DD248664A5 - Method and reagent for the specific determination of pancreatic alpha-amylase - Google Patents
Method and reagent for the specific determination of pancreatic alpha-amylaseInfo
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Abstract
Zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel-alpha-Amylase in Koerperfluessigkeiten, insbesondere in Serum, Plasma, Duodenalsaft oder Urin setzt man diese mit einem System zum Nachweis von alpha-Amylase in Gegenwart eines ersten monoklonalen Antikoerpers, welcher das Speichelenzym zu weniger als 97% spezifisch hemmt, in Kombination mit einem zweiten monoklonalen Anti-Speichel-alpha-Amylase-Antioerper, der dieses Enzym zu weniger als 10% hemmt, um.For the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase in body fluids, especially in serum, plasma, duodenal or urine they are set with a system for the detection of alpha-amylase in the presence of a first monoclonal antibody to which the salivary enzyme specifically inhibits less than 97%, in combination with a second monoclonal anti-salivary alpha-amylase antisera that inhibits less than 10% of this enzyme.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel-alpha-Amylase in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum, Plasma, Duodenalsaft oder Urin, durch Umsetzung mit einem System zum Nachweis von alpha-Amylase in Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers, der Speichel-alpha-Amylase inhibiert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird insbesondere angewandt in der klinischen Analytik und Diagnostik.The invention relates to a method for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase in body fluids, in particular in serum, plasma, duodenal or urine, by reaction with a system for the detection of alpha-amylase in the presence of a monoclonal antibody, the salivary alpha-amylase inhibited. The method according to the invention is used in particular in clinical analysis and diagnostics.
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Alpha-Amylase (E.C.3.2.1.1.) baut 1,4-d-glucosidisch verknüpfte Oligo- und Polysaccharide überwiegend durch zufällige Hydrolyse der 1,4-alpha-glucosidischen Bindungen zu Maltose und Malto-oligosacchariden ab. Das Enzym hat neben der industriellen Fermentationstechnik erhebliche Bedeutung im Rahmen der klinischen Analytik und Diagnostik. Bei zahlreichen Erkrankungen verändert sich nämlich der alpha-Amylasegehalt in den Körperflüssigkeiten wie Serum, Harn oder Duodenalsekret beträchtlich. Im Körper kommen jedoch im wesentlichen zwei alpha-Amylaseenzyme vor, das Pankreasenzym und das Speichelenzym. Da diagnostische Bedeutung nur dem Pankreasenzym zukommt, stellt sich die Aufgabe, diese beiden (neben selten und nur in geringer Menge auftretenden weiteren Isoenzymen) alpha-Amylasen analytisch zu differenzieren. Die Schwierigkeit besteht hierbei darin, daß die beiden multiplen Formen ähnlichen Aufbau besitzen und immunologisch identisch sind (K. Lorentz, Laboratoriumblätter 32:118 [1982]). Zur Eliminierung der Aktivität des Speichelenzyms ist es bekannt, Adsorbtion an Anionenaustauscher, Hemmung · durch ein Weizenprotein oder Elektrophorese bzw. Elektrofokusierung anzuwenden. Diese Verfahren sind jedoch entweder in ihrer Trennwirkung unbefriedigend oder für eine Routinediagnostik zu aufwendig. Unter den genannten Methoden ist allein das in Clim. Chem 28/7, 1525-1527 (1982) beschriebene Verfahren der Hemmung des Enzyms vom Speicheltyp durch einen aus Weizenkeimen gewonnenen Inhibitor mit einem für die Routinediagnose akzeptablen Zeitaufwand verbunden, jedoch ist die Selektivität unbefriedigend. Auch bei der optimalen Inhibitorkonzentration bleiben etwa 13% der Aktivität des Speicheltyp-Enzyms erhalten, während die Aktivität des Pankreasenzyms auf etwa 81 % verringert wird.Alpha-amylase (E.C.3.2.1.1.) Degrades 1,4-d-glucosidically linked oligo- and polysaccharides predominantly by random hydrolysis of the 1,4-alpha-glucosidic bonds to maltose and malto-oligosaccharides. In addition to industrial fermentation technology, the enzyme has considerable significance in the context of clinical analysis and diagnostics. For many diseases, the alpha-amylase content in body fluids such as serum, urine or duodenal secretions changes considerably. In the body, however, there are essentially two alpha-amylase enzymes, the pancreatic enzyme and the salivary enzyme. Since only the pancreatic enzyme has diagnostic significance, the task arises of analytically differentiating these two alpha-amylases (in addition to rare and only small amounts of other isoenzymes). The difficulty here is that the two multiple forms have similar structures and are immunologically identical (K. Lorentz, Laboratoriumblätter 32: 118 [1982]). To eliminate the activity of the salivary enzyme, it is known to use adsorption on anion exchangers, inhibition by a wheat protein or electrophoresis or electro-focussing. However, these methods are either unsatisfactory in their separation effect or too expensive for routine diagnostics. Among the methods mentioned is that alone in Clim. Chem. 28/7, 1525-1527 (1982), the inhibition of the salivary-type enzyme by an inhibitor derived from wheat germ is associated with an expenditure of time that is acceptable for routine diagnosis, but the selectivity is unsatisfactory. Even at the optimal inhibitor concentration, about 13% of the activity of the salivary-type enzyme is retained while the activity of the pancreatic enzyme is reduced to about 81%.
In der Europäischen Patentanmeldung Nr. 84 114 172.4 wird bereits vorgeschlagen, die Pankreas-alpha-Amylase neben der Speichel-alpha-Amylase zu bestimmen, indem man in Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers arbeitet, der mit Speichel-alpha-Amylase reagiert und hierbei eine Kreuzaktivität von 5% oder weniger gegenüber Pankreas-alpha-Amylase aufweist. Mit diesem monoklonalen Antikörper ist es bei Zusatz eines präzipitierenden Agens auch möglich, einen unlöslichen Komplex mit der Speichel-alpha-Amylase zu bilden, den man aus der Lösung abtrennen kann, so daß nur das Pankreasenzym in der Lösung zurückbleibt und dort bestimmt werden kann. Alternativ ist es möglich, den monoklonalen Antikörper in immobilisierter Form zu verwenden und auf diese Weise die Speichel-Amylase abzutrennen. In beiden Fällen ist es jedoch erforderlich, eine unlösliche Phase zu bilden und von der löslichen Phase zu trennen.In European Patent Application No. 84 114 172.4 it is already proposed to determine the pancreatic alpha-amylase in addition to the salivary alpha-amylase by working in the presence of a monoclonal antibody which reacts with salivary alpha-amylase and thereby a cross activity of 5% or less against pancreatic alpha-amylase. With this monoclonal antibody, with the addition of a precipitating agent, it is also possible to form an insoluble complex with the salivary alpha-amylase which can be separated from the solution so that only the pancreatic enzyme remains in the solution and can be determined there. Alternatively, it is possible to use the monoclonal antibody in immobilized form and thus separate the salivary amylase. In both cases, however, it is necessary to form an insoluble phase and to separate it from the soluble phase.
In der DE A-1 35 00 526.2 wird darüberhinaus ein Verfahren der angegebenen Art offenbart, bei dem anstelle des bindenden monoklonalen Antikörpers der genannten europäischen Patentanmeldung ein spezifisch das Speichel-isoenzym hemmender monoklonaler Antikörper verwendet wird. Hierdurch wird zwar eine weitere Verbesserung der alpha-Amylase-lsoenzymbestimmung erreicht, ohne hierbei eine Phasentrennung vornehmen zu müssen, jedoch betrug die maximal erreichte Hemmung des Speichelenzyms weniger als 97%, so daß immer noch eine unerwünscht große Ungenauigkeit der Bestimmung anhaftet.DE-A-1 35 00 526.2 moreover discloses a process of the stated type in which, instead of the binding monoclonal antibody of said European patent application, a monoclonal antibody specifically inhibiting salivary isoenzyme is used. Although this achieves a further improvement of the alpha-amylase isoenzyme determination without having to carry out a phase separation, the maximum achieved inhibition of the salivary enzyme was less than 97%, so that an undesirably large inaccuracy of the determination still adheres.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum, Plasma, Duodenalsaft oder Urin, mit dem die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Bestimmung verbessert werden kann. .The aim of the invention is to provide an improved method for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in body fluids, in particular in serum, plasma, duodenal or urine, with which the speed and accuracy of the determination can be improved. ,
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Nachteil der bekannten Verfahren zu beseitigen und ein,Verfahren und ein Reagenz zu schaffen, welches eine raschere und einfache, aber noch genauere Bestimmung der Pankreas-alpha-Amylase neben der alpha-Amylase vom Speicheltyp in Körperflüssigkeiten ermöglicht.The invention has for its object to eliminate the disadvantage of the known methods and to provide a method and a reagent which allows a faster and easier, but still more accurate determination of pancreatic alpha-amylase in addition to the salivary type alpha-amylase in body fluids ,
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel-alpha-Amylase in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum, Plasma, Duodenalsaft oder Urin, durch Umsetzung mit einem System zum Nachweis von alpha-Amylase in Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers, der Speichel-alpha-Amylase inhibiert, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Inhibitor einen ersten monoklonalen Antikörper, welcher das Speichelenzym zu weniger als 97% spezifisch hemmt, in Kombination mit einem zweiten monoklonalen Anti-Speichel-alpha-Amylase-Antikörper, der dieses Enzym zu weniger als 10% hemmt, verwendet.This object is achieved according to the invention by a method for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase in body fluids, especially in serum, plasma, duodenal or urine, by reaction with a system for the detection of alpha-amylase in the presence of a A monoclonal antibody which inhibits salivary alpha-amylase, which comprises, as an inhibitor, a first monoclonal antibody which inhibits the salivary enzyme to less than 97% specifically, in combination with a second monoclonal anti-salivary alpha-amylase Antibody that inhibits less than 10% of this enzyme used.
Insbesondere eignen sich für die Erfindung hemmende Antikörper mit < 93% Hemmung als erste monoklonale Antikörper und bindende Antikörper mit < 5% Hemmung des Speichelenzyms als zweite monoklonale Antikörper. Als unterer Grenzwert der Hemmung sind etwa 70%, vorzugsweise 80% anzusehen, um in der erfindungsgemäßen Kombination eine Hemmung über 97% zu erzielen.In particular, inhibiting antibodies with <93% inhibition as first monoclonal antibodies and binding antibodies with <5% inhibition of the salivary enzyme as second monoclonal antibodies are suitable for the invention. The lower limit of the inhibition is about 70%, preferably 80%, in order to achieve an inhibition above 97% in the combination according to the invention.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der sehr überraschenden Beobachtung, daß die inhibierende Wirksamkeit eines monoklonalen Antikörpers, welcher das Speichelenzym nicht voll zufriedenstellend hemmt, durch einen lediglich bindenden, aber praktisch nicht oder völlig ungenügenden monoklonalen Antikörper synergistisch verstärkt wird und eine fast quantitative Hemmung des Speichelenzyms bei 100% Erhaltung der Aktivität des Pankreasenzyms erreicht werden kann. Außerdem gelingt es, so die Inkubationszeit wesentlich zu verringern.The method of the present invention is based on the very surprising observation that the inhibitory potency of a monoclonal antibody which does not fully satisfactorily inhibit the salivary enzyme is synergistically enhanced by a monoclonal antibody that is merely binding, but not practically or completely insufficient, and contributes to almost quantitative inhibition of the salivary enzyme 100% maintenance of pancreatic enzyme activity can be achieved. It also succeeds in significantly reducing the incubation period.
Für das Verfahren der Erfindung werden als erste monoklonale Antikörper bevorzugt die aus den bei NCACC unter den Nummern (99D12) 84122003 und (89E2) 84122004 hinterlegten (National Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, GB) Zellkulturen gewonnenen Antikörper verwendet. Als zweite monoklonale Antikörper werden bevorzugt dieinderEU-AI84114 172.4 offenbarten bindenden Antikörper der bei NCACC unter den Nummern 84111301, 84111302 hinterlegten Zellkulturen verwendet; besonders bevorzugt wird NCACC 84111301.The first monoclonal antibodies used for the method of the invention are preferably the antibodies obtained from cell cultures which have been deposited at NCACC under the numbers (99D12) 84122003 and (89E2) 84122004 (National Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, GB). As second monoclonal antibodies, preferably the binding antibodies disclosed in EU-AI84114 172.4 of the cell cultures deposited at NCACC under numbers 84111301, 84111302 are used; particularly preferred is NCACC 84111301.
Die jeweils nötige Menge an erstem und zweitem Antikörper läßt sich für bestimmte Antikörperpräparate leicht durch wenige Vorversuche feststellen. Vorzugsweise verwendet man mindestens 5 pg/ml, mehr bevorzugt mindestens 20 μg/ml an erstem monoklonalem Antikörper und mindestens 1 Mg/ml, mehr bevorzugt mindestens 5μg/ml an zweitem monoklonalem Antikörper.The respectively required amount of first and second antibodies can be determined easily for certain antibody preparations by a few preliminary experiments. Preferably, at least 5 pg / ml, more preferably at least 20 μg / ml of first monoclonal antibody and at least 1 μg / ml, more preferably at least 5 μg / ml of second monoclonal antibody is used.
Erfindungsgemäß verwendbare monoklonale Antikörper lassen sich erhalten durch Immunisierung von Versuchstieren mit nativer oder modifizierter Speichel-alpha-Amylase, Fusion von B-Lymphocyten der so erhaltenen immunisierten Tiere mit transformierenden Agenzien, Klonierung und Kultivierung der so gebildeten Hybridzellen, welche den monoklonalen Antikörper produzieren und Isolierung des letzteren. Besonders geeignete Tiere für die Herstellung der Speichel-alpha-Amylase-Antikörper sind Ratten und Mäuse. Die Immunisierung erfolgt entweder mit nativer humaner Speichel-alpha-Amylase oder mit modifizierter Speichel-Amylase. Verwendet man natives Enzym, so eignen sich hierzu die handelsüblichen, elektrophoretisch homogenen Präparate. Chemisch modifizierte Speichel-alpha-Amylase läßt sich ebenfalls nach bekannten Methoden der Enzymmodifikation erhalten, wie sie z. B. in der DE-AS 2 543 994 näher beschrieben sind. Geeignete Modifizierungsmittel sind beispielsweise N-Bromsuccinimid (NBS) unter Oxidation von Tryptophangruppen am Protein (BBA 143 [1967] 462-472), Carboxymethylierung mit Jodacetat (IAA), die hauptsächlich am Histidin angreift bzw. Nitrierung mit Tetranitromethan (TNM) (J. Biol. Chem. 238 [1963] 3307) sowie Diazotierung mit diazotierter Sulfanilsäure (Meth. Enzymol. 25 [1972] 515-531). Am besten geeignet erwies sich dabei das mit TNM modifizierte Enzym bei" Verwendung von Balb/c-Mäusen oder das native Enzym bei Verwendung von AJ-Mä'usen.Monoclonal antibodies useful in the present invention can be obtained by immunization of experimental animals with native or modified salivary alpha-amylase, fusion of B lymphocytes of immunized animals thus obtained with transforming agents, cloning and culturing of the hybrid cells thus produced which produce the monoclonal antibody and isolation of the latter. Particularly suitable animals for the production of salivary alpha-amylase antibodies are rats and mice. Immunization is either with native human salivary alpha-amylase or with modified salivary amylase. If native enzyme is used, the commercially available, electrophoretically homogeneous preparations are suitable for this purpose. Chemically modified salivary alpha-amylase can also be obtained by known methods of enzyme modification, as described, for. B. in DE-AS 2,543,994 described in more detail. Suitable modifiers are, for example, N-bromosuccinimide (NBS) with oxidation of tryptophan groups on the protein (BBA 143 [1967] 462-472), carboxymethylation with iodoacetate (IAA), which acts mainly on histidine or nitration with tetranitromethane (TNM) (J. Biol. Chem. 238 [1963] 3307) and diazotization with diazotized sulphanilic acid (Meth. Enzymol. 25 [1972] 515-531). The TNM-modified enzyme was found to be most useful with "Balb / c mice or the native enzyme using AJ mice.
Die Immunisierung erfolgt durch übliche Verabreichung des nativen oder modifizierten Enzyms, vorzugsweise in Kombination mit Adjuvanz. Bevorzugt wird als Adjuvanz Aluminiumhydroxid zusammen mit Brodatella pertussis. Wird für die Immunisierung native Speichel-alpha-Amylase in AJ-Mäusen oder TNM-modifizierte Speichel-alpha-Amylase in Baib/c-Mäusen verwendet, so erfolgt die Immunisierung vorzugsweise über mindestens 9 Monate mit mindestens 7 Immunisierungen (Injektionen I. P.).Immunization is by conventional administration of the native or modified enzyme, preferably in combination with adjuvant. Preference is given to aluminum hydroxide as adjuvant together with Brodatella pertussis. If native salivary alpha-amylase in AJ mice or TNM-modified salivary alpha-amylase in Baib / c mice is used for the immunization, the immunization is preferably carried out for at least 9 months with at least 7 immunizations (injections I.P.).
Nach erfolgter Immunisierung werden die B-Lymphocyten der immunisierten Tiere nach üblichen Methoden mit transformierenden Agenzien fusioniert. Beispiele für transformierende Agenzien, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden können, sind Myelomazellen, transformierende Viren wie z. B. Epstein-Barr-Virus oder die in der deutschen Offenlegungsschrift 3 245 665 beschriebenen Agenzien. Die Fusionierung erfolgt nach dem bekannten Verfahren von Koehler und Milstein (Nature 256 [1975] 495-497). Die hierbei gebildeten Hybridzellen werden in üblicherweise kloniert, z. B. unter Verwendung eines handelsüblichen Zellsorters, und die erhaltenen Klone, welche den gewünschten monoklonalen Antikörperhilden, gezüchtet. Aufgrund des krebsartigen Wachsens der Hybridzellen lassen sich diese auf unbestimmte Zeit weiterkultivieren und produzieren den gewünschten monoklonalen Antikörper in beliebiger Menge.After immunization, the B lymphocytes of the immunized animals are fused by conventional methods with transforming agents. Examples of transforming agents that can be used in the invention are myeloma cells, transforming viruses such. Epstein-Barr virus or the agents described in German Offenlegungsschrift 3 245 665. The fusion is carried out according to the known method of Koehler and Milstein (Nature 256 [1975] 495-497). The hybrid cells formed in this case are usually cloned, z. Using a commercial cell sorter, and the resulting clones producing the desired monoclonal antibody. Due to the cancerous growth of the hybrid cells, they can be cultivated indefinitely and produce the desired monoclonal antibody in any amount.
Für das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren können die monoklonalen Antikörper als solche oder ihre entsprechende immunologische Eigenschaften aufweisenden Fragmente (Fab-Fragmente) verwendet werden. Unter dem Begriff „monoklonaler Antikörper" werden hier daher auch die Fragmente verstanden. Sowohl der komplette Antikörper, als auch seine Fragmente, können in immobilisierter Form verwendet ,werden.For the determination method according to the invention, the monoclonal antibodies can be used as such or their corresponding immunological properties having fragments (Fab fragments). The term "monoclonal antibody" is therefore also understood to mean the fragments, and both the complete antibody and its fragments can be used in immobilized form.
Die Bestimmung der alpha-Amylase als solche erfolgt nach den hierfür bekannten Methoden. Da die erfindungsgemäße Kombination monoklonaler Antikörper selektiv die alpha-Amylase vom Speicheltyp hemmt und sie so der Enzymaktivitätsbestimmung entzieht, ohne das Pankreasenzym zu beeinträchtigen, entsprechen die bei der alpha-Amylase-Bestimmung in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers erhaltenen Werte der dem Pankreasenzym alleine zukommenden Aktivität.The determination of the alpha-amylase as such is carried out by the methods known for this purpose. Since the combination of monoclonal antibodies of the present invention selectively inhibits the salivary type alpha-amylase and thus deprives it of enzyme activity determination without adversely affecting the pancreatic enzyme, the values obtained in the presence of the monoclonal antibody in the alpha-amylase determination correspond to the pancreatic enzyme-only activity.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einem System zum Nachweis von alpha-Amylase durchgeführt, welches eine Maltopolyose mit 4 bis 7 Glucoseresten im Molekül, Maltosephosphorylase, ß-Phosphoglucomutase, Clucose-6-phosphatdehydrogenase und NAD enthält.The process according to the invention is preferably carried out with a system for the detection of alpha-amylase which contains a maltopolyose having 4 to 7 glucose residues in the molecule, maltose phosphorylase, β-phosphoglucomutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and NAD.
Ein weiteres, im Rahmen der Erfindung bevorzugt verwendetes System zum Nachweis der alpha-Amylase besteht aus Nitrophenylmaltopolyose mit 4 bis 7 Glucoseresten im Molekül und alpha-Glucosidase.Another system preferably used in the invention for the detection of alpha-amylase consists of Nitrophenylmaltopolyose with 4 to 7 glucose residues in the molecule and alpha-glucosidase.
Ein weiteres bevorzugtes Nachweissystem für alpha-Amylase besteht aus mit bestimmbaren Gruppen modifizierter Stärke. Der Begriff modifizierte Stärke umfaßt beispielsweise Stärke, die mit bestimmbaren Gruppen modifiziert ist, z. B. das als „Phadebas" handelsübliche Produkt sowie das in der DE-OS 2 812 154 beschriebene Produkt sowie im Abbauverhalten veränderte Stärke, beispielsweise Carboxymethylstärke und Grenzdextrine. Alle diese Systeme sind bekannt und bedürfen daher hier keiner näheren Beschreibung.Another preferred detection system for alpha-amylase consists of identifiable groups of modified starch. The term modified starch includes, for example, starch modified with detectable groups, e.g. For example, the product commercially available as "Phadebas" and the product described in DE-OS 2 812 154 as well as starch modified in the degradation behavior, for example carboxymethyl starch and limiting dextrins All these systems are known and therefore do not require any further description here.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probeflüssigkeit entweder zuerst mit den erfindungsgemäß verwendeten Antikörpern inkubiert und danach direkt im üblichen Amylasetest eingesetzt oder einer Mischung der Antikörper mit dem Amylasenachweisreagenz ohne Substanz zugegeben und nach der Inkubation durch Substratzusatz gestartet. Die Dauer der Inkubationszeit ist von der Aktivität der eingesetzten Anitkörper abhängig und beträgt vorzugsweise 0,5 bis 10, insbesondere etwa 5 Minuten.For carrying out the method according to the invention, the sample liquid is incubated either first with the antibodies used in the invention and then used directly in the usual amylase or added to a mixture of antibodies with the Amylasenachweisreagenz without substance and started after incubation by addition of substrate. The duration of the incubation period depends on the activity of the antibody bodies used and is preferably 0.5 to 10, in particular about 5 minutes.
Sofern eine Abtrennung der Speichel-alpha-Amylase wünschenswert erscheint, kann einer der monoklonalen Antikörper, sowohl in kompletter Form als auch in Form der Fragmente, auch auf einem festen Träger fixiert vorliegen, beispielsweise auf immunosorptivem Papier oder der Oberfläche von Kunststoffröhrchen bzw. -schläuchen. Auf diese Weise wird die alpha-Amylase vom Speicheltyp an den Träger, also die feste Phase, gebunden.If separation of the salivary alpha-amylase appears desirable, one of the monoclonal antibodies, both in complete form and in the form of the fragments, may also be fixed on a solid support, for example on immunosorptive paper or on the surface of plastic tubing , In this way, the salivary type alpha-amylase is bound to the carrier, that is, the solid phase.
Den durch die Erfindung erzielten Effekt belegen folgende Versuche:The effect achieved by the invention is demonstrated by the following experiments:
Monoklonale Antikörper (MAK), welche h-SA spezifisch zu maximal 93% hemmen, werden durch (NH^SO^Fällung und DEAE-Chromatographie nach gebräuchlichen Methoden aufgereinigt. Ebenso wird ein MAK, welcher spezifisch h-SA bindet, aufgereinigt. Der oder die monoklonalen Antikörper in Lösung werden mit humaner Amylase vorgemischt und diese Mischung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird diese Mischung zu Amylasereagenz gegeben und es wird die Amylaseaktivität gemessen. Als Kontrolle dient Amylase, welche mit Puffer ohne MAK's vorgemischt war. Alternativ wird bzw. werden der (die) monoklonale(n) Antikörper in einem Teil des Amylasereagenz - der alpha-Glucosidase-Lösung - vorgelegt. Danach wird die Amylaselösung zugegeben und es wird 5 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird mit dem Substrat - G7PNP (p-Nitrophenylmaltoheptaosid) - gestartet. Als Kontrolle dient eine Glucosidaselösung ohne MAKV. Fig. 1 zeigt die %-Restaktivität der h-SA bzw. h-PA mit und ohne bindenden MAK als Funktion der Endkonzentration an hemmendem MAK, ermittelt mit der Substratstartmethode. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Serumstartmethode (MAK[s] und Amylase vorgemischt) dargestellt.Monoclonal antibodies (MAbs) that specifically inhibit h-SA to a maximum of 93% are purified by (NH 4 SO 4) precipitation and DEAE chromatography using conventional methods, and a MAb that specifically binds h-SA is also purified the monoclonal antibodies in solution are premixed with human amylase and this mixture is incubated for 5 minutes at room temperature, then this mixture is added to the amylase reagent and the amylase activity is measured, as control is amylase premixed with buffer without MAbs The monoclonal antibody (s) are placed in a portion of the amylase reagent, the alpha-glucosidase solution, then the amylase solution is added and incubated for 5 minutes The reaction is carried out with the substrate - G 7 PNP (p -Nitrophenylmaltoheptaoside) - as a control serves Glucosidaselösung without MAKV.Figure 1 shows the% residual activity of h-SA or h-PA with and without binding n MAK as a function of the final concentration of inhibitory MAK, as determined by the substrate initiation method. Table 1 shows the results of the serum start method (MAK [s] and amylase premixed).
Hemmung der humanen Speichel- und Pankreas-alpha-Amylase durch 1. MAK (NCACC 84122004) mit und ohne 2. MAK (NCACC 84111301), SubstratstartmethodeInhibition of human salivary and pancreatic alpha-amylase by 1. MAK (NCACC 84122004) with and without 2. MAK (NCACC 84111301), substrate initiation method
Reagenzien: Puffer (wie in Beispiel 1) h-SA (wie in Beispiel 1) h-PA (wie in Beispiel 1)Reagents: Buffer (as in Example 1) h-SA (as in Example 1) h-PA (as in Example 1)
MAK-1": 1. MAK in Puffer, verschiedene Konzentrationen MAK-2": 2. MAK in Puffer, 0,513 mg/mlMAK-1 ": 1st MAb in buffer, different concentrations MAK-2": 2nd MAK in buffer, 0.513 mg / ml
alpha-Glucosidase: aus Amylasereagenz (Boehringer Mannheim, Kat. Best. Nr. 568 589) Substrat: G7PNP aus Amylasereagenzalpha-glucosidase: from amylase reagent (Boehringer Mannheim, cat. Order No. 568 589) Substrate: G 7 PNP from amylase reagent
Versuch: Zu 880 μΙ alpha-Glucosidase werden 10 μΙ einer MAK-1" Lösung sowie 10 μΙ MAK-2" Lösung oder 10 μΙ Puffer zugegeben. Dazu werden 25 μΙ h-PA oder h-SA gemischt. Diese Mischung wird 5-Minuten bei 370C inkubiert. Danach erfolgt der Start durch Zugabe von 100 μΙ Substratlösung und die Bestimmung der Amylaseaktivität nach Anleitung. Als Kontrolle dient eine Mischung von alpha-Glucosidase mit 20 μΙ Puffer sowie der entsprechenden Amylase. Die Aktivität mit MAK(s) dividiert durch die Aktivität ohne MAK's ergibt die %-Restaktivität.Experiment: 10 μΙ of a MAK-1 solution and 10 μM MAK-2 solution or 10 μΙ buffer are added to 880 μM alpha-glucosidase. For this 25 μΙ h-PA or h-SA are mixed. This mixture is incubated for 5 minutes at 37 0 C. Thereafter, the start takes place by addition of 100 μΙ substrate solution and the determination of the amylase activity according to instructions. The control is a mixture of alpha-glucosidase with 20 μΙ buffer and the corresponding amylase. The activity with MAK (s) divided by the activity without MAbs gives the% residual activity.
Ergebnis: Fig. 1 zeigt die %-Restaktivität als Funktion der Endkonzentration des 1. MAK bei h-SA mit und ohne 2. MAK und bei h-PA nur mit 2. MAK.Result: Fig. 1 shows the% residual activity as a function of the final concentration of the 1st MAb in h-SA with and without 2nd MAK and in h-PA only with 2nd MAb.
Hemmung von humaner Speichel- und Pankreas-alpha-Amylase durch hemmenden MAK NCACC 84122003 (MAK I) oder 84122004 (MAK II) und/oder bindendem MAK NCACC 84111301 (MAK III); Serumstartmethode, G7PNPaIs Substrat. GA = Gesamtaktivität; A = Aktivität mit MAK(s), RA = % RestaktivitätInhibition of human salivary and pancreatic alpha-amylase by inhibiting MAK NCACC 84122003 (MAK I) or 84122004 (MAK II) and / or binding MAK NCACC 84111301 (MAK III); Serum start method, G 7 PNPaIs substrate. GA = total activity; A = activity with MAK (s), RA =% residual activity
Es zeigt sich anhand der Abbildung und der Tabelle, daß die Kombination von hemmendem, spezifischem MAK sowie spezifisch h-SA bindendem MAK eine synergistische Steigerung der Hemmung bewirkt. Dieser Effekt ist unabhängig vom Substrat. Er wird ebenso bei hochmolekularem Substrat (gefärbte Stärke) als auch bei kurzkettigen Substraten, z. B. G5PNP (p-Nitrophenylmajtopentaosid) gefunden.It can be seen from the figure and the table that the combination of inhibitory, specific MAb and specific h-SA binding MAK causes a synergistic increase in inhibition. This effect is independent of the substrate. It is also in high molecular weight substrate (colored starch) as well as short-chain substrates, eg. B. G 5 PNP (p-Nitrophenylmajtopentaosid) found.
Auch beim Substrat eth-G7PNP wurde der Effekt beobachtet. Auch Speichelamylase in Humanseren wird synergistisch durch die zwei MAK's gehemmt.The effect was also observed with the substrate eth-G 7 PNP. Also salivary amylase in human sera is synergistically inhibited by the two MAbs.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel-alpha-Amylase in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum, Duodenalsaft, Plasma, oder Urin, enthaltend ein System zum Nachweis von alpha-Amylase und einen monoklonalen Antikörper gegen Speichel-afpha-Amylase, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen ersten monoklonalen Antikörper enthält, welcher das Speichelenzym zu weniger als 97% spezifisch hemmt, in Kombination mit einem zweiten monoklonalen Anti-Speichel-alpha-Amylase-Antikörper, der dieses Enzym zu weniger als 10% hemmt, verwendet.Another object of the invention is a reagent for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase in body fluids, especially in serum, duodenal, plasma, or urine, containing a system for the detection of alpha-amylase and a monoclonal antibody against salivary alpha-amylase, which is characterized in that it contains a first monoclonal antibody which inhibits less than 97% of the salivary enzyme specifically, in combination with a second monoclonal anti-salivary alpha-amylase antibody containing this enzyme inhibits less than 10%.
Hinsichtlich des im erfindungsgemäßen Reagenz enthaltenen Systems zum Nachweis von alpha-Amylase und der übrigen · Bedingungen gelten die obige Ausführungen bezüglich des Verfahrens entsprechend.With regard to the system for detecting alpha-amylase and the other conditions contained in the reagent according to the invention, the above explanations regarding the method apply accordingly.
Die·Erfindung ermöglicht eine einfache und besonders rasche und sehr genaue Bestimmung der Pankreas-alpha-Amylase (h-PA)-neben alpha-Amylase vom Speicheltyp (h-SA) in Körperflüssigkeiten und verbessert damit die Möglichkeiten der klinischen Diagnostik erheblich.The invention makes it possible to determine the pancreatic alpha-amylase (h-PA) -negative alpha-amylase of the salivary type (h-SA) in body fluids in a simple and particularly rapid and very accurate manner, thus considerably improving the possibilities of clinical diagnostics.
Ausführungsbeispielembodiment
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiterThe following examples further illustrate the invention
Beispiel 1example 1
Hemmung der humanen Pankreas- und Speichel-alpha-Amylase durch 1. MAK (NCACC 84122004) alleine und in Kombination mitInhibition of human pancreatic and salivary alpha-amylase by 1. MAK (NCACC 84122004) alone and in combination with
2. MAK (NCACC 84111301), Serumstartmethode2. MAK (NCACC 84111301), serum start method
Reagenzien: Puffer: 100 mM PO4 3", 150 mM NaCI, 6% Rinderserumalbumin, pH 7,1 Amylasereagenz: G7PNP (Boehringer Mannheim, Kat. Best. Nr. 568 589, 37"C) MAK-1:0,63 mg/ml 1. MAK in PufferReagents: Buffer: 100 mM PO 4 3 ", 150 mM NaCl, 6% bovine serum albumin, pH 7.1 Amylasereagenz: G 7 PNP (Boehringer Mannheim, Cat Order No. 568 589, 37..." C) MAK-1: 0 , 63 mg / ml 1st MAb in buffer
MAK-2:0,63 mg/ml 1. MAK und 0,105 mg/ml 2. MAK in Puffer MAK-3: 0,105 mg/ml 2. MAK in Puffer h-SA: etwa 3 000 U/l (G7PNP) in Puffer • h-PA: etwa 3 000 U/l (G7PNP) in PufferMAK-2: 0.63 mg / ml 1. MAb and 0.105 mg / ml 2. MAb in buffer MAK-3: 0.105 mg / ml 2. MAb in buffer h-SA: about 3000 U / l (G 7 PNP ) in buffer • h-PA: about 3,000 U / l (G 7 PNP) in buffer
Versuch: 100 μΙ h-SA oder h-PA werden mit jeweils 100 μΙ Puffer oder den verschiedenen MAK-Lösungen gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden jeweils 25 μΙ dieser Mischungen zu 1 000 μΙ bei 37°C vortemperiertem Amylasereagenz gegeben und die Amylaseaktivität nach Anleitung bestimmt. Die Restaktivität errechnet sich nach folgender Formel:Experiment: 100 μΙ h-SA or h-PA are mixed with 100 μΙ buffer or the various MAK solutions and incubated for 5 minutes at room temperature. Thereafter, 25 μΙ of these mixtures are added to 1 000 μΙ at 37 ° C preheated amylase and determines the amylase activity according to instructions. The residual activity is calculated according to the following formula:
Restaktivität (%) = χ 100 Akt. ohne MAK(s)Residual activity (%) = χ 100 Akt. without MAK (s)
Ergebnis: Die entsprechenden Restaktivitäten von h-SA betragen mit 1. MAK 8,6%, mit 2. MAK 96,9% und mit beiden MAK's 2,7%. Die h-PA Restaktivitäten betragen entsprechend 100,1 %, 99,6% und 99,7%.Result: The corresponding residual activities of h-SA amount to 8.6% with 1. MAK, with 2. MAK 96.9% and with both MAK's 2.7%. The h-PA residual activities are accordingly 100.1%, 99.6% and 99.7%.
Hemmung der Amylase durch 1. MAK (NCACC 84122003) und/oder 2. MAK (NCACC 84111301), SerumstartversionInhibition of Amylase by 1. MAK (NCACC 84122003) and / or 2. MAK (NCACC 84111301), serum start version
Reagenzien: wie bei Beispiel 1, nur MAK-1 und MAK-2 verändertReagents: as in Example 1, only changed MAK-1 and MAK-2
MAK-T: 0,525 mg/ml 1. MAK in Puffer MAK-2': 0,525 mg/ml 1. MAK und 0,105 mg/ml 2. MAK in Puffer MAK-T: 0.525 mg / ml 1. MAb in buffer MAK-2 ': 0.525 mg / ml 1. MAb and 0.105 mg / ml 2. MAb in buffer
Versuch: wie in Beispiel 1, ebenso wie die Berechnung der %-RestaktivitätExperiment: as in Example 1, as well as the calculation of% residual activity
Ergebnis: Die Restaktivitäten von h-SA betragen mit 1. MAK 9,1 %, mit 2. MAK 96,9% und mit beiden MAK's 2,5%. Die h-PA Restaktivitäten betragen entsprechend 99,9%, 99,6% und 99,7%.Result: The residual activities of h-SA amount to 9.1% with 1. MAK, with 2. MAK 96.9% and with both MAK's 2.5%. The h-PA residual activities are respectively 99.9%, 99.6% and 99.7%.
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