DD246566A1

DD246566A1 - SELECTION PROCEDURE FOR PHYTOEFFECTORS WITH EFFECT ON CHLOROPHYLENE SYNTHESIS

Info

Publication number: DD246566A1
Application number: DD28660986A
Authority: DD
Inventors: Horst Arndt; Erhard Tschirner; Hans-Guenther Hiekel; Heinz Boehm; Sigrid Arnold
Original assignee: Paedagogische Hochschule Wolfg
Priority date: 1986-01-30
Filing date: 1986-01-30
Publication date: 1987-06-10

Abstract

Die Erfindung "Selektionsverfahren fuer Phytoeffektoren mit Wirkung auf die Chlorophyllsynthese" dient in erster Linie der Suche nach Pflanzenschutzmitteln. Zusaetzlich bestehen Moeglichkeiten des Einsatzes des Verfahrens zur Umweltueberwachung. Sie verfolgt das Ziel, ein Verfahren vorzuschlagen, das durch photometrische Messung der Extinktionen zweier definierter Wellenlaengen vermittels speziell hergerichteter Photometer und opalisierten Kuevetten, auf der Basis von diffus gestreutem Licht mit Wellenlaengen des Absorptionsmaximums des jeweiligen Pigmentes bei nur geringer Ueberlagerung des Absorptionsspektrums durch andere Pigmente und des absorptionsfreien Bereiches zur Korrektur der Reststreuung, an intakten Algensuspensionen, die dem Einfluss abgestufter Konzentrationen verschiedener Noxen oder anderer Umweltfaktoren ausgesetzt werden, unter Ausschaltung des zellzahl- und volumenproportionalen Streuungseinflusses, weitgehend pigmentkonzentrationsproportionale Messwerte zulaesst, wodurch diese im Vergleich mit denen unbehandelter Proben exakt quantifizierbare Aussagen zur Beeinflussung der wachstums- und entwicklungsabhaengigen Neusynthese des Chlorophyll a von Pflanzen zulassen. Das Verfahren ermoeglicht auch eine Testung von Verbindungen, die eine Truebung des Kulturmediums der Algen hervorrufen.The invention "selection process for Phytoeffektoren with effect on the chlorophyll synthesis" serves primarily to search for pesticides. In addition, there are possibilities of using the environmental monitoring procedure. It aims to propose a method by photometric measurement of the extinctions of two defined wavelengths by means of specially prepared photometers and opalescent cuvettes, based on diffused light with wavelengths of the absorption maximum of the respective pigment with only slight superposition of the absorption spectrum by other pigments and the absorption-free region for correcting the residual scattering, on intact algae suspensions, which are exposed to the influence of graded concentrations of different Noxen or other environmental factors, eliminating the Zellzahl- and volume proportional scattering influence, largely pigment concentration proportional allowable values, which in comparison with those of untreated samples exactly quantifiable statements to influence the growth and development-dependent re-synthesis of the chlorophyll a of plants. The method also enables testing of compounds which cause turbidity of the culture medium of the algae.

Description

Hierzu 3 Seiten ZeichnungenFor this 3 pages drawings

Field of application of the invention

Pflanzenschutzmittelforschung, Umweltschutz, MikroalgenPlant protection research, environmental protection, microalgae

Characteristic of the known technical solutions

Detaillierte in vitro-Untersuchungen des Pigmentgehaltes von Pflanzen sind zeit-, material- und personalaufwendig. Sie erfordern neben der Zerkleinerung der Pflanzen den Aufschluß der Zellen sowie die Extraktion, die Trennung und Quantifizierung der verschiedenen Pigmentanteile. Zur gravimetrischen Bestimmung braucht man zusätzlich nicht nur sehr viel Phytomasse, sondern unterliegt auch der Gefahr eines oxydativen Abbaus oder Zerfalls der Farbstoffe. Daher wird in den meisten Fällen der Pigmentgehalt nach Aufschluß- und Extraktionsverfahren ohne Auftrennung photometrisch bestimmt und nach Ausgleichsformeln verschiedener Autoren (MCKINNEY, 1941; ARNON, 1949; BÖGER, 1964) berechnet. Bei diesem Vorgehen muß mit Fehlern um 15% gerechnet werden (KUNERT und BÖGER, 1979).Detailed in vitro investigations of the pigment content of plants are time, material and personnel consuming. In addition to the comminution of the plants, they require the digestion of the cells and the extraction, separation and quantification of the various pigment components. In addition, not only a great deal of phytomass is needed for gravimetric determination, but it is also subject to the risk of oxidative degradation or decomposition of the dyes. Therefore, in most cases the pigment content after digestion and extraction without separation is determined photometrically and calculated according to balancing formulas of different authors (MCKINNEY, 1941, ARNON, 1949, BÖGER, 1964). Errors of 15% must be expected in this procedure (KUNERT and BÖGER, 1979).

Photometrische in vivo-Pigmentbestimmungsverfahren an Algen sind durch die von den Zellen verursachte Scheinextinktion mit einem großen Fehler behaftet. DOUCHA und KUBIN (1976) eliminieren die Meßwertverfälschung durch Streuung dadurch, daß jede Probe intakter Zellen von Algen gegen ihre eigene Ffeferenzprobe mit ausgebleichten Zellen vermessen wird. Dieses · Vorgehen erfordert einen erhöhten Zeit-und Materialaufwand und setzt voraus, daß beim Ausbleichen der Zellen die chlorophyllfreien intrazellulären Strukturen nicht angegriffen werden.Algal in vivo photometric pigmentation methods are subject to a large error by the illusion of appearance caused by the cells. DOUCHA and KUBIN (1976) eliminate scattering variability by measuring each sample of intact cells of algae against their own bleached ffference sample. This procedure requires an increased expenditure of time and material and requires that the bleaching of the cells, the chlorophyll-free intracellular structures are not attacked.

Nach den Patenten „Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen ",DD-WP 94 234 „Verfahren zur differenzierten Selektion von Effektoren mittels autotropher Zellsuspensionen", DD-WP 200472 und „Verfahren zur Selektion von Effektoren mittels Wachstumsanalyse von Zellsuspensionen", DD-WP 214146 können diejenigen Chemikalien aus einer Stichprobe selektiert werden, die den außerordentlich komplexen Lebensprozeß des Zellwachstums oder die ihm zu Grunde liegenden Metabolismen beeinträchtigen. Derartige Verfahren erheben keinen Anspruch auf eine Zuordnung der Wirkung der eingesetzten Chemikalien zu einem Teilprozeß des komplexen Lebensprozesses des Zellwachstums. Aussagen zum Einfluß auf die Chlorophyllsynthese sind nicht verifizierbar.According to the patents "Methods for the selection of biochemically active substances", DD-WP 94 234 "Method for the differentiated selection of effectors by means of autotrophic cell suspensions", DD-WP 200472 and "Method for the selection of effectors by growth analysis of cell suspensions", DD-WP 214146 For example, it is possible to select those chemicals from a random sample that interfere with the extremely complex life cycle of cell growth or its underlying metabolisms, and such methods do not claim to attribute the effect of the chemicals used to a subprocess of the complex life cycle of cell growth on the chlorophyll synthesis are not verifiable.

Das von SHIBATA und Mitarbeitern (1954) im Rahmen von Grundlagenuntersuchungen zur Pigmentbestimmung an Algen vorgeschlagene Verfahren, die durch die Algenzellen verursachte Scheinextinktion in ihrem Einfluß auf die Messung der Lichtabsorption durch Pigmente dadurch zu minimieren, daß mit durch geeignete Opalglasfilter maximal gestreutem, d.h. diffusem Licht bei einer das jeweilige Pigment charakterisierenden Wellenlänge photometriert wird, bildet die Grundlage für das nachfolgend vorgeschlagene Selektionsverfahren für Phytoeffektoren mit Wirkung auf die Chlorophyilsynthese.The method proposed by SHIBATA and coworkers (1954) in the context of basic studies on algae pigmentation to minimize the appearance of bogus extinction caused by the algae cells in their influence on the measurement of light absorption by pigments, characterized in that with maximum scattered by suitable opal glass filters, i. photometric of diffuse light at a wavelength characterizing the respective pigment forms the basis for the subsequently proposed selection process for phyto-effectors with effect on the synthesis of chlorophylls.

Object of the invention

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein einfaches, schnelles und hinreichend sicheres Verfahren für den photometrischen in vivo-Test vermittels diffusem Licht zur Selektion von Phytoeffektoren bzw. anderweitiger Umwelteinflüsse mit Wirkung auf die Chlorophyllsynthese von höheren Pflanzen auf der Basis einzelliger Mikroalgenkulturen vorzuschlagen, das nicht nur große Versuchsserien zuläßt, arbeits-, material-, zeit- und personalökonomisch sowie automatisierbar ist und sowohl bei Kultivierungsverfahren mit periodischer oder kontinuierlicher Verdünnung Verwendung finden kann, sondern auch erlaubt, Aussagen zur Substanzwirkung in den Fällen vorzunehmen, die bisher infolge von Trübung der Meßprobe einer Analyse meßtechnisch nicht zugänglich waren.The invention aims to propose a simple, fast and sufficiently safe method for the in vivo photometric test by means of diffuse light for the selection of phyto-effectors or other environmental influences with effect on the chlorophyll synthesis of higher plants on the basis of unicellular microalgae cultures that not only large experimental series permits labor, material, time and personal economics and can be automated and can be used both in cultivation methods with periodic or continuous dilution, but also allows to make statements on the substance effect in the cases previously due to turbidity of the sample of a Analysis were not accessible by measurement.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,durch photometrische Messung der Extinktion zweier definierter Wellenlängen vermittels speziell hergerichteter Photometer und Küvetten, auf der Basis yon diffus gestreutem Licht mit Wellenlängen des Absorptionsmaximums des jeweiligen Pigmentes bei nur geringer Überlagerung des Absorptionsspektrums durch andere Pigmente und des absorptionsfreien Bereiches zur Korrektur der Reststreuung, an intakten Algensuspensionen, die dem Einfluß abgestufter Konzentrationen verschiedener Noxen oder anderer Umweltfaktoren ausgesetzt werden, unter Ausschaltung des zeilzahl- und volumenproportionalen Streuungseinflusses, weitgehend pigmentkonzentrationsproportionale Meßwerte zu erhalten, die im Vergleich mit denen unbehandelter Proben exakt quantifizierbare Aussagen zur Beeinflussung derwachstums- und entwicklungsabhängigen Neusynthese des Chlorophyll a von Pflanzen zulassen.The invention is based on the object by photometric measurement of the extinction of two defined wavelengths by means of specially prepared photometers and cuvettes, based on scattered diffused light with wavelengths of the absorption maximum of the respective pigment with only slight superposition of the absorption spectrum by other pigments and the absorption-free area Correcting the residual scattering on intact algal suspensions subjected to the influence of graded concentrations of various pollutants or other environmental factors, eliminating the zeolite and volume proportional scattering influence, to obtain largely pigment concentration proportional measured values which, compared to those of untreated specimens, give exactly quantifiable statements for influencing the growth rate. and allow developmental re-synthesis of chlorophyll a from plants.

Daneben sollen Aussagen zur biologischen Aktivität solcher Verbindungen, die infolge schlechter Löslichkeit und Trübung des Kulturmediums einer in vivo-Testung an Algen bisher unzugänglich waren, auf der Basis der Pigmentsynthese nach Eliminierung der durch die Zellen selbst und die Wirkstoffe verursachten Streuungen des Meßlichtes, vermittels des Verfahrens möglich werden.In addition, statements on the biological activity of such compounds, which were previously inaccessible due to poor solubility and turbidity of the culture medium in vivo testing on algae, on the basis of the pigment synthesis after elimination of the cells themselves and the active substances caused scattering of the measuring light, by means of Procedure become possible.

embodiments

1. Ausführungsbeispiel1st embodiment

Man suspendiert eine Synchronkultur von Chlorella vulgaris in ein mineralisches Nährmedium und zieht die Zellen in einer geeigneten Anzuchtapparatur autotroph bei einer Temperatur von 37 ⁰C unter Zufuhr von 51 Luft pro Stunde, die 2Vol.-% CO2 enthält, an. Es werden vor Belichtungsbeginn die Kontrollsuspensionen mit einem minimalen Volumen Wasser sowie die weiteren Chargen der Algensuspensionen mit den gleichen Volumena, die abgestuften Konzentrationen des gelösten Phytoeffektors Dodine enthalten, beimpft. Die Chlorophyllsynthese der Algen soll bei einer Lichtintensität von 2 χ 90 Watt/m² PhAR über den Zeitraum von 6,5 Stunden untersucht werden. Dazu erfolgen innerhalb dieses Zeitintervalls distiηkte Messungen der optischen Dichte der einzelnen Chargen bei 680nm und750nm mit opalisierten Küvetten (0,5cm Schichtdicke) am Photometer (Spekol 10). Für jedes gemessene Wertepaar wird nun die chlorophyll a-konzentrationsproportionale Extinktionsdifferenz ΔΕ(ΔΕ = E₆₈₀-E₇₅₀) errechnet. Sie wird in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit t für die einzelnen Chargen zeichnerisch aufgetragen (Fig. 1).Suspending a synchronous culture of Chlorella vulgaris in a mineral nutrient medium and the cells draws in a suitable culture apparatus autotrophic at a temperature of 37 ⁰ C under supply of air 51 per hour containing 2 vol .-% CO2, at. Prior to exposure, control microcells are inoculated with a minimum volume of water and the further lots of algal suspensions containing the same volume containing graded concentrations of the dissolved phytostimulator dodine. The chlorophyll synthesis of the algae should be investigated at a light intensity of 2 χ 90 watt / m ² PhAR over a period of 6.5 hours. Within this time interval, distiπkte measurements of the optical density of the individual batches at 680nm and750nm with opalized cuvettes (0.5cm layer thickness) on the photometer (Spekol 10). For each measured value pair, the chlorophyll a concentration-proportional extinction difference ΔΕ (ΔΕ = E ₆₈₀ -E ₇₅₀ ) is calculated. It is graphically applied as a function of the cultivation time t for the individual batches (FIG. 1).

Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind der Figur 1 zu entnehmen. Die mit K gekennzeichnete Kurve zeigt den Extinktionsdifferenzverlauf der unbehandelten Kontrolle. Der zeitliche Verlauf der chlorophyll a-proportionalen Extinktionsdifferenz nach Zugabe von 3 x 10"⁴M, 1 x 1O^-4M, 3 x 10"⁵M, 2 x 10"⁵M und 1 x 10"⁵M Dodine wird durch die Kurven I bis V dargestellt. Die Kurve I zeigt, daß die Chlorophyllsynthese durch die Behandlung mit 3 χ 10"⁴M Dodine bis etwa zur Hälfte des Untersuchungszeitraumes besonders stark gehemmt ist und danach eine sehr geringe Syntheseaktivität erreicht wird. Auch mit der niedrigsten Konzentration (Kurve V) werden die Kontrollwerte nicht erreicht.The results of this study are shown in FIG. The curve marked K shows the extinction difference profile of the untreated control. The time course of chlorophyll a-proportional in absorbance after the addition of 3 x 10 ^"4 M, 1 x 1O ⁴ M, 3 x 10" ⁵ M, 2 x 10 ^"5 M and 1 x 10" ⁵ M dodine is determined by the Curves I to V shown. Curve I shows that chlorophyll synthesis is particularly strongly inhibited by the treatment with 3χ10 " ⁴ M dodine until about half of the test period and thereafter a very low synthesis activity is reached.Also with the lowest concentration (curve V) the control values become not reached.

Die Umrechung der chlorophyllkonzentrationsproportionalen Extinktionsdifferenz in Milligramm Chlorophyll a pro Liter Suspension wird durch die gewählte Auftragung von in Vorversuchen ermittelten Werten in Figur 2 verdeutlicht. Es ergeben sich bei doppeltlogarithmischer Darstellung der Extinktionsdifferenz in Abhängigkeit vom Chlorphyll a-Gehalt zwei lineare Bereiche a und b mit unterschiedlichen Anstiegen. °'The conversion of the chlorophyll concentration-proportional extinction difference in milligrams of chlorophyll a per liter of suspension is illustrated by the selected plot of values determined in preliminary experiments in FIG. With double logarithmic representation of the extinction difference as a function of the chlorophyll a content, two linear regions a and b with different increases are obtained. ° '

Der mathematische Zusammenhang zwischen dem Chlorphyll a-Gehalt und der Extinktionsdifferenz wird durch die folgenden ermittelten Gleichungen beschrieben: Bereich a:cchia= 4,6866 χ ΔΕ⁰·³³⁷⁶mg/lThe mathematical relationship between the chlorophyll a content and the extinction difference is described by the following equations: Range a: cchia = 4.6866 χ ΔΕ ⁰ · ³³⁷⁶ mg / l

fürAE< 0,144 Bereich b: c_chi_a = 32,7292 x AE^u1S6mg/lfor AE <0.144 range b: c _ch i _a = 32.7292 x AE ^u1S6 mg / l

fürAE> 0,144for AE> 0.144

Embodiment 2

Verfährt man wie im Ausführungsbeispiel 1 und versetzt einzelne Chargen von Algensuspensionen frisch angesetzter Synchronkulturen von Chlorella vulgaris mit abgestuften Konzentrationen von Amitrol, so erhält man die in Figur 3 dargestellten Änderungen des Chlorophyll a-Gehaltes durch die mehr oder weniger stark gehemmte Chlorophyll a-Synthese der Algen. Die mit K gekennzeichnete Kurve zeigt den Verlauf der Extinktionsdifferenz der unbehandelten Kontrollsuspension. Das Verhalten der Extinktionsdifferenz bei Einwirkung von 5 x 10"²%,1 χ 10"²%,3 χ 10"³%und 1 χ 10"³% Amitrol auf die Algensuspensionen ist durch die Kurven I bis IV dargestellt. 5 χ 10~²% Amitrol unterbindet fast über den gesamten Untersuchungszeitraum die Chlorophyllsynthese. Eine äußerst geringe Chlorophyllsynthese setzt erst nach der fünften Stunde ein. ,By proceeding as in Embodiment 1 and added individual batches of algae suspensions freshly prepared synchronous cultures of Chlorella vulgaris with graded concentrations of amitrole, we obtain the changes shown in Figure 3 of the chlorophyll a content by the more or less inhibited chlorophyll a synthesis of algae. The curve marked K shows the course of the extinction difference of the untreated control suspension. The behavior of absorbance when exposed to 5 x 10 ^"2%, 1 χ 10" ^2%, 3 χ 10 ^"3% and 1 χ 10" ^3% amitrole on the algal suspensions is represented by the curves I to IV. 5 χ 10 ~ ² % Amitrole inhibits chlorophyll synthesis almost throughout the study period. An extremely low chlorophyll synthesis begins after the fifth hour. .

Claims

Invention claim:

1. Selection method for Phytoeffektoren with effect on the chlorophyll synthesis, characterized in that by photometric measurement of the extinctions of two defined wavelengths by means of specially prepared photometer and

opalized cuvettes based on diffused light having wavelengths of absorption maximum of chlorophyll a with only slight overlay of the absorption spectrum by other pigments and the non-absorption region for correcting residual scattering on intact algal suspensions exposed to the influence of graded concentrations of various noxae or other environmental factors In the absence of the cell-count and volume-proportional scattering influence, measurement values proportional to the pigment concentration are obtained which, in comparison with those of untreated samples, permit exactly quantifiable statements to influence the growth and development-dependent re-synthesis of the chlorophyll a of plants.

2. Method according to item 1, characterized in that pigment concentration-proportional extinction values are obtained by forming the differences of the measured values of the absorbing wavelength range minus those of the absorption-free range.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that the method with a variety of species of microalgae and homogenates of pigment-containing organs of lower and higher plants and also with suspended chloroplasts and chloroplast fragments is feasible.

4. The method according to item 1, 2 and 3, characterized in that the extinction values obtained by the described procedure of a different mathematical processing can be supplied and comparisons with the behavior of other growth and development parameters are feasible.