DD156714A1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF THERMITASE - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung einer thermophilen Protease aus Thermoactinomyces vulgaris. Thermitase wird eingesetzt zur Klebererweichung bei der Naehrmittel-, Waffel- und Backwarenherstellung, der Gewinnung von Protein-Partialhydrolysaten und anderen Prozessen. Das Verfahren besteht darin, dass man zur Vorkultivierung eine eingesetzte mit Sauerstoff gesaettigte Naehrloesung mit Sporen beimpft und die Auskeimung im hermetisch verschlossenen Gefaess bei Absinken des Sauerstoffpartialdruckes auf 20 bis 40 % des Sauerstoffpartialdruckes bei Saettigung vornimmt den gewuenschten Sauerstoffpartialdruck aufrecht erhaelt,die Vorkultur danach in einen Fermentor mit dem Produktionsmedium ueberfuehrt und die Fermentation durchfuehrt, wobei man dabei weitere Mengen von Naehrstoffen zufuehrt.The invention relates to the preparation of a thermophilic protease from Thermoactinomyces vulgaris. Thermitase is used for the softening of adhesives, wafers and bakery products, the production of protein partial hydrolysates and other processes. The procedure consists in that one pre-cultivates a used oxygen-saturated nutrient solution with spores and the germination in the hermetically sealed vessel with decreasing the oxygen partial pressure to 20 to 40% of the oxygen partial pressure at Saettigung makes the desired oxygen partial pressure maintained, the preculture thereafter in one Fermentor is transferred to the production medium and the fermentation is carried out, adding further quantities of nutrients.
Description
Erfinder: Dieter KörnerInventor: Dieter Körner
Dr» Sigrid Kretschmer Dr. Hans-Egon Jacob Dr. Peter Klingenberg Ingeborg von Lupin Dr. Günther Strohbach Prof. Dr. Heinz RuttloffDr. Sigrid Kretschmer Hans-Egon Jacob Peter Klingenberg Ingeborg by Lupine dr. Günther Strohbach Heinz Ruttloff
Verfahren zur Herstellung von Thermitase Anwendungsgebiet der Erfindung Methods for the Production of Thermitase Field of the Invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer thermophilen Protease aus Thermoactinomyces vulgaris mit speziellen Eigenschaften zur partiellen Hydrolyse von tierischen und pflanzlichen Proteinen. Das entstehende Enzym Thermitase ist geeignet, als Rohpräparat oder in teilgereinigter Form bei verschiedenen Prozessen in der Lebensmittelindustrie sowie hochgereinigt als Biofeinehemikalie eingesetzt zu werden. Applikationsgebiete sind die Klebererweichung bei der Nährmittel-, Waffel- und Back-The invention relates to a process for the preparation of a thermophilic protease from Thermoactinomyces vulgaris with special properties for the partial hydrolysis of animal and vegetable proteins. The resulting enzyme thermitase is suitable to be used as a crude preparation or in partially purified form in various processes in the food industry as well as highly purified as a biofine chemical. Areas of application are the adhesive softening of the food, waffle and baking
Φ Φ
Warenherstellung, die Gewinnung von Protein-Partialhydro-Iysäten für bestimmte Zielgruppen, zum Beispiel für diätetische Zwecke bzw. für die Ernährung von Kranken und Rekonvaleszenten. Das Verfahren zur Herstellung von Thermitase ist für die großtechnische Produktion des Enzyms in Rührfermentoren geeignet.Production of goods, the production of protein partial hydrolyzates for specific target groups, for example for dietary purposes or for the nutrition of patients and convalescents. The process for the production of thermitase is suitable for the large-scale production of the enzyme in stirred fermentors.
Charakterist^kde^Charakterist ^ ^ kde
Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen, z. B. solche der Gattung Aspergillus, Bacillus und Streptomyces, unter den jeweils erforderlichen Kulturbedingungen Proteasen produzieren, die sich hinsichtlich ihrer Eigenschaften voneinander unterscheiden» Für verschiedene Anwendungszwecke ist es vorteilhaft, wenn die Aktivität des Enzyms auch oder aber vorrangig bei höherer Temperatur wirksam ist. Es ist weiter bekannt, daß durch die Kultivierung von Thermoactinomyces vulgaris auf geeigneten Nährsubstraten eine thermophile Protease erzeugt werden kann, deren Temperaturoptimum bei 60 - 70 C liegt und die eine weitgehend unspezifische und damit tiefgreifende Spaltung tierischer und pflanzlicher Proteine bewirkt.It is known that numerous microorganisms, eg. As those of the genus Aspergillus, Bacillus and Streptomyces, under the respectively required culture conditions produce proteases which differ in their properties from each other »For various applications, it is advantageous if the activity of the enzyme is also or primarily at higher temperature is effective. It is further known that the cultivation of Thermoactinomyces vulgaris on suitable nutrient substrates, a thermophilic protease can be produced, the optimum temperature is 60-70 C and causes a largely nonspecific and thus profound cleavage of animal and vegetable proteins.
Der bekannte Stamm zur Herstellung von Thermitase von der Art Thermoactinomyces vulgaris sowie eine Mutante desselben sind in der Zentralen Statnmsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter BIET 9512 und IFiET 9515 hinterlegt. Die Charakteristik des Stammes und seine Kultivierung zum Zweck der submerseη Gewinnung von Thermitase sind im WP 112 662 beschrieben« In einem Zusatzpatent WP 117 083 ist das Verfahren in der Weise verbessert worden, daß Zusätze von Rapsöl, Trockenhefe und Essigsäure zu Nährmedium zu einer Erhöhung der Enzymausbeute führen»The known strain for the production of thermitase of the species Thermoactinomyces vulgaris and a mutant thereof are deposited in the Central Statnm Collection of the GDR in the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy in Jena under BIET 9512 and IFiET 9515. The characteristics of the strain and its cultivation for the purpose of submerseη recovery of thermitase are described in WP 112 662. "In a supplementary patent WP 117 083, the process has been improved in such a way that additions of rapeseed oil, dry yeast and acetic acid to nutrient medium to increase the Enzyme yield lead »
Die Reproduzierbarkeit der bekannten Verfahren ist jedoch unbefriedigend, da die Auskeimung der als Inoculum verwendeten Mikroorganismensporen in der verwendeten Vorkultur (Schüttelkultur) stark von den hydrodynamischen Bedingungen abhängt und bezüglich der Keimungsrate differiert. Dadurch treten im Produktionsmedium häufig Wachstumsverzögerungen auf, die von ungenügender Produktbildung und einer Vergrößerung der Infektionsgefahr begleitet sind*However, the reproducibility of the known methods is unsatisfactory, since the germination of the microorganism spores used as inoculum in the preculture used (shaking culture) strongly depends on the hydrodynamic conditions and differs with respect to the germination rate. This often leads to growth delays in the production medium, which are accompanied by insufficient product formation and an increase in the risk of infection *
Es ist bekannt, daß das unterschiedliche Verhalten bei der,It is known that the different behavior in the,
Sporenkeimung durch die Abhängigkeit des Vorganges vom COo-Gehalt im Kulturmedium hervorgerufen wird. Wie Kretschmer und Jacob (" Carbon dioxide requirement for outgrowth of Thermoactinomyces vulgaris spores" in Modarski, M., W. Kurylowicz and J. Jeljaszewicz (Hrsg.) "Nocardia and Streptomyces", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart - New York, 1978) fanden, erfolgt das Auswachsen der Keimschläuche nur in Anwesenheit von COp, das sich jedoch v/egen der erforderlichen Belüftung der Kulturen nur sporadisch in erforderlicher Konzentration anreichern kann. Auch unter Verwendung der im WP 11? 083 genannten Zusätze zum Kulturmedium ist die Enzymausbeute mit 6 TE/ml Kulturmedium aus ökonomischer, Sicht hinsichtlich Herstellung und Applikation noch zu niedrig. Die Aktivitätsangabe erfolgt in Tyrosin-Einheiten (TE), wobei gemäß TGL 29 166/02 1 TE derjenigen Enzymmenge entspricht, die aus einer 0,625 %igen Caseinlösung bei pH 8,0 und 55 C so viel in 4 %iger Trichloressigsäurelösung lösliche Caseinbruchstücke je 1 min freisetzt, welche der Absorption (274nm) von 1 uMol Tyrosin entsprechen.Spore germination is caused by the dependence of the process on the COo content in the culture medium. As Kretschmer and Jacob ("Carbon dioxide requirement for outgrowth of Thermoactinomyces vulgaris spores" in Modarski, M., W. Kurylowicz and J. Jeljaszewicz (ed.) "Nocardia and Streptomyces", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart - New York, 1978) found outgrowth of the germ tubes takes place only in the presence of COp, which, however, can only occasionally accumulate the required aeration of the cultures in the required concentration. Also using the WP 11? 083 mentioned additions to the culture medium is the enzyme yield with 6 TE / ml culture medium from an economic point of view, with regard to preparation and application still too low. The activity is reported in tyrosine units (TE), according to TGL 29 166/02 1 TE corresponds to that amount of enzyme which consists of a 0.625% casein solution at pH 8.0 and 55 C as much in 4% trichloroacetic acid solution Caseinbruchstücke each 1 min corresponding to the absorbance (274nm) of 1 μM tyrosine.
Ziel der Erfindung ist es, die genannten Nachteile der bekannten Verfahren durch eine reproduzierbare Keimung sowie durch rasches und.kräftiges Wachstum des Organismus zu vermeiden, um damit zugleich eine Steigerung der Proteaseausbeute herbeizuführen, und einen großtechnisch sicher ; beherrschbaren Fermentationsprozeß zu gewährleisten, so .daß unter,., industriellen Bedingungen die Ökonomie'des Verfahrens verbessert wird»The aim of the invention is to avoid the disadvantages of the known methods by a reproducible germination and by rapid and.kräftiges growth of the organism, in order at the same time to bring about an increase in the protease yield, and a large-scale safe; to ensure a controllable fermentation process so that, under 'industrial conditions, the economics' of the process are improved »
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Thermitäse zu entwickeln, das ein reproduzierbares Wachstum des Mikroorganismus mit vergrößer-The invention has for its object to develop a process for the preparation of thermitia, which reproducible growth of the microorganism with enlargement
ten Biomasseausbeuten sowie hoher Enzymsynthese leistung gewährleistet«biomass yields and high enzyme synthesis performance «
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Thermitase durch Anzucht, Vorkultivierung und Kultivierung von Mikroorganismen des. Stammes Thermoactinomyces vulgaris und/oder seiner Mutante - hinterlegt in der zentralen StammSammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter IMET 9512 und für die Mutante IMET 95^5 - wird in der Weise vorgegangen, daß man zur Vorkultivierung eine eingesetzte mit Sauerstoff gesättigte Nährlösung mit Sporen beimpft und die Auskeimung im hermetisch verschlossenen Gefäß bei Absinken des Sauerstoffpartialdruckes auf 20 bis 40 % des Sauerstoffpartialdruckes bei Sättigung, vorzugsweise auf 30 %, vornimmt, den gewünschten Sauerstoffpartialdruck bis zur vollständigen Auskeimung der Sporen durch Einleiten von Luft aufrecht erhält, die Vorkultur danach in einen Fermentor mit dem Produktionsmedium überführt und die Fermentation durchführt, wobei man ?rä.hrend der Fermentation weitere Mengen von Nährstoffen zuführt.According to the inventive method for the production of thermitase by cultivation, precultivation and cultivation of microorganisms of the strain Thermoactinomyces vulgaris and / or its mutant - deposited in the central strain collection of the GDR Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy in Jena under IMET 9512 and for the mutant IMET 95 ^ 5 - is proceeded in such a way that one uses for pre-cultivation an oxygen-saturated nutrient solution with spores and the germination in a hermetically sealed vessel when the oxygen partial pressure drops to 20 to 40% of the oxygen partial pressure at saturation, preferably to 30%, maintains the desired oxygen partial pressure until complete sprouting of the spores is maintained by introducing air, the preculture is subsequently transferred to a fermenter with the production medium and the fermentation is carried out, during which further amounts of vo are obtained during the fermentation n nutrients.
Als Produktionsmedium werden vorzugsweise Maisstärke, Maisquellwasser, Tr'ockenhefe, Magermilchpulver, Natriumchlorid und Kalziumchlorid eingesetzt« Vorteilhaft ist es, wenn man Stärkehydrolysat und/oder Maisquellwasserhydrolysat verwendet. Für die Vorkultivierung } d. tu die vollständige Auskeimung, ist es sehr effektiv, den nach dem Absinken erreichten Sauerstoffpartialdruck im Vorkulturgefäß 2 bis 4 h, vorzugsweise 2 h, beizubehalten. Für die eigentliche Produktion hat es sich als sehr zweckmäßig erwiesen, daß man während der Fermentation Maisstärke oder Stärkehydrolysate und/G'der Maisquellwasser oder Maisquellwasserhydrolysate in einer solchen Menge zuführt, die dem Doppelten bis 1,5fachen der Menge des Ausgangsnährmediums entspricht« Die Nährstoffe können dabei kontinuierlich oder in Etappen zugeführt werden, wobei man 2 bis 6 h, vorzugsweise 2 h, nach Überführung der Vorkul- .As a production medium, corn starch, corn steep liquor, Tr'ockenhefe, skimmed milk powder, sodium chloride and calcium chloride are preferably used «It is advantageous when using starch hydrolyzate and / or corn steep water hydrolyzate. For pre-cultivation } d. In the case of complete germination, it is very effective to maintain the partial pressure of oxygen after submergence in the pre-culture vessel for 2 to 4 hours, preferably 2 hours. For the actual production, it has been found to be very useful during the fermentation to add corn starch or starch hydrolysates and / or corn steep liquor or corn steep liquor hydrolysates in an amount equal to twice to 1.5 times the amount of the starting nutrient medium be supplied continuously or in stages, with 2 to 6 h, preferably 2 h, after transfer of Vorul-.
tür in den lermentor beginnt. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß die Keimung der als Inoculum verwendeten Sporen reproduzierbar und zu 100 % in einem hermetisch abgeschlossenen Kulturgefäß unter Ausschaltung von Begasungseinflüssen erfolgt.door into the lermentor begins. The invention is based on the finding that the germination of the spores used as inoculum occurs reproducibly and 100% in a hermetically sealed culture vessel with the elimination of fumigation.
Im einzelnen geht man zweckmäßigerweise so vor, daß je nach benötigter Inoculummenge ein Rührgefäß, vorzugsweise ein Glaskolben mit Magnetrührer oder ein Rührfermentor, mit Nährlösung befüllt und sterilisiert wird. Das Gefäß ist mit einer Sonde zur Messung des Sauerstoffpartialdruckes sowie mit einer Regulierung für die Zugabe von Luft ausgestattet. Vor der Beimpfung mit Sporen, vorzugsweise mit 10 - 10 Sporen/ml Nährlösung, wird die Nährlösung durch Einleiten von Luft mit Sauerstoff gesättigt. Nach der Beimpfung wird das Gefäß hermetisch verschlossen. Die eingeimpften Sporen beginnen sofort zu atmen und produzieren dabei C0?, das sich infolge des fehlenden Gasaustausches mit der Umgebung in der Nährlösung anreichert. Innerhalb von 30 - 60 min wachsen dabei die Keimschläuche aus und es schließt sich unmittelbar die logarithmische Entwicklungsphase an. Um Oo-Limitation zu vermeiden und die Anpassung der "Vorkultur an die nachfolgende belüftete Fermentationsstufe zu -gewährleisten, ist es erforderlich, den Sauerstoffpartialdruck nach Erreichen von 20 bis 40 % des Sauerstoffpartialdruckes bei Sättigung (Anfangswert), vorzugsweise von 30 %, bis zu einer Zeit von 2 h bis 4 h auf diesem Niveau zu halten. Nach etwa 2 h bis 4 h sind die Sporen 100 %ig ausgekeimt und weisen bereits lange, teilweise verzweigte Keimschläuche auf, so daß die Vorkultür in das Produktionsmedium überführt werden kann.In detail, it is expedient to proceed so that, depending on the required amount of inoculum, a stirred vessel, preferably a glass flask with magnetic stirrer or a stirring fermentor, is filled with nutrient solution and sterilized. The vessel is equipped with a probe for measuring the oxygen partial pressure and with a regulation for the addition of air. Before inoculation with spores, preferably with 10-10 spores / ml of nutrient solution, the nutrient solution is saturated with oxygen by introducing air. After inoculation, the vessel is hermetically sealed. The inoculated spores start to breathe immediately, producing C0 ? , which accumulates due to the lack of gas exchange with the environment in the nutrient solution. Within 30 - 60 min, the germ tubes grow out and immediately follow the logarithmic development phase. In order to avoid Oo limitation and to ensure the adaptation of the preculture to the subsequent aerated fermentation stage, it is necessary to increase the oxygen partial pressure after reaching 20 to 40% of the partial pressure of oxygen at saturation (initial value), preferably 30%, to one After 2 h to 4 h, the spores are 100% germinated and already have long, partially branched germ tubes, so that the preculture can be transferred into the production medium.
Es hat sich gezeigt, daß diese Methode der Yorkulturführung wesentlich für eine hohe Reproduzierbarkeit ist und daß im Fermentor ein Wachstums- und Enzymbildungsprozeß einheitlich und äußerst effektiv abläuft.It has been found that this method of Yorkulturführung is essential for high reproducibility and that in the fermentor, a growth and enzyme formation process is uniform and extremely effective.
Die Messung des Sauerstoffpartialdruckes während der Kei-The measurement of the oxygen partial pressure during the
mung gestattet Aussagen über den Verlauf dieses Vorganges und dient somit einer sicheren Kontrolle (Fig. 1 zeigt die Keimbildungsrate in Abhängigkeit vom.Sauerstoffpar™ tialdruck). Die Nährlösung für die Durchführung der Keimung enthält Maisstärke oder Stärkehydrolysate, Maisquellwasser oder daraus hergestellte Hydrolysate, RaCl sowie GaClp« Vorteilhaft ist eine Zusammensetzung aus Stärkehydrolysat, Maisquellwasserhydrolysat, NaCl und CaCIp, da es keine unlöslichen Bestandteile enthält und somit eine exakte mikroskopische Kontrolle des Keimungsablaufes ge-' stattet«; .It permits statements about the course of this process and thus serves as a safe control (FIG. 1 shows the nucleation rate as a function of the oxygen partial pressure). The nutrient solution for carrying out the germination contains corn starch or starch hydrolysates, corn steep liquor or hydrolyzates, RaCl and GaClp. "A composition of starch hydrolyzate, corn steep liquor hydrolyzate, NaCl and CaClp is advantageous, since it contains no insoluble constituents and thus an exact microscopic control of the germination process - 'equips'; ,
Die Enzymausbeute bei der Herstellung von Thermitase wird entscheidend durch den Wachstumsprozeß, d. h. durch die Menge an gebildeter Biomasse sowie durch die stoffwechselphysiologischen Verhältnisse im Stadium der Enzymsynthese bestimmt. So wird bei dem Verfahren gemäß WP 117 083 eine Enzymaktivität von 6 TE je ml Kulturmedium infolge Limitation der. C- und IT-Quellen nicht überschritten, da nach 3 bis 6 h Fermentationsdauer die für Wachstum und Enzymbildung erforderliche Konzentration dieser Substanzen nicht mehr gegeben ist» Insbesondere gerät die Proteinquelle in Limitation bzw. einzelne Komponenten derselben (Aminosäuren). Durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß mit einer Erhöhung der Nährstoffkonzentration zu Beginn der Fermentation keine Verbesserung erzielbar ist, weil in diesem Fall das Wachstum 3 bis.4 h lang gehemmt ist und damit die Infektionsgefahr wieder ansteigt..The enzyme yield in the production of thermitase becomes crucial through the growth process, i. H. determined by the amount of biomass formed and by the metabolic physiological conditions in the stage of enzyme synthesis. Thus, in the method according to WP 117 083 an enzyme activity of 6 TE per ml of culture medium due to Limitation the. C and IT sources are not exceeded, since the concentration of these substances required for growth and enzyme formation is no longer present after 3 to 6 hours of fermentation. In particular, the protein source is limited or individual components thereof (amino acids). Investigations have shown that with an increase in the nutrient concentration at the beginning of the fermentation no improvement can be achieved, because in this case, the growth is inhibited for 3 to 4 h and thus increase the risk of infection again.
Erfindungsgemäß ist die Aufhebung dieser Nährstofflimitation bei gleichzeitiger Vermeidung von Repressionen des Wachstums aber möglich, wenn die erforderlichen Nährstoffe während der Fermentation zugeführt werden. Dabei ist es notwendig, im angeführten Umfang die C-Quelle zu ergänzen und im angepaßten Verhältnis dazu auch die Proteinkomponente» Der C~Spiegel dient der Aufrechterhaltung des Energiehaushaltes und dem Zellaufbau, während eine definierte N-Konzentration die Enzymsynthese begünstigtAccording to the invention, it is possible to remove this nutrient limitation while at the same time avoiding repressions of the growth if the required nutrients are supplied during the fermentation. It is necessary to supplement in the scope cited the source of C and in an adjusted proportion to the protein component »The C ~ mirror serves to maintain the energy balance and the cell structure, while a defined N concentration favors the enzyme synthesis
und langer aufrechterhält.and keeps up longer.
Es wurde weiter gefunden, daß die Zugabe der Nährstoffe in kontinuierlicher Weise in der logarithmischen Wachstumsphase, vorzugsweise ab 2.Fermentationsstunde, erfolgen kann. Jedoch bewirkt eine impulsförmige Zudosierung im Abstand von 2 h, vorzugsweise beginnend mit der 2. Fermentationsstunde , einen gleich guten Effekt.It has also been found that the addition of the nutrients in a continuous manner in the logarithmic growth phase, preferably from 2.Fermentationsstunde done. However, a pulse-shaped addition at an interval of 2 h, preferably starting with the second fermentation hour, causes an equally good effect.
Als für die Grundzusammensetzung von Nährlösung und Produktionsmedium günstig haben sich Maisstärke oder Stärkehydrolysate, Maisquellwasser oder daraus hergestellte Hydrolysate, Hefeextrakt oder Trockenhefe, NaCl und CaCIp erwiesen. Eine Zugabe von Phosphaten zur Erhöhung der Pufferwirkung während der Sterilisation ist vorteilhaft. Rapsöl sowie Essigsäure sind im allgemeinen nicht erforderlich. Als Entschäumer können handelsübliche Silikonöle oder Pflanzenöle (z. B. auch Rapsöl) verwendet werden (0,1 %). Als Zusatznährstoffe für das Produktionsmedium werden hauptsächlich Maisstärke, Stärkehydrolysate und Maisquellwasser eingesetzt. Die Menge der zusätzlich verabreichten Nährstoffe muß - wie bereits ausgeführt - bis zum Ende der Fermentation das Doppelte bis T,5fache der Ausgangskonzentration erreichen. Es zeigt sich, daß nach diesem Vorgehen die Biomassekonzentration gegenüber dem Verfahren des WP 117 083 erheblich ansteigt. Die Enzymsynthese wird deutlich erhöht.und erreicht z. B. bei einer Fermentationsdauer von 16 bis 24 h Werte von 10 bis 12 TE/ml Nährlösung gegenüber 6 TE/ml entsprechend dem Stand der Technik.Corn starch or starch hydrolysates, corn steep liquor or hydrolyzates prepared therefrom, yeast extract or dry yeast, NaCl and CaClp have proved to be favorable for the basic composition of nutrient solution and production medium. Addition of phosphates to increase the buffering effect during sterilization is advantageous. Rapeseed oil and acetic acid are generally not required. Commercially available silicone oils or vegetable oils (eg rapeseed oil) can be used as defoamers (0.1%). As additional nutrients for the production medium mainly corn starch, starch hydrolysates and corn steep liquor are used. The amount of additionally administered nutrients must - as already stated - reach twice to T, 5 times the initial concentration by the end of the fermentation. It turns out that after this procedure, the biomass concentration compared to the method of WP 117 083 increases significantly. The enzyme synthesis is significantly increased. B. at a fermentation time of 16 to 24 h values of 10 to 12 TE / ml nutrient solution compared to 6 TE / ml according to the prior art.
Eine Limitation der Nährstoffe äußert sich u.'a.in der Atmungsaktivität'der Kultur. Unter konstanten Belüftungsverhältnissen steigt nach Erreichen limitierender Substratkonzentration der Sauerstoffpartialdruck im Fermentor an, d. h. die Atmung verlangsamt sich. Zugaben von" Gemischen aus Kohlenhydraten und Proteinen bewirken dann eine sofortige erneute Zunahme des Op-Verbrauches infolge weiteren Wachstums bzw. der verstärkten Enzymsynthese. Das kräftigeLimitation of nutrients manifests itself in the breathability of the culture. Under constant aeration conditions, after reaching a limiting substrate concentration, the partial pressure of oxygen in the fermenter increases, ie. H. breathing slows down. Additions of "mixtures of carbohydrates and proteins then cause an immediate increase in the Op consumption due to further growth or the increased synthesis of enzymes
Wachstum begünstigt außerdem die Stabilität des Verfahrens gegenüber äußeren schädlichen Einflüssen, z. B« Infektionen«Growth also favors the stability of the process to external harmful influences, e.g. B "Infections"
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Beispiele näher erläutertοThe process according to the invention is explained in more detail by the following examples
Ein 1 1-üundkolben, der mit Stutzen für die Aufnahme eines Oo-Sensoi'S, für die Zuführung von steriler Luft, für die Abführung der Luft und für die Beimpfung versehen ist, wird mit 800 ml Nährlösung folgender Zusammensetzung befüllt und sterilisiertίA 1 l round bottom flask fitted with sockets for receiving an Oo-Sensoi'S, sterile air supply, air exhaust and inoculation is filled and sterilized with 800 ml of nutrient solution of the following compositionί
Stärkehydrolysenprodukt (SHP) Maisquellwasserhydrolysat (ca-Ge samtproteingehaIt)Starch hydrolysis product (SHP) Corn steep liquor hydrolyzate (whole protein protein)
7 % 7 %
1,00 Masse-%1.00% by weight
5,00 Masse~% 0,10 Masse-% 0,05 Masse-%5.00 mass% 0.10 mass% 0.05 mass%
Der Inhalt des Kolbens wird mit einem Magnetrührer durchmischt, auf 50 0C temperiert und durch Einleiten von Luft mit Sauerstoff gesättigt« Aus einer homogenisierten Sporensuspension der Mutante IMET 95^5» die durch 20stündige Bebrütung von Schrägkulturen auf einem Maisquellwasser-Stärke Medium bei 5& °C und nach Abschwemmung mit einer 0,01 %igenThe contents of the flask is mixed with a magnetic stirrer, heated to 50 0 C and saturated by introducing air with oxygen "From a homogenized suspension of spores of the mutant IMET 95 ^ 5" by 20-hour incubation of slants in a corn steep liquor-starch medium at 5 ° C and after flushing with a 0.01%
Tween-80-Lösung erhalten wurde, v/erden 10 Sporen/ml Nährlösung, d. h. 8 . 10 Sporen, in den Kolben eingeimpft. Anschließend wird der Kolben luftdicht verschlossen» Unmittelbar nach Beimpfung beginnt die Atmung der Sporen, was an der Abnahme der Op-Konzentration feststellbar ist (Fig. 1)«, Nach etwa 85 min ist die Op-Konzentration (Kurve 1) im Kolben auf 30 % abgesunken und es wird über eine Regeleinrichtung Luft zugeführt, so daß dieser Wert bis zu einer Zeit von 120 min aufrechterhalten werden kann. Das Auswachsen von,Keimschläuchen aus den Sporen beginnt etwaTween-80 solution was obtained from 10 spores / ml of nutrient solution, ie 8. 10 spores, inoculated into the flask. Then the flask is sealed airtight "Immediately after inoculation the respiration of the spores begins, as can be seen from the decrease in the Op concentration (Fig. 1)." After about 85 minutes, the Op concentration (curve 1) in the flask is 30 % and it is supplied via a control device air, so that this value can be maintained up to a time of 120 min. The outgrowth of, germ tubes from the spores begins about
4Ό min nach Beimpfung; nach ca. 100 min sind 100 % der Sporen gekeimt (Kurve 2). Mittels Kontrolle der optischen Dichte kann das beginnende Wachstum nachgewiesen werden (Kurve 3)· Nach 120 min wird die Kultur in einen Fermentor überimpft und hier setzt sich das'.Wachstum .nahezu verzögerungsfrei fort.4Ό min after inoculation; After about 100 minutes, 100% of the spores germinated (curve 2). By monitoring the optical density, the incipient growth can be detected (curve 3). After 120 min, the culture is transferred to a fermenter and here the growth continues almost without delay.
Ein 30 1-Fermentor wird mit 20 1 Produktionsmedium der ZusammensetzungA 30 L fermentor is charged with 20 L of production medium of the composition
Stärkehydrolysenprodukt (SHP) 1,0 Masse-%Starch Hydrolysis Product (SHP) 1.0% by mass
Maisquellwasserhydrolysat (ca. Corn steep liquor hydrolyzate (approx.
7 % Gesamtproteingehalt) 5»0 Masse-%7% total protein content) 5 »0% by mass
NaCl 0,1 Masse-%NaCl 0.1 mass%
0,05 Masse-%0.05% by mass
befüllt und sterilisiert. Die Beimpfung erfolgt mit einer Vorkultur gemäß Beispiel 1. Die Fermentationstemperatur beträgt 50 0C, der Rührer hat eine Drehzahl von 300 Um-filled and sterilized. The inoculation is carried out with a preculture according to Example 1. The fermentation temperature is 50 ° C., the stirrer has a rotational speed of 300 μm.
—1 drehungen min , es werden 300 1 Luft/h zugeführt. Als Entschäumer werden vor Beimpfung 10 ml Silikonöl oder Rapsöl zugesetzt. 2 h nach Fermentationsbeginn erfolgt die kontinuierliche Zuführung von Nährstoffen, bestehend aus · -1 revolutions min, 300 l air / h are supplied. As defoamer, 10 ml of silicone oil or rapeseed oil are added before inoculation. 2 h after the start of fermentation, the continuous supply of nutrients, consisting of
Stärkehydrolysenprodukt (SHP) 1,0 Masse-%Starch Hydrolysis Product (SHP) 1.0% by mass
Maisquellwasserhydrolysat (ca.Corn steep liquor hydrolyzate (approx.
7 % Gesamtproteingehalt) 5,0 Masse-%,7% total protein content) 5.0% by mass,
und zwar in einer Menge von 2,5 ml/min. Die Dosierung" wird bis zum Ende der Fermentation nach 26 h fortgesetzt. Fig. 2 zeigt das Ergebnis im Vergleich zu einer Fermentation ohne Nährstoffzuführung (Grundmedium obiger Zusammensetzung). Die maximale Biomassekonzentration steigt gegenüber dem Kontrollversuch (Kurve 1) von 1,7 mg/ml auf ca« 3,5 mg/ml an (Kurve 2). Die Enzymsynthese verläuft mit deutlich erhöhter Bildungsrate und erreicht gegenüber derin an amount of 2.5 ml / min. The dosage "is continued until the end of the fermentation after 26 h .. Fig. 2 shows the result compared to a fermentation without nutrient supply (basic medium above composition) .The maximum biomass concentration increases over the control experiment (curve 1) of 1.7 mg / ml to about 3.5 mg / ml (curve 2) .The enzyme synthesis proceeds with a marked increase in the formation rate and attains the same level as the
Kontrolle rait 4 TE/ml Nährlösung (Kurve 3) einen Wert von etwa 10 TE/ml (Kurve 4).Control 4 TE / ml nutrient solution (curve 3) has a value of about 10 U / ml (curve 4).
Beispie_l_3Beispie_l_3
Ein 30 l~Fermentor wird gemäß Beispiel 2 mit 20 1 Produktionsmedium vorbereitet und mit einer Vorkultur gemäß Beispiel 1 beimpft» Die Fermentationsparameter entsprechen denjenigen, von Beispiel 2. Nach 2, 4, 6, 10 und 15 h werden jeweils 200 ml Maisquellwasserhydrlysat zugeführt. Fig* 3 zeigt das Ergebnis« Während die Enzymbildung in der Kontrolle bei 4 TE/ml Medium liegt, steigt sie bei der Zuführung von Proteinkomponenten auf ca. 10,5 TE/ml (Kurve 2). Die registrierten Werte des Sauerstoffpartialdruckes im Fermentor (Kurve 3) lassen nach der 3«j 4. und 6» Nährstoff gäbe deutlich die Beschleunigung der Atmung erkennen«A fermenter of 30 l is prepared according to Example 2 with 20 l of production medium and inoculated with a preculture according to Example 1. The fermentation parameters correspond to those of Example 2. After 2, 4, 6, 10 and 15 h 200 ml of corn steep liquor are added. FIG. 3 shows the result. While the enzyme formation in the control is 4 TE / ml of medium, it increases to about 10.5 TE / ml in the supply of protein components (curve 2). The registered values of the partial pressure of oxygen in the fermentor (curve 3) clearly show the acceleration of the respiration after the "3" and "6" nutrients. "
Beipe_il__4Beipe_il__4
Ein 30 1-Fermentor wird mit 20 1 Produktionsmedium der ZusammensetzungA 30 L fermentor is charged with 20 L of production medium of the composition
Maisstärke. 1,0 Masse-%Cornstarch. 1.0% by mass
Maisquellwasser ( 50 %ig ) 1,0 Masse-%Corn steep liquor (50%) 1.0% by mass
Trockenhefe 0,03 Masse-%Dry yeast 0.03% by mass
Magermilchpulver · 0,05 Masse-%Skimmed milk powder · 0.05% by mass
NaCl 0,5 Masse-%NaCl 0.5 mass%
CaGl2 0,05 Masse-%CaGl 2 0.05 mass%
gemäß Beispiel -2 vorbereitet und mit einer Vorkultur gemäß Beispiel 1 beimpft. Die Rührerdrehzahl beträgtprepared according to Example -2 and inoculated with a preculture according to Example 1. The stirrer speed is
—1 Umdrehungen min' , es wird Luft mit 300 l/h zugeführt, die Fermentationstemperatur beträgt 50 0C. 2h nach Beginn der Fermentation erfolgt die kontinuierliche Zuführung von zusätzlichen Nährstoffen, bestehend aus-1 revolutions min ', it is supplied with air at 300 l / h, the fermentation temperature is 50 0 C. 2h after the start of the fermentation, the continuous supply of additional nutrients, consisting of
Stärkehydrolysenprodukt (SHP) 1,0 Masse-% Maisquellwasserhyd.roIysat (ca. -Starch Hydrolysis Product (SHP) 1.0% by weight corn steep liquor hydrolyzate (approx.
7 % Gesamtproteingehalt) 5jO Masse-%7% total protein content) 5jO% by mass
in einer Menge von 2,5 ml/min. Die Dosierung wird bis Fermentationsende ( 24 h nach Versuchsbeginn ) fortgesetzt. Die Abhängigkeit der Enzytnbildung (Aktivität) von der Zeit ist in Fig. 4 dargestellt. Sie erreicht nach,24- h 10,8 TE/ml Produktionsmedium.in an amount of 2.5 ml / min. The dosage is continued until the end of fermentation (24 h after the start of the test). The dependence of enzyme formation (activity) on time is shown in FIG. It reaches after, 24 h 10.8 TE / ml production medium.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD22796581A DD156714A1 (en) | 1981-03-02 | 1981-03-02 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF THERMITASE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD22796581A DD156714A1 (en) | 1981-03-02 | 1981-03-02 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF THERMITASE |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD156714A1 true DD156714A1 (en) | 1982-09-15 |
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ID=5529364
Family Applications (1)
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| DD22796581A DD156714A1 (en) | 1981-03-02 | 1981-03-02 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF THERMITASE |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| DD (1) | DD156714A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003084334A2 (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-16 | Puratos | Method and composition for the prevention or retarding of staling |
-
1981
- 1981-03-02 DD DD22796581A patent/DD156714A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003084334A2 (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-16 | Puratos | Method and composition for the prevention or retarding of staling |
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| EP1790230A2 (en) * | 2002-04-05 | 2007-05-30 | Puratos N.V. | Method and composition for the prevention or retarding of staling and its effect during the baking process of bakery products |
| EP1790230A3 (en) * | 2002-04-05 | 2007-09-05 | Puratos N.V. | Method and composition for the prevention or retarding of staling |
| US9456616B2 (en) | 2002-04-05 | 2016-10-04 | Puratos Naamloze Vennootschap | Method and composition for the prevention or retarding of staling of bakery products |
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