Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung kann angewendet werden zur Herstellung von Oligodesoxyribonukleotiden mit hinreichend homogener Länge aus natürlicher DNA, die als Primer angewendet werden können bei der Synthese von DNA an der Matrix von einzel- und doppelsträngigen RNA oder DNA, z. B. zur radioaktiven Markierung von Hybridisierungsproben.The invention can be applied to the preparation of oligodeoxyribonucleotides of sufficiently homogeneous length from natural DNA that can be used as primers in the synthesis of DNA on the matrix of single and double-stranded RNA or DNA, e.g. For radioactive labeling of hybridization probes.
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Für die Synthese von komplementärer DNA (sDNA) mittels reverser Transkriptase zu RNA-Spezies ohne З'-terminale PoIy(A)-Ketten wird häufig die Verwendung unspezifischer Primer empfohlen (z.B. MANIATIS u.a., 1982), die aus natürlicher DNA (z.B. Kalbsthymus-DNA) gewonnen werden können. Zur Herstellung dieser Primer wird die Verdauung der natürlichen DNA mittels DNaseI aus Rinderpankreas angewandt. Da diese DNase in gewissem Grade sequenzspezifisch spaltet, entstehen hierbei Fragmente unterschiedlicher Länge, weshalb meist eine relativ aufwendige Größenfraktionierung der entstandenen Oligonukleotidedurchgeführt wird (HOHN und SCHALLER, 1967). Unlängst wurde von FEINBERG und VOGELSTEIN (1983) eine weitere Anwendung von Oligodesoxyribonukleotiden für die geprimte DNA-Synthese beschrieben. Die Autoren verwendeten allerdings synthetische Hexadesoxyribonukleotide (PHARMACIA Kat. Nr. 2166). Diese DNA-MarkierungsrrfBthode stellt eine sehr vorteilhafte Alternative zu der bis dahin meist angewendeten sogen, nick translation dar. Sind synthetische Oligonukleotide nicht verfügbar, können ebensogut auch die erwähnten Primeraus natürlicher DNA verwendet werden. Der Mangel und Nachteil besteht darin, daß aufgrund des uneinheitlichen Abbaus der DNA aufwendige Fraktionierungen durchgeführt werden müssen. Wird hingegen ein Oligonukleotidpräparat verwendet, aus dem längere Fragmente zuvor nicht abgetrennt wurden, kommt es bei der Synthesereaktion zu einem verstärkten Einbau der radioaktiven Prekursoren in Primer-spezifische Sequenzen. Dies hat bei der nachfolgenden Hybridisierung ein verschlechtertes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zur Folge, was insbesondere beim sogen, geromischen blotting zu Fehlinterpretationen führt.For the synthesis of complementary DNA (sDNA) by means of reverse transcriptase to RNA species without З'-terminal poly (A) chains, the use of nonspecific primers is frequently recommended (eg MANIATIS et al., 1982) consisting of natural DNA (eg calf thymus). DNA) can be obtained. For the preparation of these primers, the digestion of natural DNA by DNaseI from bovine pancreas is used. Since this DNase cleaves to a certain extent sequence-specific, fragments of different lengths are formed, which is why a relatively expensive size fractionation of the resulting oligonucleotides is usually carried out (HOHN and SCHALLER, 1967). More recently, FEINBERG and VOGELSTEIN (1983) described another application of oligodeoxyribonucleotides for primed DNA synthesis. However, the authors used synthetic hexadecoxyribonucleotides (PHARMACIA cat. No. 2166). This DNA labeling method provides a very advantageous alternative to the so-called nick translation which has hitherto been most widely used. If synthetic oligonucleotides are not available, the primers of natural DNA mentioned can just as well be used. The defect and disadvantage is that complicated fractionation must be carried out due to the inconsistent degradation of the DNA. If, on the other hand, an oligonucleotide preparation is used from which longer fragments have not previously been separated off, the synthesis reaction results in an increased incorporation of the radioactive precursors into primer-specific sequences. This results in a reduced signal-to-noise ratio in the subsequent hybridization, which leads to misinterpretations, in particular in the case of so-called geromic blotting.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Durch mehrfache enzymatische Spaltung natürlicher DNA und einfache Fällungsprozeduren wird ein Oligonukleotidpräparat erhalten, das ohne weitere Fraktionierung als Primer sowohl für die cDNA-Synthese als auch für die Oligomarkierung nach FEINBERG und VOGELSTEIN (1983) eingesetzt werden kann.By multiple enzymatic cleavage of natural DNA and simple precipitation procedures an oligonucleotide preparation is obtained, which can be used without further fractionation as a primer for both the cDNA synthesis and for the oligo-labeling according to FEINBERG and VOGELSTEIN (1983).
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Die vorgelegte Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß natürliche DNA im ersten Schritt in Mn++-haltiger Lösung mittels DNasel in Fragmente mit überwiegend stumpfen Enden gespalten wird. Diese Fragmente haben З'-terminale OH-Gruppen und sind somit nach Denaturierung prinzipiell als Primermoleküle geeignet. Um ausreichend kleine DNA-Fragmehte und eine hinreichend homogene Größenverteilung an Oligonukleotiden zu erhalten, wird zusätzlich mit Niklease aus Staphylococcus (micrococcal nuclease) gespalten. Da die hierbei neuentstandenen З'-Enden phosphoryliert sind, scheidet ein Teil der resultierenden Fragmente als Primermoleküle aus. Durch die genannte Doppelspaltung der natürlichen DNA werden Oligonukleotide mit für die geprimte DNA-Synthese optimaler Länge erhalten, die unter Standardversuchsbedingungen ohne Zusatz von Template-DNA praktisch keinen Radioaktivitätseinbau bewirken. Verbliebene längere DNA-Fragmente werden durch differentielle Ethanolfätlung aus dem Präparat entfernt. Diese Methode liefert auf einfachste Weise und kostengünstig Primerpräparate, die keiner weiteren Fraktionierung z.B. durch HPLC oder DEAE-Chromatographie bedürfen.The present invention is characterized in that natural DNA in the first step in Mn ++ -containing solution is cleaved by DNasel into fragments with predominantly blunt ends. These fragments have З'-terminal OH groups and are therefore suitable after denaturation in principle as primer molecules. In order to obtain sufficiently small DNA Fragmehte and a sufficiently homogeneous size distribution of oligonucleotides is additionally cleaved with Niklease from Staphylococcus (micrococcal nuclease). Since the neu'-ends which are newly formed are phosphorylated, some of the resulting fragments precipitate as primer molecules. By said double cleavage of the natural DNA oligonucleotides are obtained with optimal length for the primed DNA synthesis, which cause virtually no radioactivity incorporation under standard experimental conditions without the addition of template DNA. Remaining longer DNA fragments are removed from the preparation by differential ethanolylation. This method provides in the simplest and most cost-effective manner primer preparations that require no further fractionation, for example by HPLC or DEAE chromatography.
Ausführungsbeispielembodiment
Auf 1g DNA(z. B. aus Kalbsthymus) in 2OmMTHs-HCI, pH7,4 und 1OmM MnCI2 werden 2 mg DNasel aus Rinderpankreas gegeben und die Lösung 30min bei 37°C gehalten. Die Reaktion wird durch Na2EDTΑ-Zugabe auf 1 mM abgestoppt, die Losung auf 1 % SDS gebracht und nacheinander mit Phenol, PhenokChloroform (1:1, V:V) bzw. Chloroform deproteinisiert. Die DNA-Fragmente werden aus der resultierenden wäßrigen Phase nach Zugabe von Natriumacetat, CaCI2 und Ethanol auf 0,3 M, 10 mM bzw. 70% über Nacht bei —200C präzipitiert und durch Zentrifugation gesammelt. Nach Waschen und Trocknen des Präzipitats werden die DNA-Fragmente in 10mMTris-HCI,pH7,5,1OmM CaCI2,8 M Harnstoff gelost, mit 2 \ig micrococcal nucleaseje mg DNA versetzt und 1 h bei 500C gehalten. Die Reaktion wird wie bereits beschrieben abgestoppt und das Präparat deproteinisiert. Nach Zugabe von Ethanol auf 50% wird 5min bei 6000g zentrifugiert, der Überstand mit Natriumacetat, CaCI2 und Ethanol auf 0,3M, 1OmM bzw. 70% (Gesamtkonzentration) versetzt und über Nacht bei -20°C gehalten. Die Sammlung des Präzipitats erfolgt durch Zentrifugation 30min bei 16000g,4°C.On 1 g of DNA (eg from calf thymus) in 20 mM H-HCl, pH 7.4 and 10 mM MnCl 2 , 2 mg of DNasel from bovine pancreas are added and the solution is kept at 37 ° C. for 30 min. The reaction is stopped by addition of Na 2 EDTΑ to 1 mM, the solution is brought to 1% SDS and deproteinized successively with phenol, phenol chloroform (1: 1, V: V) or chloroform. The DNA fragments are precipitated from the resulting aqueous phase after addition of sodium acetate, CaCl 2 and ethanol to 0.3 M, 10 mM and 70% overnight at -20 0 C and collected by centrifugation. Following washing and drying the precipitate, the DNA fragments in 10 mM Tris-HCl, pH7,5,1OmM CaCl 2 are 8 M urea dissolved, mixed with 2 \ ig Micrococcal nucleaseje mg DNA and 1 h at 50 0 C. The reaction is stopped as already described and the preparation is deproteinized. After addition of ethanol to 50% is centrifuged for 5 min at 6000g, the supernatant with sodium acetate, CaCl 2 and ethanol to 0.3M, 1OmM and 70% (total concentration) and kept overnight at -20 ° C. The precipitate is collected by centrifugation for 30 min at 16000g, 4 ° C.