DD242691A5 - Method for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase - Google Patents
Method for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylaseInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel-alpha-Amylase in Koerperfluessigkeit, insbesondere in Serum, Plasma, Duodenalsaft oder Urin, durch Umsetzung mit einem System zum Nachweis von alpha-Amylase in Gegenwart eines monoklonalen Antikoerpers, der mit Speichel-alpha-Amylase reagiert. Das erfindungsgemaesse Verfahren wird angewandt in der klinischen Diagnostik. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten, einfachen und schnell ausfuehrbaren Verfahrens. Erfindungsgemaess wird ein monoklonaler Antikoerper verwendet, welcher das Speichelenzym spezifisch hemmt, das Pankreasenzym aber nicht mehr als 50% inhibiert. Hierbei verwendet man vorzugsweise einen der Antikoerper NCACC Nr. 84122003 und NCACC 84122004.The invention relates to a method for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase in body fluid, in particular in serum, plasma, duodenal or urine, by reaction with a system for the detection of alpha-amylase in the presence of a monoclonal antibody, which reacts with salivary alpha-amylase. The method according to the invention is used in clinical diagnostics. The aim of the invention is to provide an improved, simple and quickly executable method. According to the invention, a monoclonal antibody is used which specifically inhibits the salivary enzyme but does not inhibit the pancreatic enzyme by more than 50%. One preferably uses one of the antibodies NCACC No. 84122003 and NCACC 84122004.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel-alpha-Amylase in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum, Plasma, Duodenalsaft oder Urin, durch Umsetzung mit einem System zum Nachweis von alpha-Amylase in Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers, der mit Speichel-alpha-Amylase reagiert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird angewandt in der klinischen Diagnostik.The invention relates to a method for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase in body fluids, in particular in serum, plasma, duodenal or urine, by reaction with a system for the detection of alpha-amylase in the presence of a monoclonal antibody, which reacts with salivary alpha-amylase. The method according to the invention is used in clinical diagnostics.
Alpha-Amylase (E.C.3.2.1.1) baut 1 ^-d-glucosidisch verknüpfte Oligo- und Polysaccharid überwiegend durch zufällige Hydrolyse der 1,4-alpha-glucosidischen Bindungen zu Maltose und Malto-oligosacchariden ab. Das Enzym hat neben der industriellen Fermentationstechnik erhebliche Bedeutung im Rahmen der klinischen Analytik und Diagnostik. Bei zahlreichen Erkrankungen verändert sich nämlich der alpha-Amylasegehalt in den Körperflüssigkeiten wie Serum, Harn oder Duodenalsekret beträchtlich. Im Körper kommen jedoch im wesentlichen zwei alpha-Amylaseenzyme vor, das Pankreasenzym und das Speichelenzym. Da diagnostische Bedeutung nur dem Pankreasenzym zukommt, stellt sich die Aufgabe, diese beiden (neben selten und nur in geringer Menge auftretenden weiteren Isoenzymen) alpha-Amylasen analytisch zu differenzieren. Die Schwierigkeit besteht hierbei darin, daß die beiden multiplen Formen ähnlichen Aufbau besitzen und immunologisch identisch sind (K. Lorentz, Laboratoriumsblätter 32: 118 [1982]). Zur Eliminierung der Aktivität des Speichelenzymsistes bekannt, Adsorbtion an Anionenaustauscher, Hemmung durch ein Weizenprotein oder Elektrophorese bzw. Elektrofokussierung anzuwenden. Diese Verfahren sind jedoch entweder in ihrer Trennwirkung unbefriedigend oder für eine Routinediagnostik zu aufwendig. Unter den genannten Methoden ist allein das in Clin. Chem. 28/7,1525-1 527 (1982) beschriebene Verfahren der Hemmung des Enzyms vom Speicheltyp durch einen aus Weizenkeimen gewonnenen Inhibitor mit einem für die Routinediagnose akzeptablen Zeitaufwand verbunden, jedoch ist die Selektivität unbefriedigend. Auch bei der optimalen Inhibitorkonzentration bleiben etwa 13% der Aktivität des Speicheltyp-Enzyms erhalten, während die Aktivität des Pankreasenzyms auf etwa 82% verringert wird. In der älteren, nicht vorveröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 84114172.4 wird bereits vorgeschlagen, die Pankreas-alpha-Amylase neben der Speichel-aipha-Amylase zu bestimmen, indem man in Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers arbeitet, der mit Speichel-alpha-Amylase reagiert und hierbei eine Kreuzreaktivität von 5% oder weniger gegenüber Pankreas-alpha-Amylase aufweist. Mit diesem monoklonalen Antikörper ist es bei Zusatz eines präzipitierenden Argens auch möglich, einen unlöslichen Komplex mit der Speichel-alpha-Amylase zu bilden, den man aus der Lösung abtrennen kann, so daß nur das Pankreasenzym in der Lösung zurückbleibt und dort bestimmt werden kann. Alternativ ist es möglich, den monoklonalen Antikörper in immobilisierter Form zu verwenden und auf diese Weise die Speichel-Amylase abzutrennen. In beiden Fällen ist es jedoch erforderlich, eine unlösliche Phase zu bilden und von der löslichen Phase zu trennen.Alpha-amylase (E.C.3.2.1.1) degrades 1 ^ -d-glucosidically linked oligo- and polysaccharides predominantly by random hydrolysis of the 1,4-alpha-glucosidic bonds to maltose and malto-oligosaccharides. In addition to industrial fermentation technology, the enzyme has considerable significance in the context of clinical analysis and diagnostics. For many diseases, the alpha-amylase content in body fluids such as serum, urine or duodenal secretions changes considerably. In the body, however, there are essentially two alpha-amylase enzymes, the pancreatic enzyme and the salivary enzyme. Since only the pancreatic enzyme has diagnostic significance, the task arises of analytically differentiating these two alpha-amylases (in addition to rare and only small amounts of other isoenzymes). The difficulty here is that the two multiple forms have a similar structure and are immunologically identical (K. Lorentz, Laboratoriumsblätter 32: 118 [1982]). For eliminating the activity of the salivary enzyme, it is known to use adsorption on anion exchangers, inhibition by a wheat protein or electrophoresis. However, these methods are either unsatisfactory in their separation effect or too expensive for routine diagnostics. Among the methods mentioned, only the one given in Clin. Chem. 28 / 7,1525-1,527 (1982), the inhibition of the salivary-type enzyme by an inhibitor derived from wheat germ is associated with an expenditure of time that is acceptable for routine diagnosis, but the selectivity is unsatisfactory. Even at the optimal inhibitor concentration, about 13% of the activity of the salivary-type enzyme is retained while the activity of the pancreatic enzyme is reduced to about 82%. In the earlier, non-prepublished European Patent Application No. 84114172.4 it is already proposed to determine pancreatic alpha-amylase besides salivary alpha-amylase by operating in the presence of a monoclonal antibody which reacts with salivary alpha-amylase and thereby has a cross-reactivity of 5% or less to pancreatic alpha-amylase. With this monoclonal antibody, upon addition of a precipitating agent, it is also possible to form an insoluble complex with the salivary alpha-amylase which can be separated from the solution so that only the pancreatic enzyme remains in the solution and can be determined there. Alternatively, it is possible to use the monoclonal antibody in immobilized form and thus separate the salivary amylase. In both cases, however, it is necessary to form an insoluble phase and to separate it from the soluble phase.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel-alpha-Amylase, mit dem die Nachteile bekannter Verfahren vermieden werden.The aim of the invention is to provide an improved method for the determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase, which avoids the disadvantages of known methods.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Reagenz zu schaffen, welches eine rasche, einfache und zuverlässige Bestimmung der Pankreas-alpha-Amylase neben der alpha:Amylase vom Speicheltyp in Körperflüssigkeiten ermöglicht, ohne hierbei eine Phasentrennung vornehmen zu müssen.The invention has for its object to provide a method and a reagent which allows a rapid, simple and reliable determination of pancreatic alpha-amylase in addition to the saliva type alpha : amylase in body fluids, without having to make a phase separation.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgeäß durch ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel-alpha-Amylase in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum, Plasma, Duodenalsaft oder Urin, durch Umsetzung mit einem System zum Nachweis von alpha-Amylase in Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen monoklonalen Antikörper verwendet, welcher das Speichelenzym spezifisch hemmt, das Pankreasenzym aber nicht mehr als 50% inhibiert.This object is achieved erfindungsgeäß by a method for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase in body fluids, especially in serum, plasma, duodenal or urine, by reaction with a system for the detection of alpha-amylase in the presence of monoclonal antibody characterized by using a monoclonal antibody which specifically inhibits the salivary enzyme but inhibits the pancreatic enzyme by not more than 50%.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der sehr überraschenden Auffindung eines monoklonalen Antikörpers, welcher das Speichelenzym hemmt, nicht jedoch das Pankreasenzym. Dies war nicht zu erwarten, da es bekannt war, daß dasSpeichel- und das Pankreasenzym immunologisch identisch sind (Gerhard Pfleiderer, Lab. Med. 7,189-193; K. Lorentz loc. cit). So gibt Morton K.Schwarz in „Immunoassay of Enzymes — an Overview" (1983), Seite 4 bis 9, z.B. an, daß Antikörper gegen humane Speichel-alpha-Amylase das Enzym vom Speicheltyp zu 78%, das Pankreasenzym zu 75% hemmen. Es war daher nicht vorhersehbar, daß es möglich sein würde, einen monoklonalen Antikörper zu entwickeln, welcher eine praktisch quantitative Unterscheidung der beiden Enzyme durch selektive hochspezifische Hemmung ermöglichen würde. Dabei wird eine Hemmung von 95% und mehr für das Speichelenzym bei den bevorzugten Antikörpern erzielt.The method of the invention is based on the very surprising discovery of a monoclonal antibody which inhibits the salivary enzyme but not the pancreatic enzyme. This was not to be expected since it was known that the salivary and pancreatic enzymes are immunologically identical (Gerhard Pfleiderer, Lab Med., 7, 189-193, K. Lorentz loc. Cit). For example, Morton K. Schwarz states in "Immunoassay of Enzymes - an Overview" (1983), pages 4 to 9, that human salivary alpha-amylase antibodies inhibit the salivary-type enzyme by 78% and the pancreatic enzyme by 75% It was therefore not foreseen that it would be possible to develop a monoclonal antibody that would allow for a practically quantitative discrimination of the two enzymes by selective, highly specific inhibition, with an inhibition of 95% and more for the salivary enzyme in the preferred antibodies achieved.
Der neue, für das Verfahren der Erfindung verwendete, monoklonale Antikörper wurde bei NCACCunter den Nummern (99D12) 84122003 und (89E2) 84122004 hinterlegt (National Collection of Animal Cell Culture, P.orton Down, GB).The novel monoclonal antibody used in the method of the invention has been deposited with NCACC under numbers (99D12) 84122003 and (89E2) 84122004 (National Collection of Animal Cell Culture, P.orton Down, UK).
Er läßt sich erfindungsgemäß erhalten durch Immunisierung von Versuchstieren mit nativer oder modifizierter Speichel-alpha-Amylase, Fusion von B-Lymphocyten der so erhaltenen immunisierten Tiere mit transformierenden Agenzien, Klonierung und Kultivierung der so gebildeten Hybridzellen, welche den monoklonalen Antikörper produzieren und Isolierung des letzteren. Besonders geeignete Tiere für die Herstellung der Speichel-alpha-Amylase-Antikörper sind Ratten und Mäuse. Die Immunisierung erfolgt entweder mit nativer humaner Speichel-alpha-Amylase oder mit modifizerter Speichel-Amylase. Verwendet man natives Enzym, so eignen sich hierzu die handelsübliche!"!, elektrophoretisch homogenen Präparate. Chemisch modifizierte Speichel-alpha-Amylase läßt sich ebenfalls nach bekannten Methoden der Enzymmodifikation erhalten, wie sie z. B. in der DE-AS 2543994 näher beschrieben sind. Geeignete Modifizierungsmittel sind beispielsweise N-Bromsuccinimid (NBS) unter Oxidation von Tryptophangruppen am Protein (BBA 143 [1967] 462-472), Carboxymethylierung mit Jodacetat (IAA), die hauptsächlich am Histidin angreift bzw. Nitrierung mitTetranitromethan (TNM) (J. Biol. Chem. 238 [1963] 3307) sowie Diazotierung mit diazotierter SuIfanilsäure (Meth. Enzymol. 25 [1972] 515-531). Am besten geeignet erwies sich dabei das mit RNM modifizierte Enzym bei Verwendung von Balb/c-Mäusen oder das native Enzym bei Verwendung von AJ-Mäusen. Die Immunisierung erfolgt durch übliche Verabreichung des nativen oder modifizierten Enzyms, vorzugsweise in Kombination mit Adjuvanz. Bevorzugt wird als Adjuvanz Aluminiumhydroxid zusammen mit Bordatella pertussis. Wird für die Immunisierung native Speichel-alpha-Amylase in AJ-Mäusen oderTNM-modifizierte Speichel-alpha-Amylase in Balb/c-Mäusen verwendet, so erfolgt die Immunisierung vorzugsweise über mindestens 9 Monate mit mindestens 7 Immunisierungen (Injektionen I. P.).It can be obtained according to the invention by immunization of experimental animals with native or modified salivary alpha-amylase, fusion of B-lymphocytes of the thus obtained immunized animals with transforming agents, cloning and culturing of the hybrid cells thus produced producing the monoclonal antibody and isolation of the latter , Particularly suitable animals for the production of salivary alpha-amylase antibodies are rats and mice. Immunization is either with native human salivary alpha-amylase or with modified salivary amylase. If native enzyme is used, the commercially available preparations are suitable for this purpose. Chemically modified salivary alpha-amylase can likewise be obtained by known methods of enzyme modification, as described in more detail, for example, in DE-AS 2543994 Suitable modifying agents are, for example, N-bromosuccinimide (NBS) with oxidation of tryptophan groups on the protein (BBA 143 [1967] 462-472), carboxymethylation with iodoacetate (IAA), which acts mainly on histidine, or nitration with tetranitromethane (TNM) (J. Biol Chem 238 [1963] 3307) and diazotization with diazotized sulfanilic acid (Meth Enzymol 25 [1972] 515-531) The enzyme modified with RNM proved to be most suitable when using Balb / c mice or the native enzyme using AJ mice The immunization is carried out by conventional administration of the native or modified enzyme, preferably in combination with adjuvant Adjuvant aluminum hydroxide together with Bordatella pertussis. When native salivary alpha-amylase in AJ mice or TNM-modified salivary alpha-amylase is used in Balb / c mice for immunization, immunization is preferably carried out for at least 9 months with at least 7 immunizations (injections I.P.).
-3- 242 69'-3- 242 69 '
Nach erfolgter Immunisierung werden die B-Lymphocyten der immunisierten Tiere nach üblichen Methoden mit transformierenden Agenzien fusioniert. Beispiele für transformierende Agenzien, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden können, sind Myelomazellen, transformierende Viren wie z. B. Epstein-Barr-Virus oder die in der deutschen Offenlegungsschrift3245655 beschriebenen Agenzien. Die Fusionierung erfolgt nach dem bekannten Verfahren von Koehler und Milstein (Nature 256 [1975] 495-997). Die hierbei gebildeten Hybridzellen werden in üblicher Weise kloniert, z. B. unter Verwendung eines handelsüblichen Zellsorters, und die erhaltenen Klone, welche den gewünschten monoklonalen Antikörper bilden, gezüchtet. Aufgrund des krebsartigen Wachsens der Hybridzellen lassen sich diese auf unbestimmte Zeit weiterkultivieren und produzieren den gewünschten monoklonalen Antikörper in beliebiger Menge. Mit den so erhaltenen monoklonalen Antikörpern kann die Speichel-alpha-Amylase aus Körperflüssigkeiten quantitativ gehemmt werden, so daß die verbleibende Amylaseaktivität der Pankreas-alpha-Amylase zuzuordnen ist.After immunization, the B lymphocytes of the immunized animals are fused by conventional methods with transforming agents. Examples of transforming agents that can be used in the invention are myeloma cells, transforming viruses such. Epstein-Barr virus or the agents described in German Offenlegungsschrift 3245655. The fusion takes place according to the known method of Koehler and Milstein (Nature 256 [1975] 495-997). The hybrid cells formed in this way are cloned in a conventional manner, for. Using a commercial cell sorter, and the resulting clones producing the desired monoclonal antibody are cultured. Due to the cancerous growth of the hybrid cells, they can be cultivated indefinitely and produce the desired monoclonal antibody in any amount. With the monoclonal antibodies thus obtained, the salivary alpha-amylase can be quantitatively inhibited from body fluids, so that the remaining amylase activity is attributed to the pancreatic alpha-amylase.
Für das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren können die monoklonalen Antikörper als solche oder ihre entsprechende immunologische Eigenschaften aufweisenden Fragmente (Fc-Fragmente) verwendet werden. Unter dem Begriff „monoklonaler Antikörper" werden hier daher auch die Fragmente verstanden. Sowohl der komplette Antikörper, als auch seine Fragmente, können in immobilisierter Form verwendet werden.For the determination method according to the invention, the monoclonal antibodies can be used as such or their corresponding immunological properties having fragments (F c fragments). The term "monoclonal antibody" is therefore also understood to mean the fragments, and both the complete antibody and its fragments can be used in immobilized form.
Der erfindungsgemäß verwendete monoklonale Antikörper weist überraschenderweise gegenüber der Pankreas-alpha-Amylasi eine Hemmung von 5% oder weniger auf, erreicht in vielen Fällen eine Hemmung von nur noch 1 % und in einigen Fällen sogar eine unterhalb der Meßgrenze liegende Hemmung. Er eignet sich daher anstelle des bisher bekannten, aus Weizenkeimen gewonnenen Hemmstoffes oder des bindenden monoklonalen Antikörpers der oben erwähnten älteren Anmeldung zur spezifischen Bestimmung der Pankreas-alpha-Amylase in Körperflüssigkeiten.The monoclonal antibody used according to the invention surprisingly has an inhibition of 5% or less compared to the pancreatic alpha-amylase, in many cases achieves an inhibition of only 1% and in some cases even an inhibition below the measurement limit. It is therefore suitable for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in body fluids instead of the heretofore known inhibitor obtained from wheat germ or the binding monoclonal antibody of the above-mentioned prior application.
Die Bestimmung der alpha-Amylase als solche erfolgt nach den hierfür bekannten Methoden. Da der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper selektiv die alpha-Amylase vom Speicheltyp hemmt und sie so der Enzymaktivitätsbestimmung entzieht, entsprechen die bei der alpha-Amylase-Bestimmung in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers erhaltenen Werte der dem Pankreasenzym alleine zukommenden Aktivität.The determination of the alpha-amylase as such is carried out by the methods known for this purpose. Since the monoclonal antibody of the present invention selectively inhibits the salivary-type alpha-amylase and thus abstracts it from the enzyme activity determination, the values obtained in the presence of the monoclonal antibody at the alpha-amylase determination correspond to the pancreatic enzyme-only activity.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einem System zum Nachweis von alpha-Amylase durchgeführt, welches eine Maltopolyose mit 4 bis 7 Glucoseresten im Molekül, Maltosephosphorylase, ß-Phosphoglucomutase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase und NAD enthält.The process according to the invention is preferably carried out with a system for the detection of alpha-amylase which contains a maltopolyose having 4 to 7 glucose residues in the molecule, maltose phosphorylase, β-phosphoglucomutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and NAD.
Ein weiteres, im Rahmen der Erfindung bevorzugt verwendetes System zum Nachweis der alpha-Amylase besteht aus Nitrophenylmaltopolyose mit 4 bis 7 Glucoseresten im Molekül und alpha-Glucosidase.Another system preferably used in the invention for the detection of alpha-amylase consists of Nitrophenylmaltopolyose with 4 to 7 glucose residues in the molecule and alpha-glucosidase.
Ein weiteres bevorzugtes Nachweissystem für alpha-Amylase besteht aus mit bestimmbaren Gruppen modifizierter Stärke. De Begriff modifizierte Stärke umfaßt beispielsweise Stärke, die mit bestimmbaren Gruppen modifiziert ist, z. B. das als „Phadebas" handelsübliche Produkt der Firma Pharmazia, Schweden sowie das in der DE-OS 2812154 beschriebene Produkt sowie im Abbauverhalten veränderte Stärke, beispielsweise Carboxymethylstärke und Grenzdextrine. Alle diese Systeme sind bekannt und bedürfen daher hier keiner näheren Beschreibung.Another preferred detection system for alpha-amylase consists of identifiable groups of modified starch. The term modified starch includes, for example, starch modified with detectable groups, e.g. For example, the product commercially available as "Phadebas" from Pharmazia, Sweden, and the product described in DE-OS 2812154 and starch modified in the degradation behavior, for example carboxymethyl starch and limit dextrins All these systems are known and therefore need not be described in any more detail here.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probeflüssigkeit mit dem erfindungsgemäßen Antikörper zweckmäßig inkubiert und danach direkt im üblichen Amylasetest eingesetzt. Die Dauer der Inkubationszeit ist von der Aktivitäi des eingesetzten Antikörpers abhängig und beträgt vorzugsweise 15 bis 30 Minuten.For carrying out the method according to the invention, the sample liquid is expediently incubated with the antibody according to the invention and then used directly in the usual amylase assay. The duration of the incubation period depends on the activity of the antibody used and is preferably 15 to 30 minutes.
Sofern eine Abtrennung der Speichel-alpha-Amylase wünschenswert erscheint, kann der monoklonale Antikörper, sowohl in kompletter Form als auch in Form der Fragmente, auch auf einem festen Träger fixiert vorliegen, beispielsweise auf immunosorptivem Papier oder der Oberfläche von Kunststoffröhrchen bzw. -schläuchen. Auf diese Weise wird die alpha-Amylase vom Speicheltyp an den Träger, also die feste Phase, gebunden.If separation of the salivary alpha-amylase appears desirable, the monoclonal antibody, both in complete form and in the form of the fragments, may also be fixed on a solid carrier, for example on immunosorptive paper or on the surface of plastic tubing. In this way, the salivary type alpha-amylase is bound to the carrier, that is, the solid phase.
Es ist auch möglich, ein monoklonales Antikörperpräparat zu verwenden, welches aus den hemmenden monoklonalen Antikörpern der Erfindung, die durch mehrere verschiedene Klone produziert werden, gemischt ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-alpha-Amylase neben Speichel:alpha-Amylase in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum, Duodenaisaft, Plasma oder Urin, enthaltend ein System zum Nachweis von alpha-Amylase und einen monoklonalen Antikörper gegen Speichel-alpha-Amylase, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen monoklonalen Antikörper enthält, welcher das Speichelenzym spezifisch hemmt, das Pankreasenzym aber nicht mehr als 50% inhibiert (Kreuzreaktivität < 50%.It is also possible to use a monoclonal antibody preparation mixed from the inhibiting monoclonal antibodies of the invention produced by several different clones. Another object of the invention is a reagent for the specific determination of pancreatic alpha-amylase in addition to saliva : alpha-amylase in body fluids, especially in serum, Duodenaisaft, plasma or urine containing a system for the detection of alpha-amylase and a monoclonal antibody Salivary alpha-amylase, which is characterized in that it contains a monoclonal antibody which specifically inhibits the salivary enzyme, but inhibits the pancreatic enzyme not more than 50% (cross-reactivity <50%.
Hinsichtlich des im erfindungsgemäßen Reagenz enthaltenen Systems zum Nachweis von alpha-Amylase und der übrigen Bedingungen gelten die obigen Ausführungen bezüglich des Verfahrens entsprechend.With regard to the system for detecting alpha-amylase and the other conditions contained in the reagent according to the invention, the statements above with regard to the method apply accordingly.
Die Erfindung ermöglicht eine einfache und rasche Bestimmung der Pankreas-alpha-Amylase neben alpha-Amylase vom Speicheltyp in Körperflüssigkeiten mit hoher Spezifität und verbessert damit die Möglichkeiten der klinischen Diagnostik.The invention enables a simple and rapid determination of pancreatic alpha-amylase in addition to salivary alpha-amylase in body fluids with high specificity and thus improves the possibilities of clinical diagnostics.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.
A) AJ-Mäuse werden mit 100pg humaner Speichelamylase in Aluminiumhydroxid mit BORDETELLA PERTUSSIS immunisiert In ca. achtwöchigem-Rhythmus wird mit je 50 pg humaner Speichelamylase im gleichen Adjuvant drei- bis viermal weiterimmunisiert. VierTage vor Fusion wird die letzte Immunisierung mit 50\ig Speichelamylase in physiologischer Kochsalzlösung intravenös durchgeführt.A) AJ mice are immunized with 100 μg of human salivary amylase in aluminum hydroxide with BORDETELLA PERTUSSIS In approximately eight-week intervals, 50 μg of human salivary amylase are further immunized three to four times in the same adjuvant. Four days prior to fusion, the final immunization with 50 % salivary amylase in physiological saline is performed intravenously.
B) Balb/c-Mäuse werden mit 100pg humaner TNM-modifizierter Speichelamylase in Aluminiumhydroxid mit BORDETELLA PERTUSSIS immunisiert. In ca. achtwöchigem Rhythmus wjrd mit je 50μg humaner TNM-Speichelamyläse im gleichen Adjuvant drei-bis viermal weiterimmunisiert. VierTage vor Fusion wird die letzte Immunisierung mitöOpg Speichelamylase in physiologischer Kochsalzlösung intravenös durchgeführt.B) Balb / c mice are immunized with 100 μg of human TNM-modified salivary amylase in aluminum hydroxide with BORDETELLA PERTUSSIS. In approximately eight-week intervals with 50μg each of human TNM salivary amylase in the same adjuvant, three to four further immunizations are carried out. Four days before fusion, the final immunization with oOpg salivary amylase in physiological saline is performed intravenously.
C) Die Fusion der Milzzellen mit Ag8.653 (ATCC CRL 1 580) oder SP2/0 (ATCC CRL 1 581) Myelomzellen wird nach dem Standardverfahren gemäß J. of Imm. Meth. Vol.39, 285-308 durchgeführt. Das Fusionsverhältnis Milz zu Myelomzellen ist 5:1. Die Fusionsprodukte werden auf 20 24er-Kulturschalen (von Costar) angesät und mit 5 x 104 peritoneal-exsudat-Zellen pro Kulturnapf gefüttert. Positive Primärkulturen (siehe Beispiel 3) werden 3 bis 4 Wochen nach Fusion mit Hilfe eines Fluoreszens-aktivierten Zellsorters kloniert. Die Zellen werden einzeln in 96er Costar-Platten abgelegt und mit 2 χ 104 peritoneal-exsudat-Zellen gefüttert.C) The fusion of the spleen cells with Ag8.653 (ATCC CRL 1 580) or SP2 / 0 (ATCC CRL 1 581) myeloma cells is carried out according to the standard method according to J. of Imm Meth Meth.39, 285-308. The fusion ratio spleen to myeloma cells is 5: 1. The fusion products are seeded on 20 24 culture dishes (from Costar) and fed with 5 × 10 4 peritoneal exudate cells per culture well. Positive primary cultures (see Example 3) are cloned 3 to 4 weeks after fusion with the aid of a fluorescence-activated cell sorter. The cells are individually deposited in 96-well Costar plates and fed with 2 × 10 4 peritoneal exudate cells.
Als Kulturmedium wird verwendet handelsübliches RPMI-1 640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (beschrieben in J. A. M. A. 199(1957)519.The culture medium used is commercially available RPMI-1 640 medium containing 10% fetal calf serum (described in J.A.M.A. 199 (1957) 519.
Modifizierung der alpha-Amylase mitTetranitromethan (TNM)Modification of alpha-Amylase with Tetranitromethane (TNM)
5,2mg Human-Speichelamylase (Sigma) wurden in 1,6ml Tris-Puffer (5OmM Tris-HCI, 1 mM CaCI2, pH = 8,0) gelöst.5.2 mg of human salivary amylase (Sigma) were dissolved in 1.6 ml of Tris buffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl 2 , pH = 8.0).
Unter Rühren wurde dazugegeben 10μΙ einer 10% (V/V) Lösung von Tetranitromethan (Roth) in abs. Ethanol. Das Gemisch wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Dann wurde das Protein durch Dialyse über Nacht gegen denWith stirring was added 10μΙ a 10% (v / v) solution of tetranitromethane (Roth) in abs. Ethanol. The mixture was left at room temperature for 12 hours. Then the protein was dialyzed overnight against the
obengenannten Puffer vom überschüssigen Tetranitromethan befreit. : freed the above buffer from the excess tetranitromethane. :
Eine Extinktionsmessung bei 381 nm ergab 2,6 Nitrogruppen je Molekül alpha-Amylase.An absorbance reading at 381 nm gave 2.6 nitro groups per molecule of alpha-amylase.
Um die Konzentration und Spezifität amylasehemmender Antikörper im Serum immunisierter Mäuse oder im Kulturüberstand der Hybridzellen oder in Ascites zu erfassen, wird ein Amylase-Inhibitions-Test als screening-assay verwendet.In order to detect the concentration and specificity of amylase-inhibiting antibodies in the serum of immunized mice or in the culture supernatant of the hybrid cells or in ascites, an amylase inhibition assay is used as a screening assay.
Dazu werden in 96er Elisa-Platten (Firma Nunc) 50μΙ Pankreas- oder Speichel-Amylase (etwa 400 mU/ml) in Puffer (5OmM Tris, 1 % Rinderserumalbumin, 0,1 M NaCI, pH 7,5) vorgelegt und mit 50 μΙ der zu testenden Lösung (z. B. Kulturüberstand) 20 Minuten vorinkubiert (Raumtemperatur).For this purpose, 50 μl pancreatic or salivary amylase (about 400 mU / ml) in buffer (50 mM Tris, 1% bovine serum albumin, 0.1 M NaCl, pH 7.5) are initially introduced into 96-well Elisa plates (Nunc) and incubated with 50 μl μΙ of the solution to be tested (eg culture supernatant) is pre-incubated for 20 minutes (room temperature).
Danach wird ιηίΐδΟμΙ Amylasesubstrat (4-Nitrophenylmaltoheptaosid) die Enzymreaktion gestartet. Nach ca. 20 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur werden die Extinktionen bei 405 nm in einem Photometer (Elisa-Reader, Kontron, Schweiz) bestimmt.Thereafter, the enzyme reaction is started ιηίΐδΟμΙ amylase substrate (4-Nitrophenylmaltoheptaosid). After about 20 to 60 minutes at room temperature, the extinctions at 405 nm are determined in a photometer (Elisa Reader, Kontron, Switzerland).
Folgende Kontrollen werden mitbestimmt:The following controls are determined:
1. Frisches Kulturmedium (vgl. Beispiel 1 C)1. Fresh culture medium (see Example 1 C)
2. Kulturüberstand des Klons der EU-84 114172.42. Culture supernatant of clone of EU-84 114172.4
4. Weizenkeim-Inhibitor (EP 0079793), Konzentrationen 2 \ig/m\ und 0,2 μg/ml.4. wheat germ inhibitor (EP 0079793), concentrations of 2 \ ig / m \ and 0.2 ug / ml.
In dem oben beschriebenen Testsystem werden folgende Ergebnisse erhalten:In the test system described above, the following results are obtained:
Hemmung %Inhibition%
Klon 79 Weizenkeim-Clone 79 wheat germ
Inhibitor ' Inhibitor
2mg/ml O^g/ml 99D12 99C11 88E8 89E2 ·2mg / ml O ^ g / ml 99D12 99C11 88E8 89E2 ·
Speichel-Amylase 0 75 40 58 "65 67 65 Pankreas-Salivary amylase 0 75 40 58 "65 67 65 pancreatic
Amylase 0 17 6,2 1,8 4,6 0,5 0Amylase 0 17 6.2 1.8 4 4.6 0.5 0
Aus ca. 4% aller Primärkulturen werden spezifisch Speichelamylase hemmende Aktivitäten gefunden, deren Kreuzreaktivität kleiner als 10% war.From about 4% of all primary cultures specifically salivary amylase inhibitory activities are found whose cross-reactivity was less than 10%.
Produktion von Ascites und Bestimmung dessen AktivitätProduction of ascites and determination of its activity
1-2 χ 106 Hybridzellen (hergestellt nach Beispiel 1) wurden intraperitoneal in 1 bis 2ml mit je 0,5ml Pristan (Sigma, Nr.T7640) vorbehandelte Mäuse gespritzt. Nach ca. 15 bis 20 Tagen werden pro Maus 3 bis 5ml Ascites gezapft, der etwa 10mg IgG/ml enthält. In einer Konzentration von 200μg/ml inhibiert der monoklonale Antikörper 89 E 2, die humane Speichelalpha-Amylase (800 mU/mI) zu über 95%, die humane Pankreas-alpha-Amylase zu weniger als 2% (Verfahren analog Beispiel 3).1-2 × 10 6 hybrid cells (prepared according to Example 1) were injected intraperitoneally in 1 to 2 ml mice each pretreated with 0.5 ml pristane (Sigma, No. T7640). After about 15 to 20 days, 3 to 5 ml of ascites per mouse, containing about 10 mg IgG / ml, are drawn. At a concentration of 200 μg / ml, monoclonal antibody 89 E 2, human salivary alpha-amylase (800 mU / ml) inhibits more than 95%, human pancreatic alpha-amylase less than 2% (method analogous to example 3).
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