DD259046A1

DD259046A1 - PROCESS FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF C-REACTIVE PROTEIN (CRP)

Info

Publication number: DD259046A1
Application number: DD30136787A
Authority: DD
Inventors: Wolf Buerger; Ruediger Von Baehr
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1987-04-01
Filing date: 1987-04-01
Publication date: 1988-08-10
Also published as: DD259046B1

Abstract

Objekt der Erfindung ist die quantitative Bestimmung eines Serumproteins, genannt C-reaktives Protein. Ihr Anwendungsgebiet ist die klinische Laboratoriumsdiagnostik, da die Konzentration des CRP im Serum und anderen Koerperfluessigkeiten Rueckschluesse zulaesst auf den gesundheitlichen Zustand der untersuchten Patienten bzw. auf den gesundheitlichen Zustand von Tieren. Die Konzentrationsbestimmung wird durchgefuehrt als Ligandassay, d. h., ohne die Anwendung von spezifischen Antikoerpern, wie sonst in derartigen Testen ueblich (Immunoassays). Durch das hier beschriebene Verfahren werden mehrere Nachteile beseitigt, die die bislang durchgefuehrten Teste besitzen. Es entfaellt die aufwendige und den Einsatz von Tiermaterial benoetigende Erzeugung von spezifischen Antiseren/Antikoerpern. Es ergeben sich merkliche Vereinfachungen bei der Testausfuehrung, insbesondere was die Verduennung der Proben anbetrifft, der Test ist bedeutend schneller als die Antikoerperassays und schliesslich ist das Verfahren kostenguenstig, da die Reaktanten relativ einfach hergestellt werden koennen. Das Verfahren ist dadurch charakterisiert, dass markiertes CRP, das in konstanter Menge zugegeben wird, mit dem Proben-CRP um die Bindungsstellen an einem Ligand-Traegerkonjugat konkurriert. Nach Inkubation und Abtrennung der ungebundenen Molekuele ergibt sich mit Hilfe einer Standardkurve die gesuchte Konzentration in der Probe.Object of the invention is the quantitative determination of a serum protein, called C-reactive protein. Its field of application is clinical laboratory diagnostics, since the concentration of CRP in the serum and other body fluids allows conclusions about the health status of the examined patients or the health status of animals. Concentration determination is performed as a ligand assay, i. h., without the use of specific antibodies, as usual in such tests (immunoassays). By the method described here, several disadvantages are eliminated, which possess the previously performed tests. It eliminates the elaborate and the use of animal material benoetigende production of specific antisera / antibodies. There are considerable simplifications in the test execution, especially as regards the sedimentation of the samples, the test is significantly faster than the antibody assays, and finally the method is cost-effective, since the reactants can be prepared relatively easily. The method is characterized in that labeled CRP added in a constant amount competes with the sample CRP for binding to a ligand-trap conjugate. After incubation and separation of the unbound molecules, the sought concentration in the sample is obtained using a standard curve.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung stellt ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung von C-reaktivem Protein dar. Die Konzentration des CRP im Serum und anderen Körperflüssigkeiten erhöht sich bei bakteriellen Infektionen, Verletzungen, nach chirurgischen Eingriffen, Verbrennungen, Gewebsuntergängen.The invention provides a novel method for the quantitative determination of C-reactive protein. The concentration of CRP in serum and other body fluids increases in bacterial infections, injuries, after surgery, burns, tissue subsidence.

Durch die Bestimmung der Konzentration des CRP erhält der Kliniker Hinweise auf den Zustand eines Patienten, da bei Gesundung Normalwerte erreicht werden. Hauptsächliche Anwendungen sind z. Z. Erkennen und Beurteilen von Heilungsverläufen nach chirurgischen Eingriffen und Verletzungen, Sepsis bei Neugeborenen, Nachweis von Infarkten und Nekrosen, Zustand bei chronischen Entzündungen, Verläufe und Differentialdiagnose bei akuten bakteriellen und viralen Infektionen.By determining the concentration of the CRP, the clinician receives information on the condition of a patient, since normal values are reached when recovering. Main applications are z. Z. Recognition and assessment of healing outcomes following surgery and injury, neonatal sepsis, detection of infarcts and necroses, condition of chronic inflammation, course and differential diagnosis in acute bacterial and viral infections.

Anwendungsgebiet ist daher die klinische Laboratoriumsdiagnostik. Da Wirbeltiere in ähnlicher Weise reagieren, ist das Verfahren auch für die Überwachung von Tierbeständen und die Beurteilung des Zustandes von Tieren geeignet.The field of application is therefore clinical laboratory diagnostics. Because vertebrates respond similarly, the method is also suitable for monitoring livestock and assessing the condition of animals.

Characteristic of the known state of the art

Die quantitative Bestimmung von Eiweißen in Körperflüssigkeiten findet Anwendung in der klinischen Laboratoriumsdiagnostik. Empfindliche Methoden sind bei der Analytik von Hormonen und einer Reihe von Plasmaproteinen notwendig. In den letzten Jahren haben sich hierfür Immunoassays durchgesetzt, die Antikörper einsetzen: Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Fluorimmunoassays, jetzt auch Lumineszenzimmunoassays. Bei diesen Immunoassays gibt es verschiedene Konstruktionen: homogene und heterogene Assays, kompetetive Tests, direkte und indirekte Zweiseitenbindungsassays, Immunglobulin- und Antigenbindungsassays, Capture-techniken. Bei allen diesen Verfahren findet im entscheidenen Schritt eine Reaktion zwischen spezifischen Antikörpern und Antigen bzw. Hapten statt. Die quantitative Auswertung der Reaktion wird durch Zählung radioaktiver Zerfallsprozesse, Substratreaktionen mit anschließender optischer Auswertung, Fluoreszenzuntersuchungen oder Messung der Chemilumineszenz erreicht. Die Empfindlichkeit der Methoden ist hoch, die Meßbereiche liegen in Konzentrationsbereichen von pg/l bzw. ng/l im Test. Diese Tests bieten in der praktischen Durchführung einige Schwierigkeiten: Die hohe Empfindlichkeit erfordert in der Regel, daß sehr verdünnte Lösungen der Proben eingesetzt werden, die exakt angefertigt werden müssen, was zu großem Aufwand bei hohen Probenzahlen führt. Weiterhin sind bei den üblichen Assays die Versuchszeiten relativ lang, d.h., die Tests dauern mehrere Stunden bzw. Tage. Antikörpertests führen bei niedrigem Titer und hoher Rheumafaktorkonzentration zu falsch erhöhten Werten. Am Beispiel des CRP in Gegenwart von Rheumafaktoren wurde dies beschrieben von J. Highton und P. Hessian, J. Immunol. Meth. 68 (1984) 185—192. Immunoassays sind relativ teuer, da die Herstellung, Aufarbeitung und Spezifitätsuntersuchung von Antiseren bzw. Antikörpern aufwendig ist. Es ist der Einsatz von Tiermaterial notwendig. Das gleiche trifft zu bei der Anwendung von monoklonalen Antikörpern.The quantitative determination of proteins in body fluids is used in clinical laboratory diagnostics. Sensitive methods are needed in the analysis of hormones and a range of plasma proteins. In recent years, immunoassays have been established for this purpose which use antibodies: radioimmunoassays, enzyme immunoassays, fluoroimmunoassays, now also luminescence immunoassays. There are several constructions in these immunoassays: homogeneous and heterogeneous assays, competitive tests, direct and indirect bilateral binding assays, immunoglobulin and antigen binding assays, capture techniques. In all of these methods, in the crucial step, a reaction between specific antibodies and antigen or hapten takes place. The quantitative evaluation of the reaction is achieved by counting radioactive decay processes, substrate reactions with subsequent optical evaluation, fluorescence studies or measurement of chemiluminescence. The sensitivity of the methods is high, the measuring ranges are in the concentration ranges of pg / l and ng / l in the test. These tests offer some difficulties in the practical implementation: The high sensitivity usually requires that very dilute solutions of the samples are used, which must be precisely prepared, which leads to great expense at high numbers of samples. Furthermore, in the usual assays the experimental times are relatively long, i.e. the tests take several hours or days. Antibody testing leads to falsely elevated titers and high rheumatoid factor levels. The example of CRP in the presence of rheumatoid factors has been described by J. Highton and P. Hessian, J. Immunol. Meth. 68 (1984) 185-192. Immunoassays are relatively expensive because the preparation, processing and specificity of antisera or antibodies is expensive. It is the use of animal material necessary. The same applies to the use of monoclonal antibodies.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zur quantitativen Bestimmung des CRP zu entwickeln, wobei gleichzeitig eine richtige Konzentrationsbestimmung bei Problemseren (hohe Konzentration an Rheumafaktoren) möglich ist.The aim of the invention is to develop a simple, fast and cost-effective method for the quantitative determination of the CRP, at the same time a correct determination of the concentration is possible in Problemeren (high concentration of rheumatoid factors).

Explanation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung des CRP zu entwickeln, indem die Nachteile der bisherigen Verfahren vermieden werden durch die Anwendung neuer Bindungspartner unter Vermeidung von Antikörpern bzw. Antiseren. Das Verfahren hat weiterhin die Aufgabe, praktikabel zu sein und die Untersuchung großer Probenmengen mit vertretbarem Aufwand zuzulassen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, indem das CRP mit Liganden folgender chemischer Strukturen: Galaktane (galaktosehaltige Polysaccharide), Polykationen und Polyanionen, Bindung an Histone, Protamine, Nucleinsäuren, Aminoalkyl- bzw. mono-, di-, tri-Alkylaminoalkylphosphorylverbindungen, Cu-haltige Proteine. Als besonders vorteilhaft hat sich der Einsatz von ß-Aminoalkylphosphoryl-Trägerprotein-Konjugaten zur Bestimmung von C-reaktivem Protein erwiesen.The object of the invention is to develop a new method for the quantitative determination of CRP, by avoiding the disadvantages of the previous methods by the application of new binding partners while avoiding antibodies or antisera. The process also has the task of being practicable and allowing the examination of large quantities of samples at a reasonable cost. According to the invention, the object is achieved by the CRP having ligands of the following chemical structures: galactans (galactose-containing polysaccharides), polycations and polyanions, binding to histones, protamines, nucleic acids, aminoalkyl or mono-, di-, tri-alkylaminoalkylphosphorylverbindungen, Cu containing proteins. The use of β-aminoalkyl phosphoryl carrier protein conjugates for the determination of C-reactive protein has proven to be particularly advantageous.

Das Verfahren ist weiterhin gekennzeichnet durch einen Temperaturbereich von 0 bis 45⁰C, vorzugsweise 20°C, und einer Reaktionszeit von 5 bis 120 min, vorzugsweise 15 min. Die untere Nachweisungsgrenze beträgt 1 mg/l CRP bei einem Normbereich bis8mg/l bei gesunden Erwachsenen. Der Meßbereich des Tests liegt zwischen 0,03 und 0,50mg/l. In diesem Bereich betragen die Variationskoeffizienten unter 15% in der Serie und rund 13—18% von Tag zu Tag bei dem imThe method is further characterized by a temperature range of 0 to 45 ⁰ C, preferably 20 ° C, and a reaction time of 5 to 120 min, preferably 15 min. The lower detection limit is 1 mg / l CRP with a normal range up to 8 mg / l in healthy adults. The measuring range of the test is between 0.03 and 0.50 mg / l. In this range, the coefficients of variation are below 15% in the series and around 13-18% from day to day at the

Anwendungsbeispiel beschriebenen Beispiel. Die Ligand-Träger-Konjugate können mit Hilfe von Kopplungsreaktanten bzw. durch unspezifische Bindung hergestellt werden> als praktikabel hat sich die Kopplung von Trägerprotein (z. B. Albumin, Globulin, Ferritin) an ß-Aminoalkylphosphat mittels Glutaraldehyd und anschließender Reduktion mit Natriumborhydrid erwiesen.Application example described example. The ligand-carrier conjugates can be prepared by coupling reactants or by nonspecific binding> the coupling of carrier protein (eg albumin, globulin, ferritin) to β-aminoalkyl phosphate by means of glutaraldehyde and subsequent reduction with sodium borohydride has proven to be practical ,

embodiment

Kompetetiver Ligandassay zur Bestimmung von C-reaktivem Protein unter Verwendung von Ligand-Protein-Konjugat Aus ß-Aminoethylphosphat und Trägerprotein wird unter Verwendung von Glutaraldehyd ein Ligand-Protein-Konjugat hergestellt und mittels 0,1 m Karbonatlösung, pH = 9,5, auf eine Konzentration von 3,2 mg/l verdünnt. Diese Lösung wird zur Festphaseadsorption in geeignete Trägermaterialien überführt. Die Inkubation wird über Nacht bei 4°C ausgeführt. Anschließend wird die Flüssigkeit entfernt und die Träger bei -20⁰C bis zum Gebrauch gelagert. Es werden Standard- und , Probenverdünnungen in Calziumpuffer (0,02 m) pH = 7,3, im Verhältnis 1:50 angefertigt. Auf einer nichtbenetzten Mikortiterplatte werden gleiche Mengen dieser Proben und einer Lösung von 0,32 mg/l Peroxidase-C-reaktives-Protein-Konjugat in Calziumpuffer gemischt. Stehen die Mischungen zur Verfügung, so werden sie in einheitlicher Menge innerhalb einer Minute in die entsprechenden benetzten und gewaschenen Trägermaterialien überführt und 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Lösung und dreimaligem Waschen wird die Substratreaktion mit o-Phenylendiamin/H₂0₂ durchgeführt und nach 5min mit Schwefelsäure (1 m/l) gestoppt, die Extinktion am Mehrkanalphotometer resp. Spektrophotometer gemessen, die Eichkurve auf halblogarithmischem Papier gezeichnet und die Konzentration der Proben ermittelt.Competitive Ligand Assay for the Determination of C-Reactive Protein Using Ligand-Protein Conjugate From β-aminoethyl phosphate and carrier protein, a ligand-protein conjugate is prepared using glutaraldehyde and prepared using 0.1 M carbonate solution, pH 9.5 diluted to a concentration of 3.2 mg / l. This solution is converted to solid phase adsorption into suitable support materials. The incubation is carried out overnight at 4 ° C. Then the liquid is removed and stored at -20 ⁰ C, the carrier until use. Standard and sample dilutions are made in calcium buffer (0.02 m) pH = 7.3 in the ratio 1:50. On a non-wetted microtiter plate, equal amounts of these samples and a solution of 0.32 mg / L peroxidase C-reactive protein conjugate are mixed in calcium buffer. If the mixtures are available, they are transferred in a uniform amount within one minute to the corresponding wetted and washed carrier materials and incubated for 15 minutes at room temperature. After removal of the solution and washing three times, the substrate reaction is carried out with o-phenylenediamine / H ₂ 0 ₂ and stopped after 5 min with sulfuric acid (1 m / l), the extinction at the multichannel photometer resp. Measured spectrophotometer, the calibration curve drawn on semi-logarithmic paper and determines the concentration of the samples.

Claims

Claim:

1. A method for the quantitative determination of C-reactive protein (CRP), characterized in that the CRP reacts with ligand-carrier conjugates at 0 to 45 ° C, preferably 2O ⁰ C, within 5 to 120min.

2. The method according to claim 1, characterized in that are used as ligand-carrier conjugates galactans, polycations and polyanions, histones, protamines, nucleic acids, aminoalkyl or mono-, di-, tri-Alkylaminoalkylphosphorylverbindungen, preferably ß-Aminoalkylphosphoryl conjugates.