Claims (3)
Erfindungsansprücheinvention claims
1. Verfahren zur Ermittlung derToxizität pflanzenaktiver Stoffe, dadurch gekennzeichnet, daß synchrone oder asynchrone nährstofffreie Zeil- oder Organismensuspensionen, die durch Abtrennung des Zeil- oder Organismenmaterials aus der Nährstofflösung, gegebenenfalls mehrmaligem Waschen und Suspendierung des Zellmaterials in destilliertes Wasser gewonnen werden, mit zu prüfenden Substanzen in abgestuften Konzentrationen unter konstanten Umweltbedingungen konfrontiert werden und zu entsprechenden Zeitpunkten oder am Ende des Tests die optischen Eigenschaften der substanzbehandelten Zeil- oder Organismensuspensionen und von entsprechenden unbehandelten Kontrollsuspensionen bestimmt werden, um mittels substanzinitiierter Variation der optischen Eigenschaften solcher Suspensionen die Effektoren nach ihrer Toxizität und Toxizitätscharakteristik differenzieren zu können.1. A method for determining the toxicity of plant-active substances, characterized in that synchronous or asynchronous nutrient-free cell or organism suspensions, which are obtained by separation of the cell or organism material from the nutrient solution, optionally repeated washing and suspension of the cell material in distilled water, to be tested Substances in graded concentrations under constant environmental conditions are confronted and at appropriate times or at the end of the test the optical properties of the substance-treated cell or organism suspensions and of untreated control suspensions are determined to determine, by substance-initiated variation of the optical properties of such suspensions, the effectors according to their toxicity and toxicity To be able to differentiate toxicity characteristics.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, das als Zeil- oder Organismensuspensionen alle suspendierbaren Bakterien, Blaualgen und Grünalgen verwendet werden können.2. The method according to item 1, characterized in that all suspendable bacteria, blue-green algae and green algae can be used as cell or organism suspensions.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften der Zellsuspensionen mittels Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei 1 bis η verschiedenen Wellenlängenbereichen oder ganzen Spektralbereichen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich analysiert werden.3. The method according to item 1 and 2, characterized in that the optical properties of the cell suspensions by means of spectral colorimetry, spectrophotometry or nephelometry at 1 to η different wavelength ranges or entire spectral ranges in the infrared, visible or ultraviolet spectral range are analyzed.
Hierzu 3 Seiten ZeichnungenFor this 3 pages drawings
Anwendung der ErfindungApplication of the invention
Pflanzenschutzmittelforschung, Suche nach Regulatoren biologischer Prozesse, Naturstoffchemie, Umweltanalyse Charakteristik der bekannten technischen LösungenPlant protection research, search for regulators of biological processes, natural product chemistry, environmental analysis Characteristic of the known technical solutions
Es ist bekannt, daß der Einfluß chemischer Substanzen auf biologische Prozesse auf vielfältige Weise geprüft werden kann. Als Indikatoren lassen sich auch autotroph oder heterotroph kultivierte Mikroalgensuspensionen nutzen. Nach dem Patent DD Nr. 94 234 lassen sich mittels autotroph kultivierter einzelliger Algensuspensionen diejenigen Chemikalien aus einer Stichprobe selektieren, die den fundamentalen Prozeß des autotrophen Zellwachstums, die Photosynthese, unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen. Durch parallele Analysen der wachstumsbedingten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der photosynthetischen bzw. respiratorischen Gaswechselumsätze und/oder der lonenumsätze substanzbehandelter autotropher bzw. heterotropher Mikroalgensuspensionen ist man über spezifische Anwendungsverfahren hinaus in der Lage, die Effektoren in vorrangige Effektoren des Stickstoffhaushaltes einzustufen (z. B. DD Nr. 20 0472/1). Alle diese Prüf- und Selektionsverfahren sind an das komplexe Wachstum der Algen- bzw. Zellsuspensionen gebunden, deshalb ist es nicht möglich, die erhaltenen Hemmdaten eindeutigauf wachstumshemmende Wirkungen oder auf die Toxizität der Substanzen zurückzuführen. Da Effektoren mit hoher Toxizität kaum selektive Wirkungen erwarten lassen, ist die Bestimmung derToxizität solcher Effektoren auf Pflanzen wichtig für ihre Einstufung hinsichtlich notwendiger Prüfverfahren und des Verwendungszweckes.It is known that the influence of chemical substances on biological processes can be tested in a variety of ways. Autotrophic or heterotrophically cultured microalgae suspensions can also be used as indicators. According to the patent DD No. 94 234 can be selected by autotrophically cultured unicellular algal suspensions those chemicals from a random sample, which affect the fundamental process of autotrophic cell growth, photosynthesis, directly or indirectly. By parallel analysis of the growth-related influences on the optical properties, the photosynthetic respiratory gas turnover and / or the ion conversions of substance-treated autotrophic or heterotrophic microalgae suspensions one is able to classify the effectors into priority effectors of the nitrogen balance beyond specific application methods (eg. DD No. 20 0472/1). All these testing and selection procedures are linked to the complex growth of the algal or cell suspensions, therefore it is not possible to clearly attribute the obtained inhibition data to growth-inhibiting effects or to the toxicity of the substances. Since high toxicity effectors are unlikely to produce selective effects, the determination of the toxicity of such effectors to plants is important for their classification in terms of necessary test procedures and intended use.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Die Erfindung verfolgt das Ziel, einen Toxizitätstest auf der Basis von Mikroalgen zu entwickeln, der eine sichere vom Wachstum unabhängige Beurteilung derToxizität von pflanzlichen Effektoren gestattet.The object of the invention is to develop a microalgae-based toxicity test which allows a safe, growth-independent assessment of the toxicity of plant effectors.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß definierte Mengen chemischer Verbindungen mit nährstofffreien einzelligen Algensuspensionen, die durch Abtrennung des Zellmaterials aus der Nährstofflösung, gegebenenfalls mehrmaligem Waschen und Suspendierung des Zellmaterials in destilliertes Wasser gewonnen werden, in abgestuften Konzentrationen in unmittelbaren Kontakt gebracht und diese Proben parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicher Temperatur mit Stickstoff zum Zweck einer gleichmäßigen Verteilung der Zellen begast werden. Zu festgelegten Zeitpunkten und/bzw. am Testende werden dann von Proben und Vergleichskulturen oder von Anteilen von beiden parallel oder in definierter Folge mittels spektroskopischer Verfahren bei einer oder mehreren Wellenlängen bzw. Wellenlängenbereichen des infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektrums die optischen Eigenschaften analysiert, um mittels vergleichender Betrachtung der substanzinitiierten Variation der optischen Eigenschaften solcher Suspensionen die Effektoren nach ihrer Toxizität und Toxizitätscharakteristik differenzieren zu können.This object is achieved in that defined amounts of chemical compounds with nutrient-free unicellular algal suspensions, which are obtained by separation of the cell material from the nutrient solution, optionally repeated washing and suspending the cell material in distilled water, placed in graded concentrations in direct contact and these samples in parallel with untreated reference cultures at uniform temperature are sparged with nitrogen for the purpose of uniform distribution of the cells. At fixed times and / or. At the end of the test, specimens and reference cultures or portions of both samples are analyzed in parallel or in a defined sequence by spectroscopic techniques at one or more wavelengths or wavelength ranges of the infrared, visible or ultraviolet spectra to obtain a comparative analysis of the substance-initiated variation of the optical spectrum Characteristics of such suspensions to differentiate the effectors according to their toxicity and toxicity characteristics.
Ausführungsbeispieleembodiments
Aus normal autotroph kultivierten Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgaris var. vulgaris Stamm BÖHM u. BORNS 1972/1 werden durch Abzentrifugieren und Waschen mit destilliertem Wasser die frischen Autosporen oder gegebenenfalls das asynchrone Zellmaterial von der Nährstofflösung getrennt und dann in destilliertem Wasser suspendiert. Durch gegebenenfalls mehrmalige Wiederholung dieses Vorganges werden dann die vollkommen nährstofffreien Algensuspensionen definierter optischer Dichte (z. B. 20 χ 10β Zellen/cm3) mit verschiedenen Konzentrationen alkoholischer Lösungen der zu prüfenden Substanz, in diesem Fall Benzen beimpft und zusammen mit unbehandelten Kontrollen bei 37°C mit Stickstoff begast, damit eine ständige gleichmäßige Verteilung der Zellen gewährleistet ist. Während die Algen in den Kontrollsuspensionen auf Grund des Nährstoff- und Kohlendioxidmangels nicht wachsen und sich nicht entwickeln können, - die optischen Eigenschaften bleiben während der Testdauer nahezu konstant-, werden die Algenzellen in den mit Chemikalien versetzten Proben mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen mehr oder weniger toxisch wirken. In diesem Fall verringert sich die optische Dichte der Suspensionen. Die Ergebnisse der Analyse derToxizität des Benzens sind den Figuren 1 und 2 zu entnehmen. Figur 1 enthält die Extinktionswerte bei 680 nm für die unbehandelte Kontrolle K und die mit abgestuft zunehmenden Konzentrationen 1 bis 6, die zu den entsprechenden Zeitpunkten vorgenommen wurden. Die Figur 2 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurven (DWK) in Form von Auftragungen der relativen Vergiftung in Prozent als Funktion der Logarithmen der Effektorkonzentration für den Einfluß des Wirkstoffes nach 1, 2, 4 und 8 Stunden Einwirkzeit. Aus den Haibstufenhöhen dieser DWK erhält man in allen vier Fällen beispielsweise einen Toxizitätswert -IgC50 = 2,12. Die Figur 3 zeigt einige mögliche stoffspezifische Toxizitätsverläufe in Form zeitabhängiger Änderungen der relativen Stufenhöhe der BWK für die Effektoren Benzen, Chlorbenzen, p-Dichlorbenzen, p- und m-Dinitrobenzen. Die Anstiege d relative Stufenhöhe der DWK/d Ig t der Graphen von der ersten bis etwa zur dritten Stunde in Figur 3 scheinen durch Verteilungsgleichgewichte determiniert zu sein, wie eine entsprechende Korrelation zu^hydrophoberTSubstitüentenpsrametern nach HANSCH bestätigt.From normal autotrophically cultured cell suspensions of unicellular green algae of the species Chlorella vulgaris var. Vulgaris strain BÖHM u. BORNS 1972/1, by centrifuging and washing with distilled water, the fresh autos pores or optionally the asynchronous cell material are separated from the nutrient solution and then suspended in distilled water. By optionally multiple repetition of this operation, the perfect nutrient-free algae suspensions are then defined optical density (z. B. 20 χ 10 β cells / cm 3) with various concentrations of alcoholic solutions of at substance to be tested, in this case inoculated benzene and together with untreated controls Gassed with nitrogen at 37 ° C to ensure a constant uniform distribution of the cells. While the algae in the control suspensions are unable to grow and develop due to nutrient and carbon dioxide deficiencies - the optical properties remain nearly constant during the test period - algal cells are more or less affected in the chemical samples when different concentrations of substance more or less toxic. In this case, the optical density of the suspensions decreases. The results of the analysis of the toxicity of the benzene are shown in FIGS. 1 and 2. Figure 1 contains the absorbance values at 680 nm for the untreated control K and those at incrementally increasing concentrations 1 to 6 made at the respective time points. FIG. 2 shows the dose-response curves (DWK) in the form of percent relative poisoning plots as a function of the logarithm of the effector concentration for the effect of the active agent after 1, 2, 4 and 8 hours exposure time. In all four cases, for example, a toxicity value of -IgC 50 = 2.12 is obtained from the shallow heights of this DWK. FIG. 3 shows some possible substance-specific toxicity courses in the form of time-dependent changes in the relative step height of BWK for the effectors benzene, chlorobenzene, p-dichlorobenzene, p- and m-dinitrobenzene. The increases in the relative step height of the DWK / d Ig t of the graphs from the first to about the third hour in Figure 3 appear to be determined by distributional equilibria, as confirmed by a correlation to HANSCH hydrophobic Substituent Rate Predators.