DD251999A1

DD251999A1 - METHOD AND DEVICE FOR SUBMERSED CULTIVATION OF MOLD MUSHROOMS

Info

Publication number: DD251999A1
Application number: DD86293396A
Authority: DD
Inventors: Dieter Koerner; Erhard Schiweck; Rainer Radosta; Bernhard Pardemann; Heinz Ruttloff
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1986-08-04
Filing date: 1986-08-04
Publication date: 1987-12-02

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur submersen Kultivation von filamentoes wachsenden Mikroorganismen. Sie laesst sich vorzugsweise anwenden, um Stoffwechselprodukte zu gewinnen, die an die vitale, wachsende Zelle gebunden sind. Weiterhin ist sie fuer Stoffumwandlungen in Substraten geeignet, bei denen zelleigene Enzyme der verwendeten Mikroorganismen zur Wirkung gelangen. Ein spezielles Anwendungsgebiet bezieht sich auf die Herstellung pektinolytischer Enzyme mittels Aspergillus niger. Erfindungsgemaess werden filamentoes wachsende Mikroorganismen auf einem Traegerverbund aus flaechigem, poroesem Material zum Anwachsen gebracht und bilden waehrend des weiteren Wachstums die gewuenschten Produkte. Die Versorgung mit Naehrstoffen und Sauerstoff erfolgt durch Umwaelzung des Substrates im Kreislauf durch den Reaktor. Die erfindungsgemaesse Vorrichtung besteht aus einem Rohrreaktor, der mit einem aeusseren Medienkreislauf ausgestattet ist. Im Reaktor stehen die als Traegerverbund ausgebildeten flaechigen Traegerelemente auf einem Tragring. Zwischen den Traegern befindet sich freier Raum, der dem wachsenden Organismus zur Verfuegung steht und der vom Substrat durchflossen wird.The invention relates to a method and a device for the submerged cultivation of filamentous growing microorganisms. It is preferably used to recover metabolic products bound to the vital, growing cell. Furthermore, it is suitable for substance conversions in substrates in which the cell's own enzymes of the microorganisms used come into effect. A particular field of application relates to the production of pectinolytic enzymes by means of Aspergillus niger. According to the invention, filamentous growing microorganisms are grown on a carrier composite of flat, porous material and grow during further growth the desired products. Nutrients and oxygen are supplied by circulation of the substrate in the circulation through the reactor. The device according to the invention consists of a tubular reactor which is equipped with an external media circuit. In the reactor are designed as Traegerverbund flat Traegerelemente on a support ring. There is free space between the carriers, which is available to the growing organism and flows through the substrate.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für die submerse Kultivation von Schimmelpilzen auf einem Trägersystem, wobei der wachsende Organismus kompakte Biomassestrukturen bildet. Verfahren und Vorrichtung sind sowohl geeignet, mittels der fixierten Organismen Stoff Umwandlungen in Substraten durchzuführen, als auch extrazeiluläre Stoffwechselprodukte, vorzugsweise Enzyme, zu gewinnen. Erfindungswesentlich sind die jeweiligen Merkmale bei der Verfahrensführung und der eingesetzten Vorrichtung und deren Zusammenhang. .The invention relates to a method and a device for the submerged cultivation of molds on a carrier system, wherein the growing organism forms compact biomass structures. Methods and apparatus are both suitable for carrying out substance transformations in substrates by means of the fixed organisms, and for obtaining extracellular metabolites, preferably enzymes. Essential to the invention are the respective features in the process control and the device used and their context. ,

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Schimmelpilze erlangen als Produzenten mikrobieller Produkte zunehmende Bedeutung. Im industriellen Maßstab werden sie bereits genutzt, um beispielsweise Enzyme, insbesondere Amylasen, Proteasen und Pektinasen, zu gewinnen. Aber auch Stoffumwandlungen von Substratkomponenten können mit Hilfe der zelleigenen Enzyme direkt durch die vitale Biomasse herbeigeführt werden.Mold fungi are becoming increasingly important as producers of microbial products. On an industrial scale, they are already being used, for example, to win enzymes, in particular amylases, proteases and pectinases. But also material conversions of substrate components can be brought about directly by the vital biomass with the help of the cell's own enzymes.

Bei der submersen Fermentation derartiger Organismen werden Verfahren bevorzugt, bei denen in unterschiedlichster Weise eine Fixierung bzw. Immobilisierung der Zellen erfolgt.In the submerged fermentation of such organisms, preference is given to processes in which the cells are immobilized or immobilized in various ways.

Dafür gibt es folgende wesentliche Gründe:There are the following main reasons for this:

1. Vermeidung hoher mechanischer Beanspruchungen filamentös wachsender Organismen, wie sie beispielsweise in herkömmlicher Rührfermentoren auftreten. "1. Avoidance of high mechanical stresses filamentous growing organisms, as they occur for example in conventional Rührfermentoren. "

2. Erzielung einer hohen Biomassedichte, bezogen auf das Mediumvolumen, um möglichst hohe Umsatzraten bzw. Ausbeuten an Stoffwechselprodukten zu erzielen.2. Achieving a high biomass density, based on the volume of the medium, in order to achieve the highest possible conversion rates or yields of metabolic products.

3. Einschränkung bzw. Vermeidung von Wachstumsprozessen der Organismen bei deren Einsatz für biokatalytische Stoff Umwandlungen.3. Restriction or avoidance of growth processes of organisms in their use for biocatalytic substance transformations.

4. Erzeugung kompakter Biomassestrukturen als Voraussetzung für ökonomische Bildungsraten bei der Gewinnung von Stoffwechselprodukten.4. Generation of compact biomass structures as a prerequisite for economic formation rates in the recovery of metabolic products.

Insbesondere die Herausbildung kompakter Mycelstrukturen scheint bei Schimmelpilzen häufig die einzige Möglichkeit zu sein, sie in submerser Kultur zur effektiven Produktion bestimmter Stoffwechselprodukte anzuregen.In particular, the emergence of compact mycelial structures often appears to be the only possibility in mold fungi to induce them in submerged culture for the effective production of certain metabolic products.

Die bekannten technischen Lösungen gehen mehr oder weniger von den genannten Faktoren 1 bis 4 aus und enthalten Vorschläge zur Gestaltung geeigneter verfahrensspezifischer Kultivationsbedingungeri. So werden von BATKINSON et al. (DE-OS 2 845 552) ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, wonach das biologische Material an porösen Körpern aus Stahl, Kunststoffen, Glas oder anderen Stoffen fixiert wird. Die Beschaffenheit der Träger ist von B. ATKINSON et al. (Biotechnol. Bioeng. 21,1979,193-200) näher beschrieben. Sie bestehen aus Glas-Ballotini oder aus kissen- bzw. kugelförmigen Gebilden, die aus Siebgewebe oder Draht geformt sind. Diese Träger werden in einem Reaktionsgefäß in der Art eines Fest- oder Fließbettes angeordnet. Sie tragen die Mikroorganismen im Inneren der porösen Körper. Schreitet das Wachstum über die Körpergrenzen hinaus fort, so werden die Träger aus dem Reaktor entfernt, außerhalb von der Biomasse befreit und in den Fermentor zurückgeführt.The known technical solutions are more or less based on the above factors 1 to 4 and contain proposals for the design of suitable process-specific cultivation conditions. Thus, BATKINSON et al. (DE-OS 2 845 552) describes a method and a device, according to which the biological material is fixed to porous bodies made of steel, plastics, glass or other materials. The nature of the supports is described by B. ATKINSON et al. (Biotechnol. Bioeng., 21, 1979, 1993-200). They are made of glass ballotini or of pillow-like or spheroidal shapes, which are formed of mesh or wire. These carriers are placed in a reaction vessel in the manner of a fixed or fluidized bed. They carry the microorganisms inside the porous body. If the growth proceeds beyond the body boundaries, the carriers are removed from the reactor, freed from the biomass and returned to the fermentor.

Das Verfahren dient vorzugsweise der Behandlung von Abwässern, die kontinuierlich oder im Kreislauf über die Träger geführt werden. Zur Sauerstoffversorgung ist die Belüftung des Fermentors möglich.The process preferably serves to treat wastewaters which are continuously or circulated over the carriers. To oxygenate the aeration of the fermenter is possible.

Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß es die Herausbildung größerer, kompakter Biomassestrukturen bei einem gleichzeitig günstigen Verhältnis zum Substratvolumen nicht ermöglicht, da das Wachstum auf die äußeren Grenzen des Trägerkörpers beschränkt werden muß. Andernfalls wäre die Beweglichkeit des Trägers durch Zuwachsen eingeschränkt und damit der Substratdurchfluß und der Stoffaustausch behindert. Für Produktbildungsprozesse, die an das Wachstum des Mikroorganismus gekoppelt sind, ist das Verfahren daher nicht geeignet. Außerdem ist eine sterile Prozeßführung mit der beschriebenen Vorrichtung nicht möglich.The disadvantage of this method is that it does not allow the formation of larger, more compact biomass structures at the same time a favorable ratio to the substrate volume, since the growth must be limited to the outer limits of the carrier body. Otherwise, the mobility of the carrier would be limited by growth and thus hinders the substrate flow and the mass transfer. For product formation processes that are coupled to the growth of the microorganism, the method is therefore not suitable. In addition, a sterile process control with the device described is not possible.

Andere Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von Fermentationsverfahren werden von W. ENGELBART undOther methods and apparatus for carrying out fermentation processes are described by W. Engelbart and

F. ENGELBART (DD-WP 108 322) vorgeschlagen. Als Träger für das biologische Material dient einmal ein sogenannter „Tauchwickel". Es handelt sich um eine in einem Behälter waagerecht angeordnete Welle, auf die in Trommel- oder Haspelform Schläuche bzw. biegsame Rohre aufgewickelt sind, auf denen sich außen oder im Inneren Mikroorganismen ansiedeln können. Der Behälter ist teilweise mit Medium gefüllt, so daß die Rotation des „Tauchwickels" abwechselnd Kontakt mit dem Substrat oder der Luft besteht. Eine weitere in dieser Patentschrift beschriebene Verfahrensvariante stellt das sogenannte „Biogehänge" dar. Es handelt sich um ein Umlaufsystem, in dem die Medienumwälzung nach dem Mammutpumpenprinzip erfolgt. Die Mikroorganismen können sich auf Spiralkernrohren oder zusätzlich nach einer dritten grundsätzlich dargelegten Variante auf festen Körpern, die dem Substrat beigemischt werden, ansiedeln.F. ENGELBART (DD-WP 108 322) proposed. The carrier for the biological material is once a so-called "dipping winder." It is a shaft arranged horizontally in a container, on which hoses or flexible tubes are wound in drum or reel form, on which microorganisms settle on the outside or inside The container is partially filled with medium so that the rotation of the "dipping roll" alternately makes contact with the substrate or the air. A further process variant described in this patent specification is the so-called "biohanger." The microorganisms can be based on spiral core tubes or additionally according to a third variant set forth on solid bodies, which the substrate are mixed, settle.

Auch diese Verfahren und die entsprechenden Vorrichtungen sind in erster Linie geeignet, mit vitalen, aber nichtwachsenden Organismen zu arbeiten. Das Bestreben, große Trägeroberflächen zu erzeugen, führt zu teilweise sehr geringen Querschnittflächen, die von wachsenden Zellen leicht zugesetzt werden können. Insbesondere filamentöse Organismen wurden die beabsichtigte Funktion stark beeinträchtigen. Selbst wenn durch Abrieb von Biomasse für die Schichtreduzierung gesorgt wird, wie es im Fall des „Biogehänges" vorgesehen ist, so lassen sich Anlagerungen von Flocken an anderen Stellen nicht vermeiden. Nachteilig ist auch der hohe mechanische Aufwand zur Herstellung, Bewegung und Reinigung des „Tauchwickels". Die genannten Nachteile führen insbesondere dazu, daß die Verfahren und Vorrichtungen eine Arbeit mit hohen Konzentrationen an wachsender Biomasse nicht gestatten.These methods and the corresponding devices are primarily suitable for working with vital, but non-growing organisms. The desire to produce large support surfaces results in sometimes very small cross-sectional areas, which can be easily added by growing cells. Filamentous organisms, in particular, have a strong adverse effect on the intended function. Even if abrasion of biomass provides for the layer reduction, as is the case in the case of the "bio-hanger", it is not possible to avoid deposits of flakes in other places.Also disadvantageous is the high mechanical outlay for producing, moving and cleaning the " diving roll ". The disadvantages mentioned in particular lead to the fact that the methods and devices do not allow work with high concentrations of growing biomass.

Ein Fermentor, der das Wachstum filamen.töser Organismen besser ermöglicht, wird von J. A. BLAIN et al. (Biotechnol. Lett., 1979, 1, 269-74) beschrieben. Auf einer waagerechten Welle sind Scheiben angeordnet, auf denen die Zellen fixiert werden können. Durch Drehung der Welle wird im Medium für entsprechenden Stoffaustausch gesorgt. Nachteilig ist hierbei wieder der hohe mechanische Aufwand der Fermentorkonstruktion.A fermentor that better facilitates the growth of filamentous organisms is described by J. A. BLAIN et al. (Biotechnol. Lett., 1979, 1, 269-74). On a horizontal shaft discs are arranged, on which the cells can be fixed. By rotation of the shaft is provided in the medium for appropriate mass transfer. The disadvantage here again is the high mechanical complexity of the fermenter construction.

Eine andere Art der Fixierung kompakter Biomasseschichten stellt auch das Verfahren von F. BAUM et al. (DWP 145 027) dar. Eine auf der Nährmedienoberfläche angezogene Myceldecke wird bei Erhöhung des Substratvolumens gegen eine perforierte Platte gedruckt und so im Fermentor fixiert. Hierbei stehen jedoch erreichbare Biomassemengen und Medienvolumen in einem ungünstigen Verhältnis, das sich bei Vergrößerung des Fermentors weiter verschlechtert.Another way of fixing compact biomass layers is also the method of F. BAUM et al. (DWP 145 027). A mycelium cover put on the nutrient media surface is printed against a perforated plate as the volume of the substrate increases and thus fixed in the fermentor. However, achievable biomass quantities and media volumes are in an unfavorable ratio, which further deteriorates as the fermenter is enlarged.

Verfahren zur Fixierung von Mikroorganismen innerhalb von polymeren Stoffen, wie z. B. von A. GRÜNECKER et al. (DE-OS 2 633 076) vorgeschlagen, sind von vornherein auf bestimmte Anwendungen beschränkt, weil die Zellen aufgrund sterischer Einflüsse nicht wachsen können, insbesondere können damit enzymatische Substratumsetzungen durchgeführt werden, jedoch keine Produktsynthesen, die an die voll entwicklungsfähige Zelle gekoppelt sind.Method for fixing microorganisms within polymeric materials, such. By A. GRÜNECKER et al. (DE-OS 2,633,076), are limited from the outset to certain applications, because the cells can not grow due to steric influences, in particular so that enzymatic substrate conversions can be carried out, but no product syntheses, which are coupled to the fully viable cell.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur trägerfixierten submersen Kultur von filamentös wachsenden Mikroorganismen, vorzugsweise von Schimmelpilzen, zu entwickeln, welche die vorstehend genannten Nachteile der bekannten technischen Lösungen vermeiden und insbesondere für die Gewinnung von Stoffwechselprodukten aus wachsenden Mikroorganismen geeignet sind.The aim of the invention is to develop a method and a device for the carrier-fixed submerged culture of filamentous growing microorganisms, preferably of molds, which avoid the aforementioned disadvantages of the known technical solutions and are particularly suitable for the recovery of metabolic products from growing microorganisms.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu entwickeln, die es durch eine unkomplizierte technische Lösung gestatten, filamentös wachsende Mikroorganismen trägerfixiert in kompakten Biomassestrukturen unter submersen Bedingungen zu kultivieren.The invention has for its object to develop a method and an apparatus that allow it by a straightforward technical solution to cultivate filamentous growing microorganisms carrier fixed in compact biomass structures under submerged conditions.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur submersen Kultivation von Schimmelpilzen auf einem in einem Reaktionsgefäß eingesetzten Trägersystem mit dem Ziel der Gewinnung von extrazellulären Stoffwechselprodukten, vorzugsweise von Enzymen, oder der Durchführung mikrobieller Stoffumwandlungen in Substraten, bei dem die Biomasse in einem Reaktor auf einem Trägersystem zum Anwachsen gebracht, die Kultivation unter Ausbildung einer kompakten Mycelschicht auf dem Trägersystem fortgesetzt, das Substrat nach Bildung der gewünschten Produktmenge abgelassen sowie mehrfach neues Substrat in den Reaktor eingefüllt, und der Kultivationsvorgang weitergeführt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß nach einer vorgegebenen Anzahl von Reaktorneufüllungen mit Kultivationsmedium nach der letzten Kultivation der Reaktor entleert, die obere mit Anschlußstutzen für Medieneintritt, Abluft, Beimpfung, Medienzuführung versehene Haube entfernt, das mit der kompakten Mycelschicht bewachsene Trägersystem gegen ein bewuchsfreies Trägersystem ausgetauscht und die Kultivation, gegebenenfalls nach vorausgegangener Sterilisation, erneut eingeleitet wird.The invention relates to a process for the submerged cultivation of molds on a carrier system used in a reaction vessel with the aim of obtaining extracellular metabolites, preferably of enzymes, or carrying out microbial metabolism in substrates, wherein the biomass in a reactor on a support system for Growth is continued, the cultivation is continued to form a compact mycelium layer on the support system, the substrate is discharged after formation of the desired amount of product as well as multiple new substrate filled in the reactor, and the cultivation process is continued, which is characterized in that after a predetermined number of reactor refills with Kultivationsmedium emptied after the last cultivation of the reactor, the upper removed with connection piece for media inlet, exhaust air, inoculation, media supply hood removed, which grows with the compact mycelium layer a carrier system against a vegetation-free carrier system exchanged and the cultivation, possibly after previous sterilization, is initiated again.

Es ist dabei vorteilhaft, die produkthaltige Nährlösung durch Klär- und Sterilfiltration mittels Schichtenfilter zu reinigen, zur Konzentrierung der hochmolekularen und Abtrennung der niedermolekularen Bestandteile eine Behandlung durch Ultrafiltration vorzunehmen und eine Reinigung der hochmolekularen Fraktion durch Diafiltration durchzuführen, die Zuführung der für die Sauerstoffversorgung der Organismen notwendigen Luft über einen Injektor oder durch Einspeisung mittels Verteiler in das Reaktorgefäß unterhalb des Trägerverbundes oder durch direkte Einleitung in ein Umlaufrohr vorzunehmen sowie die Temperierung des Mediums durch Zu- bzw. Abführung von Wärme mittels eines Wärmeübertragers im äußeren Kreislauf des Reaktors öder mittels eines Wärmeübertragers im Reaktionsgefäß unterhalb des Trägerverbundes oder auch durch eine Kombination von innerem und äußerem Wärmeübertrager herbeizuführen.It is advantageous here to purify the product-containing nutrient solution by means of clarification and sterile filtration by means of a layer filter, to carry out a treatment by ultrafiltration for concentration of the high molecular weight and separation of the low molecular weight components and to carry out purification of the high molecular weight fraction by diafiltration, supplying the oxygen supply to the organisms necessary air via an injector or by feeding by means of distributor in the reactor vessel below the support network or by direct introduction into a circulation pipe as well as the temperature of the medium by supply or removal of heat by means of a heat exchanger in the outer circuit of the reactor or by means of a heat exchanger in the Reaction vessel below the carrier composite or by a combination of inner and outer heat exchanger bring about.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens besteht aus einem zylindrischen senkrechtstehenden Reaktionsgefäß mit einer im Verhältnis zum Durchmesser großen Länge, welches am unteren und oberen Ende durch Deckel oder Hauben, die zentrale Stutzen für einen Medienein- und austritt sowie weitere Stutzen für Abluft, Beimpfung, Medienzuführung, Probenahme und Entleerung enthalten, verschlossen ist, einem zwischen der unteren Haube oder Deckel und dem Reaktionsrohr angeordneten Tragring, auf dem die in einer Haltekonstruktion angeordneten Trägerelemente stehen, einer am unteren Stutzen angesetzten Rohrleitung, in der sich Stutzen für die Aufnahme von Meßfühlern befinden, einer mit dieser Rohrleitung verbundenen Pumpe und einer von dort abgehenden Rohrleitung, die einen Wärmeübertrager enthält und zum oberen Stutzen führt und einem im oberen Reaktorteil angeordneten Kegel bzw. anders gestalteten Verteiler für den eintretenden Medienstrahl.The inventive device for carrying out the method consists of a cylindrical vertical reaction vessel with a large diameter in relation to the length, which at the bottom and top by cover or hoods, the central port for a media inlet and outlet and other nozzles for exhaust air, inoculation, Contain media supply, sampling and emptying, is closed, arranged between the lower hood or cover and the reaction tube support ring on which are arranged in a support structure support elements, an attached to the lower nozzle pipe, in which are prongs for receiving sensors , A connected to this pipe pump and a pipe outgoing therefrom, which contains a heat exchanger and leads to the upper nozzle and a cone arranged in the upper part of the reactor or otherwise designed distributor for the incoming media jet.

Anstelle der Pumpe ist auch eine direkte Rohrverbindung zwischen dem unteren und oberen zentralen Stutzen einsetzbar, in derem senkrechten Abschnitt sich ein Injektor für Luft befindet, oder es wird eine Kombination von Pumpe und Injektor verwendet. Als Trägersystem werden flächenförmige Gebilde aus porösen Materialien, vorzugsweise aus Metallgewebe, deren Breite dem runden Reaktorquerschnitt angepaßt ist, oder röhrenförmige Gebilde aus diesen Materialien eingesetzt, wobei es vorteilhaft ist, zwischen den Trägerflächen jeweils Trennbleche anzuordnen und im Reaktorrohr ein oder mehrere Trägersysteme übereinander unterzubringen.Instead of the pump, a direct pipe connection between the lower and upper central stub can be used, in whose vertical section there is an injector for air, or a combination of pump and injector is used. As a carrier system are sheet-like structures made of porous materials, preferably made of metal fabric whose width is adapted to the round reactor cross-section, or tubular structures made of these materials, it is advantageous to arrange each separating plates between the support surfaces and one or more support systems to accommodate one another in the reactor tube.

Für die der Durchführung des Verfahrens dienende Vorrichtung ist von Bedeutung, daß durch die Anordnung eines stabilen, flächenförmigen Trägers aus porösem Material, der verschiedene geometrische Formen besitzen kann und vorzugsweise aus mehreren Trägerelementen zu einem Trägerverbund zusammengesetzt ist, in einem zylindrischen Reaktionsrohr Bedingungen geschaffen werden, die es ermöglichen, einen Mikroorganismus auf dem Träger anwachsen zu lassen und ihn unter weiterem Wachstum für eine gewünschte Zeitdauer zu kultivieren. Es ist ferner von Bedeutung, daß die Versorgung der Biomasse mit Nährstoffen und Sauerstoff sowie der Abtransport gebildeter Stoffwechsel- oder Umsatzprodukte durch einen umlaufenden Strom des Nährmediums erfolgt, der in einer äußeren Kreislaufleitung durch eine Pumpe oder durch Luft mittels eines Injektors erzeugt wird. Dabei erfolgt die Temperierung des Nährmediums auf die für den Mikroorganismus erforderliche Temperatur mittels eines Wärmeübertragers, der entweder in der Kreislaufleitung angeordnet ist oder im Reaktor selbst unterhalb des Trägerverbundes, oder durch eine Kombination zweier Wärmeübertrager innerhalb und außerhalb des Reaktors.It is important for the apparatus used to carry out the method that conditions are created in a cylindrical reaction tube by the arrangement of a stable, sheet-like carrier made of porous material, which can have different geometric shapes and is preferably composed of a plurality of carrier elements to form a carrier composite. which make it possible to grow a microorganism on the carrier and to cultivate it with further growth for a desired period of time. It is also important that the supply of biomass with nutrients and oxygen and the removal of formed metabolic or turnover products is carried out by a circulating stream of nutrient medium, which is generated in an outer circulation line by a pump or by air by means of an injector. In this case, the temperature of the nutrient medium to the temperature required for the microorganism by means of a heat exchanger, which is arranged either in the circulation line or in the reactor itself below the support network, or by a combination of two heat exchangers inside and outside the reactor.

Die für die Sauerstoffversorgung des Mikroorganismus notwendige Luft wird entweder durch einen Verteiler unterhalb des Trägerverbundes bzw. Wärmeaustauscher direkt in das Reaktorrohr zugeführt oder sie wird über den Injektor eingetragen bzw. direkt in das Umlaufrohr oberhalb der Pumpe. Sie verläßt den Reaktor durch einen Stutzen am Kopf des Apparates. Die einzelnen Flächenelemente des Trägers sind so angeordnet, daß zwischen ihnen ein Raum für die wachsende Biomasse entsteht, wobei es vorteilhaft ist, diesen Zwischenraum zwecks Verhinderung des Ineinanderwachsens der Biomasse durch Trennbleche in zwei Sektionen zu unterteilen. Die Trägerelemente werden durch Bolzen und Distanzhülsen zu einem kompakten Trägerverbund zusammengesetzt, der im Reaktionsrohr auf einem Tragring am unteren Ende des Rohres bzw. oberhalb des Wärmeübertragers und Luftverteilers steht. Je nach Länge des Reaktorrohres besteht der Trägerverbund aus einem Stück oder erThe air required for the oxygen supply of the microorganism is either fed directly through a distributor below the support network or heat exchanger in the reactor tube or it is entered via the injector or directly into the circulation pipe above the pump. She leaves the reactor through a nozzle on the head of the apparatus. The individual surface elements of the carrier are arranged so that a space for the growing biomass arises between them, wherein it is advantageous to divide this gap in order to prevent the growing together of the biomass by separating plates in two sections. The support elements are assembled by bolts and spacers to form a compact carrier composite, which stands in the reaction tube on a support ring at the lower end of the tube or above the heat exchanger and air distributor. Depending on the length of the reactor tube, the carrier composite consists of one piece or he

ist aus mehreren Segmenten, welche aufeinandergestellt werden, zusammengesetzt. Um den eintretenden Medienstrahl gleichmäßig über den Querschnitt des Trägers zu verteilen, ist zwischen Einlaufstutzen und Trägerverbund ein Verteiler angeordnet.is composed of several segments which are stacked together. In order to distribute the incoming media jet uniformly over the cross section of the carrier, a distributor is arranged between the inlet connection and carrier composite.

Für die der Durchführung des Verfahrens dienende Vorrichtung ist weiter von Bedeutung, daß als Material für die Reaktorkonstruktion neben Stahl vorteilhaft auch Glas eingesetzt werden kann. In einfacher Weise ist es möglich, die Vorrichtung in der gewünschten Größe aus Normteilen zusammenzusetzen und spezifischen Verfahrensbedingungen anzupassen. Von Bedeutung ist weiterhin, daß sich in der beschriebenen Weise aufgebaute einzelne Reaktorrohre zu Reaktorbatterien zusammenschließen lassen, indem die weiteren Medienausläufe einer gemeinsamen Pumpe zugeführt und nach dieser wieder auf die Rohre verteilt werden, wodurch die Fermentationskapazität dem erforderlichen Produktionsumfang angeglichen wird.For the implementation of the method serving device is also of importance that can be used advantageously as a material for the reactor construction in addition to steel and glass. In a simple way, it is possible to assemble the device in the desired size of standard parts and to adapt to specific process conditions. It is also important that individual reactor tubes constructed in the manner described can be combined to form reactor batteries by supplying the further media outlets to a common pump and distributing them back to the tubes after this, thereby equalizing the fermentation capacity with the required production volume.

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anlage besteht aus einem zylindrischen Reaktionsgefäß, dessen Stutzen am Boden über eine Leitung mit einer Pumpe zur Förderung des Mediums verbunden ist, von der aus eine zweite Rohrleitung zum Kopfstutzen des Reaktionsgefäßes führt und die einen Wärmeübertrager zur Temperierung des Mediums enthält, sowie Anschlüsse für die Zuführung von Luft und für die Messung von Temperatur, pH-Wert und Sauerstoffpartialdruck; außerdem enthält das Reaktionsgefäß im unteren Teil eine Vorrichtung zum Einleiten und Verteilen von Luft, die beispielsweise als ringförmige Leitung ausgebildet sein kann, und am Kopf sind mehrere Stutzen angeordnet, durch die Nährmedium, Impfmaterial und Zusätze während der Fermentation eingebracht werden und Abluft austreten können. Ferner ist in dem Reaktionsgefäß ein aus mehreren Platten bestehender Träger angeordnet, wobei die Trägerplatten aus feinmaschigem Stahlgewebe bestehen, die durch eine Tragevorrichtung gehalten werden, und bei dem der Zwischenraum zwischen je zwei Platten durch ein Trennblech aus Stahl unterteilt ist.A preferred embodiment of the system according to the invention consists of a cylindrical reaction vessel, the nozzle is connected at the bottom via a line with a pump for conveying the medium, from which a second pipe leads to the head nozzle of the reaction vessel and which contains a heat exchanger for temperature control of the medium, and connections for the supply of air and for the measurement of temperature, pH and oxygen partial pressure; In addition, the reaction vessel in the lower part of a device for introducing and distributing air, which may be formed, for example, as an annular conduit, and at the top of several nozzles are arranged, can be introduced through the nutrient medium, inoculum and additives during the fermentation and exhaust air can escape. Further, in the reaction vessel, a support consisting of a plurality of plates, wherein the support plates are made of fine-mesh steel fabric, which are held by a support device, and wherein the space between each two plates is divided by a separating plate made of steel.

Eine abgeänderte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anlage ist derart gestaltet, daß sich der Wärmeübertrager im unteren Teil des Reaktionsgefäßes befindet.A modified embodiment of the system according to the invention is designed such that the heat exchanger is located in the lower part of the reaction vessel.

Bei einer weiteren abgewandelten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anlage wird die Zirkulation des Mediums in der Kreislaufleitung durch Luft hervorgerufen, indem am unteren Ende der Leitung ein Injektor angeordnet ist, der einen aufsteigenden Luft-Medien-Strom erzeugt und dadurch gleichzeitig für Transport und Belüftung des Kulturmediums sorgt.In a further modified embodiment of the system according to the invention, the circulation of the medium in the circulation line is caused by air by an injector is arranged at the lower end of the line, which generates an ascending air-medium flow and thereby simultaneously provides for transport and ventilation of the culture medium ,

Ausführungsbeispieleembodiments

Durch die folgenden Ausführungsbeispiele werden die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert. Es enthalten:The following exemplary embodiments explain the device according to the invention and the method according to the invention in more detail. It contains:

Fig. 1: ' Schematische Darstellung der bevorzugten Ausführungsform der Anlage Fig. 2: Schematische Darstellung abgewandelter Ausführungsformen der Anlage Fig. 3: Schematische Darstellung des Querschnittes von Ausführungsformen des Trägers Fig. 4: Schematische Darstellung eines bevorzugten TrägerverbundesFig. 1: 'Schematic representation of the preferred embodiment of the system Fig. 2: Schematic representation of modified embodiments of the system Fig. 3: Schematic representation of the cross section of embodiments of the carrier Fig. 4: Schematic representation of a preferred carrier composite

Fig. 5: Technologisches Schema der Herstellung pektinolytischer Enzyme mit Hilfe des Schimmelpilzes Aspergillus nigerFig. 5: Technological diagram of the production of pectinolytic enzymes with the aid of the mold Aspergillus niger

Wie die Fig. 1 zeigt, besteht die Vorrichtung aus einem zylindrischen Reaktionsgefäß 1 mit einer im Verhältnis zum Durchmesser großen Länge. Das Gefäß ist oben und unten mit je einer Haube 2, 3 verschlossen, an denen sich die zentralen Stutzen für den Medieneintritt 4 und den Medienaustritt 5 sowie weitere Öffnungen für die Abführung der Abluft 6, für die Beimpfung 7, für die Zuführung von Medien 8, für die Probenahme 9 und für die Entleerung 10 befinden. Zwischen dem zylindrischen Teil des Reaktionsgefäßes und der Bodenhaube ist ein Tragring 11 angebracht, auf dem die Trägerkonstruktion 18 steht. Vom unteren Stutzen 5 führt eine Rohrleitung 12 zu einer Pumpe 13. In dieser Rohrleitung können sich Stutzen 14 befinden, die zur Aufnahme von Meßfühlern dienen, hier beispielsweise zur Messung des Sauerstoffpartialdruckes. Von der Pumpe führt eine Rohrleitung 15 zum zentralen Stutzen der oberen Haube. In diese Rohrleitung sind ein Wärmeübertrager 16 eingefügt, der der' Kühlung bzw. Heizung des Nährmediums dient und weitere Stutzen 14a für die Luftzuführung bzw. für weitere Meßsonden.,Der in das Reaktionsgefäß eintretende Medienstrom wird über einen Kegel 17 verteilt, um das direkte Auftreffen auf den Träger zu vermeiden. Der Trägerverbund 18, der im Reaktionsgefäß durch den Tragring 11 gehalten wird, besteht aus mehreren parallel j angeordneten Platten 19 aus Edelstahl-Maschengewebe. Der freie Raum zwischen ihnen wird durch Trennbleche 20 unterteilt. Die Breite der Trägerplatten und Trennbleche ist der Rundung der Gefäßwand angepaßt. Der Verbund der Trägereiemente wird durch Bolzen und Distanzhülsen erreicht, so daß ein kompaktes Gebilde entsteht, welches man insgesamt von oben in das Reaktionsgefäß einsetzen kann. Einzelheiten zur Trägergestaltung und zum Trägerverbund werden in Fig. 3 und Fig. 4 gezeigt. Bei einer abgewandelten Ausführungsform der Vorrichtung wird die Umwälzung des Nährmediums nicht mit Hilfe einer Pumpe erreicht, sondern mit Luft nach dem Injektorprinzip, indem die Pumpe 13 durch eine Rohrleitung 12a ersetzt wird, in der sich der Injektor 21 befindet.As shown in Fig. 1, the device consists of a cylindrical reaction vessel 1 with a large diameter in relation to the length. The vessel is closed at the top and bottom, each with a hood 2, 3, in which the central nozzle for the media inlet 4 and the media outlet 5 and other openings for the discharge of the exhaust air 6, for the inoculation 7, for the supply of media. 8 , for sampling 9 and for emptying 10. Between the cylindrical part of the reaction vessel and the bottom cover a support ring 11 is mounted, on which the support structure 18 stands. From the lower nozzle 5, a pipe 12 leads to a pump 13. In this pipe, nozzles 14 may be located, which serve to receive sensors, here for example for measuring the oxygen partial pressure. From the pump a pipe 15 leads to the central neck of the upper hood. In this pipeline, a heat exchanger 16 are inserted, which is the 'cooling or heating of the nutrient medium and further nozzle 14a for the air supply or for further probes., The entering into the reaction vessel media flow is distributed over a cone 17 to the direct impact to avoid the carrier. The carrier assembly 18, which is held in the reaction vessel by the support ring 11, consists of several parallel j arranged plates 19 made of stainless steel mesh. The free space between them is divided by dividers 20. The width of the carrier plates and dividers is adapted to the rounding of the vessel wall. The composite of the Trägereiemente is achieved by bolts and spacers so that a compact structure is formed, which can be used from the top of the reaction vessel in total. Details of the carrier design and carrier composite are shown in FIG. 3 and FIG. 4. In a modified embodiment of the device, the circulation of the nutrient medium is not achieved by means of a pump, but with air according to the injector principle by the pump 13 is replaced by a pipe 12a in which the injector 21 is located.

Bei einer weiteren abgewandelten Ausführungsform der Anlage Fig. 2 ist der Wärmeübertrager 22 zur Heizung bzw. Kühlung des Mediums im unteren Teil des Reaktorrohres angeordnet.In a further modified embodiment of the system Fig. 2, the heat exchanger 22 is arranged for heating or cooling of the medium in the lower part of the reactor tube.

Bei einer anderen abgewandelten Ausführungsform der Anlage wird die Luft zur Sauerstoffversorgung des Mikroorganismus durch einen Verteiler 23 im unteren Teil des Reaktorrohres zugeführt. Fig. 2 zeigt in schematischer Darstellung eine Kombination dieses Aufbaus. Ebenso ist auch die Kombination dieser abgewandelten Ausführungsformen mit der Ausführung gemäß Fig. 1 möglich. Die Fig. 5 zeigt eine Ausführungsform der Vorrichtung, bei der diese unmittelbar mit dem Verfahren zur Herstellung pektinolytischer Enzyme, insbesondere eines Gemisches aus Endo-Polygalacturonase und Pektinesterase, mit Hilfe des Schimmelpilzes Aspergillus niger (Stamm R 1/214, hinterlegt in der Stammsammlung der DDR unter ZIMET43 692) zusammen genutzt werden. Zur Durchführung des Verfahrens wird eine Reaktorausführung gemäß Fig. 1 oder Fig. 2 verwendet. Dem Reaktor 24 sind je nach Menge und Behandlungsmodus der Substrate ein oder mehrere Ansetzbehälter 25 sowie Sterilisatoren 26 für die Nährlösungen vorgeschaltet. Die Sterilisation kann dabei sowohl diskontinuierlich in Rührautoklaven als auch kontinuierlich in Durchlaufsterilisatoren oder durch Sterilfiltration erfolgen. Der Fermentationsprozeß verläuft als zyklisches Batch-Verfahren, indem auf dem Träger im 1. Zyklus eine Biomasseschicht angezogen wird, die im Verlaufe von bis zu 5 Tagen das gewünschte Enzymgemisch produziert. Anschließend wird die Kulturlösung geerntet und es schließt sich durch Auffüllen frischer Substrate unmittelbar nach der Ernte oder nach einer Trocknungsphase von bis zu 24 h ein zweiter Fermentationszyklus an. In analoger Weise können weitere Zyklen folgen, solange die Biomasse keinen störenden Einfluß auf die Zirkulation des Mediums im Reaktor ausübt. Bei der Ernte der enzymhaltigen Kulturlösung gelangt das Medium mittels der Pumpe 27 in einen kühlbaren Zwischenbehälter 28, aus dem sie durch ein ein- oder mehrstufiges Schichtenfilter 29 zwecks Klärung und gegebenenfalls Entkeimung in einen zweiten Behälter 30 gefördert wird. Mit Hilfe der Ultrafiltrationsanlage 31 wird die Kulturlösung auf das gewünschte Maß konzentriert und gegebenenfalls durch Diafiltration weiter gereinigt.In another modified embodiment of the plant, the air is supplied to the oxygen supply of the microorganism through a manifold 23 in the lower part of the reactor tube. Fig. 2 shows a schematic representation of a combination of this structure. Likewise, the combination of these modified embodiments with the embodiment of FIG. 1 is possible. FIG. 5 shows an embodiment of the device in which it is directly related to the process for producing pectinolytic enzymes, in particular a mixture of endo-polygalacturonase and pectin esterase, with the aid of the mold Aspergillus niger (strain R 1/214 deposited in the strain collection of DDR under ZIMET43 692) can be used together. For carrying out the method, a reactor design according to FIG. 1 or FIG. 2 is used. The reactor 24, depending on the amount and treatment mode of the substrates one or more Ansetzbehälter 25 and sterilizers 26 upstream of the nutrient solutions. Sterilization can be carried out either batchwise in stirred autoclaves or continuously in continuous sterilizers or by sterile filtration. The fermentation process proceeds as a cyclic batch process by growing on the support in the 1st cycle a biomass layer which produces the desired enzyme mixture over a period of up to 5 days. Subsequently, the culture solution is harvested and it joins by filling fresh substrates immediately after harvesting or after a drying phase of up to 24 h, a second fermentation cycle. In an analogous manner, further cycles may follow, as long as the biomass does not exert any disturbing influence on the circulation of the medium in the reactor. When harvesting the enzyme-containing culture solution, the medium passes by means of the pump 27 into a coolable intermediate container 28, from which it is conveyed through a single- or multi-stage layer filter 29 for clarification and, if appropriate, sterilization in a second container 30. With the aid of the ultrafiltration unit 31, the culture solution is concentrated to the desired level and optionally further purified by diafiltration.

Claims

1. A method for the submerged cultivation of molds on a carrier system used in a reaction vessel for the production of extracellular metabolites, preferably of enzymes, or the implementation of microbial metabolism in substrates in which the biomass in a reactor on a carrier system brought to increase, the cultivation continuing to form a compact mycelium layer on the support system, draining the substrate after the desired amount of product has been formed, filling the reactor several times, and continuing the culturing operation, characterized in that after a predetermined number of reactor refills with the culture medium after the last cultivation the reactor is emptied, the top with connection piece for the media inlet, exhaust air, inoculation and media supply provided hood removed, the overgrown with the compact mycelium carrier system against a vegetation-free Replaced support system and the cultivation, possibly after previous sterilization, is initiated again.

2. The method according to claim 1, characterized in that the nutrient solution is purified by Klär- and sterile filtration using a layer filter, for concentrating high molecular weight and separation of low molecular weight components, a treatment by ultrafiltration and purification of the high molecular weight fraction by diafiltration.

3. Process according to claims 1 to 2, characterized in that the supply of necessary for the oxygen supply of the organisms air via an injector or by feeding by means of distributor into the reaction vessel below the carrier network or by direct introduction into a circulation pipe.

4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the temperature of the medium takes place by supply or removal of heat by means of a heat exchanger in the outer circuit of the reactor.

5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the temperature of the medium by supply and removal of heat by means of a heat exchanger in the reaction vessel below the carrier composite takes place.

6. Process according to claims 1 to 5, characterized in that the temperature control of the medium takes place by supply or removal of heat by a combination of inner and outer heat exchanger.

7. Apparatus for carrying out the method according to claim 1, characterized by a cylindrical vertical reaction vessel having a length in relation to the diameter, which at the bottom and top by cover or hoods, the central nozzle for a media inlet and media outlet and other nozzles for Exhaust air, inoculation, media supply, sampling and emptying contained, is closed, arranged between the lower hood and the reaction tube supporting ring, arranged in a support structure support elements, a set on the lower pipe, in which there are sockets for receiving sensors, a pump connected to this pipe and a pipe " outgoing" therefrom, which contains a heat exchanger and leads to the upper pipe and _; a cone arranged in the upper part of the reactor or a differently designed distributor. '

8. Apparatus according to claim 7, characterized in that instead of the pump, a direct pipe connection is arranged, in whose vertical section is an injector.

9. Device according to claims 7 and 8, characterized in that the injector is installed in addition to the pump after this in the pipeline.

10. Device according to claims 7 to 9, characterized in that as a carrier system sheet-like structure of porous support materials, preferably made of metal fabric whose width is adapted to the round reactor cross-section, or tubular structures are used from these materials.

11. The device according to claim 7, characterized in that separating plates are arranged between the support surfaces.

12. The device according to claim 7, characterized in that one or more support systems are arranged one above the other in the reactor tube.

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