or adsorbing the substance in solution, the affinity matrix of this invention having a ligand covalently bound to the affinity matrix. Such substances to be separated or purified include, for example, enzymes, receptors, antibodies, antigens, nucleic acids and the like.

Zusätzlich können die Affinitätsmatrizen dieser Erfindung für die Immobilisierung von Enzymen entweder als Liganden für die Affinitäts-Chromatographie, wie zuvor beschrieben, oder als immobilisierte Enzyme zur Verwendung als Reaktionskatalysatoren verwendet werden. Derartige immobilisierte Enzyme, welche auf den Affinitätsmatrizen dieser Erfindung immobilisiert sind, sind hoch wirksame und stabile Katalysatoren und behalten ihre entsprechende Spezivität. Derartige immobilisierte Enzymkatalysatoren können wiederverwendet werden, erlauben kontinuierliche Reaktionen, ermöglichen eine bessere Reaktionskontrolle und ergeben eine höhere Reinheit und Ausbeute der Produkte. Darüber hinaus bewirken derartige immobilisierte Enzymkatalysatoren allgemein eine geringere Verunreinigung aufgrund der Reduktion oder Eliminierung des Verlustes an Enzymkatalysator. Die Verwendung von derartigen immobilisierten Enzymen findet eine weite Anwendung in einer Vielzahl von enzymkatalysierten Reaktionen, beispielsweise in Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren.In addition, the affinity matrices of this invention can be used for the immobilization of enzymes either as ligands for affinity chromatography, as previously described, or as immobilized enzymes for use as reaction catalysts. Such immobilized enzymes immobilized on the affinity matrices of this invention are highly effective and stable catalysts and retain their respective specificity. Such immobilized enzyme catalysts can be reused, allow continuous reactions, enable better reaction control, and result in higher purity and yield of products. In addition, such immobilized enzyme catalysts generally result in lower contamination due to the reduction or elimination of enzyme catalyst loss. The use of such immobilized enzymes finds wide application in a variety of enzyme-catalyzed reactions, for example in processes for the production of L-amino acids.

EXAMPLE 1

Zu 25,0 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) in einem Reaktionskessel werden 13,0 g (0,128 Mol) Triethylamin gemeinsam mit 100 ml Chloroform, 27,6 g (0,115 ml) Cyanurchlorid bei etwa 20ºC zugesetzt. Die Reaktion ist stark exotherm. Zusätzliche 200 Mol Chloroform wurden zugesetzt und die Reaktion wurde bei etwa 20ºC 5 1/2 Stunden gerührt, filtriert, mit 3 x 100 ml Chloroform gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26,2 g. Analyse: C = 10.74%; H = 2,11%; N = 6.32%; Cl = 5,52%.To 25.0 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.8% N, 0.05 meq) in a reaction kettle was added 13.0 g (0.128 mol) of triethylamine along with 100 mL of chloroform, 27.6 g (0.115 mL) of cyanuric chloride at about 20ºC. The reaction is strongly exothermic. An additional 200 mol of chloroform was added and the reaction was stirred at about 20ºC for 5 1/2 hours, filtered, washed with 3 x 100 mL of chloroform and dried at about 80ºC for about 4 hours. Yield = 26.2 g. Analysis: C = 10.74%; H = 2.11%; N = 6.32%; Cl = 5.52%.

EXAMPLE 2

300 ml Chloroform wurden in einen Reaktionskessel, welcher mit einem Thermometer, einem Rührer und einem Kühler ausgestattet war und welcher mit Hilfe von Eis und Salz auf etwa 0 bis 5ºC gekühlt war, gegeben. 27,6 g (0,15 Mol) Cyanurchlorid wurden über einen Zeitraum von 20 Minuten zugesetzt während die Temperatur zwischen 0 und 5ºC gehalten wurde. Dann wurden 15.0 g (0.15 Mol) Triethylamin auf einmal zugesetzt und die Suspension färbte sich gelb und die Temperatur stieg auf etwa 25ºC. Die Lösung wurde dann neuerlich auf 0 bis 5ºC gekühlt und 25,0 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) wurden in kleinen Portionen über einen Zeitraum von 20 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei 0 bis 5ºC gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei dieser Temperatur etwa 30 Minuten gerührt, wonach das Eisbad entfernt wurde und die Mischung 22 Stunden gerührt wurde, filtriert wurde, mit 3 x 100 ml Chloroform gewaschen wurde und dann bei etwa 0ºC etwa 4 Stunden getrocknet wurde. Ausbeute = 25,4 g. Analyse: C= 10,22%; H = 2,12%; N = 5,78%; Cl = 5,59%.300 ml of chloroform were added to a reaction vessel equipped with a thermometer, a stirrer and a condenser and cooled to about 0 to 5ºC with the help of ice and salt. 27.6 g (0.15 mol) of cyanuric chloride were was added over a period of 20 minutes while maintaining the temperature between 0 and 5ºC. Then 15.0 g (0.15 mol) of triethylamine was added all at once and the suspension turned yellow and the temperature rose to about 25ºC. The solution was then recooled to 0 to 5ºC and 25.0 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.8% N, 0.05 meq) was added in small portions over a period of 20 minutes while maintaining the temperature at 0 to 5ºC. The reaction mixture was stirred at this temperature for about 30 minutes, after which the ice bath was removed and the mixture was stirred for 22 hours, filtered, washed with 3 x 100 mL of chloroform and then dried at about 0ºC for about 4 hours. Yield = 25.4 g. Analysis: C = 10.22%; H = 2.12%; N = 5.78%; Cl2 = 5.59%.

EXAMPLE 3

25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) wurden in 100 ml Chloroform suspendiert, wozu 15,0 g (0,15 Mol) Triethylamin zugesetzt wurden. 28,0 g Triazin wurden mit 200 ml Chloroform aufgeschlämmt und in den Reaktionskessel überführt, wobei eine stark exotherme Reaktion auftritt. Die Mischung wurde etwa 5 1/2 Stunden bei etwa 20ºC gerührt, filtriert, mit 3 x 100 ml Chloroform gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26 g. Analyse: C = 10,95%; H = 2,12%; N = 5,96%; Cl = 5,63%.25 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.8% N, 0.05 meq) was suspended in 100 mL of chloroform, to which 15.0 g (0.15 mol) of triethylamine was added. 28.0 g of triazine was slurried with 200 mL of chloroform and transferred to the reaction vessel, where a strongly exothermic reaction occurred. The mixture was stirred at about 20°C for about 5 1/2 hours, filtered, washed with 3 x 100 mL of chloroform, and dried at about 80°C for about 4 hours. Yield = 26 g. Analysis: C = 10.95%; H = 2.12%; N = 5.96%; Cl = 5.63%.

EXAMPLE 4

In einem Reaktionskessel wurden 50,0 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) in 200 ml Chloroform suspendiert, wozu 29,0 g Triethylamin zugesetzt wurden. 20,0 g Cyanurchlorid wurden teilweise zugesetzt und der Rest des Cyanurchlorids wurde mit 200 ml Chloroform aufgeschlämmt und in den Reaktionskessel überführt, wodurch eine stark exotherme Reaktion auftrat. Die Mischung wurde etwa 5 1/2 Stunden bei etwa 20ºC gerührt, filtriert, mit 3 x 200 ml Chloroform gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 51 g. Analyse: C = 10,71%; H = 2,14%; N = 5,88%; Cl = 5,33%.In a reaction vessel, 50.0 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.8% N, 0.05 meq) was suspended in 200 mL of chloroform, to which 29.0 g of triethylamine was added. 20.0 g of cyanuric chloride was partially added and the remainder of the cyanuric chloride was slurried with 200 mL of chloroform and transferred to the reaction vessel, causing a strongly exothermic reaction. The mixture was stirred for about 5 1/2 hours at about 20°C, filtered, washed with 3 x 200 mL of chloroform washed and dried at about 80ºC for about 4 hours. Yield = 51 g. Analysis: C = 10.71%; H = 2.14%; N = 5.88%; Cl = 5.33%.

EXAMPLE 5

400 ml Chloroform wurden in einem Reaktionskessel, welcher mit einem Kühler, Rührer oder Thermometer ausgestattet war und welcher auf 0 bis 5ºC mit Hilfe eines Eis-/Salzbades abgekühlt wurde, suspendiert. 56 g (0,29 Mol) Cyanurchlorid wurden zu der gekühlten Chloroformlösung während 15 bis 20 Minuten zugesetzt während die Temperatur bei 0 bis 5ºC gehalten wurde. 36 g (0,35 Mol) Triethylamin in 50 ml Chloroform wurden tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Minuten zugesetzt, wobei die Temperatur unter 10ºC gehalten wurde. Die Lösung färbte sich, nachdem der Zusatz von Triethylamin vollständig war, gelb. Die Mischung wurde auf 0 bis 5ºC gekühlt und 50 g Silica-PrSi-PEI-Triazin, welches in Übereinstimmung mit Beispiel 4 hergestellt wurde, wurden zugesetzt während die Temperatur auf unter 10ºC gehalten wurde. Der Zusatz des Kieselgels war in etwa 10 Minuten vollständig. Die Reaktionsmischung wurde bei dieser Temperatur etwa 10 Minuten gerührt, wonach das Eisbad entfernt wurde und die Mischung bei etwa 20ºC 18 1/2 Stunden gerührt wurde, filtriert, mit 4 x 250 ml Chloroform gewaschen wurde und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet wurde. Ausbeute = 49 g. Analyse: C = 11,3%; H = 2,25%; N = 6,31%; Cl = 4,86%.400 ml of chloroform was suspended in a reaction vessel equipped with a condenser, stirrer or thermometer and cooled to 0 to 5ºC using an ice/salt bath. 56 g (0.29 mol) of cyanuric chloride was added to the cooled chloroform solution over 15 to 20 minutes while maintaining the temperature at 0 to 5ºC. 36 g (0.35 mol) of triethylamine in 50 ml of chloroform was added dropwise over a period of 30 minutes while maintaining the temperature below 10ºC. The solution turned yellow after the addition of triethylamine was complete. The mixture was cooled to 0-5°C and 50 g of silica-PrSi-PEI-triazine, prepared in accordance with Example 4, was added while maintaining the temperature below 10°C. The addition of the silica gel was complete in about 10 minutes. The reaction mixture was stirred at this temperature for about 10 minutes, after which the ice bath was removed and the mixture was stirred at about 20°C for 18 1/2 hours, filtered, washed with 4 x 250 mL chloroform and dried at about 80°C for about 4 hours. Yield = 49 g. Analysis: C = 11.3%; H = 2.25%; N = 6.31%; Cl = 4.86%.

EXAMPLE 6

In einem Reaktionskessel wurden 250 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0.05 meq) und 100 ml 25% Glutaraldehyd-Lösung gemischt. Die Mischung wurde in einem Schüttler etwa 4 Stunden bei etwa 20ºC gehalten. Die Mischung färbte sich leicht braun, und wurde nach 4 Stunden abfiltriert, mit 3 x 100 ml deionisiertem Wasser, 3 x 100 ml Methanol und 3 x 100 ml Aceton gewaschen, bei etwa 20ºC in einem Vakuumofen über Nacht bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet. Ausbeute = 26 g. Analyse: C = 15,43%; H = 2,48%; N = 2,34%.In a reaction vessel, 250 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.8% N, 0.05 meq) and 100 ml of 25% glutaraldehyde solution were mixed. The mixture was kept in a shaker at about 20ºC for about 4 hours. The mixture turned slightly brown and was filtered after 4 hours, washed with 3 x 100 ml deionized water, 3 x 100 ml methanol and 3 x 100 ml acetone, kept at about 20ºC in a vacuum oven overnight until dried to a constant weight. Yield = 26 g. Analysis: C = 15.43%; H = 2.48%; N = 2.34%.

EXAMPLE 7

25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) wurden in einem 500 ml Rundkolben gegeben und 5,1 g (0,05 ml) Triethylamin in 100 ml Tetrahydrofuran wurden zugesetzt, gefolgt von 10,15 g (0,05 Mol) p-Nitrophenylchloroformat und zusätzlich 150 ml Tetrahydrofuran. Die Mischung wurde in einem Schüttler etwa 16 Stunden bei etwa 20ºC gehalten, dann filtriert, mit 4 x 125 ml Chloroform gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26 g. Analyse: C = 9,73%; H = 2,51%; N = 3,26%.25 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.8% N, 0.05 meq) was placed in a 500 mL round bottom flask and 5.1 g (0.05 mL) of triethylamine in 100 mL of tetrahydrofuran was added, followed by 10.15 g (0.05 mol) of p-nitrophenyl chloroformate and an additional 150 mL of tetrahydrofuran. The mixture was kept in a shaker at about 20°C for about 16 hours, then filtered, washed with 4 x 125 mL of chloroform and dried at about 80°C for about 4 hours. Yield = 26 g. Analysis: C = 9.73%; H = 2.51%; N = 3.26%.

EXAMPLE 8

25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) wurden in 250 ml Tetrahydrofuran suspendiert und 10.12 g (0,1 Mol) Triethylamin wurden zugesetzt, gefolgt von 9,32 g (0,01 Mol) Epichlorhydrin. Die Mischung wurde in einem Schüttler etwa 19 Stunden bei 20ºC gehalten, dann filtriert, mit 2 x 250 ml Tetrahydrofuran, 2 x 250 ml Chloroform und 2 x 250 ml Aceton gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 25,5 g. Analyse: C = 7,84%, H = 1,61%; N = 2,63%.25 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.8% N, 0.05 meq) was suspended in 250 mL of tetrahydrofuran and 10.12 g (0.1 mol) of triethylamine was added, followed by 9.32 g (0.01 mol) of epichlorohydrin. The mixture was kept in a shaker at 20°C for about 19 hours, then filtered, washed with 2 x 250 mL of tetrahydrofuran, 2 x 250 mL of chloroform and 2 x 250 mL of acetone and dried at about 80°C for about 4 hours. Yield = 25.5 g. Analysis: C = 7.84%, H = 1.61%; N = 2.63%.

EXAMPLE 9

In einem Reaktionskessel wurden 25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,86% N, 0,05 meq) in 250 ml Tetrahydrofuran suspendiert und 11,25 g (0,055 Mol) 1,4 Butandiolglycidylether wurden zugesetzt. Die Mischung wurde in einen Schüttler gegeben, etwa 8 Stunden bei 20ºC , dann filtriert, mit 3 x 100 ml Methanol gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Analyse: C = 7,09%; H = 1,62%; N = 2,36%.In a reaction vessel, 25 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.86% N, 0.05 meq) was suspended in 250 mL of tetrahydrofuran and 11.25 g (0.055 mol) of 1,4-butanediol glycidyl ether was added. The mixture was placed in a shaker, stirred for about 8 hours at 20ºC, then filtered, washed with 3 x 100 mL of methanol and dried at about 80ºC for about 4 hours. Analysis: C = 7.09%; H = 1.62%; N = 2.36%.

EXAMPLE 10

Beispiel 9 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das Produkt mit 3 x 100 ml Aceton und 3 x 100 ml Diethylether gewaschen wurde. Analyse: C = 7,13%; H = 1,61%; N = 2,75%.Example 9 was repeated except that the product was washed with 3 x 100 mL of acetone and 3 x 100 mL of diethyl ether. Analysis: C = 7.13%; H = 1.61%; N = 2.75%.

EXAMPLE 11

10 g (0,061 ml) 1,1'-Carbonyldiimidazol wurde in 150 ml Aceton suspendiert und die Suspension wurde zu 25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) in einem Reaktionskessel zugesetzt. Zusätzliche 100 ml Aceton wurden in den Reaktionskessel zugegeben und er wurde auf einem Rotavapor etwa 18 Stunden bei etwa 30ºC gehalten. Das Produkt wurde filtriert mit 3 x 250 ml Aceton und 1 x 250 ml Diethylether gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26 g. Analyse: C = 8,99%; H = 1,72%; N = 3,98%.10 g (0.061 mL) of 1,1'-carbonyldiimidazole was suspended in 150 mL of acetone and the suspension was added to 25 g of silica-PrSi-PEI (40 u, 2.8% N, 0.05 meq) in a reaction vessel. An additional 100 mL of acetone was added to the reaction vessel and it was kept on a rotavapor at about 30°C for about 18 hours. The product was filtered, washed with 3 x 250 mL of acetone and 1 x 250 mL of diethyl ether and dried at about 80°C for about 4 hours. Yield = 26 g. Analysis: C = 8.99%; H = 1.72%; N = 3.98%.

EXAMPLE 12

25 g Silica-PrSi-PEI (C = 5,92%, H = 2,82%; 0,05 meq) wurden in 125 ml Tetrahydrofuran suspendiert und 5,05 g (0,05 Mol) Triethylamin wurden zugesetzt und die Reaktionsmischung wurde bei etwa 20ºC etwa 10 Minuten gerührt, wonach 6,12 g (0,05 Mol) Ethylchloracetat zugesetzt wurden, gefolgt von 125 ml Tetrahydrofuran. Die Reaktionsmischung wurde bei etwa 20ºC in einem Schüttler etwa 24 Stunden gerührt, filtriert, mit 2 x 250 ml Chloroform, 2 x 250 ml Aceton gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Analyse: C = 6,61%; H = 1,67%; N = 2,80%.25 g of silica-PrSi-PEI (C = 5.92%, H = 2.82%; 0.05 meq) was suspended in 125 mL of tetrahydrofuran and 5.05 g (0.05 mol) of triethylamine was added and the reaction mixture was stirred at about 20°C for about 10 minutes, after which 6.12 g (0.05 mol) of ethyl chloroacetate was added, followed by 125 mL of tetrahydrofuran. The reaction mixture was stirred at about 20°C in a shaker for about 24 hours, filtered, washed with 2 x 250 mL of chloroform, 2 x 250 mL of acetone and dried at about 80°C for about 4 hours. Analysis: C = 6.61%; H = 1.67%; N = 2.80%.

EXAMPLE 13

2,5 g (0,013 ml) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid wurde in 50 ml Aceton:2-Propanol (1:1) gelöst. 1,3 g (0,011 Mol) N-Hydroxysuccinimid wurden in 100 ml Aceton suspendiert und in einem Schüttler gehalten (es löst sich nicht vollständig). 25 g des succinoylierten Silica-PrSi- PEI (C = 11,89%; H = 1,86%; N = 2,69%, Carboxylgruppe = 0,95 meq/g) wurden in einen Reaktionskessel gegeben und die Lösung von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid in Aceton/2-Propanol wurde zugesetzt. Der Reaktionskessel wurde etwa 5 Minuten geschüttelt und dann wurde die Lösung von N-Hydroxysuccinimid in Aceton zugesetzt gefolgt von 25 ml 2-Propanol. Der Reaktionskessel wrude etwa 22 Stunden in einem Schüttler gehalten und dann wurde das Produkt filtriert, mit 2 x 250 ml Isopropanol, 2 x 250 ml Aceton gewaschen und bei etwa 80ºC 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26,4 g. Analyse: C = 13,60%; H= 2,14%; N = 3,38%.2.5 g (0.013 ml) of 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimide hydrochloride was dissolved in 50 ml of acetone:2-propanol (1:1). 1.3 g (0.011 mol) of N-hydroxysuccinimide was suspended in 100 ml of acetone and kept in a shaker (it dissolves 25 g of the succinoylated silica-PrSi-PEI (C = 11.89%; H = 1.86%; N = 2.69%, carboxyl group = 0.95 meq/g) was placed in a reaction vessel and the solution of 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimide hydrochloride in acetone/2-propanol was added. The reaction vessel was shaken for about 5 minutes and then the solution of N-hydroxysuccinimide in acetone was added followed by 25 mL of 2-propanol. The reaction vessel was kept in a shaker for about 22 hours and then the product was filtered, washed with 2 x 250 mL of isopropanol, 2 x 250 mL of acetone and dried at about 80°C for 4 hours. Yield = 26.4 g. Analysis: C = 13.60%; H= 2.14%; N = 3.38%.

EXAMPLE 14

Die Herstellung von Diazo-Affinitätschromatographie-Matrizen in Übereinstimmung mit dieser Erfindung kann entsprechend den folgenden Verfahren durchgeführt werden:The preparation of diazo affinity chromatography matrices in accordance with this invention can be carried out according to the following methods:

A) Silica-PrSi-PEI wird mit p-Nitrobenzaldehyd in Methanol umgesetzt und das resultierende Produkt wird mit Natriumborhydrid in Methanol umgesetzt. Das Produkt wird in Natriumdithionit-Lösung bei etwa 60ºC suspendiert. Das resultierende Produkt wird mit eiskaltem HBF&sub4; umgesetzt und das Produkt wird filtriert, mit Eiswasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das gewünschte Diazoniumfluoborat-Produkt zu ergeben: A) Silica-PrSi-PEI is reacted with p-nitrobenzaldehyde in methanol and the resulting product is reacted with sodium borohydride in methanol. The product is suspended in sodium dithionite solution at about 60ºC. The resulting product is reacted with ice cold HBF₄ and the product is filtered, washed with ice water and dried in vacuo to give the desired diazonium fluoborate product:

B) Silica-PrSi-PEI wird mit p-Nitrobenzoylchlorid in Tetrahydrofuran und Triethylamin umgesetzt und das resultierende Produkt wird in einer Natriumditionit-Lösung suspendiert gefolgt durch eine Behandlung des Reaktionsproduktes mit eiskaltem HBF&sub4;, Filtrieren, Waschen mit Eiswasser und Trocknen des Produktes im Vakuum ergibt das gewünschte Diazoniumfluoborat-Produkt: B) Silica-PrSi-PEI is reacted with p-nitrobenzoyl chloride in tetrahydrofuran and triethylamine and the resulting product is suspended in a sodium nitrite solution followed by treatment of the reaction product with ice-cold HBF₄, filtration, washing with ice-water and drying the product in vacuo to give the desired diazonium fluoborate product:

EXAMPLE 15

10 g Glutaraldehyd PEI-Silica-Gel Affinititsmatrix, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 6 hergestellt wurde, wurden mit 0,1 M Phosphat (pH 8,0) gewaschen bis der pH der ablaufenden Lösung gleich dem pH des Wasch-(Equilibrierungs-)Puffers ist. 20,0 ml einer 25 mg/ml menschlisches IgG-Lösung (in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0) wurde zu der Affinitätsmatrix zugegeben. Eine konzentrierte Proteinlösung wurde verwendet, um die Reaktionsvolumen klein zu halten und die Reaktion wurde über Nacht bei 4ºC ablaufen gelassen. Die Affinitätsmatrix wurde mit der folgenden Sequenz von Puffern gewaschen um das nicht kovalent gebundene Material zu entfernen: 0,1 M Phosphat, 0.1 M Phosphat + 1.5 M NaCl, 0,1 M Phosphat. Der pH aller Puffer wurde auf 8,0 eingestellt. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,2 M Ethanolamin (PH 8,0) gewaschen, um nichtreagierte Stellen abzudecken 1 bis 3 Stunden bei 4ºC. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,1 M Phosphat, pH 7,0 equilibriert. Die Affinitätsmatrix wurde bei 4ºC gelagert, wobei 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel zugesetzt wurde. 96% des Immunoglobulin-Proteins wurden immobilisiert, wie dies durch Analyse der in der Lösung verbliebenen Menge an Immunoglobulin-Protein mit Hilfe von Umkehrphasen HPLC bestimmt wurde. Der immobilisierte Antikörper war immunologisch wirksam, wie dies durch Retention seines spezifischen Antigen Somatotropins bestimmt wurde, wenn dieses Peptid in Lösung über eine gepackte Säule der Antikörperaffinitätsmatrix geleitet wurde. Strukturell nicht bestimmte Peptide wurden von der Säule nicht zurückgehalten.Ten grams of glutaraldehyde PEI-silica gel affinity matrix prepared in accordance with Example 6 was washed with 0.1 M phosphate (pH 8.0) until the pH of the effluent solution was equal to the pH of the wash (equilibration) buffer. 20.0 ml of a 25 mg/ml human IgG solution (in 0.1 M phosphate buffer, pH 8.0) was added to the affinity matrix. A concentrated protein solution was used to keep the reaction volumes small and the reaction was allowed to proceed overnight at 4°C. The affinity matrix was washed with the following sequence of buffers to remove non-covalently bound material: 0.1 M phosphate, 0.1 M phosphate + 1.5 M NaCl, 0.1 M phosphate. The pH of all buffers was adjusted to 8.0. The affinity matrix was then washed with 0.2 M ethanolamine (pH 8.0) to cover unreacted sites for 1 to 3 hours at 4ºC. The affinity matrix was then equilibrated with 0.1 M phosphate, pH 7.0. The affinity matrix was stored at 4ºC with 0.1% sodium azide added as a preservative. 96% of the immunoglobulin protein was immobilized as determined by analysis of the amount of immunoglobulin protein remaining in solution using reverse phase HPLC. The immobilized antibody was immunologically active as determined by retention of its specific antigen, somatotropin, when this peptide in solution was passed over a packed column of the antibody affinity matrix. Structurally unidentified peptides were not retained by the column.

EXAMPLE 16

5 g Glutaraldehyd PEI-Kieselgel-Affinitätsmatrix, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 6 hergestellt wurde, wurde mit 0,1 M Acetat (pH 8,7) gewaschen bis der pH der abströmenden Lösung gleich dem pH des Wasch- (Equilibrierungs-) Puffers war. 10 ml einer 30 mg/ml Chymotrypsinlösung in 0,1 M Acetatpuffer (pH 8,7) wurde zu der Affinititätsmatrix zugegeben. Eine konzentrierte Proteinlösung wurde verwendet, um das Reaktionsvolumen gering zu halten und die Reaktion wurde über Nacht bei 5ºC laufen gelassen. Die Affinitätsmatrix wurde mit 0,1 M Acetatpuffer pH 7,0 gewaschen, um nicht kovalent gebundenes Material zu entfernen. Die Affinitätsmatrix wurde bei 4ºC trocken oder in Acetatpuffer (pH 7,0): 2-Propanol (9:1) gelagert. 90% des Enzyms wurden immobilisiert, wie dies durch Analysieren der in Lösung verbliebenen Enzymproteinmenge durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt wurde. Das immobilisierte Enzym wurde in eine Glassäule gepackt und wurde als Chromatographiematrix verwendet, um Aminosäuren und Aminosäurederivate zu chromatographieren.5 g of glutaraldehyde PEI-silica gel affinity matrix prepared in accordance with Example 6 was washed with 0.1 M acetate (pH 8.7) until the pH of the effluent was equal to the pH of the wash (equilibration) buffer. 10 ml of a 30 mg/ml chymotrypsin solution in 0.1 M Acetate buffer (pH 8.7) was added to the affinity matrix. A concentrated protein solution was used to keep the reaction volume low and the reaction was allowed to run overnight at 5°C. The affinity matrix was washed with 0.1 M acetate buffer pH 7.0 to remove non-covalently bound material. The affinity matrix was stored dry or in acetate buffer (pH 7.0):2-propanol (9:1) at 4°C. 90% of the enzyme was immobilized as determined by analyzing the amount of enzyme protein remaining in solution by reverse phase HPLC. The immobilized enzyme was packed into a glass column and was used as a chromatography matrix to chromatograph amino acids and amino acid derivatives.

EXAMPLE 17

50 mg Glutaraldehyd PEI-Silica Kieselgel Affinitätsmatrix, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 6 hergestellt wurde, wurden mit 0,05 bis 0,1 M Phosphat (pH 7,5 bis 8,5) gewaschen bis der pH der durchströmenden Lösung gleich dem pH des Wasch- (Equilibrierungs)-Puffers war. 2,0 ml einer 0,5 mg/ml Galactoseoxidase-Lösung (in 0,05 bis 0,01 M Phosphat oder Boratpuffer, pH 7,5 bis 8,5) wurde zu der Affinitätsmatrix zugesetzt. Eine konzentrierte Proteinlösung wurde verwendet, um das Reaktionsvolumen gering zu halten und die Reaktion wurde über Nacht bei 4ºC durchgeführt. Die Affinitätsmatrix wurde mit der folgenden Puffersequenz gewaschen, um nicht kovalent gebundenes Material zu entfernen: 0,1 M Phosphat, 0,1 M Phosphat + 1,0 M NaCl, 0,1 M Phoshphat, wobei der pH aller Puffer auf 8,05 eingestellt war. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,2 M Ethanolamin oder Tris (pH 8,0) gewaschen, um unreagierte Stellen abzudecken 1 bis 3 Stunden bei 4ºC. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,1 M Phosphat pH 7,0 equilibriert. Die Affinitätsmatrix wurde bei 4ºC gelagert. 98% des Enzyms wurden immobilisiert wie dies durch Analysieren mit Umkehrphasen-HPLC, der in der Lösung verbliebenen Enzymproteinmenge bestimmt wurde. Immobilisiertes Enzym war wirksam wie dies durch eine cholorimetrische Oxidations-Reduktions- Reaktion unter Verwendung von O-Dianisidin bestimmt würde.50 mg of glutaraldehyde PEI-silica affinity matrix prepared in accordance with Example 6 was washed with 0.05 to 0.1 M phosphate (pH 7.5 to 8.5) until the pH of the percolating solution was equal to the pH of the wash (equilibration) buffer. 2.0 ml of a 0.5 mg/ml galactose oxidase solution (in 0.05 to 0.01 M phosphate or borate buffer, pH 7.5 to 8.5) was added to the affinity matrix. A concentrated protein solution was used to keep the reaction volume low and the reaction was carried out overnight at 4°C. The affinity matrix was washed with the following buffer sequence to remove non-covalently bound material: 0.1 M phosphate, 0.1 M phosphate + 1.0 M NaCl, 0.1 M phosphate, with the pH of all buffers adjusted to 8.05. The affinity matrix was then washed with 0.2 M ethanolamine or Tris (pH 8.0) to cover unreacted sites for 1 to 3 hours at 4ºC. The affinity matrix was then equilibrated with 0.1 M phosphate pH 7.0. The affinity matrix was stored at 4ºC. 98% of the enzyme was immobilized as determined by analyzing with reverse phase HPLC, the amount of enzyme protein remaining in the solution. Immobilized enzyme was effective as determined by a chlorimetric oxidation-reduction reaction using O-dianisidine.

EXAMPLE 18

Triazin PEI-Kieselgel-Affinitätsmatrix, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 3 hergestellt wurde, wurde mit 0,1 M Phosphat (pH 7,5) gewaschen bis der pH der durchströmenden Lösung gleich dem pH des Waschpuffers war. 2,5 ml einer 1 mg/ml Peroxidaselösung (in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5) wurde zu der Affinitätsmatrix zugesetzt und bei Raumtemperatur 4 Stunden reagieren gelassen. Die Affinitätsmatrix wurde mit der folgenden Puffersequenz gewaschen, um nicht kovalent gebundenes Material zu entfernen: 0,1 M Phosphat, 0,1 M Phosphat + 1,0 M NaCl, 0,1 M Phosphat). Ein pH von 8,0 wurde für alle Puffer verwendet. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,2 M Ethanolamin (pH 8,0) 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur gewaschen, um die unreagierten Stellen abzudecken. Dann wurde die Affinitätsmatrix mit 0,1 M Phosphat, pH 7,0, equilibriert. Die Affinitätsmatrix wurde bei 4ºC gelagert. Das Immoblisierungsverfahren wurde durch Beobachtung der Absorption bei 280 nm der überstehenden Lösung von der Reaktionssuspension bestimmt. 54% des Enzyms in Lösung wurden absorbiert. Das immobilisierte Enzym zeigte 55% Wirksamkeit einer äquivalenten Menge eines löslichen Enzyms.Triazine PEI-silica affinity matrix prepared in accordance with Example 3 was washed with 0.1 M phosphate (pH 7.5) until the pH of the percolating solution was equal to the pH of the wash buffer. 2.5 ml of a 1 mg/ml peroxidase solution (in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5) was added to the affinity matrix and allowed to react at room temperature for 4 hours. The affinity matrix was washed with the following buffer sequence to remove non-covalently bound material: 0.1 M phosphate, 0.1 M phosphate + 1.0 M NaCl, 0.1 M phosphate). A pH of 8.0 was used for all buffers. The affinity matrix was then washed with 0.2 M ethanolamine (pH 8.0) for 1 to 3 hours at room temperature to cover the unreacted sites. Then the affinity matrix was equilibrated with 0.1 M phosphate, pH 7.0. The affinity matrix was stored at 4°C. The immobilization process was determined by observing the absorbance at 280 nm of the supernatant solution from the reaction suspension. 54% of the enzyme in solution was absorbed. The immobilized enzyme showed 55% efficacy of an equivalent amount of soluble enzyme.

EXAMPLE 19

50 mg Glutaraldehyd PEI-Kieselgel-Affinitätsmatrix wurden sorgfältig mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8 gewaschen und mit demselben Puffer equilibriert. 2,5 ml einer 0,8 mg/ml Lösung von β-Galactosidase wurde zu der Affinitätsmatrix-Suspension zugesetzt und die Immobilisierungsrate wurde durch Beobachtung der Absorption bei 280 nm der überstehenden Lösung bestimmt. Nach 20 Stunden bei 4ºC waren 73% des Enzyms an die Matrix gebunden und zeigten 40% der spezifischen Aktivität des löslichen Enzyms.50 mg of glutaraldehyde PEI-silica gel affinity matrix was carefully washed with 0.1 M phosphate buffer, pH 8 and equilibrated with the same buffer. 2.5 ml of a 0.8 mg/ml solution of β-galactosidase was added to the affinity matrix suspension and the immobilization rate was determined by observing the absorbance at 280 nm of the supernatant solution. After 20 hours at 4ºC, 73% of the enzyme was bound to the matrix. and showed 40% of the specific activity of the soluble enzyme.

Claims

1. Solid phase carrier selected from the group consisting of:

(a) a carrier of the general formula

Silica-PrSi-PEI(R)x,

where Silica-PrSi-PEI is a covalently bonded, non- crosslinked polyethyleneimine bound solid phase support, which is the reaction product of

(1) (a) particulate silica gel having an average particle diameter of 1 to 100 µm and an average pore size of 0 to 100 nm (0 to 1000 Angstroms) or

b) particulate controlled pore glass with an average particle diameter of 1 to 100 µm and an average pore size of 0 to 100 nm (0 to 1000 Angstroms) with

(2) Polyethyleniminopropyltrimethoxysilane having an average molecular weight of 400 to 1800, or

(b) the weakly acidic carboxylated product of the solid silica-PrSi-PEI support with a dibasic acid anhydride, wherein the carboxylated product contains from 0.3 to 1.2 carboxyl milliequivalents per gram

and wherein R, in the case of the non-weakly acidic carboxylated support, is the residue of any chemically reactive moiety capable of accepting a nucleophilic substituent at two different sites, such that R at one such site is covalently bonded to the primary or secondary amino groups of the PEI, whereas the other site remains available and reactive for subsequent nucleophilic substitution under non-denaturing conditions with an affinity chromatography ligand to form a second covalent bond which is stable under aqueous hydrolytic buffer conditions and X is a positive integer which is less than or equal to the total number of primary or secondary amino groups in the PEI moiety.

and in the case of the weakly acidic carboxylated support, R is the residue of any chemically reactive moiety capable of facile nucleophilic displacement of the hydroxyl group of the carboxyl to form a covalent bond to the carboxyl carbon, thereby creating a sufficiently electrophilic site so that it can be readily displaced to the carboxyl carbon with a nucleophilic functional group on an affinity chromatography ligand, and X is a positive integer which is less than or equal to the total number of carboxyl groups in the carboxylated PEI moiety.

2. The solid phase support of claim 1, wherein the silica gel has an average particle diameter of 3 to 70 µm and an average pore size of 5 to 100 nm (50 to 1000 angstroms).

3. Solid phase support according to claim 1 or 2, wherein R is

is selected.

4. An immobilized solid phase enzyme comprising the enzyme immobilized on an affinity chromatography matrix solid phase support, wherein the solid phase support is as defined in any one of the preceding claims.

5. Ligand-bound affinity chromatography matrix, wherein the affinity matrix is selected from a support (a) and a product (b) as defined in claims 1 to 3.

6. A method for separating or purifying a substance from a solution by binding the substance in solution with an affinity matrix having a ligand for the substance covalently bound to the affinity matrix, wherein the affinity matrix is a solid phase support according to any one of claims 1 to 3.