DD251080A5 - METHOD FOR PRODUCING A STRUCTURE WITH MEMBRANES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aendern der wirksamen Porenweite einer Struktur, insbesondere einer Ultrafiltrationsmembrane, die angewandt werden kann beispielsweise zur Gasseparation oder fuer Ionenaustauschverfahren. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens, das eine breitere Verwendungsmoeglichkeit einer bestimmten Struktur zulaesst. Erfindungsgemaess wird die Porenweite an als Ultrafiltrationsmembranen geeigneten Strukturen mit an einem Traeger fixierten Membranen aus kristallin angeordneten und intra- und intermolekular vernetzten Proteinmolekuelen oder proteinhaltigen Molekuelen, zwischen denen durchgehende Poren frei bleiben, wobei diese Molekuele insbesondere von Zell-Huellen von Prokaryonten gewonnen werden, durch Aenderung der Milieubedingungen, wie des p H-Wertes, der Ionenstaerke oder der Ionenzusammensetzung geaendert. Die Massnahmen dienen insbesondere auch zum Einschliessen bzw. Freigeben von Wertsubstanzen in die bzw. aus den Strukturen. Die Wertsubstanzen koennen gleichzeitig mit der Ausbildung der Struktur in diese eingeschlossen werden. Bei der Herstellung solcher Strukturen koennen auch Zellwandfragmente oder Zellhuellen eingesetzt werden, die - neben den Proteinschichten - die darunterliegenden Zell-Stuetzschichten umfassen koennen.The invention relates to a process for modifying the effective pore size of a structure, in particular an ultrafiltration membrane, which can be used, for example, for gas separation or for ion exchange processes. The object of the invention is to provide an improved method allowing a broader application of a particular structure. According to the invention, the pore size of structures suitable as ultrafiltration membranes with membranes fixed to a carrier is made of crystal-arranged and intra- and intermolecularly crosslinked protein molecules or protein-containing molecules, between which through pores remain free, these molecules being obtained in particular from cell sources of prokaryotes Changing the environmental conditions, such as the p H value, the ionic strength or the ion composition changed. The measures are also used in particular for the inclusion or release of valuable substances into or out of the structures. The valuable substances can be included in the structure simultaneously with the formation of the structure. In the production of such structures, it is also possible to use cell wall fragments or cell envelopes which, in addition to the protein layers, may comprise the underlying cell support layers.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ändern der wirksamen Durchgangsweite der Poren an einer insbesondere als Ultrafiltrationsmembrane geeigneten Struktur, die zumindest eine Membrane mit durchgehenden Poren umfaßt oder aus zumindest einer solchen Membrane gebildet ist, wobei sich die Membrane oder die Membranen, die sich längs ebenen, gekrümmten, zylindrischen oder vesikulären Flächen erstrecken, jeweils aus zumindest einer Schicht von aneinanderliegend miteinander verbundenen und dabei längs einem Kristallgitter angeordneten Molekülen, nämlich Proteinmolekülen oder proteinhältigen Molekülen aufgebaut sind, wobei in diesen Schichten zwischen den Molekülen gemäß einem Gitter angeordnete durchgehende Poren frei bleiben, wobei gegebenenfalls diese Membranen an oder in einem gegebenenfalls porösen Träger gebunden bzw. eingebunden sind oder wobei gegebenenfalls sie zu einer selbsttragenden Folie vereinigt sind und wobei die Proteinmoleküle oder proteinhältigen Moleküle der Membranen — gegebenenfalls durch Fremdmoleküle — intra- und/oder intermolekular und/oder mit dem Träger vernetzt sind. Die Erfindung betrifft ferner eine vorteilhafte Verwendung dieses Verfahrens, Verfahren geeignet zum Herstellen einer solchen Struktur, sowie vorteilhafte Verwendungen der so hergestellten Struktur.The invention relates to a method for changing the effective passage width of the pores on a structure which is suitable, in particular, as an ultrafiltration membrane and which comprises at least one membrane with through pores or is formed from at least one such membrane, the membranes or the membranes which are longitudinally planar, curved, cylindrical or vesicular surfaces extend, each consisting of at least one layer of interconnected and thereby arranged along a crystal lattice molecules, namely protein molecules or protein-containing molecules are constructed, leaving in these layers between the molecules according to a grid arranged through pores, wherein optionally, these membranes are bound or incorporated on or in an optionally porous carrier or where appropriate, they are combined to form a self-supporting film and wherein the protein molecules or protein-containing molecule le of the membranes - optionally substituted by foreign molecules - have intra- and / or intermolecular and / or crosslinked with the support. The invention further relates to an advantageous use of this method, to methods suitable for producing such a structure, and to advantageous uses of the structure produced in this way.
Eine Struktur der vorgenannten Art ist aus der EP-A2-0154620 bekannt. Die zum Aufbau dieser Struktur verwendeten Membranen werden dabei vorteilhaft aus Proteinmolekülen oder proteinhältigen Molekülen, welche insbesondere von Zeil-Hüllen von Prokaryonten abgetrennt wurden, durch einen als Selbstorganisation bezeichneten Rekristallisationsprozeß gebildet, danach z. B. auf oder in einem porösen Träger an- bzw. eingeschwemmt und schließlich einer chemischen Vernetzung unterworfen. Die wirksame Porenweite an den Membranen dieser Struktur liegt dabei insbesondere im Durchmesserbereich von 1 bis 200 nm (nanometer), vorteilhaft aber im Bereich von 1 bis8nm.A structure of the aforementioned type is known from EP-A2-0154620. The membranes used to construct this structure are advantageously formed from protein molecules or protein-containing molecules, which were separated in particular from Zeil-shells of prokaryotes, by a designated as self-recrystallization process, then z. B. on or in a porous carrier or flooded and finally subjected to chemical crosslinking. The effective pore size at the membranes of this structure is in particular in the diameter range of 1 to 200 nm (nanometers), but advantageously in the range of 1 to 8 nm.
Bei Verwendung dieser Struktur als Ultrafiltrationsmembrane können scharfe Trennungen zwischen Molekülen mit geringem unterschiedlichen Molekulargewicht sowie höhere Durchflußraten erreicht werden als bei vorher bekannten Ultrafiltrationsmembranen. Der gewünschte Porendurchmesser wird dabei im wesentlichen durch die Auswahl des für die Membranherstellung verwendeten Mikroorganismus erreicht, deren Zeil-Hüllen äußere Schichten, sogenannte S-Schichten (S-layers-surface layers) mit Poren mit in etwa dem angestrebten Porendurchmesser aufweisen. Dieser Porendurchmesser kann dabei noch durch Anlagerung von Fremdmolekülen an den Proteinmolekülen oder proteinhältigen Molekülen, die in den Porenbereich hineinreichen, variiert werden.Using this structure as an ultrafiltration membrane, sharp separations between molecules of low molecular weight and higher flow rates can be achieved than with previously known ultrafiltration membranes. The desired pore diameter is achieved in this case essentially by the selection of the microorganism used for membrane production, whose cell casings have outer layers, so-called S-layers (S-layers-surface layers) with pores having approximately the desired pore diameter. This pore diameter can still be varied by addition of foreign molecules to the protein molecules or protein-containing molecules that extend into the pore area.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Ändern der wirksamen Porenweite der Membranen der obengenannten Struktur anzugeben, welches dann eine breitere Verwendungsmöglichkeit einer bestimmten Struktur zuläßt.The object of the invention is to provide a method for changing the effective pore size of the membranes of the above-mentioned structure, which then allows a broader use of a particular structure.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahrensschritte und Reaktionsbedingungen für eine Änderung der wirksamen Porenweite aufzufinden.The invention has for its object to find process steps and reaction conditions for a change in the effective pore size.
Die Aufgabe wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Ändern der wirksamen Porenweite der Membranen der eingangs genannten Struktur gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß durch Ändern der Milieu bedingungen eine Änderung der die Porenform und Porengröße bestimmenden Konformation der Moleküle der Membranen und/oder eine Änderung der Ladungen an den Molekülen im Porenbereich der Membranen und damit eine Änderung der wirksamen Durchgangsweite der Membranen-Poren bewirkt wird. Dabei kann die Konformations- und/oder Ladungsänderung vorteilhaft durch Änderung des pH-Wertes, der lonenstärke und/oder Zusammensetzung oder der Temperatur des die Struktur umgebenden Milieus und/oder vorteilhaft auch durch Wechsel der Art der flüssigen Phase bewirkt werden.The object is achieved in the method according to the invention for changing the effective pore size of the membranes of the aforementioned structure, which is characterized by changing the environment conditions, a change in the pore shape and pore size-determining conformation of the molecules of the membranes and / or a change in the Charges on the molecules in the pore region of the membranes and thus causes a change in the effective passage width of the membrane pores. The conformation and / or charge change can advantageously be effected by changing the pH, the ionic strength and / or composition or the temperature of the environment surrounding the structure and / or advantageously also by changing the nature of the liquid phase.
Die Erfindung betrifft ferner eine vorteilhafte Verwendung dieses erfindungsgemäßen Verfahrens zum Ändern der wirksamen Durchgangsweite der Poren einer insbesondere als Ultrafiltrationsmembrane geeigneten Struktur, die dadurch gekennzeichnet ist, daß es dazu verwendet wird, Wertsubstanzen, wie Enzyme, pharmazeutische Wirkstoffe, Pestizide oder dgl. in der Struktur einzuschließen und/oder diese Wertsubstanzen aus dieser Struktur auszubringen.The invention further relates to an advantageous use of this method according to the invention for changing the effective passage width of the pores of a structure, in particular suitable as an ultrafiltration membrane, which is characterized in that it is used in the structure of valuable substances, such as enzymes, pharmaceutical agents, pesticides or the like include and / or deploy these valuable substances from this structure.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung dieser erfindungsgemäßen Verwendung wird eine Struktur eingesetzt, die eine die Wertsubstanzen einschließende Hülle bildet, deren Oberfläche zum Teil durch Membranen der Struktur belegt und zum Teil mit einer undurchlässigen Schicht versehen ist.According to an advantageous embodiment of this use according to the invention, a structure is used which forms a shell enclosing the valuable substances, the surface of which is partly covered by membranes of the structure and partly provided with an impermeable layer.
Nach einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verwendung wird eine Struktur eingesetzt, welche Membranen in Vesikelform aufweist.According to another advantageous embodiment of the use according to the invention, a structure is used which has membranes in vesicle form.
Eine letzte vorteilhafte Ausgestaltung dieser erfindungsgemäßen Verwendung ist schließlich dadurch gekennzeichnet, daß zum Einbringen der Wertsubstanzen in die Struktur die Poren dervesikulären Membranen durch eine Milieuänderung erweitert werden, die Wertsubstanzen anschließend durch die erweiterten Poren in das Innere der Vesikel eingebracht und danach diese Poren durch eine weitere Milieuänderung wieder verkleinert werden.A last advantageous embodiment of this use according to the invention is finally characterized in that for introducing the valuable substances into the structure, the pores dervesikulären membranes are extended by a change in environment, the value substances then introduced through the enlarged pores in the interior of the vesicles and then these pores by another To change the environment again.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Herstellen einer Struktur mit Membranen, die durchgehende Poren aufweisen, wobei Proteinmoleküle oder proteinhaltige Moleküle oder Fragmente von Schichten aus solchen Molekülen, die in diesen Schichten jeweils aneinanderliegend miteinander verbunden und dabei längs einem Kristallgitter angeordnete Poren frei bleiben, in Lösung bzw. Suspension gebracht werden, wonach durch Änderung der Milieubedingungen in der Lösung bzw. Suspension Bedingungen geschaffen werden, bei denen diese Proteinmoleküle oder proteinhältigen Moleküle und/oder die Schichtfragmente sich durch Selbstorganisation zu Membranen verbinden. Ein Verfahren dieser Art ist aus der EP-A2-0154620 bekannt. Dieses erfindungsgemäße Verfahren soll nun die Aufgabe lösen, bereits beim Herstellen der Struktur Wertsubstanzen in der Struktur einzuschließen, die gegebenenfalls durch Vergrößerung der Porenweite an der Struktur kontrolliert freigegeben werden können.The invention also relates to a method for producing a structure with membranes having through pores, wherein protein molecules or protein-containing molecules or fragments of layers of such molecules, which in these layers in each case connected to each other and remain along a crystal lattice arranged pores remain free Solution or suspension are brought, after which conditions are created by changing the environmental conditions in the solution or suspension, in which these protein molecules or protein-containing molecules and / or the layer fragments combine by self-assembly into membranes. A method of this kind is known from EP-A2-0154620. This method according to the invention is now intended to solve the problem of including value substances in the structure already during production of the structure, which can optionally be released in a controlled manner by increasing the pore size of the structure.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung bzw. Suspension der Proteinmoleküle oder proteinhältigen Moleküle oder Fragmente von Schichten aus solchen Molekülen in Kontakt mit einer Wertsubstanz gebracht wird, daß die Selbstorganisation der Proteinmoleküle oder proteinhältigen Moleküle längs der Oberfläche der Wertsubstanz erfolgt und daß — gegebenenfalls durch Behandlung mit mono- und/oder bifunktionellen Fremdmolekülen — die Moleküle dieser Membrane an reaktiven Gruppen substituiert und/oder über diese reaktiven Gruppen intramolekular und/oder miteinander kovalent vernetzt werden. Dabei kann auch vorteilhaft eine Wertsubstanz eingesetzt werden, die an oder in eine Trägersubstanz oder einen Trägerkörper gebunden bzw. eingebunden ist.This method according to the invention is characterized in that the solution or suspension of the protein molecules or protein-containing molecules or fragments of layers of such molecules is brought into contact with a valuable substance such that self-assembly of the protein molecules or protein-containing molecules occurs along the surface of the substance of value - Where appropriate, by treatment with mono- and / or bifunctional foreign molecules - the molecules of this membrane are substituted on reactive groups and / or covalently crosslinked via these reactive groups intramolecularly and / or with each other. In this case, it is also advantageous to use a valuable substance which is bound or bound to or in a carrier substance or a carrier body.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Herstellen einer Struktur mit Membranen, die durchgehende Poren aufweisen der Art, wie sie in der EP-A2-0154620 beschrieben ist, wobei das erfindungsgemäße Verfahren weniger aufwendig sein soll als dieses beschriebene Verfahren.The invention further relates to a method for producing a structure with membranes having continuous pores of the type described in EP-A2-0154620, wherein the inventive method should be less expensive than this described method.
Dieses Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß Zellen von Mikroorganismen, insbesondere Zellen von Prokaryonten, die zumindest eine Zellwandschicht aufweisen, in der Proteinmoleküle oder proteinhaltige Moleküle aneinanderliegend miteinander verbunden und dabei längs einem Kristallgitter angeordnet sind, wobei in dieser Zellwandschicht zwischen den Molekülen gemäß einem Gitter angeordnete Poren frei bleiben, gegebenenfalls aufgebrochen und die Zeil-Hüllen in Fragmente unterteilt werden, daß die—nach Entfernen des Zellinhalts sowie gegebenenfalls von anderen Zellwand-oder Membranlipidschichten — verbleibenden Zeil-Hüllen oder Zellwandfragmente, welche aus der oder den aus Proteinmolekülen oder proteinhältigen Molekülen bestehenden Schicht(en) und gegebenenfalls aus den an diese angrenzenden Zellwandschichten bestehen, gegebenenfalls an oder in einem Träger an- bzw. eingebracht werden und daß — gegebenenfalls durch Behandlung mit mono- und/oder bifunktionellen Fremdmolekülen — die Moleküle dieser verbleibenden Zeil-Hüllen oder Zellwandfragmente an reaktiven Gruppen substituiert und/oder über diese reaktiven Gruppen intramolekular und/oder miteinander und/oder mit dem Träger gegebenenfalls kovalent vernetzt werden. Dabei kann vorteilhaft auch von Zeil-Hüllen von Mikroorganismen ausgegangen werden, welche als Zellwandschichten zwei aus Proteinmolekülen oder proteinhältigen Molekülen aufgebaute Schichten und zwischen diesen, gegebenenfalls aus Peptidoglycan, Pseudomurein oder Zellulose bestehende Schichten aufweisen, wobei diese Zellwandschichten in Form von Zellwandfragmenten an oder in dem Träger an- bzw. eingebracht werden.This method is characterized in that cells of microorganisms, in particular cells of prokaryotes, which have at least one cell wall layer in the protein molecules or protein-containing molecules connected to each other and are arranged along a crystal lattice, wherein in this cell wall layer between the molecules according to a grid remain arranged pores, optionally broken and the cell envelopes are divided into fragments that the-after removal of the cell contents and optionally from other cell wall or membrane lipid layers - remaining cell envelopes or cell wall fragments, which from the or of protein molecules or proteinaceous molecules existing layer (s) and, where appropriate, consist of the cell wall layers adjacent thereto, optionally on or in a carrier and / or introduced and that - optionally by treatment with mono- and / or bifunctional F Remdmolekülen - the molecules of these remaining cell envelopes or cell wall fragments substituted on reactive groups and / or optionally covalently crosslinked via these reactive groups intramolecularly and / or with each other and / or with the carrier. It can also be advantageous to use cell casings of microorganisms which have, as cell wall layers, two layers composed of protein molecules or proteinaceous molecules and layers between these, optionally of peptidoglycan, pseudomurein or cellulose, these cell wall layers in the form of cell wall fragments on or in the cell wall fragments Carriers are introduced or introduced.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird von Zeil-Hüllen von Mikroorganismen ausgegangen, in welchen die die Schichten formenden proteinhältigen Moleküle Glycoproteine sind. Nach einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Mikroorganismenzellen osmotisch und/oder mechanisch, gegebenenfalls mit einer Zellmühle oder Ultraschall, und/oder durch Druckentspannung und/oder chemisch, gegebenenfalls mit einer French-Presse bzw. enzymatisch, aufgebrochen. In weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens können als TrägerAccording to an advantageous embodiment of the method according to the invention, Zeil sheaths are assumed to be microorganisms in which the protein-containing molecules forming the layers are glycoproteins. According to another advantageous embodiment of the method according to the invention, the microorganism cells are broken osmotically and / or mechanically, optionally with a cell mill or ultrasound, and / or by pressure release and / or chemically, optionally with a French press or enzymatically. In further advantageous embodiments of the method according to the invention can as a carrier
— eine poröse Schicht gegebenenfalls ein Mikrofilter eingesetzt werden und/oder- A porous layer optionally a microfilter are used and / or
— eine Hilfsschicht eingesetzt werden, welche gegebenenfalls vor Verwendung der Membrane entfernt wird, oder- An auxiliary layer are used, which is optionally removed before use of the membrane, or
— Körper aus innotropen Gelen verwendet werden, die von den aufzubringenden Zellwandfragmenten allseitig umschlossen werden.- Body of innotropic gels are used, which are surrounded by the cell wall fragments to be applied on all sides.
Gemäß noch anderen vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen VerfahrensAccording to still other advantageous embodiments of the method according to the invention
— werden die Zellwandfragmente durch Aufsprühen und/oder Anschwemmen auf den Träger aufgebracht, und/oder es- The cell wall fragments are applied by spraying and / or flooding on the support, and / or it
— erfolgt das Aufbringen der Zellwandfragmente auf den Träger unter Druck- und/oder Sogwirkung, oder es- The application of the cell wall fragments on the support under pressure and / or suction, or it takes place
— werden die Zellwandfragmente auf den Träger mechanisch aufgepreßt.- The cell wall fragments are mechanically pressed onto the carrier.
Nach einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden bei Verwendung von aus Polymeren bestehenden Trägern die Zellwandfragmente während des Polymerisations- oder Erstarrungsvorganges des Trägers in das sich porös ausbildende Trägermaterial eingebettet.According to a further embodiment of the method according to the invention, the cell wall fragments are embedded in the porous forming carrier material during the polymerization or solidification process of the carrier when using carriers consisting of polymers.
Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Verbindung zwischen den Zellwandfragmenten und dem Träger durch eine, gegebenenfalls oberflächige Hitzebehandlung verstärkt.In accordance with yet another advantageous embodiment of the method according to the invention, the connection between the cell wall fragments and the carrier is intensified by an optionally superficial heat treatment.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit mono- und/oder bifunktionellen Fremdmolekülen durch Aufbringen von gasförmigen und/oder flüssigen Vernetzungsmitteln erfolgt. Dabei kann die Behandlung mit den gasförmigen oder flüssigen Vernetzungsmittel vorteilhaft zeitlich nacheinander erfolgen.According to a further advantageous embodiment of the invention, the inventive method is characterized in that the treatment with mono- and / or bifunctional foreign molecules by applying gaseous and / or liquid crosslinking agents. In this case, the treatment with the gaseous or liquid crosslinking agents can advantageously take place one after the other.
In einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden der Träger und/oder die Zellwandfragmente vor Aufbringen der letzteren auf den Träger mit den Vernetzungsmitteln behandelt und diese erst nach dem Aufbringen der Zellwandfragmente auf dem Träger aktiviert.In another advantageous embodiment of the method according to the invention, the carrier and / or the cell wall fragments are treated with the crosslinking agents prior to application of the latter to the carrier and activated only after application of the cell wall fragments on the carrier.
Gemäß einer noch anderen vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vor dem Aufbringen der Zellwandfragmente auf den Träger für eine kovalente Vernetzung und/oder nebenvalente Bindung bestimmte reaktive Gruppen des Trägers und/oder der Moleküle der Zellwandfragmente freigelegt und/oder eingeführt.According to yet another advantageous embodiment of the method according to the invention, certain reactive groups of the carrier and / or the molecules of the cell wall fragments are exposed and / or introduced before applying the cell wall fragments to the carrier for covalent crosslinking and / or secondary valence binding.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das kovalente Vernetzen der Zellwandfragmente gleichzeitig mit dem kovalenten Vernetzen der Proteinmoleküle oder proteinhaltigen Moleküle der aufgebrachten Zellwandfragmente.According to a further advantageous embodiment of the method according to the invention, the covalent crosslinking of the cell wall fragments takes place simultaneously with the covalent crosslinking of the protein molecules or protein-containing molecules of the applied cell wall fragments.
In einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vor dem Aufbringen des bzw. der Vernetzungsmittel(s) die auf den Träger aufgebrachten Zellwandfragmente mittels einer porösen Schutzschicht abgedeckt, welche gegebenenfalls nach Beendigung des Vernetzungsvorganges entfernt wird.In another advantageous embodiment of the method according to the invention, the cell wall fragments applied to the support are covered by means of a porous protective layer before application of the crosslinking agent (s), which is optionally removed after completion of the crosslinking process.
Gemäß einer letzten vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens schließlich werden die Zeil-Hüllen nicht aufgebrochen, sondern die für den Aufbau der Struktur nicht benötigten Komponenten der Zellen, wie Cytroplasmamembran, Cytroplasma oder dgl. durch die Poren in den Zeil-Hüllen herausgelöst.Finally, according to a last advantageous embodiment of the method according to the invention, the cell casings are not broken, but the components of the cells, such as the cytoplasmic membrane, cytoplasm or the like, which are not required for the construction of the structure, are removed through the pores in the cell casings.
Die Erfindung umfaßt schließlich folgende erfindungsgemäßen Verwendungen der nach dem vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Struktur, nämlichFinally, the invention comprises the following uses according to the invention of the structure produced by the above process according to the invention, namely
— die Verwendung der Struktur als Ultrafilter, oder als Trennorgan für eine Gasseparation oder als Trennorgan für ein lonenaustauschverfahren;The use of the structure as an ultrafilter, or as a separating agent for a gas separation or as a separation element for an ion exchange process;
— die Verwendung der Struktur als Träger für andere semipermeablen Membranen, die sich über Poren der Membranen der Struktur spannen, wobei gegebenenfalls diese anderen semipermeablen Membranen mit Proteinmolekülen oder proteinhaltigen Molekülen der Membranen der Struktur über Carboxylgruppen und/oder Aminogruppen und/oder Sulfhydrylgruppen und/oder Hydroxylgruppen direkt oder über bifunktionelle Fremdmoleküle vernetzt sind. Dabei können diese anderen semipermeablen Membranen vorteilhaft sein: Hyperfiltrationsmembranen, gegebenenfalls Tensid- oder tensidartige Lipoid-Hyperfiltrationsmembranen, oder Trennorgane für eine Gasseparation oder Trennorgane für ein lonenaustauschverfahren oder Trennorgane für ein Pervaporationsverfahren oder Lösungsdiffusionsmembranen,The use of the structure as a support for other semipermeable membranes which stretch across pores of the membranes of the structure, optionally with these other semipermeable membranes having protein molecules or proteinaceous molecules of the membranes of the structure via carboxyl groups and / or amino groups and / or sulfhydryl groups and / or Hydroxyl groups are crosslinked directly or via bifunctional foreign molecules. These other semipermeable membranes may be advantageous: hyperfiltration membranes, optionally surfactant or surfactant-like lipoid hyperfiltration membranes, or separation organs for a gas separation or separation organs for an ion exchange process or separation organs for a pervaporation process or solution diffusion membranes,
— die Verwendung als Trennmaterial für eine Durchdringungschromatographie, wobei die erzeugte Struktur aus nicht aufgebrochenen Zeil-Hüllen besteht, aus der die nicht benötigten Komponenten herausgelöst und die verbleibenden Zeil-Hüllen anschließend vernetzt wurden.The use as a separation material for a permeation chromatography, wherein the structure produced consists of unbroken cell casings, from which the unneeded components were dissolved out and the remaining cell casings were subsequently crosslinked.
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert. Beschreibung einiger vorteilhafter Wege zur Ausführung der Erfindung.The invention is explained in more detail below with reference to some examples. Description of some advantageous ways of carrying out the invention.
Nachstehend wird zunächst gezeigt, wie anhand einer als Ultrafiltrationsmembrane einsetzbaren Struktur, deren Herstellung im Beispiel 2derEP-A2-0154620 beschrieben ist, durch Änderung der Milieubedingungen eine Änderung der wirksamen Porenweite erzielt werden kann.It will first be shown below how a change in the effective pore size can be achieved by changing the environmental conditions by means of a structure which can be used as an ultrafiltration membrane and whose preparation is described in Example 2 of EP-A2-0154620.
Diese Ultrafiltrationsmembrane enthält Membranen, die aus aneinanderliegenden Glycoproteinmolekülen aufgebaut sind, wobei jede der Membranporen von vier angrenzenden Glycoproteinmolekülen begrenzt ist. Es wird nun vermutet, daß, analog wie bei in Lösung befindlichen Proteinmolekülen, welche nur in zwei Zuständen, nämlich ganz entfaltet und ganz gefaltet bestehen, und sich durch eine Milieuänderung nur die Anzahl der sich in dem einen bzw. dem anderen Zustand befindlichen Moleküle ändert, die durch eine Milieuänderung bewirkte Änderung der Durchgangsweite der Membranporen auf einen ähnlichen Effekt beruht. Für die Konformation der Glycoproteine im Porenbereich und/oder die dort gebundenen Ladungen, besteht jeweils eine relativ kleine Zahl diskreter Zustände, deren Häufigkeiten von den Milieubedingungen, nämlich z. B. vom pH-Wert bzw. von der lonenstärke abhängen. Dies könnte sich dann so auswirken, daß bei einer bestimmten Milieubedingung der größte Teil der Poren die kleinstmöglichste Porenweite und bei einer anderen Milieubedingung der größte Teil der Poren die größtmöglichste Porenweite aufweist. Für Filtrationen, zu deren Ergebnis nur die Poren der größten Porenweite wirksam sind, würde sich dann die wirksame Porendichte dieser größten Poren kontinuierlich mit den der Änderung der Milieubedingungen ändern.This ultrafiltration membrane contains membranes made up of contiguous glycoprotein molecules with each of the membrane pores bounded by four adjacent glycoprotein molecules. It is now assumed that, analogous to protein molecules in solution, which exist only in two states, namely completely unfolded and completely folded, and change by a change in the environment only the number of molecules located in one or the other state , which is caused by a change in the environment caused change in the passage width of the membrane pores on a similar effect. For the conformation of the glycoproteins in the pore region and / or the charges bound there, in each case a relatively small number of discrete states, the frequencies of which depend on the environmental conditions, for. B. depend on the pH or the ionic strength. This could then have the effect that, for a given environmental condition, the largest part of the pores has the smallest possible pore size and, in the case of another environmental condition, the largest part of the pores has the largest possible pore size. For filtrations, to the result only the pores of the largest pore size are effective, then the effective pore density of these largest pores would change continuously with the change in the environmental conditions.
Die nachstehend beschriebenen Filtrationsversuche bestätigen im Ergebnis diese Vorstellungen. Diese Versuche wurden jeweils in Aqua dest. sowie in verschiedenen Pufferlösungen, nämlich PBS (einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung), mit Sörensenpuffer (ein genau genormter Phosphatpuffer), mit 0,9% NaCI und mit 0,1 M CaCl2 durchgeführt. Zur Erreichung eines Gleichgewichtszustandes mit der betreffenden Pufferlösung wurde die Ultrafiltrationsmembrane zunächst in dieser während 2 Stunden inkubiert. Die so vorbehandelten Ultrafiltrationsmembranen wurden dann für Filtrationsversuche in einer Ultrafiltrationseinrichtung, wie sie z. B. in Beispiel 1 anhand von Fig. 5 der obengenannten EP-A2-0154620 beschrieben ist, eingesetzt, und dabei—jeweils in derselben Pufferlösung wie für die Inkubation verwendet—das Rückhaltevermögen (%R) des Filters gegenüber Ovalbumin und Rinderserumalbumin (in der Folge BSA genannt) bestimmt. Außerdem wurden mit denselben Substanzen Vergleichsversuche in Aqua dest. durchgeführt. Alle Versuche erfolgten mit einem Filtermembran-Überdruck von 2 · 105Pa und einer Proteinkonzentration von 0,8 mg Protein pro ml einer 80%igen Einengung des Retentats sowie jeweils unter denselben Rührbedingungen (300Umdr./min). Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefapßt.The filtration experiments described below confirm these results as a result. These experiments were each in distilled water. as well as in various buffer solutions, namely PBS (a phosphate-buffered physiological saline solution), with Sörensenpuffer (a precisely standardized phosphate buffer), performed with 0.9% NaCl and 0.1 M CaCl 2 . To achieve a state of equilibrium with the relevant buffer solution, the ultrafiltration membrane was initially incubated in this for 2 hours. The ultrafiltration membranes pretreated in this way were then used for filtration tests in an ultrafiltration device, as described, for example, in US Pat. B. in Example 1 with reference to FIG. 5 of the above EP-A2-0154620 is used, and thereby-each in the same buffer solution as used for the incubation-the retention capacity (% R) of the filter against ovalbumin and bovine serum albumin (in the Sequence called BSA). In addition, comparative experiments in distilled water with the same substances. carried out. All experiments were carried out with a filter membrane overpressure of 2 × 10 5 Pa and a protein concentration of 0.8 mg protein per ml of an 80% concentration of the retentate and in each case under the same stirring conditions (300 Umdr./min). The results of these experiments are summarized in the table below.
Wie die Tabelle zeigt, gehen gegenüber den Verhältnissen bei Aqua dest. die Werte des Rückhaltevermögens bei den verwendeten Pufferlösungen stark zurück und zwar weitgehend unabhängig von dem eingesetzten Puffer. Dabei fällt auf, daß — wie der Vergleich der Werte der ersten Kolonne mit denen der zwei letzten Kolonnen zeigt — der Einfluß des pH-Wertes hier offenbar wesentlich geringer ist als der der lonenstärke.As the table shows, go with respect to the proportions of aqua dest. the retention values of the buffer solutions used are greatly reduced, largely independently of the buffer used. It is noticeable that - as the comparison of the values of the first column with those of the last two columns shows - the influence of the pH is apparently much lower than that of the ionic strength.
Ähnliche Versuche, die mit einer Ultrafiltrationsmembrane, die auf Basis der Bacillus stearothermophilus 3c/NRs 1536 hergestellt wurde (siehe dazu Beispiel 1 derEP-A2-0154620), ergaben beim Austausch von Aqua dest. durch einen Puffer wie PBS und Sörensenpuffer wesentlich geringere Änderungen der Rückhaltevermögen. Sie betrugen hier nur etwa 7 bis 10%. Die Auswahl der Mikroorganismen, deren S-Schichten bzw. die durch Rekristallisation der Proteinmoleküle oder proteinhaltigen Moleküle dieser S-Schichten erzeugten Membranen (die in der Folgeso wie in der EP-A2-0154620 als P-Membrane bezeichnet werden) bei einer Änderung der Milieubedingungen für den Anwendungszweck optimale Änderung der wirksamen Porenweite zeigen, erfolgt zweckmäßigerweise durch Überprüfung der Eigenschaften einer größeren Anzahl von Mikroorganismen. In den nachstehenden Beispielen 1 und 2 werden nun vorteilhafte Verwendungen des vorstehend im Prinzip erläuterten Verfahrens zurÄnderung der Porenweite beschrieben.Similar experiments with an ultrafiltration membrane made on the basis of Bacillus stearothermophilus 3c / NRs 1536 (see Example 1 of EP-A2-0154620) revealed when exchanging aqua dest. by a buffer such as PBS and Sörensenbuffer much smaller changes in the retention capacity. They were only about 7 to 10% here. The selection of the microorganisms, their S-layers or the membranes produced by recrystallization of the protein molecules or protein-containing molecules of these S-layers (which are referred to in the following as in EP-A2-0154620 as P-membrane) in a change of environmental conditions show optimal change in the effective pore size for the purpose, is suitably carried out by checking the properties of a larger number of microorganisms. In Examples 1 and 2 below, advantageous uses of the pore-width modification method explained in principle above will now be described.
Bei diesem Beispiel kommt eine Ultrafiltrationsmembrane ζ ur Anwendung, die auf Basis des Bacillus stearothermophilus PV72 wie in Beispiel 2 der EP-A2-0154620 beschrieben hergestellt ist. Es sollen nun die Proteine Carboanhydratase (30 kD), Ovalbumin (43kD) und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (14OkD) durch Filtrationsvorgänge getrennt werden: Diese Proteine liegen zunächst in Aqua dest. gelöst vor. In einem ersten Filtrationsschritt wird zunächst die Carbohydratase im Konzentrierungsbetrieb abgetrennt, wobei die Carbohydratase in das Permeat gelangt, wogegen Ovalbumin nahezu vollständig und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase zur Gänze im Retentat bleibt. Das Retentat wird danach von Aqua dest. in PBS umgepuffert. In der so umgepufferten Lösung, in der das Rückhaltevermögen der Ultrafiltrationsmembrane gegenüber Ovalbumin von etwa 90% etwa 25% herabgesetzt ist, wird das Ovalbumin dann in einem weiteren Diafiltrationsschritt ausgewaschen, wobei Glycerinaldehyd-3-phosphathydrogenase weiter im Retentat verbleibt und aus diesem dann gewonnen werden kann.This example uses an ultrafiltration membrane prepared on the basis of Bacillus stearothermophilus PV72 as described in Example 2 of EP-A2-0154620. The proteins carboanhydratase (30 kD), ovalbumin (43kD) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (14OkD) should now be separated by filtration: These proteins are initially in distilled water. solved before. In a first filtration step, the carbohydrate is first separated in the concentration operation, the carbohydrate goes into the permeate, whereas ovalbumin almost completely and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase remains entirely in the retentate. The retentate is then distilled from aqua. Rebuilt in PBS. In the solution thus buffered in which the retention capacity of the ultrafiltration membrane to ovalbumin is reduced by about 25% from about 90%, the ovalbumin is then washed out in a further diafiltration step, wherein glyceraldehyde-3-phosphate hydrogenase remains in the retentate and then recovered from it can.
In diesem Beispiel wird die Herstellung von vesikulären durchgehenden Poren aufweisende Membranen beschrieben sowie das Einbringen von Wertsubstanzen in diese Vesikel.In this example, the preparation of vesicular through-pore membranes is described as well as the introduction of valuable substances in these vesicles.
Man geht dabei von Zahlen des Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus (Stamm PV72) aus, oder von Clostridium thermohydrosulfuricum (Stamm L111-69), dessen S-Schicht aus Glycoproteinen besteht und ein hexagonale Gitterstruktur (p6-Symmetrie) mit einer Periodizität von 14nm und einer Porenweite in Aqua dest. von etwa 4nm aufweist. 1 g Zeilwandpräparationen werden mit 5 ml einer 5 M Guanidinhydrochloridlösung (in 50mHTRIS-HCI-PufferpH7,2) 2 Stunden bei 25X gerührt. „TRIS" steht hier und in der Folge als Abkürzung für Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Dabei lösen sich von der Oberfläche der Zellwände Glycoproteinmoleküle der sogenannten S-Schichten. Die so extrahierten Zellwände werden durch Zentrifugation (1 Stunde bei 20000g) sedimentiert, wobei die Glycoproteinmoleküle in Überstand verbleiben. Das Guanidinhydrochlorid wird nun aus dem die Glycoproteinmoleküle enthaltenden Extrakt durch Dialyse gegen Aqua dest. (pH 5,5) oder 50 mM Tris-HCI-Puffer (pH7,2) entfernt, wobei es durch Selbstorganisation der Glycoproteine zur Ausbildung von visikulären Membranen kommt. Diese in Aqua dest. suspendierten Membranvesikel werden dann mit 2%igemGlutaraldehyd als Vernetzungsmittel (in 5OmM Phosphatpuffer, pH7,2) bei 200C während 2 Stunden behandelt. Dabei kommt es zu einer intra- bzw. intermolekularen Vernetzung der Glycoproteine.It is based on numbers of the microorganism Bacillus stearothermophilus (strain PV72), or of Clostridium thermohydrosulfuricum (strain L111-69), whose S-layer consists of glycoproteins and a hexagonal lattice structure (p6 symmetry) with a periodicity of 14nm and a pore size in aqua dest. of about 4nm. 1 g of cell wall preparations are stirred with 5 ml of a 5 M guanidine hydrochloride solution (in 50 mM H-tris-HCl buffer pH 7.2) for 2 hours at 25X. "TRIS" here and in the following stands for tris (hydroxymethyl) aminomethane, whereby glycoprotein molecules of the so-called S-layers are detached from the surface of the cell walls, the cell walls thus extracted are sedimented by centrifugation (1 hour at 20000 g) The guanidine hydrochloride is now removed from the extract containing the glycoprotein molecules by dialysis against distilled water (pH 5.5) or 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2), where it is self-assembled by the glycoproteins to form comes from visikulären membranes. This in distilled water. suspended membrane vesicles are then treated with 2% igemGlutaraldehyd as a crosslinking agent (in 5OmM phosphate buffer pH 7.2,) at 20 0 C for 2 hours, treated. This leads to an intra- or intermolecular crosslinking of the glycoproteins.
Nach dem Auswaschen des Vernetzungsmittels sind die Membranvesikel für eine Beladung mit Wertsubstanzen verwendbar. Dazu werden die Membranvesikel in einer Lösung einer Wertsubstanz, z.B. in einer Lösung von 10 mg/ml eines Proteins mit einem Molekulargewicht von 65 bis 7OkD in 0,9%iger Lösung von NaCI (pH 5,5) suspendiert. Unter diesen Milieubedingungen dringt die Wertsubstanz durch die nun erweiterten Poren der Membranvesikel in diese ein, bis sich ein Konzentrationsausgleich einstellt. Nach Abzentrifugieren derVesikel (z.B. 1 Stunde bei 15000g) werden diese in Aqua dest. (pH5,5) resuspendiert. Durch diese gezielte Milieuveränderung von der NaCI-Lösung zu Aqua dest. kommt es zu einer Verkleinerung der wirksamen Porenweite an Membranvesikeln derart, daß die Wertsubstanz nicht mehr wieder aus den Poren austreten kann und so in den Membranvesikeln festgehalten wird. Für das Freisetzen der Wertsubstanz aus den Membranvesikeln werden diese wieder in ein Milieu verbracht, dessen lonenstärke etwa denselben Wert aufweist, der die Beladung der Membranvesikeln mit der Wertsubstanz ermöglicht hat.After washing out the crosslinking agent, the membrane vesicles are usable for loading with valuable substances. For this, the membrane vesicles are dissolved in a solution of a valuable substance, e.g. in a solution of 10 mg / ml of a protein having a molecular weight of 65 to 7OkD in 0.9% solution of NaCl (pH 5.5). Under these environmental conditions, the valuable substance penetrates through the now expanded pores of the membrane vesicles into them, until a concentration equilibrium sets in. After centrifuging the vesicles (e.g., 1 hour at 15000g), they are distilled into aqua. (pH 5.5) resuspended. This targeted change of environment from the NaCl solution to distilled water. There is a reduction of the effective pore size of membrane vesicles in such a way that the valuable substance can no longer escape from the pores and is thus retained in the membrane vesicles. For the release of the valuable substance from the membrane vesicles they are returned to an environment whose ionic strength has about the same value, which has allowed the loading of the membrane vesicles with the valuable substance.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Ändern der wirksamen Porenweite einer Struktur, die Membranen mit durchgehenden Poren aufweist, kann auch vorteilhaft bei einer Struktur angewendet werden, die nach einem Verfahren hergestellt wurde, bei dem die Wertsubstanzen gleichzeitig mit dem Ausbilden dieser Struktur in-oder an diese ein-bzw. angebracht wurde. Das nachfolgende Beispiel 3 illustriert einen vorteilhaften Ausführungsweg dieses Verfahrens.The method according to the invention for changing the effective pore size of a structure having continuous pore membranes may also be advantageously applied to a structure made by a process in which the valuable substances enter or leave at the same time as this structure is formed -or. was attached. Example 3 below illustrates an advantageous embodiment of this method.
Zum Fixieren eines die Wertsubstanz bildenden Enzymproteins an einem Träger, wird als Träger ein Polyacrylamidgel, das an seiner Porenoberfläche freie Carboxylgruppen aufweist, eingesetzt. Dieser Träger wird zunächst durch Dicyclohexylcarbodimid und N-Hydroxysuccinimid in einem wasserfreien Lösungsmittel wie Dioxan behandelt, wobei die Carboxylgruppen des Trägers aktiviert werden. Das Lösungsmittel samt den überschüssigen Reagentien wird dann ausgewaschen und der Träger in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) übergeführt. Danach werden pro 1g Träger 10 mg des Enzymproteins zugegegen und 5 Stunden bei 2O0C inkubiert, wobei das Enzymprotein über die aktivierte Carboxylgruppe des Trägers kovalent an diesem gebunden wird.For fixing an enzyme protein forming the substance of value to a carrier, a polyacrylamide gel which has free carboxyl groups on its pore surface is used as carrier. This carrier is first treated by dicyclohexylcarbodimide and N-hydroxysuccinimide in an anhydrous solvent such as dioxane, activating the carboxyl groups of the carrier. The solvent together with the excess reagents is then washed out and the carrier is transferred into 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.8). Thereafter, 10 mg of enzyme protein per 1 g of carrier are applied to and incubated at 2O 0 C for 5 hours, wherein the enzyme protein via the activated carboxyl group of the carrier is covalently bonded thereto.
Aus einer Zeilwandpräparation des Mikroorganismus Clostridium thermohydrosulfuricum (Stamm L111-69) werden nach dem Ablösen der Glycoproteinmoleküle der S-Schicht dieses Mikroorganismus mit 5 M Guanidinhydrochlorid und Dialyse gegen tquadest. P-Membranen hergestellt. 10mg dieser P-Membranen werden dann durch Zugabe von 10ml 0,01 M HCI in ihre Glycoproteinmoleküle zerlegt und diese extrahiert. 10ml dieses Extraktes werden mit 10g desTrägers, an dem das Enzymprotein kovalent gebunden ist, vermischt und die Mischung bei 370C gegen 1OmM CaCI2-Lösung dialysiert. Durch die dadurch erzeugte pH-Wertänderung bilden sich durch Selbstorganisation der Glycoproteine an der äußeren Oberfläche des Gelkörpers Membranen aus, die den Gelkörper und das an ihm fixierte Enzym umhüllen. Die so gebildeten Membranen werden dann, analog wie in Beispiel 2 beschrieben, intra- bzw. intermolekular vernetzt.From a Zeilwandpreparation of the microorganism Clostridium thermohydrosulfuricum (strain L111-69) are after the detachment of the glycoprotein molecules of the S-layer of this microorganism with 5 M guanidine hydrochloride and dialysis against tquadest. P membranes produced. 10 mg of these P-membranes are then broken down into their glycoprotein molecules by adding 10 ml of 0.01 M HCl and these are extracted. 10ml of this extract are mixed with 10g of the wearer to which the enzyme protein is covalently bonded and the mixture stirred at 37 0 C against 1OmM CaCl 2 solution dialyzed. By the pH change produced thereby, self-assembly of the glycoproteins on the outer surface of the gel body forms membranes which envelop the gel body and the enzyme fixed to it. The membranes thus formed are then, as described in Example 2, crosslinked intra- or intermolecularly.
Indem nun folgenden Beispiel 4 seien nun vorteilhafte Ausführungswege eines neuen Verfahrens zum Herstellen von Strukturen beschrieben, die Membranen mit durchgehenden Poren aufweisen, nämlich Strukturen der Art, wie sie in derEP-A2-0154620 beschrieben sind, wobei bei diesen neuen Verfahren der Selbstorganisationsvorgang der Proteinmoleküle bzw. der proteinhaltigen Moleküle und der aus diesen Molekülen aufgebauten Schichtfragmente zur Bildung größerer Membranen (in der EP-A2-0154620 als P-Membranen bezeichnet) vermieden wird.Now, by now following Example 4, advantageous ways of carrying out a novel process for making structures having membranes with through pores, namely structures of the kind described in EP-A2-0154620, are described, whereby in these new processes the self-assembly process of the protein molecules or the protein-containing molecules and the layer fragments composed of these molecules to form larger membranes (referred to in EP-A2-0154620 as P-membranes) is avoided.
Intakte Zellen von Bacillus stearothermophilus PV72 mit einem Naßgewicht von 10g werden in40mlTRIS-HCL-Puffer (5OmM, pH7,2) suspendiert, und durch Einwirkung von Ultraschall aufgebrochen. Die Suspension wurde dabei zur Vermeidung autolytischer Prozesse in einem Eisbad gekühlt. Die Zellwandfragmente dieser Suspension wurden durch Zentrifugieren bei 20000g pelletiert und der untere Teil des Pellets, der aus noch intakten Zellen besteht, resuspendiert und nochmals einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Die in Suspension vorliegenden Zellwandfragmente werden dann durch Zentrifugieren bei 20000g sedimentiert, resuspendiert und von ihnen dieCytroplasmamembran (eine Lipiddoppelschicht) mit 0,5%TRITON X-100 (in 5OmM TRIS-HCL-Puffer, pH7,2) während 20min bei 200C desintegriert („TRITON X-100" steht hier und in der Folge für Octylphenol-polyethylen-glycolether, einem milden Detergens), wonach die Zellwandfragmente mehrmals gewaschen werden. Die so gereinigten Zellwandfragmente bestehen nun aus der aus Glycoproteinmolekülen aufgebauten S-Schicht und der darunterliegenden Stützschicht aus Peptidoglycan. Die Größe der Flächenabmessungen dieser Zellwandfragmente wird elektronenmikroskopisch kontrolliert,siesollen im Durchschnitt 500nm betragen.Intact cells of Bacillus stearothermophilus PV72 with a wet weight of 10 g are suspended in 40 ml TRIS-HCL buffer (50 mM, pH 7.2) and disrupted by sonication. The suspension was cooled in an ice bath to avoid autolytic processes. The cell wall fragments of this suspension were pelleted by centrifugation at 20000 g and the lower part of the pellet, which consists of still intact cells, resuspended and subjected to another ultrasonic treatment. The present in suspension cell wall fragments are then pelleted by centrifugation at 20000g, resuspended and dieCytroplasmamembran of them (a lipid bilayer) containing 0.5% TRITON X-100 (in 5OmM Tris-HCl buffer, pH 7.2) during 20 min at 20 0 C. disintegrated ("TRITON X-100" here and in the following stands for octylphenol polyethylene glycol ether, a mild detergent), after which the cell wall fragments are washed several times.The cell wall fragments thus purified are now composed of the S layer composed of glycoprotein molecules and the underlying S layer Supporting layer of peptidoglycan The size of the surface dimensions of these cell wall fragments is controlled electron microscopically, they should be on average 500nm.
Mit Hilfe dieser Zellwandfragmente wird nun eine Ultrafiltrationsmembrane hergestellt, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften besitzt wie die im Beispiel 2 der EP-A2-0154620 beschriebenen Ultrafiltrationsmembrane. Als Trägermembrane für die herzustellende Ultrafiltrationsmembrane dient eine Nylonmikrofiltrationsmembrane Typ Ultripor N66, mit einem mittleren Porendurchmesser von 100nm. Das Trägermaterial besitzt freie Amino-und Carboxylgruppen im Verhältnis 1:1. Um zusätzliche reaktionsfähige Amino- und Carboxylgruppen freizusetzen, wird die einzusetzende Mikrofiltrationsmembranebei 50°C während 60min einer Behandlung mit Salzsäure (3,6N) unterzogen, mit Aqua dest. gewaschen und in eine Ultrafiltrationseinrichtung — ähnlich der wie in Beispiel 1 und anhand von Fig.5derEP-A2-0154620 beschrieben — eingelegt.With the help of these cell wall fragments, an ultrafiltration membrane is now produced which has substantially the same properties as the ultrafiltration membranes described in Example 2 of EP-A2-0154620. The carrier membrane used for the ultrafiltration membrane to be produced is a nylon microfiltration membrane of the type Ultripor N 66 , with an average pore diameter of 100 nm. The support material has free amino and carboxyl groups in the ratio 1: 1. To liberate additional reactive amino and carboxyl groups, the microfiltration membrane to be employed is subjected to treatment with hydrochloric acid (3.6N) at 60 ° C for 60 minutes, with distilled water. and inserted into an ultrafiltration device similar to that described in Example 1 and with reference to Fig. 5A-EP-0154620.
Das Aufbringen der Zellwandfragmente auf den Trägerund in die Matrix des Trägers erfolgt—analog wie gemäß den Beispielen 1 und 2 der EP-A2-0154620 — durch einen Anschwemmvorgang. Dazu werden, um eine möglichst gleichmäßige Anschwemmung der Zellwandfragmente zu erzielen, 5 ml der Ausgangssuspension mit 50 ml Aqua dest. versetzt und in die Ultrafiltrationseinrichtung eingefüllt, wobei sich diese Suspension zunächst als Schicht über der eingelegten Mikrofiltrationsmembrane befindet. Über der Suspension wird nun durch Einleiten von Stickstoff ein Überdruck von 2 · 105Pa aufgebracht, wodurch die flüssige Phase durch den Mikrofilter gepreßt und die Zellwandfragmente an oder in die Mikrofiltrationsmembrane mit einer Belegung entsprechend einer Proteinmenge von 30,u.g/cm2 an- bzw. eingeschwemmt werden.The application of the cell wall fragments on the support and in the matrix of the support is carried out-analogously as in Examples 1 and 2 of EP-A2-0154620-by a precoat process. In order to achieve the most uniform possible alluvium of the cell wall fragments, 5 ml of the starting suspension with 50 ml distilled water. added and filled in the ultrafiltration device, this suspension is initially as a layer over the inserted microfiltration membrane. Above the suspension an excess pressure of 2 · 10 5 Pa is applied now by introducing nitrogen, whereby the liquid phase is forced through the micro-filter and the cell wall fragments on or in the micro-filtration membrane with an assignment corresponding to a protein amount of 30, ug / cm 2 Toggle or be washed in.
Danach wird über einer im Oberteil der Ultrafiltrationseinrichtung angebrachten Düse mittels Preßluft von 3 · 105Pa Überdruck als Vernetzungsmittel Glutardialdehyd (0,5% in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer, pH 7,0) fein verteiltauf die auf den Träger deponierten Zellwandfragmente aufgesprüht. Da das Vernetzungsmittel nach dem Aufsprühen auf die Zellwandfragmente durch den aufgebrachten Überdruck kontinuierlich durch die Zellwandfragmente und die Mikrofiltrationsmembrane gepreßt wird, bildet sich über den Zellwandfragmenten kein stärkerer Flüssigkeitsfilm aus. Ein Vorteil dieser Art der Vernetzungsmittel-Aufbringung besteht darin, daß es in dem höchstens sehr dünnen Flüssigkeitsfilm kaum zu einer Wirbelbildung kommen kann, welche die auf dem Träger deponierten Zellwandfragmente bewegen und dabei ihre endgültige Fixierung stören könnte. Nach einer Sprüh- bzw. Vernetzungsdauer von 10 min wird die so hergestellte Ultrafiltrationsmembrane dreimal mit Aqua dest. gewaschen und die Trennkurve und die Durchflußrate—so wie in Beispiel 1 der EP-A2-0154620 beschrieben — bestimmt. Dabei zeigt sich, daß die Tatsache des Vorhandenseins der Peptidoglycan-Stützschicht auf das Trennverhalten der Ultrafiltrationsmembrane keinen Einfluß hat.Thereafter, glutaraldehyde (0.5% in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.0) is finely distributed over a nozzle mounted in the top of the ultrafiltration device by means of compressed air of 3 × 10 5 Pa overpressure as crosslinking agent onto the carrier Cell wall fragments sprayed on. Since the cross-linking agent is continuously pressed through the cell wall fragments and the microfiltration membrane after being sprayed onto the cell wall fragments by the applied overpressure, no thicker liquid film forms over the cell wall fragments. An advantage of this type of cross-linking agent application is that in the at most very thin liquid film hardly any vortex formation can occur, which could move the cell wall fragments deposited on the carrier, thereby disturbing their final fixation. After a spraying or crosslinking time of 10 minutes, the ultrafiltration membrane produced in this way is distilled three times with distilled water. washed and the separation curve and the flow rate-as described in Example 1 of EP-A2-0154620 - determined. It shows that the fact of the presence of the peptidoglycan support layer on the separation behavior of the ultrafiltration membrane has no influence.
Gemäß einer vorteilhaften Variante dieses Beispiels werden als Ausgangsmaterial zur Herstellung einer Ultrafiltrationsmembrane intakte Zellen des Mikroorganismus Clostridium thermohydrosulfuricum (Stamm L111-69) verwendet. Intakte Zellen dieses Mikroorganismus werden zunächst in 5OmM TRIC-HCL-Puffer (pH 7,2) übergeführt und in einer French-Presse (French Pressure Cell Press) aufgebrochen. Dabei werden die in der Pufferlösung suspendierten Zellen unter hohem Druck komprimiert und erfahren dann beim Durchtritt durch eine Düse infolge der dabei eintretenden Druckentlastung eine plötzliche Expansion, die ein Zerreißen der Zellen zur Folge hat. Die so erhaltenen Zellwandfragmente werden durch dreimaliges Waschen mit der Pufferlösung von Zeilinhaltsstoffen befreit und die Cytoplasmamembran durch Behandlung mit 1%igen TRITON X-100 in Aqua dest. während 30min bei 370C desintegriert. Die Zellwandfragmente werden dann von den Lipiden und anderen Verunreinigungen durch Zentrifugation getrennt und dann, analog wie in der ersten Variante dieses Beispiels beschrieben, weiterverarbeitet.According to an advantageous variant of this example intact cells of the microorganism Clostridium thermohydrosulfuricum (strain L111-69) are used as starting material for producing an ultrafiltration membrane. Intact cells of this microorganism are first transferred into 50 mM TRIC-HCl buffer (pH 7.2) and disrupted in a French press (French Pressure Cell Press). In this case, the cells suspended in the buffer solution are compressed under high pressure and then undergo a sudden expansion upon passage through a nozzle as a result of the resulting pressure release, which results in a rupture of the cells. The cell wall fragments obtained in this way are freed from cell constituents by washing three times with the buffer solution and the cytoplasmic membrane is treated by treatment with 1% strength TRITON X-100 in distilled water. during 30 min at 37 0 C disintegrated. The cell wall fragments are then separated from the lipids and other impurities by centrifugation and then processed further analogously as described in the first variant of this example.
In der Folge werden einige vorteilhafte Varianten und Beispiele für einzelne Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens angegebenIn the following, some advantageous variants and examples of individual process steps of the method according to the invention are given
Für die Auswahl und Vorbereitung der Träger: For the selection and preparation of the carrier:
Die Verwendung von Nylonmikrofiltrationsmembranen, bei denen die hydrolytische Schaltung der Peptidbindung von Nylon durch Behandlung mit HCI oder mit Ν,Ν-Dimethylpropandiamin erfolgt um eine Erhöhung der Anzahl derfreien Amino-und/ oder Carboxylgruppen an Nylon zu erzielen. Beispiele für solche Nylonmikrofiltrationsmembranen sind z. B. folgende TypenThe use of nylon microfiltration membranes in which the peptide-bond hydrolytic coupling of nylon is effected by treatment with HCl or with Ν, Ν-dimethylpropanediamine to increase the number of free amino and / or carboxyl groups on nylon. Examples of such nylon microfiltration membranes are e.g. For example, the following types
— Pail Biodyne mit freien Amino-und Carboxylgruppen im Verhältnis 1:1;Pail Biodyne with free amino and carboxyl groups in the ratio 1: 1;
— Pail Aminodyne mit freien Aminogruppen;- Pail Aminodyne with free amino groups;
— Pail Carboxydyne mit freien Carboxylgruppen.- Pail carboxydyne with free carboxyl groups.
Für das Aufbringen der Zellwandfragmente auf eine Trägermembrane:For applying the cell wall fragments to a carrier membrane:
Eine Suspension der Zellwandfragmente in CH3OH wird bei einer Temperatur von 50°C auf einem glatten Träger z.B. einer Glasplatte, aufgewalzt, wobei durch Verdampfen von CH3OH eine Eindickung der Suspension auftritt, bis schließlich eine feuchte Schicht mit einer Dicke von maximal 200 nm auf den Träger zu rückbleibt. Der so beschichtete Träger wird in eine mit Formaldehyd gesättigten Atmosphäre gebracht und etwa 30min inkubiert, wobei eine intra- und intermolekulare Vernetzung der Zellwandfragmente eintritt. Der durch die Vernetzung der Zellwandfragmente entstandene zusammenhängende dünne Film löst sich durch vorsichtiges Aufsprühen von destilliertem Wasser (40C) von dem Träger und kann dann in einer feuchten Kammer auf einen stabilen, grobporigen Träger, z. B. ein Mikrofilter übertragen werden.A suspension of the cell wall fragments in CH 3 OH is rolled at a temperature of 50 ° C on a smooth support such as a glass plate, wherein thickening of the suspension occurs by evaporation of CH 3 OH, until finally a moist layer with a thickness of 200 or less nm remains on the carrier. The thus-coated carrier is placed in a formaldehyde-saturated atmosphere and incubated for about 30 minutes, whereby intramolecular and intermolecular crosslinking of cell wall fragments occurs. The coherent thin film formed by the cross-linking of the cell wall fragments dissolves by carefully spraying distilled water (4 ° C.) from the support and can then be placed in a moist chamber onto a stable, coarsely porous support, e.g. B. a microfilter can be transmitted.
Für die mechanische Fixierung der Zellwandfragmente an oder in dem Träger:For the mechanical fixation of the cell wall fragments on or in the carrier:
Auf die aktive, das heißt mit Zellwandfragmenten belegte Seite einer Ultrafiltrationsmembrane — hergestellt wie in Beispiel 1 —wird ein Agar (2% in Aqua dest.) in flüssiger Form beieinerTemperaturvon40°Cin einer Schichtdicke von 0,5 bis 2 mm aufgegossen. Durch Abkühlen auf 200C tritt eine Erstarrung des Agarsin Form einer Gelschicht ein. Diese Gelschicht bildet nun eine Schutzschicht für die Ultrafiltrationsmembrane und dient gegebenenfalls als Vorfilter für größere Verunreinigungen. Sie kann jederzeit z. B. nach Abnutzung oder einer Verschmutzung der Gelporen wieder abgezogen und erneuert werden.On the active, that is with cell wall fragments occupied side of an ultrafiltration membrane - prepared as in Example 1 - is poured an agar (2% in distilled water.) In liquid form at a temperature of 40 ° C in a layer thickness of 0.5 to 2 mm. By cooling to 20 0 C occurs a solidification of the agarose form of a gel layer. This gel layer now forms a protective layer for the ultrafiltration membrane and optionally serves as a pre-filter for larger impurities. You can at any time z. B. after wear or contamination of the gel pores withdrawn and renewed.
Gemäß einer anderen Variante werden zum Herstellen einer Ultrafiltrationsmembrane intra- und intermolekular vernetzte Zellwandfragmente mit einer Mischung aus Acrylamid, Bisacrylamid, Starter und Beschleuniger suspendiert, und die Mischung in Form einer Schicht bei 200C polymerisieren und gelieren lassen. Es bildet sich dabei ein poröser Träger aus, in dem die Zellwandfragmente eingebettet sind und der als Ultrafiltrationsmembrane verwendet werden kann.According to another variant, to produce an ultrafiltration membrane intra- and intermolecularly crosslinked cell wall fragments are suspended with a mixture of acrylamide, bisacrylamide, starter and accelerator, and polymerize the mixture in the form of a layer at 20 0 C and allowed to gel. A porous carrier is thereby formed in which the cell wall fragments are embedded and which can be used as ultrafiltration membranes.
Für die Bindung der Proteinmoleküle oder proteinhaltigen Moleküle der Zellwandfragemente an den Träger:For the binding of the protein molecules or protein-containing molecules of the cell wall fragments to the carrier:
Die freien Aminogruppen einerTrägermembrane werden mit Glutardialdehyd (5% in 0,1 M Na-Boratpuffer,pH8,0)als Vernetzungsmittel aktiviert. Nach den Anschwemmen der sich in Suspension befindlichen Zellwandfragmente an die Trägermembrane, z. B. durch die Sogwirkung eines (z.B. mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe erzeugten) Vakuums von 5 bis 6 104Pa an der Unterdruckseite der Ultrafiltrationseinrichtung, tritt eine Bindung der Zellwandfragmente an die mit Glutardialdehyd aktivierten Aminogruppen derTrägernfiembrane ein. Die kovalente intra- und intermolekulare Vernetzung der Proteinmoleküle oder proteinhaltigen Moleküle der Zellwandfragmente wird mit Hilfe von 2% Dimethylsuberimidat in 0,1 M Triethanolamin, pH8,7 durchgeführt.The free amino groups of a support membrane are activated with glutaric dialdehyde (5% in 0.1 M Na borate buffer, pH 8.0) as crosslinking agent. After the flooding of the cell wall fragments in suspension to the support membrane, z. B. by the suction effect of a (generated for example by means of a water jet pump) vacuum of 5 to 6 10 4 Pa on the negative pressure side of the ultrafiltration, enters a binding of the cell wall fragments to the glutaric dialdehyde activated amino groups of the carrier fiembrane. The covalent intramolecular and intermolecular crosslinking of the protein molecules or protein-containing molecules of the cell wall fragments is carried out with the aid of 2% dimethylsuberimidate in 0.1 M triethanolamine, pH 8.7.
Gemäß einer anderen Variante werden die freien Carboxylgruppen der Trägermembrane mit EDC abgekürzt für i-Ethyl-S-lDimethylaminopropylJCarbodiimid (0,1 M, pH4,75) aktiviert. Nach dem Entfernen des überschüssigen Agens und Stoppen der Reaktion mit 0,01 M Na-Acetatpuffer, pH4,75, wird mit Aqua dest. gewaschen. Die im Aqua dest. suspendierten Zellwandfragmente werden nach Zugabe von Hexamethylendiamin und 0,1 M EDC durch Anlegen eines Vakuums von 5 · 104Pa an der Unterdruckseite der Ultrafiltrationseinrichtung an die Trägermembrane angeschwemmt. Die Proteinmoleküle oder proteinhaltigen Moleküle der Zellwandfragmente werden über die durch das EDC aktivierten Carboxylgruppen über Hexamethylendiamin als Brückenbildner intra- und intermolekular vernetzt und kovalent an die Trägermembrane gebunden. Durch eine solche kovalente Bindung der Zellwandfragmente mit der Trägermembrane wird die Stabilität der Ultrafiltrationsmembrane wesentlich erhöht; eine Abtragung der für die Ultrafiltration wesentlichen Zellwandfragmente durch mechanische Kräfte, wie sie z. B. in Cross-flow-Betrieb mit Anströmgeschwindigkeiten bis zu 7m s"' auftreten, wird damit unterbunden.In another variant, the free carboxyl groups of the support membranes are abbreviated to EDC for i-ethyl-S-1-dimethylaminopropyl-1-carbodiimide (0.1 M, pH 4.75). After removing the excess agent and stopping the reaction with 0.01 M Na acetate buffer, pH 4.75, distilled with aqua. washed. The distilled in the aqua. suspended cell wall fragments are washed by the addition of hexamethylenediamine and 0.1 M EDC by applying a vacuum of 5 · 10 4 Pa at the vacuum side of the ultrafiltration to the carrier membrane washes. The protein molecules or protein-containing molecules of the cell wall fragments are cross-linked intracellularly and intermolecularly via the carboxyl groups activated by the EDC via hexamethylenediamine as bridging agents and covalently bound to the carrier membrane. By such a covalent binding of the cell wall fragments with the support membrane, the stability of the ultrafiltration membrane is substantially increased; a removal of the essential for ultrafiltration cell wall fragments by mechanical forces, as z. B. occur in cross-flow operation with flow velocities up to 7m s "'is thus prevented.
Für die Vernetzung:For networking:
Bei der Verwendung von Vernetzungsmitteln in flüssiger Phase muß für den Vernetzungsvorgang das Vernetzungsmittel durch die Poren der Zellwandfragmente gepreßt werden, wobei die Gefahr besteht, daß die erzeugte Strömung die auf oder in dem Träger auf- oder eingebrachten Zellwandfragmente bewegt, wodurch ihre endgültige Fixierung auf dem Träger erschwert wird. Um dies zu vermeiden, kann eine Vernetzung bzw. Vorvernetzung vorteilhaft auch durch ein gasförmiges Vernetzungsmittel vorgesehen werden. Dazu wird als Träger eine Nylinmikrofiltrationsmembrane mit einer Porenweite von 100nm in eine Ultrafiltrationseinrichtung eingesetzt. Die Zellwandfragmente werden durch Anlegen eines Vakuums von 5 · 104Pa an der Unterdruckseite der Ultrafiltrationseinrichtung an oder in die Trägermembrane an- bzw. eingeschwemmt. In der Ultrafiltrationseinrichtung ist über der Trägermembrane ein Behälter mit Formaldehyd installiert. Für den Vernetzungsvorgang wird die Druckkammer der Ultrafiltrationseinrichtung zusammen mit dem Formaldehyd auf 8O0C erwärmt. Der dabei verdampfende Formaldehyd, welcher bei dieserTemperatur neben seiner monomeren Form auch in oligomerer Form vorliegt, kommt nun mit den auf der Trägermembrane deponierten Zellwandfragmenten in Kontakt, wobei es insbesondere durch die oligomeren Formen des Formaldehyds, die wegen ihren größeren Kettenlängen größere. Bereiche an den Oberflächen der Zellwandfragmente überspannen, zu einer intra- oder intermolekularen Vernetzung der Proteinmoleküle oder proteinhaltigen Molekülen der Zellwandfragmente sowie zu deren Bindung an die Trägermembrane kommt. Die Anwendung eines gas-oder dampfförmigen Vernetzungsmittels hat den Vorteil, daß es hierzu keiner Wirbelbildung kommt, die gegebenenfalls eine Bewegung der deponierten Zellwandfragmente hervorrufen und so ihre endgültige Fixierung auf der Trägermembrane stören könnte. Nach einer Vernetzungszeit von 2 Stunden wird der restliche Formaldehyd mit Aqua dest. I.Std. ausgewaschen. Gemäß einer vorteilhaften Variante dieses Verfahrensschrittes kann zusätzlich und nach einer solchen Vernetzung mit Hilfe eines gas- oder dampfförmigen Vemetzungsmittels eine weitere Vernetzung mit flüssigen Vernetzungsmittel stattfinden. Dazu werden diese flüssigen Vernetzungsmittel vorteilhaft auf die vorvernetzten Zellwandfragmente aufgetropft und durch deren Poren bzw. durch die poröse Trägermembrane hindurch ein an der Rückseite der Trägermembrane erzeugtes Vakuums abgesaugt. Dabei kommt es zu keiner mechanischen Beeinträchtigung der Zellwandfragmente. Als flüssige Vernetzungsmittel, die vorteilhaft nach einer Vorvernetzung durch Formaldehyd eingesetzt werden, kommen z. B. Dimethylsuberimidat (Angriff auf die -NH2-Gruppen im Protein) oder EDC (zur Vernetzung über-COOH-Gruppen im Protein) in Frage.When using crosslinking agents in the liquid phase, for the crosslinking process, the crosslinking agent must be forced through the pores of the cell wall fragments, with the risk that the flow generated will move the cell wall fragments introduced on or in the support, thereby causing their final fixation on the cell wall fragments Carrier is difficult. In order to avoid this, crosslinking or pre-crosslinking can advantageously also be provided by a gaseous crosslinking agent. For this purpose, a Nylinmikrofiltrationsmembrane is used with a pore size of 100 nm in an ultrafiltration device as the carrier. The cell wall fragments are on or in the carrier membrane by applying a vacuum of 5 · 10 4 Pa on the negative pressure side of the ultrafiltration or on the carrier membrane. In the ultrafiltration device, a container of formaldehyde is installed over the support membrane. For the cross-linking process, the pressure chamber of the ultrafiltration device is heated to 8O 0 C together with the formaldehyde. The thereby evaporating formaldehyde, which is present in this temperature in addition to its monomeric form in oligomeric form, now comes into contact with the deposited on the support membrane cell wall fragments, in particular by the oligomeric forms of formaldehyde, the larger because of their larger chain lengths. Spanning areas on the surfaces of the cell wall fragments, comes to an intra- or intermolecular crosslinking of protein molecules or protein-containing molecules of the cell wall fragments as well as their binding to the support membrane. The use of a gaseous or vaporous crosslinking agent has the advantage that there is no vortex formation for this purpose, which may possibly cause a movement of the deposited cell wall fragments and thus disturb their final fixation on the support membrane. After a crosslinking time of 2 hours, the residual formaldehyde is distilled with aqua. I.Std. washed out. According to an advantageous variant of this process step, in addition to and after such crosslinking with the aid of a gaseous or vaporous crosslinking agent, further crosslinking with liquid crosslinking agent can take place. For this purpose, these liquid crosslinking agents are advantageously added dropwise to the precrosslinked cell wall fragments and suctioned through the pores or through the porous support membrane through a generated at the back of the support membrane vacuum. There is no mechanical impairment of the cell wall fragments. As liquid crosslinking agents, which are advantageously used after a pre-crosslinking by formaldehyde come z. As dimethyl suberimidate (attack on the -NH 2 groups in the protein) or EDC (for cross-over-COOH groups in the protein) in question.
In dem nachstehenden Beispiel 5 wird eine Struktur mit vesikulären Membranen beschrieben, die aus Zeil-Hüllen von Mikroorganismen hergestellt werden, ohne daß es zu einem Aufbrechen der Zeil-Hüllen kommt.In Example 5 below, a structure is described with vesicular membranes prepared from cell shells of microorganisms without breaking the cell shells.
Intakte Zellen des Mikroorganismus Bacillus stearothermophiles NRS1536 (10g Naßgewicht) werden in 50ml 1%TRITON X-100 in 5OmM TRIS-HCI-Puffer (pH7,2) suspendiert und die Suspension 30min bei 370C gerührt. TRITON X-100, ein mildes nicht ionisches Detergens, dringt infolge des Konzentrationsausgleiches durch die Poren der S-Schicht und der darunterliegenden zelleigenen, aus Peptidoglycan bestehenden Stützschicht in die Zelle ein und zerstört dort die an die Peptidoglycanschicht anschließende Cytoplasmamembran. Da die Cytoplasmamembran die hauptsächliche Diffusionsbarriere derZell-Hülle darstellt, können nun nach deren Zerstörung die Inhaltsstoffe der Zelle nach außen diffundieren. Die Zellen werden nach der Behandlung mit TRITON X-100 bei 20 000 g zentrifugiert, zur Zerstörung von noch vorhandenen Cytroplasmamembranresten während 10 min bei 600C einer weiteren Extraktion mit TRITON X-100 unterzogen, und neuerlich bei 20000 g zentrifugiert. Die so präparierten Z.ellwandhüllen werden dann vier aufeinanderfolgenden Waschschritten unterzogen, die jeweils durch Rühren der Zellwandhüllen in Aqua dest. während 10min und einer anschließenden Zentrifugation bei 20000 bestehen. Zum Abbau von noch vorhandenen Zeilinhaltsstoffen wie Ribosomen und Nucleinsäuren werden einer Suspension der gewaschenen Zellwandhüllen in 40ml Aqua dest. 2mg Rubonucleaseund 2mg Desoxyribonnuclease zugefügt, und 20min bei 30°C unter Rühren inkubiert. Die Suspension wird dann bei 20000 g zentrifugiert und die Zellen dann einigen Waschschritten mit Aqua dest. unterworfen.Intact cells of the microorganism Bacillus stearothermophiles NRS1536 (10g wet weight) are suspended in 50 ml of 1% TRITON X-100 in 5OmM TRIS-HCl buffer (pH 7.2) and the suspension stirred for 30 min at 37 0 C. TRITON X-100, a mild non-ionic detergent, penetrates into the cell as a result of concentration balancing through the pores of the S-layer and the underlying cell-based peptoglycan support layer, where it destroys the cytoplasmic membrane adjacent to the peptidoglycan layer. Since the cytoplasmic membrane is the main diffusion barrier of the cell envelope, after its destruction, the contents of the cell can now diffuse outward. The cells are centrifuged after the treatment with TRITON X-100 at 20 000 g for subjected to destroy still present Cytroplasmamembranresten for 10 min at 60 0 C to a further extraction with TRITON X-100, and centrifuged again at 20,000 g. The Z.ellwandhüllen so prepared are then subjected to four successive washes, each by stirring the cell wall shells in distilled water. during 10min and subsequent centrifugation at 20,000 exist. To remove remaining Zeilinhaltsstoffen such as ribosomes and nucleic acids are a suspension of the washed cell wall shells in 40 ml of distilled water. 2mg rubonuclease and 2mg deoxyribonuclease, and incubated at 30 ° C for 20min with stirring. The suspension is then centrifuged at 20,000 g and the cells are then washed several times with distilled water. subjected.
Die so erhaltenen Zellwandhüllen werden nach Zentrifugation bei 20000g in 0,1 M Triethanolamin (pH8,5) resuspendiert, wonach — unter Rühren — zu 10 ml dieser Suspension 100 mg eines Vemetzungsmittels, z. B. Dunethylsuberimidat, zugeführt wird. Nach einer Reaktionsdauer von 60 min bei 200C werden die vernetzten Zellwandhüllen durch Zentrifugation bei 20000g gewonnen, mit Aqua dest. gewaschen und können, ähnlich wie in Beispiel 2 erläutert, mit Enzymproteinen als Wertsubstanzen beladen werden.The cell wall envelopes thus obtained are resuspended after centrifugation at 20,000 g in 0.1 M triethanolamine (pH 8.5), after which - with stirring - to 10 ml of this suspension, 100 mg of a crosslinking agent, eg. B. Dunethylsuberimidat, is supplied. After a reaction time of 60 min at 20 0 C, the crosslinked cell wall shells are recovered by centrifugation at 20000g, with distilled water. washed and can, as explained in Example 2, are loaded with enzyme proteins as valuable substances.
Vorteilhafte Verwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren und der durch ein erfindungsgemäßes Verfahren hergestellten Struktur, die gewerblich bedeutsam sind.Advantageous uses of the methods of the invention and the structure produced by a method of the invention which are of commercial importance.
Einige vorteilhafte Verwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren und der durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Strukturen sind in den vorstehend beschriebenen Beispielen erwähnt Diese Strukturen, insbesondere solche, deren Herstellung anhand von Beispiel 4 samt dessen Varianten und von Beispiel 5 erläutert ist, können vorteilhaft in derselben Weise verwendet werden, wie es schon in der EP-A2-0154620 eingehend beschrieben wurde.Some advantageous uses of the processes according to the invention and the structures produced by the processes according to the invention are mentioned in the examples described above. These structures, in particular those whose preparation is illustrated by Example 4 together with its variants and Example 5, can advantageously be used in the same way , as already described in detail in EP-A2-0154620.
Claims (34)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0406984A AT382321B (en) | 1984-12-21 | 1984-12-21 | METHOD FOR PRODUCING A DEFINED POROUS MEMBRANE AND THE USE THEREOF |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD251080A5 true DD251080A5 (en) | 1987-11-04 |
Family
ID=3559235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD85284926A DD251080A5 (en) | 1984-12-21 | 1985-12-20 | METHOD FOR PRODUCING A STRUCTURE WITH MEMBRANES |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
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1984
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-
1985
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA859780B (en) | 1986-08-27 |
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