DD225440A1

DD225440A1 - Zellzuchtmedium

Info

Publication number: DD225440A1
Application number: DD26124284A
Authority: DD
Inventors: Gottfried Heder; Manfred Wehnert; Annette Doerffel; Suse-Brigitte Savoly; Christel Hornuss
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1984-03-27
Filing date: 1984-03-27
Publication date: 1985-07-31
Also published as: DD225440B1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Zellzuchtmedium, insbesondere zur Anwendung in der praenatalen Diagnostik. Erfindungsgemaess enthaelt dieses Zellzuchtmedium neben ueblichen Bestandteilen ein aus Gehirn von frisch geschlachteten Rindern gewonnenes Praeparat, das neben nicht naeher definierten Komponenten "Fibroblast Growth Factor"-Aktivitaet enthaelt. Dieses Hirnpraeparat entfaltet auf Grund eines Synergismus zwischen "Fibroblast Growth Factor" und den undefinierten Begleitkomponenten, vorzugsweise aus Proteinen bestehend, in einer optimalen Konzentration angewendet, zusammen mit ueblichen Mediumbestandteilen einen anhaltend foerdernden Effekt auf die Vermehrung von Zellen, insbesondere geringer Mengen menschlicher Fruchtwasserzellen in vitro. Durch die Erfindung wird es moeglich, geringe Mengen an menschlichen Fruchtwasserzellen, wie sie ueblicherweise in Fruchtwasserproben anfallen, in einem fuer die praenatale Diagnostik vertretbaren Zeitraum bzw. erforderlichen Umfang ohne groesseren technischen Aufwand zu vermehren.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Zellzuchtmedium, das neben üblichen Komponenten ein aus Gehirn frisch geschlachteter Rinder gewonnenes Präparat enthalt, wodurch die Vermehrung von Zellen mesodermalen Ursprungs, vor allem menschlicher Fruchtwasserzellen — insbesondere bei geringer Zeileinsaat menge — in vitro anhaltend gefördert wird. So wird es durch die Erfindung möglich, im Rahmen der pränatalen Diagnostik menschliche Fruchtwasserzellen, die zum Zeitpunkt ihrer Entnahmemöglichkeit nur in sehr geringer Menge anfallen, in einem für die diagnostische Routineuntersuchung ausreichenden Umfang bzw. vertretbaren Zeitraum ohne größeren labortechnischen Aufwand und bei Minimalisierung der Gefahr einer Mykoplasmenkontamination durch häufigen Mediumwechsel in vitro zu vermehren.

Die Erfindung ist vorzugsweise für die Humanmedizin — insbesondere für die Humangenetik — geeignet. Sie ist ferner für alle biologischen Arbeitsgebiete von Interesse, wo menschliche oder tierische Zellen vergleichbarer Art unter analogen Voraussetzungen in vitro zur Vermehrung gebracht werden sollen.

Charakteristik der bekannten technischen Losungen

Bekannt ist die Möglichkeit, sehr geringe Mengen an tierischen und menschlichen Zeilen, wie sie beispielsweise in Fruchtwassemroben im Rahmen der pranataien Diagnostik anfallen, durch übliche Zeilzuchtmedien, denen als wachstumsfördernde Komponente bis zu 20³O fötales Käiberserum zugesetzt ist, in vitro zur Vermehrung zu bringen. In bestimmten Fällen, oei denen der Zeitfaktor fur die Erreichung einer für die Weiterverwendung der Zellen geeigneten bzw. erforderlichen Zellmenge — so z. B. für Untersuchungen ^;m Rahmen der pränatalen Diagnostik — eine vorrangige Rolle spielt, haben sich weitere Zusätze von Zeilwachstumsfaktoren zum Medium — insbesondere Zusätze von „Fibroblast Growth Factor' in weitgehend aufgereinigter Form (1 ug/ml· ,PORRECO, 3RADSHAW, SARKAR und JONES, Obstetrics and Gynecology 55, 55 (1980)) bzw. in reiner Form (lOOng/ml) (GOSPODAROWICZ, MORAN und OWASHI, J. Cün. Endocrinol.

Metab. 44, 551 1977}) zwar grundsätzlich als erfolgreich erwiesen, jedoch sind hier — wie im letztgenannten Fall besenriebendie zur Vermehrung vorgesehenen Zelleinsaaten relativ hoch (etwa 3000 Zellen pro Petrischale /Scm Durchmesser/), und außerdem ist in den genannten Fällen die Zellkultivierung mit dem technischen Nachteil einer täglich bzw. sehr häufig erforderlichen Mediumerneuerung verbunden.

Es ist weiterhin bekannt, daß reiner „Fibroblast Growth Factor" zur Entfaltung seiner vollen zel I wachstumsfördernden Effektivität an Primärkulturen und frühen Passagen menschlicher diploider Zellen (Fibroblasten) — anders als bei transformierten Zellen — auf ein Zusammenwirken mit anderen Biofaktoren angewiesen ist, die ihm üblicherweise partiell aus den Serumzusätzen zum Zellzuchtmedium zur Verfügung stehen 'GOSPODAROWICZ und MORAN, Annual Rev. Biochem. 45, 531 (1976)). Somit wird auch der in den o.g. Fällen erforderliche mehrfache Mediumwechsel !Ergänzung verbrauchter Wirkstoffreserven) erkläroar, mit dessen Häufigkeit — abgesehen vom arbeitstechnischen Nachteil — ^;m Fall der Kultivierung menschlicher Fruchtwasserzellen ein infektionsbiologisches Risiko in ganz besonderer Weise zunimmt, das darin besteht, daß eine mit der Mediumerneuerung eventuell verbundene Mykouiasmeninfektion der Fruchtwasserzeilen zu chromosomalen Veränderungen derselben — und damit 2u diagnostischen Fehlentscheidungen — führen kann !SCHNEIDER, STAiMBRIDGE, EPSTEIN, GOLBUS. ABBO-HALSBASCH und RODGERS, Science 184, 477 (1974)).

Gleichfalls mit dem Ziel der Minderung einer Gefahr der Mykoplasmenkontamination — hier allerdings vorzugsweise im. ursächlichen Zusammenhang mit höheren Serumkonzentrationen (15 bis 30%) ^:rr Medium gesehen — sind für den speziellen Fall der Vermehrung menschlicher Fruchtwasserzeilen in vitro erfolgreiche Untersuchungen zu einer weitgehenden Substituierung von fötalem Kalberserum .m Medium durch 'einen „Fibroblast Growih Factor" in Verbindung mit 9 weiteren Biofaktoren 'vorwiegend Hormone) Gekannt geworden, wooei jedoch aucn hier ein Serumzusatz !fötales Kälberserum; ,-on -^:-. zum Medium ment unterschrtten werden <ann 'Cr¹ANG. JONES und MASUI. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79, 4795 11982'.'. Auch in diesem FaI! kann jedoch nicht auf häufigere Mediumerneuerungen währena der Zailkultivierung verzichtet werden. Von NORTHOFF (DE-OS 3138597) wird em Verfanren zur Beschleunigung des Wachstums von Fruchtwasser-Zeilkuituren ozw. von menschlichen Fibroblasten bzw. fibrobiastenartlgen Zeilen Geschrieben, in dem die Stabilität von reinem „Fibroblast Growth Factor" — sowie auch seine Löslichkeit — ais kritisch beurteilt wird und ein besserer Effekt einer Zumischung eines

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lymphokinreichen Überstandes von mit Concavalin A stimulierten Lymphozyten zu üblichem Zellzuchtmedium zugeschrieben

Die angeführte Schwankungsbreite für optimal wirksame Zusätze (2 bis 20VoI.-%) spricht jedoch für chargenabhängige Qualitätsschwankungen, welche für die methodische Standardisierung der Zellkultivierung einen Nachteil bilden. Aus gleicher Sicht erscheint auch die begrenzte Haltbarkeit (3 Monate, 4 bis 6°C) der Zumischung problematisch.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Zellzuchtmedium zu schaffen, das auf Grund seiner neuartigen Zusammensetzung in der Lage ist, geringe Mengen an Zellen mesodermalen Ursprungs, insbesondere menschlicher Fruchtwasserzellen, wie sie im Rahmen der pränatalen Diagnostik in Fruchtwasserproben anfallen, in einem für diesbezügliche zytogenetische bzw. biochemische Routineuntersuchungen vertretbaren Zeitraum (14 bzw. 28 Tage) mit einer dafür geeigneten Zellausbeute und unter Erhaltung wesentlicher biochemischer bzw. zytologischer Parameter in vitro zur Vermehrung zu bringen. Mit dem Einsatz dieses Mediums soll gleichzeitig eine Unterschreitung der sonst hier üblicherweise erforderlichen Häufigkeit des aus verschiedenen Gründen nachteiligen Mediumwechsels während der Zellkultivierung erreicht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Zellzuchtmedium mit besonderen Vorteilen für die in vitro-Vermehrung von Zellen mesodermalen Ursprungs, insbesondere menschlicher Fruchtwasserzellen im Rahmen der pränatalen Diagnostik zu schaffen, wodurch sich die herkömmliche diesbezügliche Zellkultivationstechnik verbessern läßt.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß aus frischen, unmittelbar nach der Entnahme mechanisch gereinigten und eingefrosteten Gehirnen geschlachteter Rinder in Anlehnung an das von GOSPODAROWICZ, BIALECKI und GREENBURG (J.

Biol. Chem. 253, 3736 (1978)) beschriebene Vorgehen durch Auftauen, Homogenisation und stufenweise Ammoniumsulfatfällung sowie durch Lyophilisation der die biologische Aktivität enthaltenden Fällungsstufe eine Proteinpräparation gewonnen wurde, die neben „Fibroblast Growth Factor"-Aktivität noch andere, nicht näher definierte Komponenten enthält, welche die zellwachstumsfördernde Potenz von „Fibroblast Growth Factor" im serumhaltigen Zellzuchtmedium im Sinne einer anhaltenden Wirksamkeit unterstützen.

Diese Hirnpräparation wird als gebrauchsfertige Zumischung zu üblichen Zellzuchtmedien zubereitet.

Es wird gesichert, daß der gesamte Präparationsgang unter keimfreien Bedingungen verläuft und auch bei der Zubereitung der Zumischung sterile Arbeitsbedingungen eingehalten werden. Bei der Vorbereitung der mit dem Präparat zu supplementierenden Zellzuchtmedien und bei der Zumischung des Hirntrockenpräparates sind die in der Zellzucht üblichen Entkeimungsverfahren bzw. Sterilbedingungen einzuhalten.

Die Bedeutung der Erfindung ergibt sich daraus, daß die in besonderem Maße anhaltende Förderung des zellwachstumsstimulierenden Zusammenwirkens zwischen „Fibroblast Growth Factor" und Serumfaktoren, die von natürlichen Begleitkomponenten des „Fibroblast Growth Factors" ausgeht, wie sie im beschriebenen Hirnpräparat vorliegen, erfindungsgemäß in der Weise genutzt wird, daß durch Zumischung dieses Hirnpräparates (Trockenpräparat) in einer Optimalkonzentration (ΙΟΟμ-g/ml) zu einem üblichen Zellzuchtmedium (z. B. EAGLE-Zellzuchtmedium /MEM/), das 1O⁰O (v/v) fötales Kälberserum enthält, ein neuartig zusammengesetztes Zellzuchtmedium entsteht, mit dem eine den Anforderungen der pränatalen zytogenetischen und biochemischen Diagnostik in verbesserter Weise gerecht werdende Vermehrung menschlicher Fruchtwasserzellen ermöglicht wird, wobei vor allem die sonst erforderliche Häufigkeit einer nachteiligen Mediumerneuerung unterschritten werden kann.'

Die Erfindung wird an nachfolgenden Ausführungsbeispielen erläutert:

Beispiel 1: Gewinnung des zellvermehrungsfördernden Hirnpräparates

In Anlehnung an das von GOSPODAROWICZ, BIALECKI und GREENBURG (J. Biol. Chem. 253, 3736 (1978)) beschriebene Vorgehen werden schlachtwarm entnommene Rindergehirne in eisgekühlter isotoner phosphatgepufferter Kochsalzlösung mechanisch von Blutgefäßen bzw. größeren Blutgerinseln befreit und in flüssigem Stickstoff eingefrostet. Nach Auftauen erfolgt bei pH 4,5 in einer 0,15M (NH₄)₂SO₄-Lösung eine Homogenisation der Gehirne. Nach 2stündigem Rühren und anschließender Zentrifugation (23000g, 45 Min.) wird der gewonnene Überstand mit 1 N NaOH auf pH 6,5 bis 7,0 eingestellt und einer (NH₄)₂SO₄-Fällung (1,66M) unterworfen. Nach Zentrifugation wird der nunmehr erhaltene Überstand einer weiteren (NH₄)₂SO₄-Fällung (3,56M) unterworfen. Das aus anschließender Zentrifugation resultierende Sediment wird in destilliertem Wasser aufgenommen und einer Entsalzungsdialyse gegen destilliertes Wasser unterworfen. Nach Abzentrifugation des dabei entstehenden Sediments wird der klare Zentrifugationsüberstand lyophilisiert. Alle Arbeitsgänge werden bei 4°C durchgeführt.

Die auf solche Weise gewonnene proteinhaltige Präparation besitzt neben „Fibroblast Growth Factor"-Aktivität noch andere nicht näher bekannte Komponenten, welche das zellwachstumsfördernde Zusammenwirken von „Fibroblast Growth Factor" und Serumkomponenten in einer Weise fördern, woraus sich eine bisher noch nicht bekannte lang anhaltende Effektivität dieses Zeilwachstumsfaktors („Fibroblast Growth Factor") ergibt, die im gegebenen Fall— Kultivierung von Zellen mesodermalen Ursprungs, insbesondere menschlicher Fruchtwasserzellen — eine Verringerung der sonst erforderlichen häufigeren Mediumerneuerungen während der Zellkultivierung möglich macht.

Beispiel 2: Zubereitung der Mediumzumischung bzw. des Mediums zur Kultivierung menschlicher Fruchtwasserzellen

Das nach Ausführungsbeispiel 1 gewonnene Hirn-Trockenpräparat wird in wenig destilliertem Wasser gelöst. Nach Ermittlung des Proteingehaltes dieser Lösung (Proteinbestimmungsmethode nach LOWRY) wird dieser durch weiteren Zusatz von destilliertem Wasser so eingestellt, daß eine leicht handhabbare Dosierung der zur Lyophilisierung in Ampullen vorgesehenen Proteinmenge möglich wird. Sie wird zweckmäßigerweise so bemessen, daß bei einmaliger Zumischung des Inhaltes einer Ampulle zu einer zuvor zum sofortigen Gebrauch bereiteten Standardmenge an einem zur Supplementierung vorgesehenen Zellzuchtmedium (z. B. 11, 10% (v/v) fötales Kälberserum enthaltend) die optimale Konzentration an Hirn-präparat (ΙΟΟμ,/ml) im gebrauchsfertigen Medium gewährleistet ist.

In unter Stickstoff eingeschmolzenen Ampullen bleibt bei einer Lagerung bei -20°C die biologische Aktivität bezüglich der Zellvermehrung im Hirntrockenpräparat für mindestens 2 Jahre erhalten.

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Beispiel 3: Nachweis des Einflusses des Hirnpräparates auf die Vermehrung menschlicher Fruchtwasserzellen

In einerau ch für Primärkulturen repräsentativen Versuchsanordnung werden unter Anwendung der in der Zellzüchtung üblichen Arbeitstechniken menschliche Fruchtwasserzellen der 2. bis 9. Subkultur in einer Einsaatdichte von 500 Zellen pro Petrischale (Durchmesser: 6cm) zur Vermehrung angesetzt. Das dabei verwendete Medium enthält als Basalmedium handelsübliches EAGLE- (MEM)-Zellzuchtmedium mit 0,5% (w/v) Laktalbuminhydrolysat, dem unterschiedliche Mengen an fötalem Kälberserum und dem beschriebenen Hirntrockenpräparat zugesetzt wurden. Bei einmaligem Mediumwechsel am 7.Tag nach Versuchsbeginn erfolgte am 14. Versuchstag die Auswertung der Versuchsansätze (Tabelle 1 und 2).

Tabelle 1: Die Wirksamkeit unterschiedlicher Mengen an Hirntrockenpräparat in einem aus Basalmedium +10% fötalem Kälberserum bestehenden Zellzuchtmedium auf die Kultivierung menschlicher Fruchtwasserzellen

Zusatzan Hirn- Am 14. Versuchstag ermittelte

trockenpräparat Zellzahl pro Petrischale Relative Plating

(/xg/ml) Efficiency (%)

0 33800± 29100 14,8 ±18,7

50 55 600 ± 50 000 81,0 ±14,4

100 180000± 103000 100,0±0

200 83 800+ 44 600 59,2 ± 22,2

500 112 500 ± 58 600 27,0 ±19,6

1000 — 0,75 ±1,5

Tabelle 2: Einfluß unterschiedlicher Mengen an fötalem Kälberserum in Gegenwart von Hirntrockenpräparat (Optimalkonzentration) auf die Plating Efficiency bei der Kultivierung menschlicher Fruchtwasserzellen Serumkonzentration im Konzentration an Plating Efficiency

Medium/% (v/v)/ Hirntrockenpräparat (%)

(/ig/ml)

20 0 5,1x0,9

0 100 0

5 100 6,8 ±: 1,1

10 100 9,2 + 0,7

15 100 10,4 + 0,6

20 100 11,0 + 0,9

Wie aus den Tabellen 1 und 2 hervorgeht, bestehen bezüglich der Anheftung der Zellen (Relative Plating Efficiency) als auch der Zunahme der Zellvermehrung optimale Bedingungen, wenn dem Basalmedium 10% fötales Kälberserum und 100/ag/ml an Hirntrockenpräparat zugesetzt sind. Unter diesen Bedingungen ist beispielsweise durch das Hirnpräparat eine etwa 5,4fache Erhöhung der Zellausbeute erreichbar, womit diese Methode den Anforderungen der pränatalen Diagnostik — bei gleichzeitigen Vorteilen bezüglich der Mediumwechselhäufigkeit — gerecht wird. Ohne Serumzusatz zum Medium ist die Hirnpräparation unwirksam, allerdings kann bei ihrem Einsatz die Menge an fötalem Kälberserum im Medium, die bei üblichen Methoden 20% beträgt, um 50% gesenkt werden (Tabelle 2).

Unter Zugrundelegung vergleichbarer Literaturangaben (GOS-PODAROWICZ, MORAN und OWASHI, J. Clin. Endocrinol.

Metab. 44,651 (1977)) ist die mit dem hier beschriebenen Medium erziel bare Vermehrungsrate menschlicher Fruchtwasserzellen auch der Wirkung eines Mediums — bestehend aus modifiziertem EAGLE-Medium nach DULBECCO (DME) und 20% (v/v) fötalem Kälberserum — überlegen.

Im Fruchtwasser kommen im wesentlichen drei morphologisch unterscheidbare Zelltypen (fibrobiastoide und epitheloide Zellen sowie „Fruchtwasser "-ZeI I en) vor. Wie Tabelle 3 zeigt, wirkt sich das hier beschriebene Medium positiv auf das Wachstum aller drei Zelltypen aus.

Tabelle 3: Die Wirkung von Hirnpräparatzusätzen zum Zellzuchtmedium (Basalmedium +10% fötales Kälberserum) auf die Plating Efficiency verschiedener morphologischer Zelltypen bei der Kultivierung menschlicher Fruchtwasserzellen

Zelltyp Plating Efficiency (%)

in Gegenwart von bei Abwesenheit von

Hirntrockenpräparat Hirntrockenpräparat

(100Aig/ml)

Fibroblastoider 25,5 ±1,0 16,3+1,0

Fruchtwasserzelltyp 8,4 + 0,5 3,2 ± 0,6

EpitheloiderTyp 4,4 ±0,6 0

Bei Anwendung des hier beschriebenen Mediums, d. h. unter dem Einfluß des Hirnpräparates, werden für die biochemische pränatale Diagnostik wichtige Parameter der Fruchtwasserzellen, wie z. B. die Aktivitäten der Enzyme a-Galaktosidase, ß-Galaktosidase, β-Glukoronidase und Arylsulfatase A nicht beeinflußt.

Claims

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Erfindungsansprüche:

1. Zellzuchtmedium, dadurch gekennzeichnet, daß es aus EAGLE-(MEM)-Zellzuchtmedium und 0,5% (w/v) Laktalbuminhydrolysat besteht, dem 10% (v/v) fötales Kälberserum zugesetzt sind und weiterhin ΙΟΟμ/ml eines proteinhaltigen Trockenpräparates aus Rindergehirn, gewonnen unter sterilen Arbeitsbedingungen durch

a) mechanische Entfernung größerer Blutgefäße und Blutgerinsel aus schlachtwarmen Rindergehirnen in eiskalter isotoner phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Einfrosten des Hirngewebes durch Einbringen in flüssigen Stickstoff, Auftauen und Homogenisierung in einer 0,15 M (NH₄)₂SO₄-Lösung bei pH 4,5, zweistündiges Rühren und darauf folgende Zentrifugation,

b) eine (NH₄J₂SO₄-FaIlUrIg des Zentrifugationsüberstandes bei pH 6,5 bis 7,0 und erneute Zentrifugation,

c) eine weitere (NH₄)₂SO₄-Fällung des Überstandes und weitere Zentrifugation,

d) Aufnahme des Sediments der letztgenannten Zentrifugation in destilliertem Wasser, eine Entsalzungsdialyse dieser Lösung gegen destilliertes Wasser, Abzentrifugation des dabei entstehenden Sediments und Lyophilisation des klaren Zentrifugationsüberstandes

vor der jeweiligen Anwendung unter sterilen Arbeitsbedingungen frisch zu gemischt werden.
2. Zellzuchtmedium nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Anwendung üblicher zeilzüchterischer Arbeitsmethoden geringe Mengen an Zellen mesodermalen Ursprungs bei Unterschreitung der üblicherweise erforderlichen Häufigkeit der Mediumerneuerung zur Vermehrung bringt.
3. Zellzuchtmedium nach Punkt 1 und 2 zur Anwendung in der pränatalen Diagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß es geringe Mengen an menschlichen Fruchtwasserzellen, wie sie im Rahmen der pränatalen Diagnostik in Fruchtwasserproben anfallen, in einem für die pränatale Diagnostik vertretbaren Zeitraum von 14 bis 28 Tagen bis zu einer für genetische Routineuntersuchungen ausreichenden Zellzahl — etwa 10⁴ bis 10⁶ Zellen — bei Auswirkung auf alle im Fruchtwasser vorkommenden Zelltypen ohne Beeinträchtigung wichtiger zellbiochemischer Enzymparameter sowie bei Unterschreitung der üblicherweise erforderlichen Häufigkeit der Mediumserneuerung zur Vermehrung bringt.