DD225710A1 - PROCESS FOR OBTAINING SUPEROXIDE DISTUTASE - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Superoxiddismutase. Das Anwendungsgebiet der Erfindung umfasst generell den Bereich der Medizin, insbesondere die klinisch-experimentelle Forschung und die Anwendung in der Klinik selbst. Hier betrifft es vor allem saemtliche Erkrankungen entzuendlicher Genese. In der Nuklearmedizin wird eine Optimierung der Strahlenbehandlung zum Beispiel bei Tumorerkrankungen angestrebt. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von chromatographisch reiner, salzfreier Superoxiddismutase mit hoher spezifischer Aktivitaet. Erfindungsgemaess wird dies erreicht durch die Verwendung eines fluechtigen Salzpuffers, der dadurch charakterisiert ist, dass er unter den Bedingungen der Gefriertrocknung in gasfoermige Bestandteile zerfaellt und dadurch vollstaendig aus dem Eluat entfernt wird.The invention relates to a process for obtaining superoxide dismutase. The field of application of the invention generally encompasses the field of medicine, in particular clinical-experimental research and its use in the clinic itself. Here, it relates above all to all diseases of inflammatory genesis. In nuclear medicine, an optimization of radiation treatment is sought, for example in tumor diseases. The aim of the invention is the provision of chromatographically pure, salt-free superoxide dismutase with high specific activity. According to the invention, this is achieved by the use of a volatile salt buffer, which is characterized in that it disintegrates into gaseous constituents under the conditions of freeze-drying and is thereby completely removed from the eluate.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Superoxiddismutase. Das Anwendungsgebiet der Erfindung umfaßt generell den Bereich der Medizin, insbesondere die klinisch-experimentelle Forschung und die Anwendung in der Klinik selbst. Hier betrifft es vor allem sämtliche Erkrankungen entzündlicher Genese. In der Nuklearmedizin werden Möglichkeiten für eine Optimierung der Strahlenbehandlung (ggf. in Kombination mit Superoxiddismutase-Hemmstoffen) zum Beispiel bei Tumorerkrankungen eröffnet.The invention relates to a process for obtaining superoxide dismutase. The field of application of the invention generally encompasses the field of medicine, in particular clinical-experimental research and its use in the clinic itself. Here, it relates above all to all diseases of inflammatory origin. In nuclear medicine, possibilities for optimizing radiation treatment (possibly in combination with superoxide dismutase inhibitors), for example in the case of tumor diseases, are opened up.
Die bekannten technischen Lösungen sind dadurch gekennzeichnet, daß die auf ein Polysaccarid-Gel (z.B. Sephadex G-100) bzw. einen Ionenaustauscher (z. B. DEAE-Zellulose) aufgetragene rohe Fraktion von Superoxiddismutase mittels eines Phosphat-Puffers (z.B. Phosphatpuffer nach Sörensen) von der Säule eluiert wird. (McCord, J.M. and I.Fridovich: Superoxide Dismutase. An Enzymic Function for Erythroeuprein [Hemocuprejn]. J. Biol. Chem. 244,6049-6055 [19691).The known technical solutions are characterized in that the crude fraction of superoxide dismutase applied to a polysaccharide gel (eg Sephadex G-100) or an ion exchanger (eg DEAE cellulose) is replaced by means of a phosphate buffer (eg phosphate buffer according to Sorensen ) is eluted from the column. (McCord, J. M. and I. Fridovich: Superoxide Dismutase An Enzymic Function for Erythroeuprein [Hemocuprejn] J. Biol. Chem., 244, 6049-6055 [19691].
Diesen Verfahren haftet der grundsätzliche Mangel an, daß die erhaltenen Fraktionen mehr oder weniger stark salzhaltig sind und die Entfernung des Salzes (zur Gewinnung des reinen Enzyms) nur mit einem erheblichen Zeit- und zum Teil auch Materialaufwand möglich ist.These methods are liable to the fundamental deficiency that the fractions obtained are more or less strongly salty and the removal of the salt (to obtain the pure enzyme) is possible only with a considerable time and sometimes also material costs.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von chromatographisch reiner, salzfreier Superoxiddismutase mit hoher spezifischer Aktivität. Dieses Ziel wird durch die Einführung des die Erfindung betreffenden Schrittes rationeller (da zeiteffektiver) und in höherer Qualität (da schonender) als mit den bisher üblichen Verfahren erreicht.The aim of the invention is to provide chromatographically pure, salt-free superoxide dismutase with high specific activity. This goal is achieved through the introduction of the step of the invention more rational (since time-effective) and higher quality (since gentler) than with the usual methods.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von Superoxiddismutase aus biologischem Material.The object of the invention is to provide a process for obtaining superoxide dismutase from biological material.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die zum Beispiel aus hämolysierten roten Blutzellen durch Lösungsmittelextraktion, Konzentrierung auf Amicon PM-10 Molekularfiltem und nachfolgender Lyophiiisierung gewonnene Superoxiddismutase-Rohfraktion an einer Sephadex G-100 Säule mittels Gelfiltration gereinigt wird, wobei zur Elution im Gegensat2 zu den konventionellen Verfahren nicht mit Phosphat- bzw. Trispuffer, sondern mit einem flüchtigen Saizpuffer (z.S.According to the invention, the object is achieved by purifying, for example, the hemolyzed red blood cells by solvent extraction, concentration on Amicon PM-10 Molekularfiltem and subsequent lyophilization Superoxiddismutase crude fraction on a Sephadex G-100 column by gel filtration, wherein the elution in Gegensat2 to the conventional method not with phosphate or Tris buffer, but with a volatile Saizpuffer (zS
Ammoniumhydrogencarbonat-Essigsäure-Puffer) vorzugsweise vom pH 7,2 eluiert wird.Ammonium bicarbonate-acetic acid buffer) is preferably eluted from pH 7.2.
Das erfindungsgemäß« Verfahren bringt gegenüber der üblichen Eluticn mit nichtflüchtigen Puffern (z. B. Phosphat-Puffer bzw. Tris-Puffer) eine Reihe von wesentlichen Vorteilen:The process according to the invention brings a number of significant advantages over the conventional eluticin with non-volatile buffers (eg phosphate buffer or Tris buffer):
1. Bereits im ersten Reinigungsschritt (Gel-Chromatographie) wird unmittelbar das salzfreie Enzym in hoher Reinheit erhalten.1. Already in the first purification step (gel chromatography) directly the salt-free enzyme is obtained in high purity.
2. Da die sonst erforderliche Entfernung der üblicherweise zur Elution benutzten nichtflüchtigen Puffersubstanzen aus den bei der Gel-Chromatographie erhaltenen Fraktionen mehrere zeit- und materialaufwendige Dialysen erforderlich macht, wird durch das erfindungsgemäße Vorgehen eine erhebliche Zeit- und auch Materialeinsparung erreicht.2. Since the otherwise necessary removal of the nonvolatile buffer substances customarily used for the elution from the fractions obtained in gel chromatography necessitates a number of time-consuming and expensive dialyses, the procedure according to the invention achieves considerable time and material savings.
3. Infolge des Wegfalls der oft über Tage laufenden Dialyseprozedur und der sich anschließenden zusätzlichen Lyophiiisierungen gelingt es durch das die Erfindung betreffende Verfahren, Superoxiddismutase-Fraktionen mit hoher spezifischer Aktivität zu isolieren. Die so erreichbaren spezifischen Aktivitäten liegen z.T. mehr als doppelt so hoch, als die mit konventionellen Methoden erreichten.3. As a result of the elimination of the current often daily dialysis procedure and the subsequent additional Lyophiiisierungen succeeds by the subject invention method of isolating superoxide dismutase fractions with high specific activity r. The specific activities that can be achieved are in some cases more than twice as high as those achieved with conventional methods.
Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.The invention will be explained in more detail using an exemplary embodiment.
10 Liter frisches Rinderblut werden in eine eisgekühlte ACD-Stabilisatorlösung einfließen gelassen. Anschließend werden bei 2000U/Min (20Min) die roten Blutkörperchen in der Kälte abzentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen des Erythrozytenbreis mit physiologischer Kochsalzlösung (jeweils Ersatz der abdekantierten Plasma- bzw. Waschlösung) wird das erhaltene Sediment roter Blutzeilen mit einem gleichgroßen Volumen Aqua bidest. versetzt und über Nacht bei 4°C hämoiysieren gelassen. Anschließend wird das Hämoglobin analog dem Verfahren von McCord und Fridovich entfernt. Aus dem hierbei anfallenden, schwach gelblich gefärbten Überstand, wird mit festem K2HPO4 χ 3H2O (2 kg/4,111) eine Phasentrennung herbeigeführt. Der größte Teü der Supercxiddismutase-Aktivität befindet sich jetzt in der oberen ethanolischen Phase. Hieraus wird in der Kälte mit 1,14 Volumenanteilen Aceton die Superoxiddismutase präzipitiert. Nach Absitzen des Niederschlages wird dieser abzentrifugiert (2000U/Min, 15Min). Dann wird das Präzipitat mehrfach in kleinen Mengen Aqua bidest. aufgenommen und abzentrifugiert. Die erhaltenen Überstände (ca. 300ml) werden dann durch Ultrafiltration an Amicon PM-10 Filtern entsalzt und an Enzym angereichert. Anschließend werden diese weitgehend salzfreien Überstände lyophiiisiert. Die so erhaltene iyophilisierte Substanz wird dann in flüchtigem Puffer (Ammcniumhydrogencarbcnat-Essigsäure-Puffer vom pH 7,2) gelöst und auf eine Sephadex G-100 Säule aufgebracht. Nach Eiution mit flüchtigem Puffer werden die im Moiekuiargewichtsbereich von 32000 bis 33000 Daiton liegenden Fraktionen herausgeschnitten und anschließend gefriergetrocknet. Die Ausbeute an Superoxiddismutase in diesen Fraktionen beträgt ca. 30% der eingesetzten Rohfraktion. Im vorliegenden Beispiel wurden aus 6S9mg Rohfraktion 220mg Superoxiddismutase mit einer spezifischen Aktivität von ca. 500C Enzymeinheiten pro mg Protein isoliert.10 liters of fresh bovine blood are added to an ice cooled ACD stabilizer solution. Subsequently, at 2000 rpm (20 min), the red blood cells are centrifuged off in the cold. After washing the erythrocyte pulp twice with physiological saline solution (replacement of the decanted plasma or washing solution), the sediment obtained is red blood cells with an equal volume of double-distilled water. and allowed to hemolyze overnight at 4 ° C. Subsequently, the hemoglobin is removed analogously to the method of McCord and Fridovich. From the resulting, slightly yellowish supernatant, a phase separation is achieved with solid K 2 HPO 4 χ 3H 2 O (2 kg / 4,111). The largest part of the superconductive dismutase activity is now in the upper ethanolic phase. From this, the superoxide dismutase is precipitated in the cold with 1.14 parts by volume of acetone. After settling of the precipitate, it is centrifuged off (2000 rpm, 15 min). Then the precipitate is repeatedly redistilled in small amounts of water. taken up and centrifuged. The supernatants obtained (about 300 ml) are then desalted by ultrafiltration on Amicon PM-10 filters and enriched in enzyme. Subsequently, these largely salt-free supernatants are lyophilized. The iyophilized substance thus obtained is then dissolved in volatile buffer (pH 7.2 pH ammonium hydrogencarbonate-acetic acid buffer) and applied to a Sephadex G-100 column. After elution with volatile buffer, the fractions lying in the Moiekuiargewichtsbereich 32000 to 33000 Daiton are cut out and then freeze-dried. The yield of superoxide dismutase in these fractions is about 30% of the crude fraction used. In the present example, 220 mg of superoxide dismutase having a specific activity of about 500C enzyme units per mg protein were isolated from 6S9 mg crude fraction.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD26022984A DD225710A1 (en) | 1984-02-22 | 1984-02-22 | PROCESS FOR OBTAINING SUPEROXIDE DISTUTASE |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD26022984A DD225710A1 (en) | 1984-02-22 | 1984-02-22 | PROCESS FOR OBTAINING SUPEROXIDE DISTUTASE |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| DD225710A1 true DD225710A1 (en) | 1985-08-07 |
Family
ID=5554802
Family Applications (1)
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| DD26022984A DD225710A1 (en) | 1984-02-22 | 1984-02-22 | PROCESS FOR OBTAINING SUPEROXIDE DISTUTASE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD225710A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3813124A1 (en) * | 1988-04-15 | 1989-10-26 | Krieg Benno | Distillable buffer solutions and their uses |
-
1984
- 1984-02-22 DD DD26022984A patent/DD225710A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3813124A1 (en) * | 1988-04-15 | 1989-10-26 | Krieg Benno | Distillable buffer solutions and their uses |
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