DD158178A3

DD158178A3 - METHOD FOR CULTURING MICROORGANISMS

Info

Publication number: DD158178A3
Application number: DD22363480A
Authority: DD
Inventors: Wolf Hadeball; Mirko Jechorek; Manfred Ringpfeil; Joerg Schneider
Original assignee: Wolf Hadeball; Mirko Jechorek; Manfred Ringpfeil; Joerg Schneider
Priority date: 1980-09-01
Filing date: 1980-09-01
Publication date: 1983-01-05

Abstract

Das Verfahren zur Kultivierung von Hefen auf Methanol betrifft das Gebiet der technischen Mikrobiologie. Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch die Zugabe landwirtschaftlicher und industrieller Abprodukte die Wachstumsgeschwindigkeit und die Ausbeute der Hefen zu erhoehen sowie die Oekonomie dieser Verfahren zu verbessern, dass die Kultivierung unter ungeschuetzten Bedingungen und ohne Zusatz von Wuchsstoffen durchgefuehrt werden kann. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass Methanol utilisierende Hefen unter Zusatz landwirtschaftlicher u. industrieller Abprodukte, vorzugsweise Melasse, Molke, Guelle, Schlempe und Sulfitablauge allein oder in Kombination derselben in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 98 Vol-% kultiviert werden. Gleichzeitig wird durch die Fermentationsbedingungen gewaehrleistet, dass die Zuechtung unter ungeschuetzten Bedingungen durchgefuehrt werden kann. Die Erfindung betrifft das Anwendungsgebiet der Zellsubstanzsynthese.The method for cultivating yeasts on methanol relates to the field of technical microbiology. The aim of the invention is to increase the growth rate and the yield of the yeasts by adding agricultural and industrial waste products and to improve the economy of these processes, that the cultivation can be carried out under unshaken conditions and without the addition of growth substances. The essence of the invention is that methanol utilizing yeasts with the addition of agricultural u. industrial waste products, preferably molasses, whey, guelle, vinasse and sulfite liquor alone or in combination thereof in a concentration range of 2 to 98% by volume are cultured. At the same time, the fermentation conditions ensure that breeding can be carried out under unprotected conditions. The invention relates to the field of application of cell substance synthesis.

Description

2 3 6 32 3 6 3

.,,-Titel . ,, - Title

Verfahren zur Kultivierung von MikroorganismenProcess for the cultivation of microorganisms

Anwendungsgebiet der Erfindung Application of the invention

Die Erfindung gehört in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweißgewinnung und Produktgewinnung, in die IPK C 12 B· Die Erfindung kann eingesetzt werden in Anlagen, in denen Futterhefe (aus Methanol) hergestellt wird·The invention belongs to the field of microbiological protein recovery and product recovery, into the IPK C 12 B. The invention can be used in plants in which feed yeast (from methanol) is produced.

Well-known technical solutions

Verfahren zur Kultivierung von Hefen auf Methanol sind in großer Zahl bekannt. Charakteristisch für diese Verfahren ist, daß Wuchsstoffe zum Fermentationsprozeß zugesetzt werden müssen und dieser unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muß· Außerdem weisen Methanol utilisierende Hefen meist relativ geringe Wachstumsgeschwindigkeiten und einen hohen spezifischen Methanolbedarf auf· So wird nach der GB - PS 1 342 744 eine Hefe der Gattung Candida mit Methanol bei einem pH-Wert von 4,0 bis 5,0 und einer Temperatur von 30 bis 40° C unter Zusatz von Hefeextrakt oder Thiamin-Hydrochlorid und Biotin kultiviert. Nach der GB - PS 1 423 642 wird eine Hefe der Art Candida alcomigas mit Methanol bei 30° C und pH = 4,7 unter sterilen Bedingungen unter Zusatz von Biotin und Thiamin-Hydrochlorid diskontinuierlich kultiviert. In verschiedenen japanischen Patentschriften (JA-PS 76 009 031, JA-PS 76 019 029, JA-PS 76 019 030, JA-PS 76 009 834, JA-PS 77 017 114) wird die diskontinuierliche Züchtung verschiedener Spezies der Gattungen Torulopsis_sPicchia, Hansenula, Saccharomyces undMethods for the cultivation of yeasts on methanol are known in large numbers. It is characteristic of these processes that growth substances must be added to the fermentation process and this must be carried out under sterile conditions. In addition, yeasts utilizing methanol usually have relatively low growth rates and a high specific methanol requirement. Thus, according to British Pat. No. 1,342,744, a yeast is produced the genus Candida with methanol at a pH of 4.0 to 5.0 and a temperature of 30 to 40 ° C with the addition of yeast extract or thiamine hydrochloride and biotin cultivated. According to British Pat. No. 1,423,642, a yeast of the species Candida alcomigas is cultured discontinuously with methanol at 30 ° C. and pH = 4.7 under sterile conditions with the addition of biotin and thiamine hydrochloride. In various Japanese patents (JA-PS 76 009 031, JA-PS 76 019 029, JA-PS 76 019 030, JA-PS 76 009 834, JA-PS 77 017 114), the discontinuous breeding of various species of the genera Torulopsis _s Picchia, Hansenula, Saccharomyces and

- 2- 223 6 34- 2- 223 6 34

Candida mit Methanol als einziger Kohlenstoffquelle unter Zusatz von Wuchsstoffen und unter sterilen Bedingungen beschrieben·Candida with methanol as sole carbon source with the addition of growth substances and described under sterile conditions.

Weiterhin ist die Kombination von zwei Hefen bekannt (DD-PS 211 271), wobei eine nicht Methanol utilisierende Hefe, die auf einem zweiten Kohlenstoffsubstrat wächst, die Wuchsstoffe für die Methanol utilisierende Hefe bildet· In allen beschriebenen Züchtungsverfahren ist außerdem die Zugabe von Nähr- und Spurensalzen für das Wachs-, 10' turn der Methanol utilisierenden Hefen notwendig·Furthermore, the combination of two yeasts is known (DD-PS 211 271), wherein a yeast which does not use methanol, which grows on a second carbon substrate, forms the growth substances for the yeast which utilizes methanol. In addition, in all the described cultivation methods the addition of nutrient and trace salts necessary for the wax, 10 'turn of the methanol utilizing yeasts ·

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Nähr- und Spurensalze und/oder die Wuchsstoffe, die für die Methanol utilisierenden Hefen essentiell sind, während der Kultivierung durch die Zugabe anderer billiger Stoffe teilweise oder vollständig zu ersetzen und gleichzeitig einen stabilen Fermentationsprozeß unter nichtsterilen Bedingungen zu gewährleisten und die Wachstumsgeschwindigkeit und Ausbeute der Methanol utilisierenden Mikroorganismen zu erhöhen.The object of the invention is to partially or completely replace the nutrient and trace salts and / or growth substances essential for the yeasts utilizing methanol during cultivation by the addition of other inexpensive substances and at the same time to maintain a stable fermentation process under nonsterile conditions ensure and increase the growth rate and yield of methanol-utilizing microorganisms.

Wesen der ErfindungEssence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, anstelle von Wuchsstoffen, Nähr- und Spurensalzen, die für das Wachstum Methanol utilisierender Hefen essentiell sind, billige Abprodukte der Industrie und Landwirtschaft, die diese Wuchsstoffe, Nähr- und Spurensalze enthalten, zu verwenden· Gleichzeitig soll der Fermentationsprozeß so gestaltet werden, daß bei der Fermentation von Methanol mittels Hefen bei Zusatz dieser Abprodukte ein Wachstumsvorteil der Hefen gegenüber unerwünschten Infektionen besteht.The invention is based on the object, instead of growth substances, nutrient and trace salts, which are essential for the growth methanol yeast utilization, cheap waste products of industry and agriculture, which contain these growth factors, nutrient and trace salts to use · At the same time the fermentation process be designed so that in the fermentation of methanol by yeasts with the addition of these waste products, a growth advantage of yeasts against unwanted infections.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur Züchtung von Methanol utilisierenden Hefen wäßrige landwirtschaftliche Abprodukte gegeben werden, die utilisierbare Kohlenstoffverbindungen, Wuchsstoffe sowie Nähr- und Spurensalze enthalten. Zu den landwirtschaftlichen Abprodukten, die das Wachstum und die Ausbeute der MethanolAccording to the invention, this object is achieved in that for the cultivation of methanol utilisierenden yeasts aqueous agricultural waste products are given, the utilizable carbon compounds, growth substances and nutrient and trace salts. To the agricultural waste products, the growth and the yield of methanol

-3- 2236 34-3- 2236 34

utilisierenden Hefen erhöhen, gehören Melasse, Molke, Gülle, Sulfitablauge und Schlempe (Melasse-, Getreide-, Mais- und Kartoffelschlempe)· Durch die Anwesenheit utilisierbarer Kohlenstoffverbindungen und der Wuchsstoffe wird die WachstumsgeBchv/indigkeit der Methanol utilisierenden Hefen in Abhängigkeit von der Menge des Abproduktes bis zu 70 % und die Ausbeute an Biomasse bis zu 30 % erhöht. Ein Zusatz von Wirk- und Wuchsstoffen, die für das Hefewachstum notwendig sind, ist dabei nicht erforderlich. Der An-10-' teil der Abprodukte im Fermentationsmedium beträgt zwischen 2 und 98 Volumen-Prozent* Darüber hinaus wurde überraschen-j der Weise gefunden, daß im ungeschützten Fermentationsprozeß praktisch keine Infektionen von Bakterien auftreten.molasses, whey, manure, sulphite waste liquor and stillage (molasses, cereal, corn and potato vinasse). The presence of utilisable carbon compounds and growth substances increases the growth potential of methanol-utilizing yeasts, depending on the amount of Abproduktes increased up to 70 % and the yield of biomass up to 30%. An addition of active substances and growth substances, which are necessary for yeast growth, is not required. The An-10 'part of the waste products in the fermentation medium is between 2 and 98 percent by volume * In addition, it was found surprising that practically no infection of bacteria occur in the unprotected fermentation process.

Als Methanol utilisierende Hefen eignen sich die Gattungen* Candida, Torulopsis, Hansenula, Saccharomyces, Picchia und ^ KlöckeraAs methanol utilisierende yeasts genera * Candida, Torulopsis, Hansenula, Saccharomyces, Picchia and ^ are Kloeckera

Nachfolgende Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern: The following examples are intended to explain the invention in more detail:

example 1

a) Der Methanol utilisierende Hefeßtarmn Hansenula polymorpha sp» wurde im ungeschützten kontinuierlichen Prozeß unter folgenden Bedingungen kultiviert:a) The yeast yeast Hansenula polymorpha sp ", which utilizes methanol, was cultivated in the unprotected continuous process under the following conditions:

Temperatur: 40° CTemperature: 40 ° C

pH-Wert: 3,4pH value: 3.4

In 1 1 Getreideschlempe wurden 40 ml CH^OH gelöst.In 1 1 grain dregs 40 ml of CH ^ OH were dissolved.

Die Fermentation erfolgte in einem 12 1-Rührfermentor. Der Stickstoff wurde über die pH-Regelung als Ammoniak zugeführt; eine Zugabe weiterer essentieller Elemente war nicht erforderlich. Die Restkonzentration an Methanol im Fermentor betrug weniger als 1,0 g/l. Als Ergebnis wurde eine spezifische Wachstumsrate von 0,168 h und eine Biomassekonzentration von 14,5 g/l erzielt. Das entspricht einem spezifischen Methanolverbrauch von 2,20 g CH^OH/g TS oder einer Biomasseausbeute von 45 %· Der Anteil von Bakterien im Fermentor war äußerst gering; auf ca. 50 Hefezellen wurde eine Bakterienzelle beobachtet.The fermentation took place in a 12 l stirred fermentor. The nitrogen was fed via the pH control as ammonia; an addition of other essential elements was not required. The residual concentration of methanol in the fermentor was less than 1.0 g / l. As a result, a specific growth rate of 0.168 hours and a biomass concentration of 14.5 g / L were achieved. This corresponds to a specific methanol consumption of 2.20 g CH.OH / g TS or a biomass yield of 45 %. The proportion of bacteria in the fermentor was extremely low; on about 50 yeast cells, a bacterial cell was observed.

-4 - 2 23 6 34-4 - 2 23 6 34

b) Wird hingegen der Hefestamm Hansenula polymorpha sp. unter Verwendung von 0,5 g Hefeextrakt/l und der für diesen Stamm essentiellen Nähr- und Spuren salze anstelle der Getreide schlempe kultiviert, so werden maximal 5 erreicht:b) If, however, the yeast strain Hansenula polymorpha sp. cultured using 0.5 g of yeast extract / l and the nutrient and trace salts essential for this strain instead of the grain flock, a maximum of 5 are achieved:

Spezifische Wachstumsrate: 0,114 h Hefekonzentration: 11 g/l Spezifischer Methanolverbrauch: 3,2 g Methanol/g HTSSpecific growth rate: 0.114 h Yeast concentration: 11 g / l Specific methanol consumption: 3.2 g methanol / g HTS

10 c) Unter gleichen Bedingungen wie b), jedoch ohne Zusatz von Hefeextrakt findet kein Wachstum statt·10 c) Growth does not take place under the same conditions as b) but without the addition of yeast extract.

Example 2

Der Methanol utilisierende Hefestamm Hansenula polymorpha sp« wurde im kontinuierlichen Irozeß unter folgenden Be-15 dingungen kultiviert:The yeast strain Hansenula polymorpha sp ", which utilizes methanol, was cultured in a continuous process under the following conditions:

Temperatur: 40° CTemperature: 40 ° C

pH-Wert: 3,4pH value: 3.4

Die Nährlösung enthält pro 11:The nutrient solution contains per 11:

K₂SO₄ K ₂ SO ₄ HgOHgO 30003000 mgmg MgSO₄ _MgSO4 HgOHgO 10001000 mgmg H₃PO₄ H ₃ PO ₄ HgOHgO 44 mlml ZnSO₄ , 7ZnSO ₄ , 7 HgOHgO 7575 mgmg PeSO₄ ♦ 7PeSO ₄ ♦ 7 2 HgO2 HgO 175175 mgmg CuSO₄ , 5CuSO ₄ , 5 7 H₂O7H ₂ O 2525 mgmg MnSO₄ . 5MnSO ₄ . 5 6060 mgmg ITa₂MoO₄ ·ITa ₂ MoO ₄ · 2020 mgmg CoSO₄ CoSO ₄ 2323 mgmg H₃BO₃ H ₃ BO ₃ Ge tre ide schlempeGe se ide fête 5050 mgmg NaClNaCl 200200 mgmg Methanolmethanol 4040 mlml 150150 mlml

- 5 - 223 6 34- 5 - 223 6 34

Die pH-Regelung erfolgte mit 5 %iger NH,OH-Lb'sung· Die Fermentation wurde in einem 12 1-Rührfermentor durchgeführt· Die Restkonzentration an Methanol im Permentor betrug weniger als 1,0 g/l. Es wurden folgende Ergebnisse erreicht:The pH was controlled with 5% NH, OH solution. The fermentation was carried out in a 12 l stirred fermentor. The residual concentration of methanol in the per-mentor was less than 1.0 g / l. The following results were achieved:

Spezifische Wachstumsrate » 0,127 h"** Hefekonzentration « 13 g/lSpecific growth rate »0.127 h ** ** Yeast concentration« 13 g / l

Das entspricht einem spezifischen Methanolverbrauch von 2,50 g CHoOH/g HTS oder einer Ausbeute von 40 %,This corresponds to a specific methanol consumption of 2.50 g CHoOH / g HTS or a yield of 40%,

Example 3

Der Methanol utilisierende Hefestamm Hansenula polymorpha sp» wurde im kontinuierlichen Prozeß unter folgenden Bedingungen kultiviert:The yeast strain Hansenula polymorpha sp », which utilizes methanol, was cultivated in a continuous process under the following conditions:

Temperatur: 40° CTemperature: 40 ° C

pH-Wert: 3,4pH value: 3.4

In 1 1 Sulfitablauge wurden 40 ml CH₃OH gelöst. Die Fermentation erfolgte in einem 12 1-Rührfermentor. Die pH-Regelung erfolgte mit Ammoniak. Die essentiellen Kahr- und Spurensalze für das Biomassewachstum wurden in gleichen Mengenverhältnissen wie im Beispiel 2 zugegeben. Die Restkonzentration an Methanol im Fermentor betrug weniger als 0,5 g/l.In 1 1 sulfite liquor 40 ml of CH ₃ OH were dissolved. The fermentation took place in a 12 l stirred fermentor. The pH control was carried out with ammonia. The essential Kahr- and trace salts for biomass growth were added in equal proportions as in Example 2. The residual concentration of methanol in the fermentor was less than 0.5 g / l.

Es wurden folgende Ergebnisse erreicht:The following results were achieved:

Spezifische Wachstumsrate: 0,157 h""¹ Hefekonzentration: 14 g/lSpecific growth rate: 0.157 h "" ¹ Yeast concentration: 14 g / l

Spezifischer Methanolverbrauch: 2,3 g Methanol/Specific methanol consumption: 2.3 g methanol /

g HTSg HTS

Example 4

a) Der Methanol utilisierende Hefestaram Pichia ambrosiae MH 26 ZIMET H 43667 wurde im kontinuierlichen Erozeß unter folgenden Bedingungen kultiviert:a) The yeast yeast Pichia ambrosiae MH 26 ZIMET H 43667, which utilizes methanol, was cultivated in the continuous process under the following conditions:

. Temperatur: 40° C, Temperature: 40 ° C

pH-Wert: 4,2pH value: 4.2

In 1 1 Getreide schlempe wurden 40 ml CH-OH gelöst. Die Fermentation erfolgte in einem 12 1-Rührfermentor. Der Stickstoff wurde über die pH-Regelung als Ammoniak zugeführt; eine Zugabe weiterer essentieller Elemente oder Wuchsstoffe war nicht erforderlich· Die Restkonzentration an Methanol im Permentor betrug zwischen 0 und 0,5 g/l· Als Ergebnis wurde eine spezifische Wachstumsrate von 0,270 h und eine Biomassekonzentration von - 19,6 g/l erzielt· Das entspricht einem spezifischen Methanolverbrauch von 2,2 g CH~0H/g HTS oder einer Biomasseausbeute von 45,5 %· In 1 1 cereal Schlempe 40 ml of CH-OH were dissolved. The fermentation took place in a 12 l stirred fermentor. The nitrogen was fed via the pH control as ammonia; Addition of further essential elements or growth substances was not required. The residual concentration of methanol in the per-mentor was between 0 and 0.5 g / l. As a result, a specific growth rate of 0.270 h and a biomass concentration of-19.6 g / l were achieved. This corresponds to a specific methanol consumption of 2.2 g CH.sub.0OH / g HTS or a biomass yield of 45.5 %.

b) Wird hingegen der Hefestamm Pichia ambrosiae MH 26 ZIMET H 43667 unter Verwendung der im Beispiel 2 aufgeführten Fährlösung und einer Zugabe von 0,5 g Hefeextrakt/l zu dieser nährlösung kultiviert, so werden erreicht:b) If, on the other hand, the yeast strain Pichia ambrosiae MH 26 ZIMET H 43667 is cultivated using the nutrient solution listed in Example 2 and an addition of 0.5 g of yeast extract / l to this nutrient solution, the following are achieved:

Spezifische Wachstumsrate: 0,250 h Hefekonzentration: 15 g HTS/1Specific growth rate: 0.250 h Yeast concentration: 15 g HTS / 1

Spezifischer Methanolverbrauch: 2,6 g CH-OH/Specific methanol consumption: 2.6 g CH-OH /

g HTSg HTS

Claims

2 3 6 3

invention claim

1 _# Process for the cultivation of a methylotrophic yeast 'on methanol, characterized in that agricultural and / or industrial waste products containing essential agents, Fähr- and trace salts and utilizable carbon and energy sources, preferably molasses, whey, manure, stillage and sulfite liquor alone or in combination thereof, in a concentration range of 2 to 98% by volume, to be added in the fermentation *