CZ671290A3 - Příprava hydrolyzátu vaječného bílku a separace peptidové a glykopeptidové frakce a kyseliny síalové - Google Patents

Abstract

K hydrolýze bílku probíhající při teplotě 37 ° C po dobu max. 72 hod. při pH 1,5-2,0 se používá kuřecí pepsin. Vzniklý hydrolysát je frakcionován pomocí dvojnásobné ultrafiltrace na frakce s rel.mol. hmotností větší než 10 000, v rozmezí 10 000- 2 000. Řešení umožůje připravit peptidové a glykopeptidové frakce jako zdroj nutričních látek a dále zdroj biologicky aktivních látek s imunomodulačními účinky; vedle toho je možné z těchto frakcí separovat kyseliny sialové.

Description

Předmětem vynálezu je způsob přípravy peptidové a 31 ykopeptidové frakce hydrolyzátu vaječného bíiku .

ř ?*' t?

·.>

*

v.

V současné době je vaječný- bílek používán především v potravinářském průmyslu a k přípravě jednotlivých bílkovin jako lysozym, ovalbumin, ovotransferin, avidin. Jako zdroje aminokyselin a nízkomolekulárních oligopeptidů se používá autolyzát pankreasu, hydrolyzát jater, kvasinek a masa. Tyto hydrolyzáty se od sebe liší aminokyselinovým složením, především zastoupením esenciálních aminokyselin a jejich biologickou dostupností, případně obsahem dalších nutričních komponent, jako jsou sacharidy, lipidy, vitaminy, atd. Jako zdroj oligosacharidů, 1ipopolysacharidů, glykoproteinů a glykopeptidů s imunomodulačními vlastnostmi se používá kvasinek a různých .nepatogenních a patogenních mikroorganismů. Jako

zdrojů nutričních ' a biologicky i munomodu1ačn í m i účinky, aktivních látek vyznačující se použitím kuřecího ··· - : . .. -.i - * .....v- « : ?· · ty-r· veV' ·’ '-· -·--jÁ ' :s>'j;’ pepsinu v procesu hydrolysy. Z peptidové frakce lze různými podle relativní aminokyselin, Z aktivní látky s separačními postupy dále získávat subfrakce molekulové hmotnosti nebo podle zastoupení glykopeptidové frakce lze získat biologicky imunomodlučními vlastnostmi .béžnými separačními postupy bez dalších úprav nebo po odštěpení peptidové části glykopeptidů, nebo ji použít jako zdroj kyseliny sialové.

Novost popsaného způsobu glykopeptidové frakce hydrolyzátu přípravy peptidové a vaječného bil ku dokládají rešerše, uvedené v příloze přihlášky, příklady ilustrují předmět vynálezu, ale nikterak jej neomezují:

V jedné šarži při teplotě 37°C bylo hydrolysováno 70-75 1 -bí Iku ,- -spotřeba-pepsin u-- by-La -..-1-33-150·-g-,--enzy-m —by-1 p-řidávándo inkubační směsi ve dvou stejně velkých dávkách. Použitý pepsin byl isolován z autolysátu žlaznatých žaludků srážením chloridem sodným. Hodnota pH inkubační směsi se v průběhu štěpení pohybovala od 1.5 do 2.0 a hodnota pH, na kterou byl hydrolysát nastaven po skončení inkubace byla 5,0 nebo 7, 0. Doba inkubace byla 72 hod.

Inkubační směs byla ultrafiltrována na ultrafiltru pňi použití tabulárních membrán. Pňi použití membrány propouštějící peptidy do rel. mol. hmotnosti 2000 byly získány dvě frakce frakjce peptidft a glykopeptidů s rel. mol. hmotností větší než 2000 a frakce peptidů s rel. mol. hmotností do 2000.

Aminokyselinová analysa frakce I (do 2000) je uvedena v Tab. 1.

Tabulka 1,

Aminokyselinová analysa frakce I (viz obr, 1) po dělení frakce peptidů (rel. mol. hmotnost do 2000) na Bio-Gelu P2.

·.

<

r-i V*,- * Aminokýselina '’Τ-'Τ⁵ -τ»·Τ vAr 0 /1-·Poměrné zastoupení ¹ ’

*. Ji*'. -í -^T *·, «b V ' *·”·***ζ·* ^{J J} _v i. « ; v ~

Jí- ..«v, ΐ'> ,&^-ίϊ,ΐ-Άί? ’*« fi.'., „ΑΛ Kyselina asparagová

Serxn .··,·(« ·,.

Kyselina glutamová Prolin ,

Glycin ¹ Alalnin Valin v Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Fenylalanin Histidin Lysán Arginin

Průběh gelové chromátografie frakce peptidů do 2000 na Bio-Gelu P2 (Obr. 1.) znázorňuje rozložení jednotlivých peptidú v této frakci podle rel. mol. hmotností, frakcionační oblast Bio-Gelu P2 je 1900-100.

-r-

·<

τ

r—4	P in	-P u	X c	i	r>- x
	0	m	m	XJ	>>	X
^.r<rý	ε	t—í	. L.	3	D		. • 'D-	•:X':
	-	43	-P	X	Ή	'1* ·
	- ...’ >	0	r~4	01	L	X
	. c 0)		•P 4-	yí «.· f*	„ m r	jV· ·'»« ► ·	; ’ ;í	v
*,*· ”v	iVí*Vt.~ \L	vt	.(JJ	ε	: u
Wff	WTTf j v	-C-	L.	,u	ni	X	%· <« * -p.	*y -·'·>·- ^áí‘
sAZ *&>- e 4 >J 4, m	XJ fS	Z-P	‘o	. Ul	m	1	ΐ'ή’-τΣί ..ι.ύ·^ »—
		C „ 3 0,4 ’:Ο.·^ íjx .»·. 0 Vr£gR 2 CM >0· •SLbť^biž.·· b.ct	+* ‘01 « -si lil	** -» s v «Λ	Si
/feiž^ť · 07 yP ~r* □»; » *· * **	* «6	·-:□ a	’CM	-c	•P 0	-j ,· « - ν-< Λ .4·
·. .'. w .	,.,Λ........ . α	• L	·„	•P	fk	43	V	* ‘'l.
	... οι	4-		U	1	3
*	?. a	4^'		a	c	Ό
>2			3	. -i	•p			,' :·’ λ
(M			P	0	ε
	a	cm	•<0	i—4		Qi
	u	Cl	01	iff	«**«	—1
	j£		ε		K<	Π
	«		L	m
	k.	3	Qi	c	0	<a
	4-	l“4	Q.		a	. i_
		as		•'c		Lú
		a		•fli	r—i	3
	01	1		>	ε	U	•
	• .' P	0	Λ ř-	0
	4—	•P		L	Ό	£.	u
	<0	ca	g	-P		u
2	L			»—4	.01	•f)	ns
	σ			Ή	U	c	u
	□			tb.		i—4	4-
	p	(0	1Ω		flj	40
	ni	c	I*		U	U	JZ
	e		CM		Ή	P	u
	0			43		3	.X
	i.	o			1*	0i	c
	ť-	«**<			iX	c	XJ
	u	,~l	«·	3	u		3
		či			ns	3	f—4
			Si	X	z	X	OJ
	•Si		i.	X		íO
	>	rs w	0	rt	z	Ϊ	X
	O	ΤΓ	N				ř“
			>	—»	ifj	□	s
	&		*	P	X		•n
	Φ	X	—*	40	»>	V»	□
		-μ		ui	/*»	u
	•		»Λ»			lii	in
	T-í	□	τ-4	i—f	_v	>
		C	1	rt bt	□	—t u	1
	s Λ	-P		L	4-’	c
	L_ =O	□	«**«	3	N	«	*-4
	J2 L	c	s		Π	P	X

L ií! x

dvou různých membrán za sebou ultrafiltrací frakce peptidů s rel. mol. hmotnostmi 10 000 - 2 000.

Průběh chromatografie na získána dvojnásobnou v rosíTiezí

Bio-Gelu znázorňuje hmotností, 000.

rpzložení jednotlivých peptidů frakcionaění oblast Bio-Gelu P10

P10 (obr. 2) podle rel. mol. je 20 000 - 5

I.

IT.

III.

5·

Průběh gelové chromatografie frakce.peptidů s rel. mol. hmotností v rozmezí 2 000-10 000 na Bio-Gelu P10 (frakcionaění oblast 20 000-5 000). Vzorek 2,5 ml permeátu po dvojnásobné ultrafiltraci. Sloupec 2,2x63 cm, eluč.ní roztok 0,15 M NaCl, frakce ά ml po 30 min., I, I

I, III spojení elučních frakcí γ-.Ύ*·

Způsob přípravy hydrolysátu vaječné čímže vaječný bílek se pí* i r- 1 Π T

-tíH sinem (vý ·= 1«dna koncen trate ho bílku vyznačuje se é 3/Pí hydrolysuje kuře— ρ e ρ 3 i n u O. 2 í v / v) po d o fa u maximálně 72 hod. při pH 1.5-2.0.

Způsob přípravy frakcí pepsinového hydrolysátu vaječného bílku dle bodu i, vyznačený tím, že se peptidy,resp. glykopeptidy a rel. mol. váze menší než 2000, získané po hydrolyse pepsinem, oddělí ultrafiltrací na zařízení s tabulárními membránami propustnými pro peptidy s rel. mol. hmotností menší než 2000.

$,

Claims (1)

1. i* .·’>

   &

   í

   Způsob přípravy hydrolysátu vaječného bílku, připraveného dle způsobu 1, v.t., Se se peptidové frakce separují kombinovanou následnou ultrafiltrací využívající membránu propustnou pro peptidy a glykopeptidy menší než 10 000 a spřaSenou s membránou propustnou pro peptidy a glykopeptidy menší