DD156667A1

DD156667A1 - METHOD OF PREPARING IMMUNE PREPARATES FROM FETAL PROTEINS

Info

Publication number: DD156667A1
Application number: DD22802081A
Authority: DD
Inventors: Peter Solisch; Rolf-Hans Brandt; Heinrich Liebermann; Manfred Mueller; Udo Meyer; Herbert Liebermann; Horst Hahnefeld; Baehr Ruediger V
Original assignee: Peter Solisch; Brandt Rolf Hans; Heinrich Liebermann; Manfred Mueller; Meyer Udo Aquaconsult Gmbh; Herbert Liebermann; Horst Hahnefeld; Baehr Ruediger V
Priority date: 1981-03-03
Filing date: 1981-03-03
Publication date: 1982-09-15

Abstract

Das Herstellungsverfahren von Immunpraeparaten, die embryonale/fetale Proteine enthalten, ist anwendbar auf dem Gebiet der Human- und Veterinaermedizin und ist dadurch gekennzeichnet, dass man Embryonen/Feten von Wirbeltieren, insbesondere von Voegeln d. h. die aus denselben hergestellten Zellkulturen gemeinsam oder nicht gemeinsam mit Retroviren oder ihren Bestandteilen mit Hilfe biophysikalischer und biochemischer Methoden isoliert und reinigt und dass die so gewonnenen Immunpraeparate fuer phylogenetisch im Verhaeltnis zum Ausgangsgewebe differenten Spezies als Diagnostikum und Medikament einsetzbar sind.The production process of immunopariments containing embryonal / fetal proteins is applicable in the field of human and veterinary medicine and is characterized in that embryos / fetuses of vertebrates, in particular of birds d. H. isolates and purifies the cell cultures prepared from the same or together with retroviruses or their constituents by means of biophysical and biochemical methods and that the immunoparates thus obtained can be used as diagnostics and medicaments for phylogenetically different species compared to the starting tissue.

Description

Herstellungsverfahren von Immunpräparaten aus fetalen ProteinenProduction process of immuno-preparations from fetal proteins

Anwendun£sgebiet der ErfindungApplicability of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur hochgereinigten Gewinnung fetaler Proteine aus Embryonen/Feten bzw. aus den von diesen hergestellten begrenzt oder unbegrenzt wachsenden Zellkulturen. Die Herkunft der Embryonen/Feten sind Wirbeltiere insbesondere Vögel. Hochgereinigte Fetoproteine stellen Immunpräparate dar, die in der Human- und Veterinärmedizin zur Diagnostik, Prophylaxe und Therapie eingesetzt werden können. Die Fetoproteine können mit gleichzeitig isolierten Partikeln von Retrovirusmorphologie assoziiert sein oder gemeinsame Antigendeterminanten aufweisen.The invention relates to a method for the highly purified recovery of fetal proteins from embryos / fetuses or from the limited or unlimited growing cell cultures produced by them. The origin of embryos / fetuses are vertebrates, especially birds. Highly purified fetoproteins are immuno-preparations that can be used in human and veterinary medicine for diagnosis, prophylaxis and therapy. The fetoproteins may be associated with simultaneously isolated particles of retrovirus morphology or have common antigenic determinants.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Die im Wirtschaftspatent 3/51 Аб1 K 35/76 bzw. der Patentanmeldung V/P C 12K/215 302 dargelegten Erfindungen zur Herstellung von Immunpräparaten lassen die Existenz der hochwirksamen Fetoproteine außer acht, indem nur die Isolierung von Partikeln mit Retrovirusmorphologie oder deren Bestandteile angestrebt wird.The inventions for the production of immune preparations set forth in the commercial patent 3/51 Аб1 K 35/76 and the patent application V / PC 12K / 215 302 disregard the existence of the highly effective fetoproteins by only the isolation of particles with retrovirus morphology or its components is sought ,

Das Wirtschaftspatent WP 0 O7G/199 351 gibt ein Verfahren zur Isolierung von Fetoproteinen aus fetalen Organen humaner Herkunft an, die innerhalb der gleichen Spezies zur Anwendung kommen.The commercial patent WP 0 O7G / 199 351 discloses a method for the isolation of fetoproteins from fetal organs of human origin, which are used within the same species.

2b Ziel der Erfindung2b Object of the invention

Der nützliche Effekt der Erfindung, der im Vergleich zu den bereits bekannten Lösungen erreicht wird, besteht in Polgendem:The useful effect of the invention achieved in comparison to the already known solutions consists in Polgendem:

Petoproteine werden aus Embryonen oder Feten bzw. von Wirbeltieren, insbesondere von Vögeln aus den aus ihnen hergestellten begrenzt oder unbegrenzt wachsenden Zellkulturen gewonnen, gereinigt und zu einem Immunpräparat aufgearbeitet, wobei unter anderem das elektronenmikroskopische Bild im Negatiykontrastverfahren, in dem sich Proteinaggregationen darstellen, Berücksichtigung findt . Me Immunpräparate werden auf Reinheit geprüft.Petoproteins are obtained from embryos or fetuses or from vertebrates, in particular from birds obtained from the limited or unlimited growing cell cultures obtained, purified and processed into an immune preparation, including the electron microscopic picture in Negatiykontrastverfahren in which protein aggregations are considered , Me immuno-preparations are tested for purity.

Dem Herstellungsverfahren liegt die Absicht zugrunden, Petoproteine mit oder ohne sich von Retroviren ableitenden Proteinen als Immunpräparat für eine phylogenetisch differente Spezies im Vergleich zur Herkunft der Petoproteine diagnostisch, prophylaktisch und therapeutisch einzusetzen,The preparation method is based on the intention to use petoproteins with or without proteins derived from retroviruses as an immunological preparation for a phylogenetically different species in comparison with the origin of the petoproteins diagnostically, prophylactically and therapeutically,

Wesen der ErfindungEssence of the invention

Embryonen/Feten beinhalten Substanzen (fetale Proteine), die dem Entwicklungsstadium der Embryonen/Feten entsprechend der Zeil- und Organdifferenzierung, der neuralen Reizausschaltung und dem Infektionsschutz dienen. Fetale Proteine können an Partikeln von Retrovirusmorphologie assoziiert oder mit Bestandteilen derselben immunologisch verwandt sein. Dementsprechend sollen die so gewonnenen Fetoproteine zum direkten Infektionsschutz, zur Schmerzbekämpfung und zur Immunisierung gegen verwandte Proteine, die in erkrankten Menschen oder Tieren auftreten, eingesetzt werden. Die letztgenannte Einsatzmöglichkeit beruht auf folgenden Erkenntnissen: Einige Erkrankungen, insbesondere Geschwulst- und destruktive Hirnerkrankungen des Menschen sind vom Wiederauftreten bestimmter fetaler Proteine begleitet. Die wiederauftretenden fetalen Proteine werden innerhalb derEmbryos / fetuses contain substances (fetal proteins), which serve the stage of development of the embryo / fetus according to the cell and organ differentiation, the neural stimulus switching off and the infection protection. Fetal proteins may be associated with particles of retrovirus morphology or may be immunologically related to components thereof. Accordingly, the fetoproteins thus obtained should be used for direct protection against infection, for the control of pain and for immunizing against related proteins that occur in diseased humans or animals. The latter application is based on the following findings: Some diseases, especially tumorous and destructive brain diseases of humans are accompanied by the recurrence of certain fetal proteins. The recurrent fetal proteins become within the

gleichen Spezies nicht genügend als "fremd" erkannt und lösen deshalb keine oder eine ungenügende Immunantwort aus. Fetale Proteine phylogenetisch differenter Spezies besitzen einerseits artspezifische d.h. voneinander unterscheidbare andererseits interspezifische, d.h. einander ähnliche oder gleiche Antigendeterminanten. Diese Erkenntnis führte zu folgender Schlußfolgerung: Petale Proteine einer bestimmten Spezies lösen in einer phylogenetisch differenten Spezies eine Immunantwort aus, die nicht nur gegen die fremden, sondern auch gegen die im Organismus bereits: vorhandenen wiederauftretenden fetalen Proteine wirksam wird. Diese Schlußfolgerung bildet die Basis zur Herstellung und zum Einsatz von Immunpräparaten bestehend aus phylogenetisch differenten fetalen Proteinen. Ss wurde gefunden, daß mit Hilfe von biochemischen und biophysikalischen Reinigungs- und Anreicherungsverfahren (Fällungen, Detergenzbehandlung, Ultrazentrifugation, Chromatographie u.a.) aus Embryonen/Feten bzw. den aus ihnen hergestellten begrenzt und unbegrenzt wachsenden Zellkulturen Fetoproteine gewonnen und zu Immunpräparaten aufbereitet werden können. Weiter wurde gefunden, daß diese Immunpräparate in von der Ursprungsspezies differenten Spezies medikamentös und diagnostisch einsetzbar sind.the same species are not sufficiently recognized as "foreign" and therefore trigger no or insufficient immune response. Fetal proteins of phylogenetically different species have on the one hand species-specific i. on the other hand interspecific, i. similar or identical antigenic determinants. This finding led to the following conclusion: Petal proteins of a certain species trigger an immune response in a phylogenetically different species, which is effective not only against the foreign, but also against the re-occurring fetal proteins already present in the organism. This conclusion forms the basis for the production and use of immuno-preparations consisting of phylogenetically different fetal proteins. It has been found that fetoproteins can be obtained from embryos / fetuses or the limited and unlimited growth of cell cultures produced therefrom by means of biochemical and biophysical purification and enrichment processes (precipitations, detergent treatment, ultracentrifugation, chromatography, etc.) and processed into immunoparodines. It has also been found that these immuno-preparations can be used medicinally and diagnostically in species different from the species of origin.

- 4 Anwendungsbeispiele- 4 application examples

Entenembryozellkulturen werden in bekannter Weise aus 11 (10-12) Tage alten Vollembryonen hergestellt und bei 38⁰C in einer Rollereinrichtung bebrütet. Die Zelldichte wird auf 3x10 Zellen eingestellt, so daß innerhalb 24 Std. eine konfluierende Zellschicht resultiert. Nach weiteren 2 Bebrütungstagen werden die Zellen durch ein Chelaplex (0,1%) - Trypsingemisch (0,2%) aus den Kulturgefäßen abgelöst, durch Zentrifugation (500g für 5 min) sedimentiert und in mindestens 10 fächer Konzentration im Verhältnis zum ZeIl-Züchtungsmedium mit serumfreier Hanks-Lösung aufgenommen. Das sich anschließende Aufarbeitungsverfahren dient zum einen der Gewinnung des Retrovirus der Ente und zum anderen der Präparation von embryonalen und fetalen Proteinen.Duck embryo cell cultures are prepared in a conventional manner from 11 (10-12) day-old embryos full and incubated at 38 ⁰ C in a roller device. The cell density is adjusted to 3x10 cells, resulting in a confluent cell layer within 24 hours. After a further 2 incubation days, the cells are detached from the culture vessels by means of a chelaplex (0.1%) trypsin mixture (0.2%), sedimented by centrifugation (500 g for 5 min) and in at least 10-fold concentration in relation to the cell culture medium recorded with serum-free Hanks solution. The subsequent work-up procedure serves on the one hand to obtain the duck retrovirus and on the other hand to prepare embryonic and fetal proteins.

1. Virusgewinnung1. Virus recovery

Zur Freisetzung des intrazellulären Virus werden die Zellen durch klimatische Beugung in CO^-Trockeneis-Alkohol-Gemisch oder mit anderen geeigneten Verfahren aufgeschlossen. Der Zelldetritus wird durch Zentrifugation bei 2000g für 30 minaus der virushaltigen Flüssigkeit entfernt. Die Virusflüssigkeit wird von den Sedimenten abgetrennt, mit 50% Chloroform und 5 min lang gründlich geschüttelt. Nach erneuter Zentrifugation bei 2000g für 30 min setzt sich die das Virus enthaltende wäßrige Phase vom Chloroform ab. Die Virusflüssigkeit wird abgesaugt und anschließend durch Ultrazentrifugation be i 25000 U/min und O⁰C in einer VAC 602 2 Std. lang zentrifugiert. Die Sedimente werden in Trispufferlösung aufgenommen. Nach Zentrifugation bei 5000g für 20 min bei 4⁰C wird das im Verhältnis zum Ausgangsmaterial 100 fach angereicherte Virus mit Formalin in einer Endkonzentration von 1:4000 inaktiviert.To release the intracellular virus, the cells are disrupted by climatic diffraction in CO.sub.3 dry ice-alcohol mixture or by other suitable methods. The cell detritus is removed by centrifugation at 2000 g for 30 min from the virus-containing fluid. The virus fluid is separated from the sediments, shaken thoroughly with 50% chloroform and for 5 minutes. After renewed centrifugation at 2000 g for 30 min, the aqueous phase containing the virus settles on the chloroform. The virus fluid is aspirated and then centrifuged by ultracentrifugation at 25,000 rpm and ⁰ ° C. in a VAC 602 for 2 hours. The sediments are taken up in Tris buffer solution. After centrifugation at 5000 g for 20 min at 4 ⁰ C, the 100-fold enriched in relation to the starting material virus is inactivated with formalin in a final concentration of 1: 4000.

2. Präparation embryonaler/fetaler Proteine2. Preparation of embryonic / fetal proteins

Die Präparation der fetalen Proteine erfolgt durch Zugabe der 10 fachen Menge an eisgekühlter 3 M KCL-Lösung (Gewicht/ Volumen) im Vergleich zur Ausgangszellmenge in phosphatgepufferter Salinelösung unter Zusatz von 0,1% Triton X-100.The preparation of the fetal proteins is carried out by adding 10 times the amount of ice-cold 3 M KCl solution (weight / volume) compared to the starting cell amount in phosphate-buffered saline solution with the addition of 0.1% Triton X-100.

Durch anschließende Ruption der Zellen durch Ultraschall bzw. mechanische Behandlung und Extraktion für 15-20 Std. im Kühlschrank erfolgt die Elution der gewünschten Proteine aus dem Zellverband. Der Zelldetritus wird durch Zentrifugation bei 5000g und 4⁰G sedimentiert. Der klare Überstand wird gegen 0,15 M NaCL-Lösung dialysiert, klarzentrifugiert, durch Ultrafiltration 1:5 aufkonzentriert und durch Zusatz von 50% (NH. ^SO, gefällt. Das durch Zentrifugation bei 5000g und 4 C erhaltene Sediment wird in 1/10 des Aus-By subsequent rupture of the cells by ultrasound or mechanical treatment and extraction for 15-20 hours in the refrigerator, the elution of the desired proteins from the cell assembly takes place. The cellular debris is pelleted by centrifugation at 5000g and 4 ⁰ G. The clear supernatant is dialyzed against 0.15 M NaCl solution, cleared by centrifugation, concentrated by ultrafiltration 1: 5 and precipitated by the addition of 50% (NH 2 SO 4.) The sediment obtained by centrifugation at 5000 g and 4 C is precipitated in 1 / 10 of the

gangsvolumens mit PBS gelöst und klarzentrifugiert und einer Chloroformbehandlung unterzogen. Wach erneuter Zentrifugation bei 2000g für 30 min wird die proteinhaltige Flüssigkeit vom Chloroform abgehebert. Die so erhaltenen fetalen Proteine werden über Ultrogel AcA34 chromatographiert. Die im Molekulargewichtbereich von 15OO00-2OOO00 Dalton vorliegenden Fraktionen werden durch Ultrafiltration 1:10 aufkonzentriert. Das nun vorliegende Präparat wird im Verhältnis 1:2 mit dem nach Pkt. 1 enthaltenen Substrat vermischt.volume dissolved with PBS and clear-centrifuged and subjected to a chloroform treatment. Upon renewed centrifugation at 2000g for 30 min, the proteinaceous liquid is siphoned off from the chloroform. The fetal proteins thus obtained are chromatographed on Ultrogel AcA34. The fractions present in the molecular weight range of 15,000-2,000 daltons are concentrated by ultrafiltration 1:10. The present preparation is mixed in a ratio of 1: 2 with the substrate according to item 1 contained.

Zur Verwendung als Impfstoff wird die Präparation in Me ngen von 5 ml in Ampullen abgefüllt, eingeschmolzen und bei 4 C aufbewahrt. In der Regel werden 5 Injektionen im Abstand von 3 Tagen i.m. verabreicht, an die sich in 4-wöchigen Abständen weitere Injektionsserien anschließen können. Die Unschädlichkeit des Medikaments wird im Tierversuch an Säuglingsmäusen, Meerschweinchen und Kaninchen bei verschiedenen Applikationsverfahren geprüft. Mit Antilymphozytenseren behandelte Mäuse dienen zum Ausschluß einer onkogenen Aktivität.For use as a vaccine, the preparation is filled into ampoules of 5 ml, melted down and stored at 4 ° C. As a rule, 5 injections are administered every 3 days i.m. which can be followed by 4 more weekly series of injections. The harmlessness of the drug is tested in animal experiments on infant mice, guinea pigs and rabbits in various application methods. Mice treated with antilymphocyte sera serve to exclude oncogenic activity.

2. Zur Verwendung als Diagnostikum wird das Zellmaterial wie unter Pkt. 1 beschrieben aufgearbeitet und nach erfolgter Ultrazentrifugation im Verhältnis 1:100 in Bezug zum Ausgangsvolumen der Zellsuspension in TN-Puffer aufgenommen. Die wie unter Pkt. 2 gewonnenen fetalen Proteine werden im Verhältnis 1:2 mit dem virushaltigen Substrat vermischt und für die immunologische Diagnostik von Tumoren z.B. im LAI-Test eingesetzt.2. For use as a diagnostic agent, the cell material is worked up as described under point 1 and taken up after the ultracentrifugation in a ratio of 1: 100 with respect to the starting volume of the cell suspension in TN buffer. The fetal proteins obtained as in item 2 are mixed in a ratio of 1: 2 with the virus-containing substrate and used for the immunological diagnosis of tumors, e.g. used in the LAI test.

Claims

invention claim

Process for the preparation of human immunoassays containing embryonic / fetal proteins, characterized in that they produce limited or indefinitely growing cell cultures from parts or whole of embryos / fetuses of the vertebrates, in particular birds, from these by known biochemical and biophysical methods Methods may be obtained or isolated and purified together with components of retroviruses embryonal / fetal proteins.