DD240909A1

DD240909A1 - PROCESS FOR PRODUCING MYCOBACTERIA BIOMASS LYSATE

Info

Publication number: DD240909A1
Application number: DD25770283A
Authority: DD
Inventors: Volker Deppmeyer; Peter Hoesel; Claere Hoerhold; Peter Atrat; Sabine Daenhardt; Jutta Kahleyss; Wolfgang Forberg; Heidrun Schulz
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1983-12-09
Filing date: 1983-12-09
Publication date: 1986-11-19

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lysat aus in der mikrobiellen Steroid-Transformation anfallender Mykobakterien-Biomasse. Verfahrensgemaess werden die nach Abschluss eines der Steroid-Transformation dienenden Fermentations- bzw. Aufarbeitungsprozesses anfallenden Zellen abgetrennt sowie anschliessend bei Temperaturen bis zu 150C und Drucken bis zu etwa 5105 Pa einer sauren Hydrolyse unterworfen (Dauer bis zu 3 Stunden). Nach Neutralisation mit alkalischen Verbindungen, die nach Abkuehlung auf Raumtemperatur erfolgt, wird das erhaltene neutralisierte Lysat dann bevorzugt dem Naehrmedium eines anschliessenden Fermentationszyklus der gleichen Art zur vollstaendigen bzw. partiellen Substitution der organischen Stickstoff-Quelle zugefuehrt.The invention relates to a process for producing lysate from mycobacteria biomass arising in the microbial steroid transformation. According to the method, the cells resulting from the completion of one of the steroid transformation fermentation or work-up process are separated and then subjected to acid hydrolysis at temperatures up to 150C and pressures up to about 5105 Pa (duration up to 3 hours). After neutralization with alkaline compounds, which takes place after cooling to room temperature, the neutralized lysate obtained is then preferably fed to the nutrient medium of a subsequent fermentation cycle of the same kind for the complete or partial substitution of the organic nitrogen source.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lysaten aus Mykobakterien-Biomasse. In hinreichenden Mengen fällt derartige Biomasse beispielsweise dann an, wenn mikrobielle Steroid-Transformationen, insbesondere der mikrobielle Seitenketten-Abbau von Sterolen, mittels Mykobakterien im technischen Maßstab durchgeführt werden; und die verfahrensgemäß erhaltenen Lysate werden bevorzugt zur Bereitung von Nährmedien für Fermentationen, die ihrerseits wiederum primär zur Transformation von Steroiden durchgeführt werden, eingesetzt.The invention relates to a process for the preparation of lysates from mycobacterial biomass. In sufficient quantities, such biomass is produced, for example, when microbial steroid transformations, in particular the microbial side-chain degradation of sterols, are carried out on an industrial scale by means of mycobacteria; and the lysates obtained according to the method are preferably used for the preparation of nutrient media for fermentations, which in turn are carried out primarily for the transformation of steroids.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der Fermentationsindustrie und gegebenenfalls in weiteren Bereichen der technischen Mikrobiologie. · 'The field of application of the invention is thus in the fermentation industry and optionally in other areas of technical microbiology. · '

Characteristic of the known technical solutions

Verfahren zur Herstellung von Mykobakterien-Biomasse-Lysaten sind bisher nicht beschrieben worden. Mykobakterien-Biomasse ist in zurückliegenden Zeiten offenbar nicht in Volumina angefallen, die es nahelegten, Verfahren zur Herstellung von Aufarbeitungsprodukten aus dieser Biomasse zu entwickeln. Insbesondere ist damit bisher auch nicht bekannt, daß Lysate aus Mykobakterien-Biomasse in ausgewählten Fermentationsnährböden als Stickstoff-Quelle verwendbar sind. Mit Blick auf einen entfernterliegenden Stand der Technik sei jedoch noch auf folgendes hingewiesen: Nachdem es gelungen ist, schnellwachsende Hefen im technischen Maßstab auf billigen Kohlenstoff-Quellen (Molkereiabfälle, Sulfitablaugen u.a.) zu kultivieren, hat die Gewinnung von Hefe-Extrakten, darunter auch von Hefe-Lysaten, Bedeutung erlangt (s. z. B. K. Hayashi et al., J. Ferment. Technol. 59 [1981], S. 319). So finden nach Lyseverfahren hergestellte Hefe-Extrakte Verwendung als Nahrungs- bzw. Futtermittelzusatz.Methods for producing mycobacterial biomass lysates have not previously been described. Mycobacterial biomass has apparently not accumulated in volumes in recent times, suggesting the development of processes for the production of reprocessed products from this biomass. In particular, so far it is also not known that lysates from mycobacterial biomass can be used in selected fermentation media as nitrogen source. In view of a remote prior art, however, should be noted on the following: After it has managed to cultivate fast-growing yeasts on an industrial scale on cheap carbon sources (dairy waste, sulfite liquors, etc.), has the extraction of yeast extracts, including Yeast lysates, gained importance (see, for example, BK Hayashi et al., J. Ferment., Technol. 59 [1981], page 319). Thus, yeast extracts prepared by lysis process find use as food or feed additive.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Mykobakterien-Biomasse-Lysat, das sich vorteilhaft für die Bereitung von Fermentationsnährböden, vorzugsweise von solchen für mikrobielle Steroid-Transformationen, einsetzen läßt.The aim of the invention is the production of mycobacterial biomass lysate, which can be used advantageously for the preparation of fermentation media, preferably those for microbial steroid transformations.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, erstmalig ein Verfahren zur Herstellung von Mykobakterien-Biomasse-Lysat zu beschreiben.The invention is based, to describe for the first time a method for the production of mycobacteria biomass lysate the task.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die am Ende eines zum Zwecke der Steroid-Transformation durchgeführten Fermentationsprozesses anfallende Mykobakterien-Biomasse, insbesondere solche von M. fortuitum, M. phlei, M. smegmatis, M. vaccae oder M. parafortuitum, die zur Abtrennung des Fermentationsproduktes bereits mit organischen Lösungsmitteln (wie Aceton oder Methanol) extrahiert sein kann, als Biofeucht- bzw. Biotrockenmasse zunächst einer sauren Hydrolyse (pH < 6,0) unterworfen wird. Die Hydrolyse wird für die Dauer von 0,5 Stunden bis 3 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, unter Erhitzen auf 100⁰C bis 150⁰C, vorzugsweise auf 120⁰C bis 125⁰C, und bei einem Druck von 1 10⁵Pa bis 5,07 · 10⁵Pa, vorzugsweise von 2,02 · 10⁵Pa, mit anorganischen oder organischen Säuren durchgeführt. Vorzugsweise wird hierfür 20%ige Schwefel- oder Salzsäure bzw. konzentrierte Ameisen- oder Essigsäure eingesetzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird mit alkalischen Verbindungen, vorzugsweise mit 25%iger wäßriger Ammoniak- und/oder Kaliumhydroxid- und/oder Natriumhydroxidlösung, neutralisiert und das neutralisierte Lysat abfiltriert. Das erhaltene Produkt kann bevorzugt zur vollständigen bzw. partiellen Substitution der organischen Stickstoff-Quelle den für mikrobielle Steroid-Transformationen bereiteten Nährmedien zugesetzt werden. Hierbei ist dem Nährmedium pro Liter das neutralisierte Lysat entsprechend von 6 g bis 120 g, vorzugsweise 60 g, Mykobakterien-Feucht- oder -Trockenmasse zuzugeben, wenn die vollständige Substitution der organischen Stickstoffquelle erreicht werden soll. Eine partielle Substitution beispielsweise bis zu 50% tritt eiri bei Zugabe des Lysates aus 1 g bis 5g Mykobakterien-Feucht- oder entsprechend Trockenmasse pro Liter Nährmedium.According to the invention, this object is achieved in that the at the end of a carried out for the purpose of steroid transformation fermentation process mycobacteria biomass, especially those of M. fortuitum, M. phlei, M. smegmatis, M. vaccae or M. parafortuitum, the Separation of the fermentation product may already be extracted with organic solvents (such as acetone or methanol), as Biofeucht- or dry biomass initially an acid hydrolysis (pH <6.0) is subjected. The hydrolysis is for a period of 0.5 hours to 3 hours, preferably 2 hours, with heating at 100 ⁰ C to 150 ⁰ C, preferably at 120 ⁰ C to 125 ⁰ C, and at a pressure of 1 10 ⁵ Pa 5.07 · 10 ⁵ Pa, preferably of 2.02 · 10 ⁵ Pa, carried out with inorganic or organic acids. Preferably, this 20% sulfuric or hydrochloric acid or concentrated formic or acetic acid is used. After cooling to room temperature, it is neutralized with alkaline compounds, preferably with 25% strength aqueous ammonia and / or potassium hydroxide and / or sodium hydroxide solution, and the neutralized lysate is filtered off. The product obtained may preferably be added to the complete or partial substitution of the organic nitrogen source for the culture media prepared for microbial steroid transformations. In this case, the nutrient medium per liter of the neutralized lysate corresponding to from 6 g to 120 g, preferably 60 g, mycobacteria moist or dry mass admit, if the complete substitution of the organic nitrogen source to be achieved. A partial substitution, for example, up to 50%, occurs when the lysate is added from 1 g to 5 g of mycobacterial wet or dry matter per liter of nutrient medium.

Das beschriebene Verfahren weist folgende vorteilhafte Wirkungen auf: — Mit der Verwertung von lysierter Mykobakterien-Biomasse wird die Substitution von relativ teureren Nährbodenkomponenten möglich, woraus sich bei mikrowellen Steroid-Transformationen im technischen Maßstab ein bedeutender ökonomischer Effekt ergibt.The described method has the following advantageous effects: With the utilization of lysed mycobacterial biomass, the substitution of relatively more expensive nutrient medium components becomes possible, resulting in a significant economic effect in microwave steroid transformations on an industrial scale.

— Bei seiner Anwendung resultieren, wenn die mikrobielle Steroid-Transformation mit fakultativ pathogenen Mykobakterien-Stämmen erfolgt, verminderte Aufwendungen zum Schutz von Umwelt und Personal (recycling-Verhalten).- When applied, microbial steroid transformation with facultative pathogenic strains of mycobacteria results in reduced environmental and human protection costs (recycling behavior).

— Durch die spezifischen Lysebedingungen wird in der Ausgangsbiomasse miterhaltenes, bisher nicht umgesetztes Steroid, vorzugsweise Sterol, nicht oder zu einem kleinen Teil lediglich geringfügig geschädigt; bei oben beschriebener Verwendung des Aufarbeitungsproduktes steht es in der nächsten Fermentation erneut für die Transformation zu Verfügung.- Due to the specific lysis conditions in the starting biomass miterhaltenes, previously unreacted steroid, preferably sterol, not or only slightly damaged only to a small extent; in the case of the above-described use of the work-up product, it is again available for transformation in the next fermentation.

embodiments

1. 60g mit Aceton extrahierte und luftgetrocknete Mykobakterien-Biomasse, die aus einem Fermentationsprozeß zur Transformation von ß-Sitosterol mit Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 oder mit Mycobacteriumfortuitum ZIMET10 849 stammt, werden 2 Stunden unter Erhitzen auf 120⁰C bis 125⁰C und bei Drücken von 2,02 · 10⁵Pa mit 20 ml 20%iger H₂SO₄ unter Rückfluß hydrolysiert. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wird mit 25%iger wäßriger NH₃-Lösung neutralisiert und anschließend filtriert. Für eine vollständige Substitution der organischen Stickstoffquelle wird das erhaltene Lysat mit 7,5g Glukose, 1BgLaI^OSe₁O₁OSgFeCI₃- 7 H₂0,0,3g MgSO₄ 7 H₂0,4,5g KH₂PO₄ und Aqua dest. ad 1 000ml zu einem Nährmedium zusammengestellt, das in bekannter Weise zur Kultivierung eines Transformatorstammes der Gattung Mycobacterium und zur Umwandlung von Sitosterol einsetzbar ist.1. 60g extracted with air acetone and air-dried mycobacteria biomass derived from a fermentation process for the transformation of ß-sitosterol with Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 or with Mycobacteriumfortuitum ZIMET10 849, 2 hours with heating to 120 ⁰ C to 125 ⁰ C and at pressures of 2.02 × 10 ⁵ Pa with 20 ml of 20% H ₂ SO ₄ hydrolyzed under reflux. After cooling to room temperature is neutralized with 25% aqueous NH ₃ solution and then filtered. For complete substitution of the organic nitrogen source, the resulting lysate is washed with 7.5 g of glucose, ₁ l of LiAl OSe ₁ O ₁ OSgFeCl ₃ - 7 H _2, 0.03 g of MgSO ₄ .7H ₂ 0.45 g of KH ₂ PO ₄ and aqua least. ad 1 000ml to a nutrient medium, which can be used in a known manner for culturing a transformer strain of the genus Mycobacterium and for the conversion of sitosterol.

Im 500ml Schüttelkolben werden 50ml dieses Nährmediums mit einem 3 Tage alten Schrägröhrchen mit Mycobacterium fortuitum ZIMET10849 beimpft, mit 10g/l einer Sitosterolsubstratpräparation, die, bezogen auf den Sterolgehalt, 10% nichtionisches Tensid enthält, versetzt und bei 28⁰C auf einem Rundschwingtisch (f = 200 min"¹) 76 Stunden geschüttelt. Nach der Aufarbeitung durch Extraktion mit Chloroform werden 150 mg (= 3,0g/l) 9a-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion erhalten, womit die Eignung eines unter Einbezug des verfahrensgemäß hergestellten Lysates bereiteten Nährmediums für mikrobielle Sterol-Transformation belegt ist.In 500ml shake flask 50ml of this culture medium are inoculated with a 3 day-old slants with Mycobacterium fortuitum ZIMET10849, with 10 g / l of a Sitosterolsubstratpräparation that to the sterol content, 10% by weight based nonionic surfactant, and stirred at 28 ⁰ C (on an orbital oscillating table f = 200 min " ¹ ) shaken for 76 hours After work-up by extraction with chloroform, 150 mg (= 3.0 g / l) of 9a-hydroxy-androst-4-ene-3,17-dione are obtained, whereby the suitability of a Incorporation of the lysate prepared according to the method prepared nutrient medium for microbial sterol transformation is occupied.

Für die partielle Substitution der organischen Stickstoff-Quelle wird das Lysat aus 5g feuchter Mykobakterien-Biomasse, welches wie oben beschrieben, hergestellt wurde, mit 7,5g Glukose, 15g Laktose, 0,05g FeCI₃ · 7H₂0,0,3g MgSo₄ · 7H₂O, 4,5 g KH₂PO₄,2,7 g Kaseinhydrolysat und Aqua dest. ad 1 000 ml zu einem Nährboden kombiniert und für die Kultivierung und Fermentation eingesetzt.For the partial substitution of the organic nitrogen source, the lysate from 5 g of wet mycobacterial biomass, prepared as described above, with 7.5 g of glucose, 15 g of lactose, 0.05 g of FeCl ₃ .7H ₂ .0. ₃ mg of MgSo ₄ · 7H ₂ O, 4.5 g KH ₂ PO ₄ , 2.7 g of casein hydrolyzate and distilled water. ad 1 000 ml combined to a nutrient medium and used for cultivation and fermentation.

2. 90g mit Aceton extrahierte und luftgetrocknete Mykobakterien-Biomasse, die aus Fermentationsprozessen zur Transformation von ß-Sitosterol mit Mycobacteriumfortuitum NRRL B-8119 gewonnen wurde, wird mit 250ml 20%iger Schwefelsäure versetzt und 2 Stunden bei 120⁰C hydrolysiert. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wird mit25%iger NH₃-Lösung neutralisiert und filtriert. Die chemische Analyse ergibt, daß das so gewonnene Biotrockenmasse-Lysat 62,2 mg/ ml Ammonium-Stickstoff und 14,0mg/ml organischen Stickstoff enthält.2. 90g extracted with air acetone and air-dried mycobacteria biomass, which was obtained from fermentation processes for the transformation of ß-sitosterol with Mycobacteriumfortuitum NRRL B-8119 is treated with 250ml of 20% sulfuric acid and hydrolyzed at 120 ⁰ C for 2 hours. After cooling to room temperature, it is neutralized with 25% NH ₃ solution and filtered. The chemical analysis shows that the dry biomass lysate thus obtained contains 62.2 mg / ml of ammonium nitrogen and 14.0 mg / ml of organic nitrogen.

3. 500g mit Aceton extrahierte und luftgetrocknete Mykobakterien-Biomasse wird mit 1375 ml 20%ige HCI versetzt und wie in Beispiel 2 hydrolysiert. Nach dem Abkühlen erfolgt das Neutralisieren mit 25%iger NH₃-Lösung.3. 500 g extracted with air acetone and air-dried mycobacteria biomass is added with 1375 ml of 20% HCl and hydrolyzed as in Example 2. After cooling, the neutralization is carried out with 25% NH ₃ solution.

Unter Zusatz von 55g Glycerin; 2,75g KH₃PO₄; 2,75g K₂HPO₄; 8,25g (NH₄J₂HPO₄; 1,1 g MgSO₄ · 7H₂O; 0,55g FeSO₄ · 6H₂O; 1,1 g ZnSO₄ 7 H₂Ozu 4000ml Aqua dest. wird ein Medium zur Umwandlung von ß-Sitostero] durch M.fortuitum NRRL B-8119 oder M.fortuitum ZIMET 10849 hergestellt.With the addition of 55g glycerol; 2.75 g KH ₃ PO ₄ ; 2.75 g K ₂ HPO ₄ ; 8,25g (NH ₄ J ₂ HPO _4, 1.1 g MgSO ₄ .7H ₂ O; 0.55 g FeSO ₄ · 6H ₂ O;. 1.1 g ZnSO ₄ 7 H ₂ Ozu 4000ml distilled water is a medium for Conversion of β-sitostero] by M.fortuitum NRRL B-8119 or M.fortuitum ZIMET 10849.

Claims

Invention claim:

1. A process for the preparation of mycobacteria biomass lysate, characterized in that the obtained at the end of a microwave steroid transformation fermentation process resulting mycobacteria biomass, which may be already extracted with organic solvents for the separation of the fermentation product, with inorganic or organic acids hydrolyzed for a period of 0.5 hours to 3 hours under heating at 100 ⁰ C to 150 ° C and at a pressure of 1 x 10 ⁵ Pa to 5.07 · 10 ⁵ Pa at a pH less than pH 6.0, After cooling to room temperature neutralized with alkaline compounds and the neutralized lysate is finally filtered off.

2. The method according to item!, Characterized in that the acidic hydrolysis 20% sulfuric or hydrochloric acid or concentrated formic or acetic acid is used and the neutralization with 25% aqueous ammonia and / or sodium and / or potassium hydroxide Solution is done.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that the hydrolysis is carried out with 20% sulfuric or hydrochloric acid with heating to 120 ° C to 125 ⁰ C at a pressure of 2.02 · 10 ⁵ Pa for a period of 2 hours and 25% aqueous ammonia solution is used for the subsequent neutralization.