DD251790A5 - Process for the preparation of Creatinamidinohydrolase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus fuer die konstitutive Creatinamidinohydrolase-Bildung sowie Verfahren zur Herstellung derselben. Die Creatinamidinohydrolase findet Anwendung in der klinischen Analytik, beispielsweise fuer die Diagnose von Nierenerkrankungen. Ziel der Erfindung ist die verbesserte gentechnologische Herstellung von Creatinamidinohydrolyse mit erhoehter Ausbeute bei gesenkten Kosten. Erfindungsgemaess wird ein neuer Mikroorganismus der Gattung E. coli oder Pseudomonas putida zur Verfuegung gestellt, der konstitutiv Creatinamidinohydrolase bildet. Bevorzugte koennen enthalten: das Plasmid pBT 2a-1, DSM 3148P oder das Plasmid pBT 306.16, DSM 3149P.The invention relates to a microorganism for constitutive Creatinamidinohydrolase formation and to processes for producing the same. Creatinamidinohydrolase is used in clinical analysis, for example for the diagnosis of kidney disease. The aim of the invention is the improved genetic engineering of Creatinamidinohydrolyse with increased yield at reduced costs. According to the invention, a novel microorganism of the genus E. coli or Pseudomonas putida is provided which constitutively forms creatinamidinohydrolase. Preferred may contain: the plasmid pBT 2a-1, DSM 3148P or the plasmid pBT 306.16, DSM 3149P.
Description
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Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus für die konstitutive Creatinamidinohydrolase-Bildung sowie Verfahren zur Herstellung derselben. Die erfindungsgemäß hergestellte Creatinamidinohydrolase wird angewandt in der klinischen Diagnostik, beispielsweise zur Diagnose von Nierenerkrankungen. ! ιThe invention relates to a microorganism for constitutive Creatinamidinohydrolase formation and to processes for producing the same. The Creatinamidinohydrolase prepared according to the invention is used in clinical diagnostics, for example for the diagnosis of kidney diseases. ! ι
Das Enzym Creatinamidino-Hydrolase EC3.5.3.3 findet industriell Anwendung zur Creatininbestimmung. Es wird daher u. a. in der klinischen Analytik für die Diagnose von Nierenerkrankungen verwendet, bei welchen im Serum oder im Urin Creatiningehalte auftreten, die von denen des gesunden Organismus abweichen. Zwar sind Mikroorganismen bekannt, wie beispielsweise Pseudomonas-Arten, welche unter Induktion durch Creatin in der Lage sind, Creatinamidino-Hydrolase in einer die Aufarbeitung lohnenden Menge herzustellen, die erzielbaren Ausbeuten und die Kosten der Isolierung des Enzyms stellen jedoch immer noch einen limitierenden Faktor für die industrielle Anwendung des Enzyms dar.The enzyme creatine amidino-hydrolase EC3.5.3.3 is used industrially for creatinine determination. It is therefore u. a. used in clinical analysis for the diagnosis of kidney diseases in which creatinine levels differ from those of the healthy organism in serum or urine. Although microorganisms are known, such as Pseudomonas species which, when induced by creatine, are capable of producing creatinamidino-hydrolase in a workup-worthful amount, the achievable yields and the cost of isolating the enzyme are still a limiting factor the industrial application of the enzyme.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Mikroorganismen, welche diese Nachteile nicht aufweisen und insbesondere die Creatinamidinohydrolase konstitutiv bilden, d. h. ohne daß hierzu eine Induktion erforderlich ist, und dabei wesentlich bessere Ausbeuten liefern als die bisher bekannten Creatinamidino-Hydrolasebildner.The aim of the invention is to provide microorganisms which do not have these disadvantages and in particular constitute constitutively the creatinamidinohydrolase, d. H. without the need for induction is required, and thereby provide much better yields than the previously known creatinamidino-Hydrolasebildner.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, nach den Methoden der Gentechnologie einen derartigen Mikroorganismus herzustellen, bei welchem die genetische Information für eine hohe Syntheseleistung an dem angegebenen Enzym in einem Wirtsmikroorganismus vorliegt, der sich gut züchten läßt und aus dem sich das Enzym kostengünstig isolieren läßt. Erfindungsgemäß gelingt es, diese Aufgabe zu lösen. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Mikroorganismus der Gattung E.coli oder Pseudomonas putida, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er konstitutiv Creatinamidinohydrolase bildet. Für Mikroorganismen der Gattung E. coli ist eine auch induktive Bildung dieses Enzyms bisher nicht gefunden worden. Bei Pseudomonas putida ist zwar eine Information für die Bildung von Creatinamidino-Hydrolase vorhanden, das Enzym wird jedoch nur unter Induktion gebildet und in recht niedrigen Aktivitäten.The invention has for its object to produce according to the methods of genetic engineering such a microorganism in which the genetic information for a high synthesis performance of the enzyme in a host microorganism is present, which can be grown well and from which the enzyme can be isolated inexpensively. According to the invention, it is possible to achieve this object. An object of the invention is therefore a microorganism of the genus E. coli or Pseudomonas putida, which is characterized in that it constitutively Creatinamidinohydrolase forms. For microorganisms of the genus E. coli, an inductive formation of this enzyme has not yet been found. Although information about the formation of creatinamidino-hydrolase is present in Pseudomonas putida, the enzyme is formed only under induction and in rather low activities.
Ein bevorzugter Mikroorganismus der Gattung E.coii gemäß der Erfindung enthält das Plasmid pBT2a-1. Ein derartiger Mikroorganismus ist in der Lage, bis zu 50% seiner gesamten Syntheseleistung an Protein für die Bildung von Creatinamidino-Hydrolase aufzubringen.A preferred microorganism of the genus E. coli according to the invention contains the plasmid pBT2a-1. Such a microorganism is capable of applying up to 50% of its total synthesis power to protein for the formation of creatinamidino-hydrolase.
Ein weiterer bevorzugter Mikroorganismus gemäß der Erfindung ist ein solcher der Gattung E.coli oder Pseudomonas putida, welcher das Plasmid pBT306.16 enthält. Derartige Mikroorganismen sind ebenfalls konstitutive Creatinamidinohydrolasebildner mit sehr hoher Syntheseleistung.Another preferred microorganism according to the invention is one of the genus E. coli or Pseudomonas putida, which contains the plasmid pBT306.16. Such microorganisms are also constitutive Creatinamidinohydrolasebildner with very high synthesis performance.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die Plasmide pBT2a-1, DSM3148P und pBT306.16, DSM3149P. Während das erstgenannte Plasmid eine besonders hohe Syntheseleistung in Mikroorganismen der Gattung E.coli liefert, besitzt das zweitgenannte Plasmid den Vorteil, daß es sowohl in der Gattung E. coli, als auch in der Gattung Pseudomonas putida eine hohe Expression des gewünschten Enzyms ergibt.Another subject of the invention are the plasmids pBT2a-1, DSM3148P and pBT306.16, DSM3149P. While the former plasmid provides a particularly high synthesis performance in microorganisms of the genus E. coli, the second-mentioned plasmid has the advantage that it gives high expression of the desired enzyme both in the genus E. coli, as well as in the genus Pseudomonas putida.
Wie bereits erwähnt, lassen sich die erfindungsgemäßen Mikroorganismen bzw. Plasmide nach Methoden der Gentechnologie gewinnen. So besteht das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von konstitutiv Creatinamidino-Hydrolase bildenden Mikroorganismen der genannten Gattungen darin, daß man DNA aus Pseudomonas putidaAs already mentioned, the microorganisms or plasmids according to the invention can be obtained by methods of genetic engineering. Thus, the process according to the invention for the production of constitutively creatinamidino-hydrolase-forming microorganisms of the mentioned genera consists in that DNA from Pseudomonas putida
a) mit Eco RI limitiert verdaut und ein 5,8 Kb-Bruchstück gewinnt odera) digested with Eco RI limited and wins a 5.8 Kb fragment or
b) mit Eco R1 und Pvu Il spaltet und ein 2,2 Kb-Bruchstück gewinnt,b) cleaves with Eco R1 and Pvu II and wins a 2.2 Kb fragment,
das nach a) oder b) erhaltene Bruchstück in einen mit dem bzw. den gleichen Restriktionsendonukleasen gespaltenen Vektor kloniert, diesen in einen für den gewählten Vektor geeigneten E.coli oder P. putida Stamm transformiert und die konstitutiv Creatinamidinohydrolase bildenden Klone isoliert. Kb steht hier für „Kilobasenpaar", also tausend Nukleotidbasenpaare. Die Information für die Expression der Creatinamidino-Hydrolase findet sich auf dem 5,8 Kb-Bruchstück, bzw. dessen Unterfragment von 2,2 Kb, welches in der oben erwähnten Weise mit der Restriktionsendonuklease Eco R1 alleine oder Eco R1 zusammen mit Pvu Il herausgespalten'wird. Die jeweiligen Fragmente werden nach den dem Gentechniker bekannten Methoden in einen Vektor kloniert, der mit der gleichen bzw. den gleichen Restriktionsendonukleasen gespalten wurde, um passende Enden zu schaffen. Alternativ, wenn auch nicht bevorzugt, ist es auch möglich, für E.coli oder Pseudomonas putida geeignete Vektoren mit anderen Restriktionsendonukleasen zu spalten, deren Spaltungsstellen am speziellen Vektor so angeordnet sind, daß die Replikationsfähigkeit des an der Spaltungsstelle mit einem der oben erwähnten DNA-Bruchstücke aus Pseudomonas putida ergänzten Vektors und seine Transformierbarkeit in einen Wirtsstamm aufrechterhalten bleibt. Als Vektor verwendet man vorzugsweise das Plasmid pBR322 und transformiert dieses nach dem Einfügen eines der beiden Pseudomonas putida DNA-Fragmente in einen geeigneten E.coli Stamm. Dem Fachmann sind zahlreiche E.coli Stämme bekannt, die sich mit dem Plasmid pBR322 und seinen Derivaten sehr gut transformieren lassen. Ein anderer bevorzugter Vektor ist der-Phage Charon 10. pBR322 sowie Derivate desselben sind ebenso wie -Vektoren kommerziell erhältlich.clones the fragment obtained according to a) or b) into a vector cleaved with the same or the same restriction endonucleases, transforms this into an E.coli or P.putida strain suitable for the selected vector and isolates the constitutively creatinamidinohydrolase-forming clones. Kb here stands for "kilobase pair", ie a thousand nucleotide base pairs The information for the expression of creatinamidino-hydrolase is found on the 5.8 Kb fragment, or its sub-fragment of 2.2 Kb, which in the manner mentioned above with the Restriction endonuclease Eco R1 alone or Eco R 1 is cleaved together with Pvu Il The respective fragments are cloned according to the methods known to the genetic engineer into a vector which has been cleaved with the same or the same restriction endonucleases to create suitable ends. although not preferred, it is also possible to cleave vectors suitable for E.coli or Pseudomonas putida with other restriction endonucleases whose cleavage sites on the particular vector are such that the ability to replicate at the cleavage site with one of the above-mentioned DNA fragments Pseudomonas putida supplemented vector and its transformability into a host strain remains maintained. The vector used is preferably the plasmid pBR322 and this is transformed after the insertion of one of the two Pseudomonas putida DNA fragments into a suitable E. coli strain. The skilled worker is aware of numerous E. coli strains which can be transformed very well with the plasmid pBR322 and its derivatives. Another preferred vector is the phage Charon 10. pBR322 as well as derivatives thereof as well as vectors are commercially available.
Mehr bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem man pBR322 mit Eco R1 und Pvu Il spaltet, das dabei gebildete 2,3 Kb-Fragment isoliert und mit dem 2,2 Kb Eco R1-Pvull Fragment aus P. putida verknüpft unter Bildung eines als pBT3-2 bezeichneten neuen Plasmids, welches man in E.coli transformiert. Man erhält so E.coli K12 ED8654 DSM3144.More preferably, a method in which pBR322 is cleaved with Eco R1 and Pvu II, the resulting 2.3 Kb fragment is isolated and linked to the 2.2 Kb Eco R1-Pvull fragment from P. putida to form one as pBT3 -2 designated new plasmid, which is transformed into E. coli. This gives E. coli K12 ED8654 DSM3144.
In der oben beschriebenen Weise mit dem Plasmidderivat aus pBR322 transformierte E.coli Stämme lassen sich sehr gut aufgrund ihrer Ampicillinresistenz selektieren. Da sie sowohl ampicillinresistent als auch Creatinamidino-Hydrolasebildnersind, können nicht transformierte Zellen nicht anwachsen und unter den angewachsenen Zellen lassen sich leicht diejenigen, welche das gewünschte Enzym bilden, nach einer weiter unten näher beschriebenen Methode herausfinden.In the manner described above with the plasmid derivative from pBR322 transformed E. coli strains can be very well selected for their ampicillin resistance. Since they are both ampicillin resistant and creatinamidino-hydrolase-forming, untransformed cells can not grow and among the grown cells, those which form the desired enzyme are easily found by a method described in more detail below.
Besonders gute Ergebnisse erhält man erfindungsgemäß, wenn man die pBT3-2 enthaltenden transformierten E. coli Zellen zum Zeitpunkt der Amplifikation des Plasmides mit Nitrosoguanidin behandelt, danach das Plasmid daraus isoliert, erneut in E.coli Zellen transformiert, diesen Zyklus gegebenenfalls wiederholt und aus den dabei erhaltenen Mikroorganismusklonen mit besonders ausgeprägter Creatinamidino-Hydrolase-Aktivität das Plasmid pBT2a-1, DSM3148P, welches ebenfalls einen Gegenstand der Erfindung darstellt, gewinnt. Wie oben bereits erwähnt, produzieren E.coli Zellen, welche dieses Plasmid enthalten, bis zu 50% an Creatinamidino-Hydrolase, bezogen auf ihre gesamte Proteinbildung.According to the invention, particularly good results are obtained by treating the transformed E. coli cells containing pBT3-2 with nitrosoguanidine at the time of amplification of the plasmid, then isolating the plasmid therefrom, transforming it again into E. coli cells, optionally repeating this cycle and removing it thereby obtained microorganism clones with particularly pronounced creatinamidino-hydrolase activity, the plasmid pBT2a-1, DSM3148P, which is also an object of the invention, wins. As mentioned above, E. coli cells containing this plasmid produce up to 50% of creatinamidino-hydrolase based on their total protein formation.
Ein Screeningsystem, welches es gestattet, gebildete Mikroorganismenklone mit besonders hoher Aktivität an Creatinamidino-Hydrolase zu identifizieren, erhält man, indem man derartige Klone mit Agaroseplatten kontaktiert, welche Creatin, Sarcosinoxidase, Peroxidase und ein H202-Farbindikatorsystem gelöst enthalten. Man wählt dann diejenigen Klone für die Vermehrung aus, welche die stärkste Färbung entsprechend der stärksten Enzymbildung ergeben. Als H202-Farbindikatorsystem wird bevorzugt 4-Aminoantipyrin in Kombination mit N-Ethyl-N-(sulfoethyl)-3-methylanilinsalz, zweckmäßig das Kaliumsalz, verwendet.A screening system which makes it possible to identify formed microorganism clones with particularly high activity of creatinamidino-hydrolase is obtained by contacting such clones with agarose plates which contain dissolved creatine, sarcosine oxidase, peroxidase and an H 2 O 2 color indicator system. One then selects those clones for the multiplication, which give the strongest color corresponding to the strongest enzyme formation. As the H 2 0 2 Farbindikatorsystem preferably 4-aminoantipyrine in combination with N-ethyl-N- (sulfoethyl) -3-methylanilinsalz, suitably the potassium salt used.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich auch Plasmide herstellen, die nicht nur zur Expression des Enzyms in E. coli, sondern auch in P. putida geeignet sind. Vorzugsweise verfährt man hierfür so, daßmanauspBT2a-1 durch Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Pvu I und Pvu Il ein 2,8 Kb-Fragment gewinnt und dieses mit einem weiteren, 10 Kb-Fragment ligiert, welches aus pBT306.1 durch Spaltung mit Pvu I und Sma I erhalten wird. Man erhält so das Plasmid pBT306.16, DSM 3149P, welches die konstitutiveCreatinamidino-Hydrolase-Bildung sowohl in E.coli als auch in P. putida bewirkt. Es ist überraschend, daß erfindungsgemäß eine wesentliche Erhöhung der Enzymbildung erreicht wird. Es wurde nämlich zwar schon mehrfach berichtet, daß durch die Anwendung der Methoden der DNA-Neukombination durch Erhöhung der Kopienzahl eines bestimmten Gens eine gesteigerte Genexpression gelungen ist. Es kann jedoch nicht davon ausgegangen werden, daß die Übertragung von Genen aus Pseudomonas in E.coli mit Wahrscheinlichkeit zu einer Erhöhung der Genexpression führt. Tatsächlich ist sogar für die Mehrzahl der durch DNA-Neukombination aus Pseudomonas in E.coli übertragene Gene eineWith the method according to the invention, it is also possible to produce plasmids which are suitable not only for expression of the enzyme in E. coli but also in P. putida. Preferably, the procedure is such that one obtains a 2.8 Kb fragment from pBT2a-1 by cleavage with the restriction endonucleases Pvu I and Pvu II and ligates this with another, 10 Kb fragment which is obtained from pBT306.1 by cleavage with Pvu I and Sma I is obtained. This gives the plasmid pBT306.16, DSM 3149P, which causes constitutive creatinamidino-hydrolase formation in both E.coli and P. putida. It is surprising that according to the invention a substantial increase of the enzyme formation is achieved. It has indeed been reported several times that increased gene expression has been achieved by using the methods of DNA recombination by increasing the copy number of a particular gene. However, it can not be expected that the transfer of Pseudomonas genes to E. coli is likely to increase gene expression. Indeed, even for the majority of genes transduced by Pseudomonas DNA recombination into E. coli, one is
Reduktion der Genexpression berichtet worden (vgl. z. B. Stanisisch und Ortiz, J. Gen. Microbiol., 1976,94,281-289, Nakazawa et al., J. Bacteriol., 1978,134, 270-277, Ribbons et al., Soc. Gen. Microbiol., Quart., 1978,6,24-25, Franklin et al., in Microbiol.Reduction of gene expression has been reported (see, e.g., Stanisisch and Ortiz, J. Gen. Microbiol., 1976, 94, 281-289, Nakazawa et al., J. Bacteriol., 1978, 134, 270-277, Ribbons et al , Soc. Gen. Microbiol., Quart., 1978, 6, 24-25, Franklin et al., In Microbiol.
Degradation of Xenobiotics and Recalicitrant Compounds, Leisinger Cook, Hütter und Nuesch Hrsgb., 1981,109-130). Daß eine derartige Verbesserung nicht erwartet werden kann, zeigt eine Betrachtung der verschiedenen biologischen Syntheseschritte, die ablaufen müssen, bis endlich ein enzymatisch aktives Protein gebildet wird.Degradation of Xenobiotics and Recalcitrant Compounds, Leisinger Cook, Hütter and Nuesch Hrsgb., 1981, 109-130). That such an improvement can not be expected is shown by a consideration of the various biological steps of synthesis that must take place until finally an enzymatically active protein is formed.
Die Information für ein Protein ist in der Desoxyribonucleinsaure (DNA) enthalten. Diese DNA wird durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase in mRNA (Boten ribonucleinsäure) übersetzt. Die so synthetisierte mRNA wird an den Ribosomen in Protein übersetzt, dabei bestimmen jeweils drei Nucleotide (Triplett oder Codon) — nach den Gesetzen des genetischen Codes — den Einbau einer bestimmten Aminosäure.The information for a protein is contained in the deoxyribonucleic acid (DNA). This DNA is translated into mRNA (messenger ribonucleic acid) by a DNA-dependent RNA polymerase. The mRNA synthesized in this way is translated into protein at the ribosomes. Three nucleotides (triplet or codon) - according to the laws of the genetic code - determine the incorporation of a specific amino acid.
Kontrollbereiche auf DNA-Ebene bestimmen, an welcher Stelle ein Strang der DNA in mRNA übersetzt wird (Promotorsequenzen) bzw. an welcher Stelle die Synthese der mRNA gestoppt wird. (Terminationssequenz).Control areas at the DNA level determine at which point a strand of the DNA is translated into mRNA (promoter sequences) or at which point the synthesis of the mRNA is stopped. (Termination).
Stopp- und Startsequenzen sind ebenso auf der Ebene der Proteinsynthese (Translation) bekannt. Dabei bestimmt im allgemeinen ein ATG (das in f-Methionin übersetzt wird) den Beginn eines Proteins und z. B. ein TAA oder ein TAG das Ende der Translation.Stop and start sequences are also known at the level of protein synthesis (translation). In general, an ATG (translated into f-methionine) will determine the onset of a protein, and z. For example, a TAA or a TAG is the end of translation.
Das Ausmaß der Expression einer Polypeptidsequenz ist von mehreren Faktoren abhängig: z.B.u.a.vonder Qualität der Promotorsequenz, mRNA-Stabilität, Sekundär- und Tertiärstruktur der mRNA, Qualität der ribosomalen Bindungsstelle, Abstand der ribosomalen Bindungsstelle vom Startcodon (ATG), Nucleotidsequenz zwischen ribosomaler Bindungsstelle und Startcodon (ATG) und dem Vorhandensein effizienter Stoppsignale auf Transskriptions- und Translationsebene. Ohne genaue Kenntnis der Primärstruktur des Gens und des von diesem kodierten Proteins kann nicht gezielt in die oben beschriebenen Regulationsprozesse der Genexpression eingegriffen werden. Da diese genauen Kenntnisse im vorliegenden Falle nicht vorhanden waren, konnte die verbesserte Syntheseleistung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen und Plasmide nicht vorhergesehen werden.The level of expression of a polypeptide sequence depends on several factors: eg, the quality of the promoter sequence, mRNA stability, secondary and tertiary structure of the mRNA, quality of the ribosome binding site, ribosomal binding site spacing from start codon (ATG), nucleotide sequence between ribosomal binding site, and start codon (ATG) and the presence of efficient stop signals at the transcriptional and translational level. Without precise knowledge of the primary structure of the gene and of the protein encoded by it, it is not possible to deliberately intervene in the regulatory processes of gene expression described above. Since this exact knowledge was not present in the present case, the improved synthesis performance of the microorganisms and plasmids according to the invention could not be foreseen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als E. coli vorteilhaft Derivate des E. coli K 12-Stammes verwendet. Unter diesen wurden beispielsweise erfolgreich eingesetzt:In the context of the present invention, derivatives of the E. coli K 12 strain are advantageously used as E. coli. Among these, for example, were used successfully:
E.coli K12, W3350 (thi, galK, galT, rpsl, von P.Tiollais), DSM3141E. coli K12, W3350 (thi, galK, galT, rpsl, from P. Tiollais), DSM3141
E.coli K12, ED8654 (trp R, hsd M+, hsd R", sup E, sup F, von K. Murray), DSM 2102 E.coli K12, CSH1 (thi, trp, Iac z, rpsl aus Cold Spring Harbor Stammsammlung), DSM 3142 Als Wirtszellen vom Pseudomonas putida Stamm können Wildtypisolate aber auch Laborstämme eingesetzt werden. Besonders gute Ergebnisse wurden erzielt mit Pseudomonas putida 2440, DSM 2106 (Gene 1981, 237-247).E. coli K12, ED8654 (trp R, hsd M + , hsd R ", sup E, sup F, by K. Murray), DSM 2102 E. coli K12, CSH1 (thi, trp, Iac z, rpsl from Cold Spring Harbor strain collection), DSM 3142. Wild type isolates as well as laboratory strains can be used as host cells of the Pseudomonas putida strain and particularly good results were obtained with Pseudomonas putida 2440, DSM 2106 (Gene 1981, 237-247).
Als Vektorsysteme für die Expression in E.coli werden erfindungsgemäß, wie erwähnt, vorzugsweise genetisch manipulierte Derivate des handelsüblichen PlasmidspBR322 (Gene 1977, 95-113) verwendet. Für die Expression in Pseudomonas-Stämmen werden vorzugsweise genetisch abgewandelte Derivate des Plasmids pRSF1010 (Gene 1981, 237-247) verwendet. Bei Verwendung der oben angegebenen Restriktionsendonukleasen für die Konstruktion der genetisch abgewandelten Plasmide der Erfindung erhält man die Creatinamidinohydrolase kodierende Genabschnitte, welche noch das Expressions-Vektor-System und einen Regulationsursprung, der eine erhöhte Kopienzahl des Vektorsystems in der Wirtszelle bewirkt, sowie Gene, auf deren Produkte leicht selektioniert werden kann (z. B. Antibiotika-Resistenzen) enthalten.As vector systems for expression in E. coli, according to the invention, as mentioned, preferably genetically manipulated derivatives of the commercially available plasmid pBR322 (Gene 1977, 95-113) are used. For expression in Pseudomonas strains, preferably genetically modified derivatives of the plasmid pRSF1010 (Gene 1981, 237-247) are used. Using the above-mentioned restriction endonucleases for the construction of the genetically modified plasmids of the invention, one obtains the creatine amidinohydrolase-encoding gene segments, which still has the expression vector system and a regulatory origin causing an increased copy number of the vector system in the host cell, as well as genes on which Products can be easily selected (eg antibiotic resistance).
Im Nachstehenden wird die Erfindung in Verbindung mit der Zeichnung und den Beispielen näher beschrieben. In der Zeichnung stellen dar:In the following the invention will be described in more detail in connection with the drawing and the examples. In the drawing represent:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Herstellung des Plasmids pBT3-2 unter Verwendung des 2,2 Kb-Fragments aus der Pseudomonas putida DNA und des Plasmids pBR322 als Ausgangsmaterial.Fig. 1 is a schematic representation of the preparation of the plasmid pBT3-2 using the 2.2 Kb fragment from the Pseudomonas putida DNA and the plasmid pBR322 as starting material.
Fig. 2 zeigt die erfindungsgemäße Herstellung des Plasmids pBT306.1 aus den Plasmiden RSF1010 und pACYC177 und Fig.3 zeigt die Bildung des erfindungsgemäßen Plasmids pBT306.16 aus pBT306.1 und pBT2a-1 schematisch. Fig. 4 zeigt ein SDS Gel, in dem Zellextrakte aufgetragen sind, von2 shows the preparation according to the invention of the plasmid pBT306.1 from the plasmids RSF1010 and pACYC177, and FIG. 3 shows the formation of the plasmid pBT306.16 according to the invention from pBT306.1 and pBT2a-1 schematically. Fig. 4 shows an SDS gel in which cell extracts are applied, from
Spalte 1: Ausgangsstamm Pseudomonas putida,Column 1: starting strain Pseudomonas putida,
Spalte 2: dem das Plasmid pBT2a-1 tragenden E.coli Wirtsstamm ED, Spalte 4: Wirtsstamm ED undColumn 2: the E.coli host strain ED carrying the plasmid pBT2a-1, column 4: host strain ED and
Spalte 3: zum Vergleich 15/xg der gereinigten CreatinaseColumn 3: for comparison 15 / xg of the purified creatinase
Fig. 5 zeigt die das Enzym Creatinamidinohydrolase kodierende DNA-Sequenz und die aus der DNA-Sequenz resultierende Proteinsequenz. Figure 5 shows the DNA sequence encoding the enzyme creatinamidinohydrolase and the protein sequence resulting from the DNA sequence.
Um positive Klone, d. h. Mikroorganismenklone, welche konstitutiv Creatinamidinohydrolase bilden, herauszufinden, kann erfindungsgemäß ein Screening-System eingesetzt werden, welches nach dem Prinzip des Enzymimmunotests arbeitet. Hierbei werden spezifische Antikörper gegen die Creatinamidino-Hydrolase an einen geeigneten Träger, z. B. eine Polyvinyl-Folie fixiert, die Folie wird auf lysierte Kolonien oder auch auf Plaques aufgelegt. Nach Waschen mit H2O wird die Folie mit dem gleichen spezifischen Antikörper in Form eines Enzymkonjugats (z. B. mit Peroxidase) inkubiert. Liegt ein das Enzym produzierender Klon vor, so entsteht ein Sandwich aus Antikörper Antigen und enzymmarkiertem Antikörper. Das Antikörper-Peroxidase-Konjugat gibt in einem geeigneten Farbindikatorsystem eine Färbung, z. B. bei einem Indikatorsystem aus Tetramethylbenzidin, Dioctylnatriumsulfosuccinat und H2O2 in Gelatine grüne Farbflecken. Dieses System ergibt eine Nachweisgrenze von 10pg bis 100 pg Proteinantigen. Die Herstellung eines derartigen Enzymimmunotests und die Präparation geeigneter Antikörper kann nach der Anleitung zu „Testkombination Genexpression" Boehringer Mannheim GmbH, erfolgen.In order to find out positive clones, ie microorganism clones constitutively constituting creatinamidinohydrolase, a screening system can be used according to the invention, which works on the principle of the enzyme immunoassay. In this case, specific antibodies against the Creatinamidino-hydrolase to a suitable carrier, for. As a polyvinyl foil fixed, the film is placed on lysed colonies or on plaques. After washing with H2O, the film is incubated with the same specific antibody in the form of an enzyme conjugate (eg with peroxidase). If a clone producing the enzyme is present, a sandwich of antibody antigen and enzyme-labeled antibody results. The antibody-peroxidase conjugate gives a staining in a suitable color indicator system, e.g. For example, in an indicator system of tetramethylbenzidine, dioctylsodium sulfosuccinate and H 2 O 2 in gelatin, green stains of color. This system gives a detection limit of 10 pg to 100 pg of protein antigen. The production of such an enzyme immunoassay and the preparation of suitable antibodies can be carried out according to the instructions for "Test combination gene expression" Boehringer Mannheim GmbH.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.
A) Isolierung der Chromosomalen Pseudomonas putida DNA >.A) Isolation of the chromosomal Pseudomonas putida DNA>.
Die chromosomale DNA von Pseudomonas putida DSM 2106 wird nach Lyse der Zellen und Aufwickeln der DNA auf einenThe chromosomal DNA of Pseudomonas putida DSM 2106 is after lysis of the cells and wound the DNA to a
Glasstab isoliert und nach 2 Phenolisierungen und Ethanolfällung in einer Konzentration von 600/xg/ml gelöst (Cosloy und Oishi, Molec. Gen. Genet., 1973,124,1-10).Glass rod isolated and dissolved after 2 phenolizations and ethanol precipitation at a concentration of 600 / xg / ml (Cosloy and Oishi, Molec. Gen. Genet., 1973, 124, 1-10).
10ytig chromosomale DNA werden limitiert mit 5 Einheiten Eco Rl, E.C. 3.1.23.11,30 Minuten gespalten und das Ausmaß der Verdauung im Agarose Gel analysiert.10ytig chromosomal DNA are limited with 5 units of Eco RI, E.C. 3.1.23.11.30 minutes and analyzed the extent of digestion in the agarose gel.
B) Isolierung und Reinigung von ACharon 10DNAB) Isolation and purification of ACharon 10DNA
1010 Bakterien des Stammes E. coli ED DSM 2102 werden mit 5 χ 108APhagen Charon 10 für 20 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend bis zum Beginn der Lyse der Bakterien in 500 ml Vollmedium wachsen gelassen. Die Prozedur der Phagen- · und DNA-Isolierung erfolgte exakt nach der Vorschrift von Maniatis et al., in: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982,76-85.10 10 bacteria of the strain E. coli ED DSM 2102 are incubated with 5 × 10 8 APhagen Charon 10 for 20 minutes at 37 ° C and then allowed to grow until the beginning of the lysis of the bacteria in 500 ml of complete medium. The procedure of phage and DNA isolation was performed exactly according to the protocol of Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 76-85.
10/xg Charon 10 DNA werden vollständig mit Eco Rl gespalten. 1 /ng limitiert mit Eco Rl verdaute chromosomale Pseudomonasputida DNA gemäß A) wird mit3μg mit Eco Rl gespaltener Charon 10 DNA mit 40 Einheiten des Enzyms T4 DNA Ligase inkubiert. Das Verpacken der zusammenligierten DNA-Fragmente in Kopf- und Schwanzproteine des Phagen λ erfolgt im Reagenzglas. Die Herstellung der zur Verpackung notwendigen Proteine sowie die Verpackung der DNA erfolgt nach Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 1982,256-291 (in vitro Verpackungssysteme für λ DNA Partikel sind kommerziell erhältlich, z.B. „DNA-Packaging Kit"). Zirka 0,5μg der zusammengeknüpften λ und Pseudomonas putida DNA wurden mit 20 μΙ des in vitro Verpackungsansatzes inkubiert, nach 60 Minuten werden 0,5 ml SM Puffer (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory 1982,443) zugegeben und V200 Volumen (2,5μΙ) des Verpackungsansatzes mit 200μΙ einer Übernachtkultur des Stammes ED (in 10~2 M Magnesiumsulfat) für 10 Minuten bei 370C inkubiert. Die Bakteriensuspension wird anschließend mit 3ml LB (Miller in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972, 433) Agarose (0,8%) gemischt und auf LB Platten gegossen. Pro 1 μ,ς eingesetzter DNA werden ca. 10s Phagenlöcher (Plaques) erhalten. Zur Identifizierung von Pagen, die ein Creatinase kodierendes Gen enthalten, wird der vorher beschriebene Enzym-lmmunotest verwendet. Das Indikatorsystem besteht aus 6mg/ml Tetramethylbenzidin, 20mg/ ml Dioctylnatriumsulfosuccinat und 0,01 %H2O2 in 6%iger Gelatine. Pro 1 000 Plaques werden zwei positive Signale festgestellt.10 / xg of Charon 10 DNA are digested to completion with Eco RI. 1 / ng limited with Eco Rl digested chromosomal Pseudomonasputida DNA according to A) is incubated with 3 ug with Eco Rl digested Charon 10 DNA with 40 units of the enzyme T4 DNA ligase. The packaging of the ligated DNA fragments into head and tail proteins of the phage λ takes place in the test tube. The preparation of the proteins required for packaging and the packaging of the DNA is carried out according to Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 256-291 (in vitro packaging systems for λ DNA particles are commercially available, eg "DNA Packaging Kit"). Approximately 0.5 μg of the pooled λ and Pseudomonas putida DNA were incubated with 20 μΙ of the in vitro packaging batch, after 60 minutes 0.5 ml of SM buffer (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory 1982,443) was added and V200 volume (2,5μΙ) incubating the packaging approach with 200μΙ of an overnight culture of the strain ED (in 10 -2 M magnesium sulphate) for 10 minutes at 37 0 C. the bacterial suspension is then (with 3 ml of LB Miller in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972, 433) agarose (0.8%) mixed and poured onto LB plates. Pro 1 μ, ς inserted DNA are obtained approximately 10 s phage holes (plaques). in order to identify pages that ei containing creatinase-encoding gene, the enzyme immunoassay previously described is used. The indicator system consists of 6 mg / ml tetramethylbenzidine, 20 mg / ml dioctyl sodium sulfosuccinate and 0.01% H 2 O 2 in 6% gelatin. Two positive signals are detected per 1000 plaques.
C) Reklonierung des Creatinase-Gens in E. coliC) Recloning of the creatinase gene in E. coli
Von fünf im Enzymimmunotest positiven Plaques wurde, wie vorher beschrieben, Phagen-DNA präpariert. Spaltung der fünf verschiedenen DNAs mit Eco Rl zeigten neben unterschiedlichen Banden eine gemeinsame DNA-Bande in allen fünf Phagen DNAs von 5,8 Kb. Das 5,8 Kb große Fragment wurde mit verschiedenen Restriktionsnukleasen charakterisiert (Fig. 1). Aus ca. 5μg dieses Eco Rl Fragments wurde unter Verwendung von Pvu Il ein 2,2 Kb-Fragment gespalten. Die entstehenden DNA Fragmente werden in einem niedrig schmelzenden Agarosegel nach ihrer Größe getrennt und das 2,2 Kb Eco Rl — Pvu Il Fragment isoliert. Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus niedrigschmelzenden Agarosegelen erfolgt, indem die entsprechende Bande ausgeschnitten, in ein Reagenzglas (Eppendorfröhrchen) überführt und mit etwa dem zweifachen Volumen Wasser versetzt wird. Anschließend wird so lange bei 65°C inkubiert (5 bis 10 Minuten) bis die Agarose geschmolzen ist, die Probe wird kurz geschüttelt und mit einem halben Volumen Phenol (neutralisiert mit 1OmM TRIS-HCI pH 7,5 und 1 mM EDTA, TE) kräftig geschüttelt. Die Phasen werden durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 15000g getrennt und die obere wäßrige Phase erneut mit Phenol ausgeschüttelt. Nach einer Zentrifugation von 10 Minuten bei 15000 g wird die obere Phase zweimal mit je 1 ml Ether ausgeschüttelt, der Ether bei 650C abgedampft und die DNA mit V10 Volumen 3 M Na-acetatpH7,2 und 2,5fachem Volumen Ethanol bei -200C gefällt. Die DNA wird durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 15000g sedimentiert im Vakuum getrocknet und in 1ΟμΙ TE aufgenommen. Alle weiter beschriebenen Fragmentisolierungen erfolgen nach dieser Prozedur.Of five plaques positive in the enzyme immunoassay, phage DNA was prepared as previously described. Cleavage of the five different DNAs with Eco RI showed, in addition to different bands, a common DNA band in all five phage DNAs of 5.8 Kb. The 5.8 Kb fragment was characterized with various restriction nucleases (FIG. 1). From approximately 5 μg of this Eco RI fragment was cleaved using Pvu II a 2.2 Kb fragment. The resulting DNA fragments are separated by size in a low melting agarose gel and the 2.2 Kb Eco Rl - Pvu II fragment isolated. The isolation of DNA fragments from low-melting agarose gels by cutting out the appropriate band, transferred into a test tube (Eppendorf tube) and mixed with about twice the volume of water. The mixture is then incubated at 65 ° C (5 to 10 minutes) until the agarose is melted, the sample is shaken briefly and with half a volume of phenol (neutralized with 1OmM TRIS-HCl pH 7.5 and 1 mM EDTA, TE) shaken vigorously. The phases are separated by centrifugation for 10 minutes at 15000g and the upper aqueous phase shaken out again with phenol. After centrifugation for 10 minutes at 15000 g, the upper phase is extracted by shaking twice with 1 ml of ether, the ether evaporated at 65 0 C and the DNA with V10 volume of 3 M Na-acetate pH 7.2 and 2.5fachem volume of ethanol at -20 0 C like. The DNA is sedimented by centrifugation for 10 minutes at 15000g dried in vacuo and taken up in 1ΟμΙ TE. All fragment isolation further described follow this procedure.
Zirka 4^.g pBR 322 DNA werden mit Eco Rl und Pvu Il gespalten und ein 2,3 Kb Fragment isoliert, 0^g dieses pBR 322 Fragments werden über Nacht unter Verwendung von fünf Einheiten T4 DNA Ligase mit 0,5μg des 2,2 Kb Eco Rl-Pvu Il Fragments aus dem vorher beschriebenen λ Phagen inkubiert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pBT3-2 und kodiert in E. coli eine biologisch aktive Creatinase.About 4 ^ .g of pBR 322 DNA are cleaved with Eco Rl and Pvu II and a 2.3 Kb fragment isolated, 0 ^ g of this pBR 322 fragment are incubated overnight using five units of T4 DNA ligase with 0.5 μg of 2, 2 Kb Eco RI-Pvu II fragment from the previously described λ phage incubated. The resulting plasmid is called pBT3-2 and encodes a biologically active creatinase in E. coli.
Die Creatinase codierende DNA aus Plasmid pBT3-2 wird exakt nach der Methode von Talmadge und Gilbert, Gene, 1980,12, 235—241, während der Amplifikationsphase mit Nitrosoguanidin behandelt. Anschließend wird die Plasmid-DNA nach Lyse der Zellen über die CsCI-Ethidiumbromid Methode isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982,88-94). Kompetente Zellen des Stammes E. coli ED 8654 werden mit Plasmid DN A transformiert (Maniatis et al.. Molecular Cloning Cold Spring Harbor, 1982, 250-251) und auf Vollmediumplatten (LB) die 20μg/ml Ampicillin enthalten, ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37 0C werden die Kolonien auf LB Platten gestempelt, auf die zuvor ein Nitrocellulose Filterpapier aufgelegt wurde. Nach Bebrütung der Platten für 12 bis 18 Stunden bei 37°C wird der Nitrocellulosefilter mit den Kolonien abgehoben und in eine Glaspetrischale (020cm) überführt, in die 1 ml Chloroform/Toluol (1:1) gegeben wurde. Inkubation erfolgt für 20 Minuten bei 37°C. Der Nitrocellulosefilter wird anschließend auf eine Indikator-Ägaroseplatte so aufgelegt, daß ein direkter Kontakt zwischen Zellen und Indikatorplatte entsteht. Die Farbreaktion erfolgt in Abhängigkeit von der Zeit und der Menge der in den einzelnen Klonen synthetisierten Creatinase. Aus dem oben beschriebenen Aktivitätsscreeriing wird der Kloi. ED mit dem Plasmid pBTSfa-1, DSM3143 isoliert. Dieses Plasmid kodiert eine Creatinase, die ca. 50% des löslichen Proteins der Zellen ausmacht. Dieses Verfahren zeigt Fig. 1 schematisch.The creatinase-encoding DNA from plasmid pBT3-2 is treated exactly with the method of Talmadge and Gilbert, Gene, 1980, 12, 235-241, during the amplification phase with nitrosoguanidine. Subsequently, after lysis of the cells, the plasmid DNA is isolated by the CsCl-ethidium bromide method (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982, 88-94). Competent cells of strain E. coli ED 8654 are transformed with plasmid DN A (Maniatis et al., Molecular Cloning Cold Spring Harbor, 1982, 250-251) and plated on whole medium plates (LB) containing 20 μg / ml ampicillin. After incubation overnight at 37 0 C, the colonies are stamped on LB plates on which a nitrocellulose filter paper was previously placed. After incubation of the plates for 12 to 18 hours at 37 ° C, the nitrocellulose filter with the colonies is lifted off and transferred to a glass petri dish (020 cm) into which 1 ml of chloroform / toluene (1: 1) was added. Incubation is for 20 minutes at 37 ° C. The nitrocellulose filter is then placed on an indicator agarose plate so that direct contact between the cells and the indicator plate is formed. The color reaction takes place as a function of the time and the amount of creatinase synthesized in the individual clones. From the Aktivitätsscreeriing described above is the Kloi. ED with the plasmid pBTSfa-1, DSM3143 isolated. This plasmid encodes a creatinase, which makes up about 50% of the soluble protein of the cells. This method is shown in FIG. 1 schematically.
Alternativ zu der hier beschriebenen direkten NG-Mutagenese kann auch durch Einfügung eines Fremdpromotors, z. B. des Lactosepromotors (dieser kann z. B. aus kommerziell erhältlichen Plasmiden, wie z. B. den pUC-Plasmiden, als DNA-Fragment isoliert werden), eine Expressionssteigerung der Creatinase erhalten werden. Dazu wird Plasmid pBT3-2 an der EcoR1-Stelle geöffnet, mit der Exonuclease BaI 31 so behandelt, daß ca. 10 bis 100 Bp von jeder Seite entfernt werden. Dann wird der Lactose-Promotor mit Hilfe des Enzyms T4-Ligase, unter Verknüpfung der Enden, in das verkürzte Plasmid pBT3-2 einligiert. Diese DNA wird dann, wie oben beschrieben, mit Nitroso-Guanidin mutagenisiert, anschließend für die Transformation des Stammes ED verwendet und die Klone werden in dem beschriebenen Plattenscreening auf hohe Genexpression getestet.Alternatively to the direct NG mutagenesis described here, it is also possible to introduce a foreign promoter, e.g. For example, the lactose promoter (which can be isolated, for example, from commercially available plasmids, such as, for example, the pUC plasmids, as a DNA fragment), an increase in the expression of creatinase can be obtained. For this purpose, plasmid pBT3-2 is opened at the EcoR1 site, treated with the exonuclease BaI 31 so that about 10 to 100 bp are removed from each side. The lactose promoter is then ligated into the truncated plasmid pBT3-2 with the aid of the enzyme T 4 -ligase, linking the ends. This DNA is then mutagenized with nitroso-guanidine as described above, then used to transform the strain ED, and the clones are tested for high gene expression in the plate screening described.
Die vorstehend erwähnte Indikator-Agaroseplatte stellt ein Testsystem für ein Aktivitätsscreening dar, dessen Prinzip darin besteht, aus Creatin durch die Enzyme Creatinamidino-Hydrolase und Sarcosinoxidase das gebildete H2O2 über Peroxidase (POD) in 72O2 und H2O zu spalten und den Sauerstoff mit dem Farbindikatorsystem z. B. aus 4-Aminoantipyrin (4-AAP) und N-Ethyl-N-(sulfoethyl)-3-methylanilin, K-SaIz (EST) reagieren zu lassen. Es entsteht eine blau-violette Färbung, die bei Überschuß der Enzyme Sarcosinoxidase und Peroxidase ein Maß für in den Kolonien synthetisierte Creatinamidino-Hydrolase darstellt.The above-mentioned indicator agarose plate represents a test system for activity screening, the principle of which is to split from creatine by the enzymes creatinamidino-hydrolase and sarcosine oxidase the H 2 O 2 formed via peroxidase (POD) into 72O 2 and H 2 O and the oxygen with the color indicator system z. B. from 4-aminoantipyrine (4-AAP) and N-ethyl-N- (sulfoethyl) -3-methylaniline, K-SaIz (EST) to react. The result is a blue-violet color, which represents a measure of creatinamidino-hydrolase synthesized in the colonies in excess of the enzymes sarcosine oxidase and peroxidase.
Testprinzip:Test principle:
Creatinamidino-Creatin + H2O Hydrolase 3 Sarcosin + HarnstoffCreatinamidino creatine + H 2 O hydrolase 3 sarcosine + urea
Sarcosin +O2 +H2O Sa rc—OD Glycin + Formaldehyd + H2O2 Sarcosine + O 2 + H 2 O Sa rc-OD glycine + formaldehyde + H 2 O 2
H2O2 + 4—AAP + EST POD Farbstoff + 2H2OH 2 O 2 + 4-AAP + EST POD dye + 2H 2 O
Zusammensetzung des Creatinamidino-Hydrolase Aktivitätsscreening SystemsComposition of creatinamidino-hydrolase activity screening system
1. Creatin 1OmM Endkonzentration1. Creatine 10 mM final concentration
2. NaN3 0,5mM Endkonzentration2. NaN 3 0.5mM final concentration
3. TrisHCIpH7,8 2OmM Endkonzentration3. TrisHClpH7.8 2OmM final concentration
4. SarcosinOxidase 5 U/ml Endkonzentration4. Sarcosine oxidase 5 U / ml final concentration
5. Peroxidase 2,5 U/ml Endkonzentration . 6. 4-AAP 0,25 mg/ml Endkonzentration5. Peroxidase 2.5 U / ml final concentration. 6. 4-AAP 0.25 mg / ml final concentration
7. EST 1,5 mg/ml Endkonzentration7. EST 1.5 mg / ml final concentration
Die unter 1 bis 7 angegebenen Reagenzien werden gelöst und mit gleichem Volumen niedrig schmelzender Agarose (2%) gemischt. 6 ml werden in eine Petrischale gegossen, die Platten können ca. 2 Wochen bei 4°C in der Dunkelheit gelagert werden.The reagents listed under 1 to 7 are dissolved and mixed with the same volume of low-melting agarose (2%). 6 ml are poured into a Petri dish, the plates can be stored for about 2 weeks at 4 ° C in the dark.
Zur Klonierung und Expression der klonierten Creatinamidino- Hydrolase im Pseudomonas putida wird Plasmid RSF1010 (Bagdasarian et al., Gene 1981,16, 237-247) verwendet. RSF1010 wurde mit Pvull linearisiert und aus Plasmid pACYC177 (Chang und Cohen, J. Bacteriol., 1978 134,1141-1156) nach Haell Spaltung das 1,4Kb Fragment isoliert. 0,2/xg RSF1010 DNA wurden mit 1 μg des Haell Fragments unter Verwendung von T4 Ligase verknüpft, das resultierende Plasmid ist pBT306.1 (Fig. 2). RSF1010 und Derivate dieses Plasmids zeichnen sich durch einen weiten Wirtsbereich aus (Gene, 16 [1981] 237-247) und sind z. B. geeignet, sich sowohl in Pseudomonaden als auch in E. colizu amplifizieren. Plasmid pBT2a-1 wurde mit Pvu I und Pvull gespalten und das 2,8Kb Fragment isoliert, pBT306.1 wird mit Pvu I und Smal gespalten und das 10Kb Fragment isoliert. 0,5/ig des Vektors DNA wird mit 0,5/u.g des Pvu I-Pvu Il Fragments ligiert. E. coli ED wird transformiert und Creatinase kodierende Klone werden mit Hilfe des vorher beschriebenen Platten-Aktivitätsscreenings identifiziert. Von einem der positiven Klone wird nach der vorher beschriebenen CsCI — Ethidiumbromid Methode Plasmid DNA präpariert. Das Plasmid trägt die Bezeichnung pBT306.16, DSM3149 (Fig.3).For cloning and expression of the cloned creatinamidino-hydrolase in Pseudomonas putida plasmid RSF1010 (Bagdasarian et al., Gene 1981, 16, 237-247) is used. RSF1010 was linearized with Pvull and isolated from plasmid pACYC177 (Chang and Cohen, J. Bacteriol., 1978, 134, 1141-1156) after Haell digestion of the 1.4 Kb fragment. 0.2 / xg RSF1010 DNA were ligated with 1 ug of the Hae II fragment using T4 ligase, the resulting plasmid is pBT306.1 (Fig. 2). RSF1010 and derivatives of this plasmid are characterized by a wide host range (Gene, 16 [1981] 237-247) and are z. B. suitable to amplify in both Pseudomonas and E. coli. Plasmid pBT2a-1 was cleaved with Pvu I and Pvull and the 2.8Kb fragment isolated, pBT306.1 cleaved with Pvu I and SmaI and the 10Kb fragment isolated. 0.5 μg of the vector DNA is ligated with 0.5 μg of the Pvu I-Pvu II fragment. E. coli ED is transformed and creatinase-encoding clones are identified using the previously described plate activity screening. From one of the positive clones, plasmid DNA is prepared according to the previously described CsCl-ethidium bromide method. The plasmid is designated pBT306.16, DSM3149 (FIG. 3).
Die Transformation von Plasmid DNA in Pseudomonas putida 2440 erfolgt exakt nach der Methode von Franklin et al. in: Microbiol Degradation of Xenobioticsand RecalicitrantCompounds, Leisinger,Cook, Hütterund Nuesch,Hrgsb., 1981,109-130). Mit Hilfe des Plattenaktiviätsscreenings wurden positive Klone identifiziert. Dies ist bei Pseudomonas putida 2440 — obwohl dieser Stamm eine chromosomal kodierte Creatinamidino-Hydrolase enthält— möglich, da die Expression der Plasmidkodierten Creatinamidino-Hydrolase konstitutiv erfolgt. Dieses Unterscheidungsmerkmal erlaubt es, zwischen chromosomalkodierter und plasmid-kodierter Creatinamidino-Hydrolase zu diskriminieren.The transformation of plasmid DNA into Pseudomonas putida 2440 is carried out exactly according to the method of Franklin et al. in: Microbiol Degradation of Xenobiotics and Recalcitrant Compounds, Leisinger, Cook, Hütter and Nuesch, Eds., 1981, 109-130). Plate activity screening identified positive clones. This is possible with Pseudomonas putida 2440 - although this strain contains a chromosomally encoded creatinamidino-hydrolase - since the expression of the plasmid-encoded creatinamidino-hydrolase is constitutive. This distinguishing feature makes it possible to discriminate between chromosomally-encoded and plasmid-encoded creatinamidino-hydrolase.
Die Bestimmung der Creatinamidino-Hydrolase-Aktivität erfolgt über den Nachweis der in der Reaktionsfolge mit Urease gebildeten Ammoniumionen mit der Testkombination „Harnstoff" (Boehringer Mannheim, Best. Nr. 124770). Der Wildtyp Pseudomonas putida 2440 wird zur Bestimmung der Creatinamidino-Hydrolase-Aktivität in LB Medium (5 ml), das 1% Creatin enthält, bei 3O0C über Nacht inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und einmal in 5OmM Phosphatpuffer pH7,5 gewaschen. Die Zellen werden im ursprünglichen Volumen in Phosphatpuffer (5OmM pH7,5) aufgenommen und durch Ultraschallbehandlung (4 χ 30 Sekunden) aufgeschlossen. Anzucht und Aufschluß von Zellen, die ein Creatinamidino-Hydrolase kodierendes Plasmid enthalten, erfolgt in gleicher Weise, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß das Medium kein Creatin zur Induktion enthält und daß auf das Plasmid durch Zugabe von Ampicillin (20//,g/ml für Plasmid pBT3-2, pBT2a-1) bzw. Streptomycin (200^g/ml für Plasmid pBT306.16) selektioniert wird. Das Wachstum der Kulturen erfolgt -für Pseudomonas putida bei30°C,für E. coli bei 370C.The creatinamidino-hydrolase activity is determined by detecting the ammonium ions formed in the reaction sequence with urease using the test combination "urea" (Boehringer Mannheim, Order No. 124770. The wild-type Pseudomonas putida 2440 is used to determine the creatinamidino-hydrolase activity. activity in LB medium (5 ml) containing 1% creatine, incubated at 3O 0 C overnight. the cells are harvested by centrifugation and washed once in 5OmM phosphate buffer pH 7.5. the cells are in the original volume in phosphate buffer (5OmM pH7 5) and disrupted by sonication (4 × 30 seconds) Culture and digestion of cells containing a plasmid encoding creatinamidino-hydrolase are carried out in the same manner as described above, except that the medium is not creatine for induction and that on the plasmid by addition of ampicillin (20 //, g / ml for plasmid pBT3-2, pBT2a-1) and streptomycin (200 ^ g / ml for Pl asmid pBT306.16) is selected. The growth of the cultures takes place at 30 ° C -for Pseudomonas putida, for E. coli at 37 0 C.
Creatinamidino-Hydrolase in Pseudomonas putida und E.coliCreatinamidino-hydrolase in Pseudomonas putida and E. coli
Stamm/PlasmidStrain / plasmid
Aktivität U/lActivity U / l
Anzuchtcultivation
- Creatin + Creatin- creatine + creatine
- Creatin ± Creatin- creatine ± creatine
- Creatin- creatine
- Creatin- creatine
Die Daten zeigen, daß durch die Klonierung der Creatinamidino-Hydrolase 1). E.coli Bakterien die neue Eigenschaft erhalten Creatinamidino-Hydrolase zu synthetisieren und 2). diese Expression — im Gegensatz zum Ausgangsstamm Pseudomonas putida — sowohl für E. coli wie für Pseudomonas putida konstitutiv erfolgt. Des weiteren ist zu entnehmen, daß durch Mutagenese der Creatinamidino-Hydrolase kodierenden DNA eine besonders hohe Expression erzielt werden kann. (Erhöhung der Liter-Aktivität gegenüber dem nicht induzierten Ausgangsstamm, bei Pseudomonas Faktor 1800, bei E.coli Faktor 2800). In E.coli ED/pBT2a-1 DSM3143 beträgt die Aktivität 500 Einheiten/g Biomasse (feucht) bzw. die spezifische Aktivität 4,5U/mg Protein. Da die spez. Aktivität des hochgereinigten Proteins 9 U/mg beträgt, heißt das, daß die Creatinamidino-Hydrolase in E. coli 50% des löslichen Proteins ausmacht. Analyse eines Rohextrakts im SDS-GeI (Laemmli, Nature, 1970,227,680-685) zeigt, daß die Creatinamidino-Hydrolase die Hauptbande der löslichen Proteinfraktion darstellt (Fig.4, Spalte 2).The data show that by cloning the creatinamidino-hydrolase 1). E.coli bacteria get the new property to synthesize creatinamidino-hydrolase and 2). this expression - in contrast to the parent strain Pseudomonas putida - is constitutive of both E. coli and Pseudomonas putida. Furthermore, it can be seen that particularly high expression can be achieved by mutagenesis of DNA encoding creatinamidino-hydrolase. (Increasing the liter activity compared to the uninduced starting strain, with Pseudomonas factor 1800, with E. coli factor 2800). In E. coli ED / pBT2a-1 DSM3143 the activity is 500 units / g biomass (wet) or the specific activity is 4.5 U / mg protein. Since the spec. Activity of the highly purified protein is 9 U / mg, this means that the creatinamidino-hydrolase in E. coli makes up 50% of the soluble protein. Analysis of a crude extract in SDS-Gel (Laemmli, Nature, 1970, 2227, 680-685) shows that creatinamidino-hydrolase is the major band of the soluble protein fraction (Figure 4, column 2).
Für die Kultivierung im Fermenter wurden drei verschiedene E.coli-Wirtsysteme, nämlich E.coli W3350, E. coli ED8654 bzw. E.coli CSH1 verwendet. Das Plasmid pBT2a-1 wird in die entsprechenden kompetenten Zellen transformiert! Nach Reinigung auf Einzelkolonien wird eine Vorkultur in DYT Medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972,433) das 20^g/ml Ampicillin enthält, über Nacht bei 37°C angezogen. Das Fermentationsmedium (DYT) wird mit der Vorkultur beimpft (Inocculum 1%) und ohne Selektion auf Plasmiderhalt 20 bis 30 Stunden bei 37°C wachsen lassen. DieCreatinamidino-Hydrolase-Aktivität beträgt nach 25 Stunden ca. 600U/g Feuchtmasse bzw. 4,5U/mg Protein.For the cultivation in the fermenter, three different E. coli host systems, namely E. coli W3350, E. coli ED8654 and E. coli CSH1 were used. The plasmid pBT2a-1 is transformed into the appropriate competent cells! After purification on single colonies, a preculture in DYT medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972, 433) containing 20 μg / ml ampicillin is grown overnight at 37 ° C. The fermentation medium (DYT) is inoculated with the preculture (inoculum 1%) and grown without selection for plasmid content at 37 ° C for 20 to 30 hours. The creatinamidino-hydrolase activity after 25 hours is about 600U / g wet weight and 4.5U / mg protein, respectively.
Für die Fermentation von Pseudomonas putida wird das Plasmid pBT306.16 in kompetente Zellen des Stammes 2440 wie vorher beschrieben, transformiert, wobei man PS putida DSM3147 erhält.For the fermentation of Pseudomonas putida, plasmid pBT306.16 is transformed into competent cells of strain 2440 as previously described to obtain PS putida DSM3147.
Nach Reinigung von Einzelkolonien wird eine Vorkultur in DYT Medium, das 200,ug/ml Streptomycin enthält, bei 30°C über Nacht inkubiert. Das Fermentationsmedium (DYT) wird beimpft (Inocculum 1 %) und die Kultur 20 bis 30 Stunden bei 30°C wachsen gelassen. Die Aktivität nach 25 Stunden beträgt ca. 220 U/g Feuchtmasse bzw. 1,8 U/mg Protein.After purification of single colonies, a preculture in DYT medium containing 200 μg / ml streptomycin is incubated at 30 ° C overnight. The fermentation medium (DYT) is inoculated (inoculum 1%) and the culture allowed to grow at 30 ° C for 20 to 30 hours. The activity after 25 hours is about 220 U / g wet weight or 1.8 U / mg protein.
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