CZ42497A3 - VACCINE CONTAINING BORRELIA BURGDORFERI OspG - Google Patents

Description

1 9-it -?τ·

Vakciny obsahující Borrelia burgdorferi OspG Oblast techniky

J/U01NA.SVU , avy o

Předkládaný vynález se týká nových antigenů a jejich h\'$Z derivátů odvozených od Borrelia burgdorferi, metod jejicl^ | produkce, jejich použití v lidské a zvířecí mediciné a i diagnostice a farmaceutických kompozic, které je obsahují! » f, 1 ?, 7, C 0 . \ \ Přesněji, předkládaný vynález poskytuje klonující exprési .f-3 1 nového polymorfního B. burgdorferi lipoproteinu OspG. Tento1'*’*.aweweu*»·»- byl dříve znám jako lp77. Určená aminokyselinová sekvence tohoto proteinu nevykazuje žádnou homologii k jiným známým antigenům Borrelií jako je OspA, OspB, OspC, OspD, OspE,

OspF a P27. Tyto proteiny zevního povrchu vykazují mezi 41% a 65% podobnosti s OspG (Tabulka 1).

Dosavadní stav techniky

Lymská choroba je nejčastější vektorem přenášenou infekční chorobou mírného klimatu. Etiologické agens, spirocheta Borrelia burgdorferi, způsobuje u lidí multisystemové onemocnění, které může napadat kůži, nervový systém, klouby a srdce (8,44). Kmeny B.burgdorferi izolované z různých biologických zdrojů a geografických oblastí jsou heterogenní (2, 19, 38, 45, 50) a je předpokládáno, že charakter manifestace onemocnění je ovlivněn antigenními rozdíly mezi kmeny spirochet. Ačkoliv byly popsány mnohé pokusy klasifikovat B.burgdorferi podle imunologických nebo molekulárních kriterií, je taxonomie B.burgdorferi stále kontraverzní a věcí aktivního výzkumu. 2

Nyní je využíváno množství antigenů B.burgdorferi jako je zevní povrchový protein A (OspA), OspB, pC a plOO pro serologickou diagnózu a jako možných kandidátů pro vývoj vakciny (13, 14, 36, 38, 40, 41). Nicméně, díky jejich zřejmé heterogenitě, stále chybí jasná kriteria pro vývoj druhově specifických diagnostických standardů a pro vývoj polypeptidové vakciny, která zaručí ochranu před jakýmkoliv poddruhem.

Podstata vynálezu Předkládaný vynález objevuje další lipoprotein B.burgdorferi, který je označen OspG. Tato molekula je charakterizována molekulární hmotností přibližně 22 kDa, izoelektrickým bodem PI=5.2 a obsahuje 196 aminokyselin.

Zralý protein je dále charakterizován jednou rozsáhlou hydrofobní doménou o přibližně 20 aminokyselinách na amino terminální části OspG. N-terminální peptid koresponduje k "leader " signálnímu peptidu, který je nacházen v typických prokaryotních 1ipoproteinových prekursorech. Na karboxy konci hydrofobního jádra je štěpící místo předpokládané rozpoznávané B.burgdorferi signální peptidasou. Potenciální štěpící místo v OspG se nachází mezi serinera v poloze 19 a cysteinem v poloze 20. Sekvence okolo štěpícího místa OspG je L-l-l-S-C.

Oproti OspA, B, C, D, E, F a P27 e OspG gen přirozeně umístěn na 55 kb plasmidu u B.burgdorferi ZS7. Byla zaznamenána slabá zkřížená reaktivita mezi OspG probou a 45 kb plasmidem. OspG má aminokyselinovou sekvenci jak je dána na Obrázku 1. Je dále charakterizován tím, že je exprivován pouze během infekce a není detekovatelný v B.burgdorferi kultivované in vitro. 3 V souladu s tím předkládaný vynález poskytuje izolovaný protein odvozený od B.burgdorferi charakterizovaný tím, že má molekulární hmotnost okolo 20 - 22 kDa, jak je určeno dvourozměrnou SDS gelovou elektroforesou, a izoelektrický bod mezi 4,9 a 5,4. Předkládaný vynález dále poskytuje protein nebo imunologicky nebo antigenně rovnocený fragment nebo jeho derivát alespoň 80% homologie k aminokyselinové sekvenci znázorněné na Obrázku 1.

Protein a jeho korespondující DNA a RNA sekvence nacházejí využití jak ve vakcině, tak na poli diagnostiky.

Preferovaně předkládaný vynález poskytuje protein mající alespoň 85% homologii, lépe 90% homologii a nejlépe 95% homologii k proteinu znázorněnému na Obrázku 1.

Protein předkládaného vynálezu může být fuzní protein, a v tomto případě je fuzní protein charakterizován tím, že má část jeho aminokyselinové sekvence nebo její fragment. Preferovanou částí je alespoň 80%, lépe 85% , ještě lépe 90%, a nejlépe 95% homologie k proteinové sekvenci Obrázku 1.

Preferovaně je protein alespoň 70% čistoty jak je určeno SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforesou, lépe 80% čistoty a nejlépe alespoň 90% čistoty.

Protein předkládaného vynálezu může být lipoprotein, nebo může být produkován jako protein bez jakýchkoliv asocioaných lipidů. Je-li produkován rekombinantními technikami bude lipoprotein exprivován se signální sekencí. Štěpení signální 4 sekvence kvůli odstranění N-koncových 19 aminokyselin povede k produkci molekuly bez lipidů.

Imunoblottová analýza ukazuje, že OspG je rozpoznán sérem od myší dříve infikovaných intaktními spirochetami což napovídá, že nativní protein je u tohoto druhu imunogenní. Předkládaný vynález dále identifikuje a sekvenuje gen pro OspG. V souladu s tím vynález poskytuje DNA sekvenci kódující protein OspG nebo jeho fragment nebo jeho derivát. Preferovaná DNA sekvence je v podstatě dána na Obrázku 1.

Termín "v podstatě" jak je zde použit znamená alespoň 70% identitu k sekvenci dané na Obrázku 1, lépe 80% identitu, ještě lépe alespoň 85% identitu a nejlépe alespoň 95% identitu. Předkládaný vynález poskytuje DNA sekvenci mající v podstatě sekvenci znázorněnou na Obrázku 1, nebo její fragment, nebo DNA sekvenci, která hybridizuje zmíněnou sekvenci a která kóduje protein, který vykazuje OspG antigenicitu. DNA předkládaného vynálezu může být připravena enzymatickou polymerací DNA, která může být provedena in vitro užitím DNA polymerasy jako je DNA polymerasa I (Klenow fragment) ve vhodném pufru obsahujícím nukleosid trifosfáty dATP, dCTP, dGTP, a dTTP podle potřeby při teplotě 10 - 37 °C, obecně v objemu 50 μΐ nebo menším. Enzymatická ligace DNA fragmentů může být provedena užitím DNA ligasy jako je T4 DNA ligása ve vhodném pufru jako je 0,05 M Tris (pH 7.4), 0,01 M MgCl2, 0,01 M dithiotreitol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP a 0,1 mg/ml hovězí sérový albumin, při okolní teplotě 4 °C, obecně v objemu 50 μΐ nebo menším. Chemická syntesa DNA polymeru nebo jeho fragmentů může být provedena konvenčními 5 fosphotriesterovou, fosphitovou nebo fosphoramiditovou chemií, užitím techniky pevné fáze jako je ta, která je popsána v "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragmente - A Laboratory Manual" (vyd. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)), nebo v jiné odborné publikaci, například M.J.Gait, H.W.D. Matthes, M.Singh, B.S. Sproat, a R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6234; B.S. Sproat a W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci a M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci a M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185, S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus, a H.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; a H.W.D.Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

Alternativně může být kódující sekvence odvozena od B. burgdorferi mRNA užitím známých technik (t.j. reverzní transkripce mRNA pro generování komplementárního cDNA řetězce), a komerčně dostupných cDNA kitů.

Vynález není omezen na specificky popsané sekvence, ale zahrnuje všechny molekuly kódující protein nebo jeho imunogenní derivát, jak je popsáno výše. DNA polymery, které kódují mutanty proteinu vynálezu mohou být připraveny místně řízenou mutagenesí cDNA kódující protein pomocí konvenčních metod jako jsou ty, které popisuje G. Winter et al., v Nátuře 1982, 299, 756 - 758 nebo Zoller a Smith 1982, Nucl. Acids Res., 10 6487 - 6500, nebo pomocí deleční mutagenese jak ji popisuje Chán a Smith v Nucl. Acids Res., 1984, 12, 2407 - 2419 nebo G.Winter et al., v Biochem. Soc. Trans., 1984, 12,224 - 225. 6 V jednom aspektu předkládaný vynález poskytuje postup, který zahrnuje tyto kroky: i) přípravu replikovatelného nebo integrujícího expresního vektoru schopného v hostitelské buňce exprese DNA polymeru obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje zmíněný OspG protein nebo jeho imunogenní derivát; i i) transformování hostitelské buňky zmíněným vektorem; iii) kultivování zmíněných transformovaných hostitelských buněk za podmínek dovolujících expresi zmíněného DNA polymeru za produkce zmíněného proteinu; a iv) odběr uvedeného proteinu.

Termín "transformování" jak je zde použit znamená zavedení cizorodé DNA do hostitelské buňky transformací, transfekcí nebo infekcí vhodným plasmidem nebo virovým vektorem za použití konvenčních technik jak je popsáno v Genetics Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A.J. Kingsman; Blackwell Sientific Publications; Oxford, England, 1988. Termín "transformovaný" nebo " transformant" je zde použit na výslednou hostitelskou buňku obsahující a exprivující požadovaný cizorodý gen.

Expresní vektor je nový a také tvoří část vynálezu.

Replikovatelný expresní vektor může být připraven podle vynálezu štěpením vektoru kompatibilního s hostitelskou buňkou za vytvoření lineárního DNA segmentu majícího intaktní replikon, a kombinováním uvedeného lineárního segmentu za ligačních podmínek s jednou nebo více DNA 7 molekulami které, spolu s uvedeným lineárním segmentem kódují požadovaný produkt jako je DNA polymer kódující OspG protein, nebo jeho fragmenty.

Tak může být DNA polymer vytvořen předem nebo vytvořen během konstrukce vektoru, jak je žádoucí.

Volba vektoru bude částečně určena hostitelskou buňkou, která může být prokaryotní nebo eukaryotní. Vhodné vektory zahrnují plasmidy, bakteriofágy, kosmidy a rekombinantní viry. Příprava repl ikovaťe lného expresního vektoru může být provedena konvenčně vhodnými enzymy pro restrikci polymerizaci a ligaci DNA postupy popsanými, například, Maniatisem et al., který byl citován výše.

Rekombinantní hostitelská buňka je připravena podle vynálezu transformováním hostitelské buňky replikovatelným expresním vektorem podle vynálezu za transformujících podmínek. Vhodné transformující podmínky jsou konvenční a jsou popsané například v Maniatis et al. citovaném výše, nebo " DNA cloning" Vol. II. D.M. Glover ed., IRL Press LTD, 1985. Výběr transformujících podmínek je určen hostitelskou buňkou. Tak bakteriální hostitel jako je E.coli může být ošetřen roztokem CaCl2 (Cohen et al., Proč. Nat. Acad.Sci., 1973, 69, 2110) nebo roztokem obsahujícím směs RbCl, MnCl2, octan draselný a glycerol, a pak 3-(N-morpholino)-propansulfonovou kyselinou, RbCl a glycerolem. Savčí buňky v kultuře mohou být transformovány vápníkovou koprecipitací DNA vektoru do buněk. Vynález také 8 zahrnuje hostitelské buňky transformované replikovatelným expresním vektorem podle vynálezu.

Kultivování transformovaných hostitelských buněk za podmínek dovolujících expresi DNA polymeru je provedeno konvenčně, jak je popsáno například v Maniatis et al. a "DNA cloning" citovaných výše. Preferovaně jsou buňce doplňovány živiny a je kultivována při teplotě nižší než 45 °C.

Produkt je shromážděn konvenčními metodami podle hostitele. Tam, kde je hostitel bakteriální, jako je E.coli, může být lyžován chemicky nebo enzymaticky a proteinový produkt může být izolován z výsledného lyzátu nebo super variant. Tam kde je hostitel savčí může být produkt obecně izolován z živného media nebo z buněk prostého extraktu. Konvenční techniky izolace proteinu zahrnují selektivní precipitaci, absorpční chromatografi i, a afinitní chromatografi i včetně monoklonální protilátka afinitní kolony.

Alternativně může být exprese provedena na hmyzích buňkách za použití vhodného vektoru jako je Baculovirus. V jednotlivém aspektu tohoto vynálezu je protein exprivován v Lepidoptera buňkách za produkce imunogenních polypeptidú. pro expresi proteinu v Lepidoptera buňkách je preferováno použití baculovirus expresního systému. V takovém systému je expresní kazeta obsahující sekvenci kódující protein, která je operativně navázána na baculovirový promotor, typicky umístěna do "shuttle" vektoru. Takový vektor obsahuje dostatečné množství bakteriální DNA k šíření "shuttle" vektoru v E.coli nebo jiném vhodném prokaryotním hostiteli. Takový "shuttle" vektor také obsahuje dostatečné množství baculovirové DNA připojené k požadované kódující sekvenci 9 proteinu, takže dovoluje rekombinaci mezi divokým typem baculoviru a heterologním genem. Rekombinantní vektor je pa^ kotransfektován do Lepidoptera buněk s DNA divokého typu baculoviru. Rekombinantní baculoviry vzniklé z homologní rekombinace jsou pak selektovány a plaky jsou purifikovány standardními technikami. Viz Summers et al., TAES Bull (Texas Agricultural Experimental Station Bulletin) NR 1555, Květen, 1987.

Postup exprese CS proteinu ve hmyzích buňkách je popsán detailně v USSN 287,934 SmithKline RIT (WO/US 89/05550).

Produkce v hmyzích buňkách může také být provedena infikováním hmyzích larev. Například, protein může být produkován v Heliothis virescens housenkách krmením rekombinantním baculovirem podle vynálezu spolu se stopovým množstvím divokého typu baculoviru a pak extrakcí proteinu z hemolymfy po asi dvou dnech. Viz, například, Miller et al., PCT/W088/02030.

Nový protein podle vynálezu může být také exprivován ve kvasinkách jak je popsáno pro CS protein v EP-A-0 278 941. Předkládaný vynález se také týká kompozice vakciny obsahující OspG nebo jeho fragment nebo derivát.

Ve vakcině podle vynálezu může být vodný roztok proteinu(ú) použit přímo. Alternativně může být protein, s nebo bez předcházející lyofilizace, smíchán nebo absorbován s jakýmkoliv z mnoha známých adjuvans. Taková adjuvans zahrnují, ale nejsou na ně omezena, hydroxid hlinitý, muramyl dipeptid a saponiny jako je Quil A. Zejména preferovaná adjuvans jsou MPL (monofosforyl lipid A) 10 a 3D-MPL (3 De-O-acetylovaný monofosforyl lipid A). Další preferovaná adjuvans jsou známá jako QS21. 3 D-MPL může být získán od Ribi Immunochem nebo metodami popsanými v UK patentu č.222021 1, zatímco QS21 může být získán od Cambridge Biotech nebo metodami popsanými v US patentu č. 5,057,540. Jako další alternativa může být protein enkapsulován v mikročásticích jako jsou liposomy nebo asociován s olejem ve vodné emulzi. V ještě další alternativě může být protein konjugován na imunostimulující makromolekulu jako je usmrcená Bordetella nebo tetanický toxoid. V preferovaném provedení vynálezu bude antigen předkládaného vynálezu obsahovat jiné Borreliové antigeny, zejména OspA.

Proteiny předkládaného vynálezu mohou být exprivovány živými vektory jako je BCG, Listeria nebo Salmonela a při použití takových vektorů mohou být vytvářeny živé vakciny. Příprava vakcin je obecně popsána v New Trends and Devolopments in Vaccines, Voliér et al., (eds.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. Enkapsulace v liposomech je popsána Fullertonem, US patent 4,235,877. Konjugaci proteinů na makromolekuly objasňuje, například, Likhite, US patent 4,372,945 a Armor et al., US patent 4,474,757. Užití Quil A popisuje Dalsgaard et al., Acta Vet Scand, 18:349 (1977).

Množství proteinu podle předkládaného vynálezu přítomného v každé dávce vakciny je vybráno jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověd bez signifikantních nepříznivých vedlejších účinků v typické vakcině. Takové množství bude velmi záviset na tom, který specifický 11 imunogen je využit a na tom, jestliže vakcina obsahuje adjuvans. Obecně je očekáváno, že každá dávka bude obsahovat 1 - 1000 pg proteinu, výhodně 1 - 200 pg. Optimální množství pro jednotlivou vakcínu může být upřesněno standartními studiemi zahrnujícími pozorování titru protilátek a jiných odpovědí subjektů. Po počáteční vakcinaci mohou subjekty dostat další dávku pro zvýšení jejich imunitní odpovědi. Předkládaný vynález se také týká protilátek, preferovaně monoklonálních protilátek, které jsou specifické pro OspG. Takové protilátky nacházejí uplatnění v diagnostice a také v prevenci Lymské choroby. V alternativním provedení vynález poskytuje diagnostický kit obsahující OspG antigen. Příklady provedení vynálezu I. Materiál a metody 1.1. Kmeny Borrelia

Kmeny B.burgdorferi použité v této studii byly popsány jinde (45). Borrelie byly kultivovány v modifikovaném Barbour - Stoenner - Kelly II (BSK II) mediu (2) při 33 °C. Spirochety byly získány centrifugací při 10000 x g při 4 °C po 20 minut, dvakrát promyty v PBS a počítány mikroskopií v temném poli. Příprava a screening B.burgdorferi expresní knihovny

Genomová DNA byla připravena z B.burgdorferi kmenu ZS7 lysozym/SDS metodou a DNA fragmenty byly generovány sonikací. Tupě zakončená DNA byla insertována do pUEXl 12 vektoru použitím adaptorové klonovací strategie (7,31). Ligovaná DNA byla transformována do E,coli MC1061 po čemž následoval expresní screening užitím imunitního séra získaného od DBA/2 myší inokulovaných 104 (a méně) B.burgdorferi (ZS7) organismy. 1.2. Southern Blot hybridizace

Celková genomová DNA byla extrahována z Borrelia organismů jak bylo popsáno dříve (32). Přibližně 5 pg DNA bylo tráveno 100 U restrikční nukleásy (HindlII) podle doporučení výrobce (Boehringer, Mannheim). Vzorky byly podrobeny elektroforese užitím 0.7% agarosového gelu. DNA fragmenty byly transferovány do Hybon ™-N nylonové membrány (Amersham) po čemž následovala UV - zkřížená vazba a hybridizace. Krátce, při použití 32P-značených prob byla hybridizace provedena přes noc při 65 °C v 0,5 M NaHPCU/7%NaDodS04, pH 7,2. Po promytí v 40 nM NaHPO/1% NaDodSCU, pH 7,2 při pokojové teplotě po 30 minut byla suchá membrána autoradiografována na Kodak XAR-5 filmu s intenzifikovaným prohlížením při -80 °C po 1 až 12 hodin. Jako hybridizační proba byl použit 500 bp DNA fragment zahrnující LA7 kódující region. Žádoucí genový fragment byl získán z agarosového gelu s nízkou teplotou tání, precipitován ethanolem a radioznačen náhodně nastartovanou reakcí jak je popsáno. 1.5. Gelová elektroforesa

Pro e1ektroforesu na jednorozměrových SDS/PAGE gelových deskách podle Laemliho (21) bylo 40 μΐ každého lyzátu (ekvivalentní k »108 organismů) smícháno s 10 μΐ 5 x redukujícím vzorkem pufru. 13

Dvourozměrná polyakrylamidová gelová elektroforeza byla provedena jak popisuje 0'Farrel (29) za použití IEF (Pharmacia/LKB amfolyty: 1,45% pH 3,5 - 10, 0,1% pH 2,5 -4,0, 0,2% pH 9 - 11) v prvním rozměru. Bylo použito stejné množství lyzátu jako v případě jednorozměrové gelové elektrofořezy. Gely byly bud barveny stříbrem nebo zpracovány pro Western blotting (15).

Proteolýza povrchu použitím proteinasy K (Boehringer -Mannheim, Germany) byla provedena podle metody Barboura et al., (20). Proteiny byly pak separovány SDS-PAGE a jednotlivé antigeny byly identifikovány imunoblottingem. 1.6. Western blotting

Po dvourozměrové SDS-PAGE byly proteiny elektroblotovány po 1 hodinu při konstantním proudu (60 mA) do Hybond C nitrocelulosové vrstvy (Amersham) za využití semisuché e1ektroblotingové komůrky (BIO-RAD, Munich, Germany) podle doporučení výrobce. Po inkubaci přes noc ve blokujícím pufru (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5% netučného sušeného mléka) byly imunobloty inkubovány po 2 hodiny při pokojové teplotě s 1:100 (obj./obj.) ředěním myšího a lidského antiséra v 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% sušeného mléka, 0,2 % Tween 20 nebo se supernatantem kultury myší mAbs (LA7).

Nitrocelulosové filtry byly promyty pětkrát v ředícím pufru a inkubovány další hodinu s alkalická fosfatasa -konjugovaným kozím anti - králičím antiserem (Dianova, Hamburg, Germany, 1:400 obj./obj.). Bloty byly promyty čtyřikrát ve výše zmíněném pufru a dvakrát v TBS a imunoreaktivní proužky pak byly vizualizovány přidáním 20 ml DEA-pufru (0,1 M diethanolamin (Sigma), 0,02% NaN3, 5mM MgCl2, pH 9,0) doplněném 5-bromo-4-chloro-3-indolfosfátem 14 (BCIP, Sigma; 165 pg/ml) a nitro blue tetrazolium (NBT,

Sigma, 330 μg/ml) jako substrátem. Reakce byla ukončena promytím membrány v 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA. 1.7. DNA sekvence B.burdorferi genomové DNA fragmenty klonované do pUEXl plasmidů (Amersham) byly sekvenovány užitím T7Sequencing kit (Pharmacia) podle doporučení výrobce. 1.8. Aminokyselinová sekvenční analýza

Simultání seřazení proteinových sekvencí a konstrukcí fy1ogenetického stromu bylo provedeno použitím HUSAR software. 1.9. Imunofluorescence

Organismy B.burgdorferi byly dvakrát promyty v PBS, transferovány do adhezních sklíček (Superior, Bad Mergentheim, FRG) (1 x 105 spirochet/reakční pole), fixovány v absolutním ethanolu (2 minuty, -20 °C) a sušeny vzduchem. Fixované spirochety byly inkubovány s přísušnou mAb, ředěné spirochety byly inkubovány s fluorescein isothiokyanatem ve vlhké komůrce po 30 minut. Po třech promytích v PBS byly preparáty vyšetřovány puožitím fluorescentního mikroskopu a dokumentovány užitím 400 ASA černobílého filmu (HP5; Illford, UK). j.10. Imunofluorescence

Organismy B.burgdorferi byly dvakrát promyty v PBS, transferovány do adhezních sklíček (Superior, Bad Mergentheim, FRG) i05 spirochet na reakční pole, fixovány v absolutním ethanolu (2 minuty, -20 °C) a sušeny vzduchem. Fixované 15 spirochety byly inkubovány s jednotlivou MAb ředěnou v PBS ve vlhké komůrce po 30 minut. Po třech promytích v PBS byly spirochety inkubovány s fluorescein isothiokyanat - značeným anti - myším imunoglobulinovým antiserem (Medac, Hamburg,

Germany) v temné vlhké komůrce po 30 minut. Po třech promytích v PBS byly preparáty vyšetřovány požitím fluorescentního mikroskopu a dokumentovány užitím 400 ASA černobílého filmu (HP5; . . . Illford, UK) . ELISA B.burgdorferi specifické protilátky byly měřeny v pevné fázi ELISA systému s B.burgdorferi B31 antigeny jak je popsáno dříve (15). 2.1. PCR amplifikace části ospG genu

OspG gen postrádající sekvenci kódující hydrofobní "leader" peptid byl PCR amplifikován s oligonukleotidovými primery 5' -GTGGATCCAAGATTGATGCGAGTAGTG - 3f (korespondující nukleotidům 61 až 79) a 5' - GTGAATTCTATTTTTTATCTTCTATATTTTGAGGCTCTG - 3' (korespondující nukleotidům 560 až 590). Plasmidová pZS7 DNA byla podrobena 30 cyklům PCR na DNA Thermal Cycler (Bio-Med60). Denaturace byla provedena při 94 °C po 60 s, tepelné zpracování při 48 °C po 90 s a extenze při 72 °C po 90 s. Amplifikovaný fragment byl ligován v rámečku s genem gluthathion S-transferasy do pGEX-2T vektoru po digesci BamHI a EcoRI a byl použit pro transformaci DH5a hostitelských buněk.

2.2. Exprese a purifikace rekombinantního OspG

Exprese gluthathion-S-transferasa-OspG fuzního proteinu v E.coli DH5a, afinitní purifikace a štěpení fuzního proteinu endoproteinasou trombinem bylo provedeno podle doporučení výrobce (Pharmacia). 16 2.3. (3H) palmitat značení a Triton X-100 fázové rozdělování E.coli organismy s plasmidy nesoucími kompletní (pZSX77) zkrácené (pOspG) verse ospG genu byly kultivovány za přítomnosti (9,10—(n)—3H) palmitové kyseliny (specifická aktivita *50 Ci/mmol, Amersham) a radioznačené lipoproteiny byly extrahovány Triton X-100 rozdělením do fází jak bylo popsáno dříve (46). 2.4. Vývoj imunitního séra a sérologie

Imunitní séra byla získána od myší dříve inokulovaných na ocase bud 10« (C.B-17; IS anti-108) nebo 103 (DBA/2; IS anti-103) živými B.burgdorferi spirochetami kmenu ZS7 nebo "primed" 5-10 pg lipidovaného (lip) lipOspA (BALB/c; IS anti-1ipOspA) nebo rekombinantním (rec) recOspG (BALB/c; IS anti-recOspA) s.c. s adjuvans (ABM2; Sebac, Aidenbach, Germany) a posílených po 10 a 20 dnech. Všechna séra byla analyzována ELISA na množství spirochety-specifických imunoglobulinů (Ig) v bud kompletním lysátu spirochet (B.b.Ig) nebo v recOspA (OspA Ig) nebo recOspG (OspG Ig) jak bylo popsáno dříve (39). 2.5. Pokusy ochrany SCID myši byly bud ponechány bez ošetření nebo rekonstituovány bud normálním myším sérem (NMS) nebo poolovaným imunitním sérem (IS). Množství spirochet-specifických IG (ELISA nebo kompletní B.burgdorferi buněčné lyzáty) transferované s jednotlivým IS bylo následující: IS anti-108, 4,4 pg lg/myš; IS anti-103, 4,5 pg/myš IS anti-1ipOspA, 5 pg/myš; IS anti-recOspG, 72 ng/myš. Při testování na recOspG bylo množství specifických Ig asi 10 - 20 krát vyšší v IS anti-recOspG ve srovnání s IS anti-103. IS byly podány i.p. a o hodinu později byly příjemci vystaveni 105 spirochetám (B.burgdorferi ZS7) s.c. Myši byly zkoumány na vývoj klinické artritidy za podmínek slepého pokusu na přítomnost 17 spirochet kultivací biopsií ucha v BSK mediu jak bylo popsáno dříve (37,40). 2.6. Patologie Vývoj klinické artritidy v tibiotarsálním skloubení byl monitorován za podmínek slepého pokusu jak bylo popsáno dříve (37,40). Použité hodnocení bylo následující: + + , těžká; + méně těžká; (+) střední; +/- mírný otok; (+/-) hraniční otok, zarudnutí; a -, žádné známky artritidy. Výsledky

Klonování OspG a analýza rekombinantních konstruktů B.burgdorferi ZS7 genomová DNA expresní knihovna byla vyšetřována imunitním sérem od myší dříve infikovaných 103 spirochetami (IS anti-103). U tohoto IS bylo ukázáno dříve, že postrádá protilátky proti OspA a OspB, ale uděluje ochranu SCDI myším proti následné infekci (35). Navíc, toto IS rozpoznává dva individuální proteiny s relativní molekulární hmotností 19 - 20 kDa a dva proteiny * 40 kDa, je-li testováno na imunoblotech z lyzátů celých buněk kmenu ZS7 separovaných dvourozměrovou gelovou elektroforesou. Bylo identifikováno přibližně 20 klonů s jedním klonem částečně reaktivním, který byl označen pZS77.

Rekombinantní plasmid pZS77 byl podroben restrikční analýze, subklonování a sekvencování. Nukleotidová sekvence OspG spolu s aminokyselinovou sekvencí OspG jsou ukázány na Obrázku 1. Konsensuální vazebné místo pro ribosom (GGAG) je umístěno 10 bp "upstream" ATG start kodonu OspG genu.Dále "upstream" této translační iniciační sekvence jsou -10 region (TATATT), v poloze -70 až -64, a -35 region (TTGTTA) v poloze -105 až -100. Dvě krátké invertované opakující se sekvence ATATTT a TTACATTT byly obsaženy v tomto "upstream" regionu mezi polohou -118 až -49. ATG 18 start kodon OspG genu v poloze +1 je následován otevřeným čtecím rámečkem o 588 nukleotidech, korespondujícím s 196 aminokyselinovým proteinem s počítanou molekulární hmotností 22049 kDa. Možný rho-nezávislý terminátor byl identifikován mezi pozicí 620 a 656. Připojení DNA sekvence "upstream" ATG start kodonu OspG genu s nedávno popsaným promotorovým regionem ospE-ospF operonu jeví 94% identitu jak je určeno GAP algoritmem. Všimněme si, že ospG promotor obsahuje dva vysoce konzervované oktamerové DNA motivy, ATGTATTT (v poloze -187 až -180) a AATTACAT (v poloze -120 až -113), které - jak bylo ukázáno dříve - asociují s protein vazebným místem pro negativní regulátorovou molekulu, pojmenovanou MATa2 a regulují genovou expresi v průběhu diferenciace kvasinky (5,25). Tyto DNA motivy byly identifikovány na dvou genech MFa2 a BARI od Saccharomyces cerevisiae a obsahují nedokonalé opakující se sekvence motivu, který se podobá imunoglobulinovému oktamerovému motivu ATTTGCAT. Ještě zajímavější je, že další imunoglobulinová (Ig) oktameru podobná sekvence ATTTGCAA (v poloze -154 až -147) je umístěna mezi dvěma S.cerevisiae podobnými motivy, které se liší od Ig-oktamerového motivu pouze jednou přechodnou substitucí.

Aminokyselinová sekvenční analýza OspG

Hydropatický profil OspG napovídá, že protein je z velké části hydrofilní s jednou hydrofobní doménou okolo 20 aminokyselin v amino koncové části. Tento N-koncový region jeví podobnost s "leader" signálním peptidem přítomným v typických prokaryotních 1ipoproteinech (51,52). Na COOH-konci signální sekvence je putativní signální peptidasu II rozpoznávající motiv Leu-X-Y-Z-Cys (Obrázek 3a). Potenciální štěpící místo v OspG je umístěno mezi serinem v poloze 19 a cysteinem v poloze 20. Spočítaný izoelektrický bod je pí 5.2. Srovnání aminokyselinové sekvence OspG se sekvencemi všech známých proteinů zevního povrchu B.burgdorferi, OspA - OspF a P27, ukazuje, že OspG 19 vykazuje vysokou homologii s OspF (65%) (Tabulka 1). Navíc, bazický N - koncový peptidový motiv M-N-K-K-M OspG je identický s tím, který je pozorován u OspE a OspF.

Mapování OspG

Plasmidová a chromozomální DNA několika B.burgdorferi kmenů byla separována gelovou elektrofořežou v pulzním poli a hybridizována ospA a ospG specifickými probami. Vyhodnotili jsme velikost plasmidu obsahujícího ospA jako 53 kb pro německý B.burgdorferi izolát ZS7. OspA obsahující plasmid kmene ACA-1 byl stěží viditelný díky malému množství DNA zavedenému do gelu, ale byl pozorován při prodloužené expozici (data nejsou ukázána). Při použití ospG proby byl pozorován prominentní proužek s lineárním plasmidem okolo 48 kb a jeden slabší s 45 kb plasmidem kmene ZS7. Oproti tomu u amerického kmene B31 dva plasmidy velikosti 45 kb a asi 35 kb hybridizovaly s ospG genovou probou. Povšimněme si, že nebyla pozorována hybridizace, pokud byla použita genomová DNA z B.garinii kmenů ZQ1 a 20047 stejně jako z kmenu B.japonica H014. V kontrolním pokusu byla použita ospE-ospF proba odvozená od kmenu ZS7 k určení toho, jestli mohou být pozorovány odlišné proužky u těchto genomových DNA. Tento pokus ukázal dva plasmidy 45 kb a 35 kb pro kmeny ZS7, B31, 20047 a 21038. DNA izolované z jiných druhů Borelií, jako je B.coriaceae Co53, B.hermsii, a B.turicatae, a z Treponema pallidum nehybridizovaly s ospG probou, což ukazuje specificitu pro druh B.burgdorferi . RFLP ospG genu

Analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) ospG endonukleasou HindlII ukázala alespoň sedm různých hybridi začnich vzorků mezi 20 testovanými B.burgdorferi izoláty: většina B.burgdorferi "sensu stricto” izolátů je charakterizována dvěma hybridizačními fragmenty 1,8 a 3,8 kb (Obrázek 6, linie 1); 3 z 6 20 izolátů B.garinii nehybridizovalo s ospG probou a B.garinii kmeny 20047 a S90 vykazovaly fragmenty 1,8 kb a 1,7 a 3 kb, v příslušném pořadí (data nejsou ukázána); mezi kmeny druhu B. afzelii byly pozorovány alespoň tři různé hybridizační vzorky: jeden proužek 2.4 kb pro kmen ACA-1 (linie 3) a dva proužky bud 1.9 a 2 kb pro kmen MMS (linie 4) nebo 2 a 5 kb pro kmen NE40 (linie 5).

Exprese OspG rekombinantního proteinu v E.coli Při amplifikaci OspG PCR byly primery vybrány takovým způsobem, aby konečný rekombinantní produkt postrádal 20 aminokyselinových zbytků tvořících "leader" peptid (46).

Amplifikovaný OspG kódující produkt byl insertován v rámečku s proteinovým nosičem expresního vektoru pGEX-2T (Pharmacia, Freiburg, Germany) a po indukci IPTG byl získán GST-OspG fúsní protein o přibližně 44 kDa. GST-OspG fuzní protein byl obohacen z E.coli lyzátu použitím gluthation-agarosových korálků a následnou digescí vazby GST-OspG fúsních proteinů místně specifickou proteasou.

Značení (3H) palmitátem K určení toho, je-li OspG exprivován jako lipoprotein v E.coli byly DH5a buňky transformovány bud plasmidem pZS77 nebo pOspG a značeny s (3H) palmitátem (Obrázek 8). Plasmid pZS77 kóduje kompletní OspG prekursorový protein s jeho normální N-koncovou signální sekvencí, zatímco pOspG specifikuje protein, který má prvních 21 zbytků OspG prekursoru nahrazeno sekvencí Met-Lys. Po extrakci dělením do detergentní fáze a separaci SDS-PAGE byly radioaktivní produkty vizualizovány fluorografií. E.coli buňky obsahující kompletní OspG gen (plasmid pZS77) exprivovaly 20 kDa lipoprotein, který se dělí do detergentní fáze, zatímco lipoprotein nemohl být pozorován u DH5a buněk obsahujících 21 zkrácený ospG gen.

Subcelulární lokalizace OspG K určení subcelulární lokalizace OspG v intaktním organismu byly spirochety ošetřeny proteinasou K a následně analyzovány užitím imuno-blotingu za použití anti-103 séra využitého k izolaci ospG z expresní knihovny. Anti-103 imunosérum detekovalo čtyři proteiny nízké molekulární hmotnosti, které částečně vymizely po proteolýze, zatímco dvě struktury molekulární hmotnosti v rozmezí * 40 kDa nebyly narušeny ošetřením proteasou (17). K určení toho, je-li rOspG rozpoznán anti-103 sérem bylo provedeno Western blotting. Po absorpci anti-103 séra rOspG rozpoznávalo absorbované anti-103 sérum stejné velké proteiny identické velikosti (0br.7A) což napovídá, že OspG nemusí být přítomen mezi proteiny nízké molekulární hmotnosti obsaženými v lyzátech in vitro kultivovaných ZS7 nebo alternativně, proteolýza OspG se může vyskytnout. Aby se potvrdila identita OspG a aby bylo zřejmé, je-li OspG schopen být exprivován v in vitro kultivované B.burgdorferi ZS7, hyperimunní myší nti-rOspG sérum selhalo v detekci OspG z 109 in vitro kultivovaných ZS7 organismů.V některých experimentech mohla být pozorována slabá neočekávaná reaktivita s 40 kDa polypeptidem, který může být bud variantou OspG nebo representuje B.burgdorferi protein, který sdílí některé epitopy s OspG. Aby se zhodnotila exprese ospG genu v in vitro kultivovaných B.burgdorferi ZS7 byla celková RNA izolována a analyzována na přítomnost opgG transkriptu Northern blot hybridizací. Jako kontrola pro in vitro expresi a RNA degradaci byl NC filtr probován ospA genovou probou. Oproti ospA probě, která se vázala na jeden 2 kb transkript, ospG proba selhala v detekci ospG transkriptu. Tyto výsledky napovídají, že deficit v OspG expresi během in vitro kultivace se jeví být na úrovni ospG transkripce mRNA stability. Zatímco OspG nebyl detekovatelný v lyzátech z in 22 vitro kultivovaných B.burgdorferi ZS7 může být exprese OspG odlišná během kultivace v savčím hostiteli. Imunoblotová analýza za použití reprezentativních vzorků séra od jak lidských pacientů s Lymskou chorobou, tak od experimentálně infikovaných myší ukázala, že protilátky se specificitou pro OspG byly přítomny. 6 ze 13 vzorků séra od pacientů s dokumentovanou lymskou boreliosou obsahovalo anti-OspG protilátky. Oproti tomu, všechna séra od zdravých dárců (n=8) neobsahovala protilátky rozpoznávající rOspG (data nejsou ukázána). Tato zjištění napovídají, že OspG je exprivován pouze v průběhu infekce. Částečná ochrana SCID myší anti-OspG imunitním sérem

Aby se testovala ochranná kapacita anti-OspG imunitního séra byly SCID myši ošetřeny následujícím množstvím B.burgdorferi specifických Ig z poolovaných (Immune Sera) IS přípravků: C.B-17 IS anti-108 (4,4 pg B.b. lg/myši), DBA/2 IS anti-103 (4,5 pg B.b. lg/myši), BALB/c IS anti-lipOspA (5 pg B.b. lg/myši), a BALB/c IS anti-recOspG (72 ng B.b. lg/myši). Nicméně, IS ant i-recOspG obsahoval > 10 krát více protilátek k recOspG ve srovnání s IS anti-103. SCID myši byly injikovány intraperitoneálně s indikovaným IS a následně vystaveny 105 B.burgdorferi organismům. Byl monitorován vývoj klinické artritidy a přítomnost spirochet v biopsiích z ucha. U inokulovaných, ale jinak neošetřených nebo (normální myší sérum) MNS ošetřených myší se vyvinula klinická artritida od dne 6 p.i. s těžkými otoky tibiotarsálního skloubení, které se vyvinuly mezi dnem 13 a 24 (konečný bod). Jak bylo popsáno výše, SCID myši pasivně imunizované IS anti-108 nebo IS anti-103 a Is anti lipOspA nevykazovaly žádné nebo pouze marginální příznaky klinické artritidy. Oproti tomu, u SCID myší pasivně imunizovaných IS anti-recOspG se vývoj artritidy pouze opozdil jak ukazuje lehký otok mezi dny 6 a 18.Později se u těchto myší vyvinuly těžší formy artritidy což ukazuje, že toto IS je méně 23 účinné než jiná IS v kontrole infekce. Fakt, že IS anti-recOspG obsahoval > 10 krát více protilátek k recOspG než IS anti-103, ale byl méně účinný v ochraně napovídá, že u IS anti-103 další specificity přispívají ke kontrole infekce. 24

Odkazy 1. Aron. L.f M. Aiekshun, L. Periee, I. Schwartz, H.P. Godfrcy and F.C. 5 Cabeilo. 1994. Cloning and DNA sequence anaiysis of bmpC, a gene encoding a potentiai membrane Iiproprotein of Borreiia burgdorferi. FEMS Microbioi. Len. 123: 75-82. 2. Barbour, A.G., S.L. Tessier, and S.F. Hayes. 1984. Variadon in a major 10 surface protein of Lyme disease spirochetes. Infect. Immun. 45:94-100. 3. Barbour, A.G., and H.G. Stoenner. 1985. Anugenic variadon of Borreiia hermsii. UCLA Symp.MoiCell.Bioi.New Ser. 20:123-125. 15 4. Bergstróm, S., V.G. Bundoc. and A.G. Barbour. 1989. Moiecuiar anaiysis of Iinear piasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of tíie Lyme disease spirochaete Borreiia burgdorieri. Mol. Microbioi. 3:479-486. 5. Borst, P. and D.R. Greaves. 1987. Programmed gene rearrangements 20 aitering gene expression. Science 235:658-667. 6. Brandt, M.E., B.S. Riley, J.D. Radolf, and M.V. Norgard. 1990. Immunogenic integrál membrane proteins of Borreiia burgdorieri are lipoproteins. Infect. Immun 58:983-991. 25 7. Bressan, G.M. and K.K. Stanley. 1987. pUEX, a bacterial expression vector reiated to pEX with umversal host speciťicity. Nuci. Acids Res. 15:10056. 8. Burgdorier, W., A.G. Barbour, S.F. Hayes, J.L. Benach, E. Grunwaldt, 30 and J.P. Davis. 1982. Lyme disease - a tick-bome spirochestosis? Science 216: 1317-1319. 9. Champion, C.I., D.R. Blanco, J.T. Skare, D.A. Haake, M.Giladi, D.Folev, J.N. Miller, and M.A. Lovett. 1994. A 9.0-kilobase-pair circular piasmid of 35 Borreiia burgdorieri encodes an exported protein: Evidence for expression oniy during infecdon. Infect. Immun. 62:2653-2661. 10. Church, G.M. and W. Gilbert. 1984. Genomic sequencing. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995. 25 11. Craft, J.E., D.K. Fischer, G.T. Shimamoto. and A.C. Steere. 1986. Antigens of Borreiia burgdorferi recognised during Lyme disease. J Clin. Invest. 78:934-939. 5 12. Dattwyier, R.J., D.J. Volkman, J.J. Haiperin. B.J.Luřt, J. Thomas, and M.G. Goiightiy. 1988. Specific immune responses in Lyme borreiiosis. Ann. NYAcad. Sci.USA 539:93-102. 10 13. Fikrig, E., S.W. Barthold, F.S. Kantor, andR.A. Flaveil. 1992. Long- tenn protecdon of mice řrom Lyme disease by vaccination with OspA. Infect. ímmim. 60:773-777. 14. Fikrig, E., S.W. Barthold, N. Marcantonio. K. Deponte, F.S. Kantor, and 15 R.A. Flaveil. 1992. Roies of OspA, OspB, and flageilin in proteciive immunity to

Lyme borreiiosis in laboratory mice. Inrect. Immun. 60:657-661. 15. Fikrig, E., H. Tao, F.S. Kantor, S.W. Barthold. and R.A. Flaveil. 1993. Evasion of protective immunity by Borreiia burgdorferi by truncation of outer 20 suriace protein B. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:4092-4096. 16. Fuchs, H., R. Wailich. M.D. Kramer, and M.M. Simon. 1994. The outer suriace protein A of Borreiia burgdorferi is a plasmrn (ogen) binding protein. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 91:12594-12598. 25 17. Gem, L., U.E. Schaible, and M.M. Simon. 1993. Mode of inoculation of the Lyme disease agent Borreiia burgdorferi influences iniection and immune responses in inbred strains oř mice. J. Infect. Dis. 167:971-975. 30 18. Hughes, C.A.N., S.M. Engstrom, L.A. Coieman. C.B. Kodner, and R.C.

Johnson. 1993. Protective immunity is induced by a Borreiia burgdorferi mutant that lacks OspA and OspB. Infect. Immun. 61:5115-5122. 19. Jonsson, M., L. Noppa, A.G. Barbour, and S. Bergstróm. 1992. 35 Heterogeneiry of outer membrane proteins in Borreiia burgdorferi: Comparison of osp operons of three isolates of different geographic origins. Infect. Immun. 60:1845-1853. 26 20. Kurashige, S., M. Bissett, and L. Oshiro. 1990. Characterisadon of a dek isoiate of Borreiia burgdorferi that posseses a major low-moiecuiar-weight surface protein. J. Clin. Microbioi. 28:1362-1366. 5 21. Laemmii, U.K. 1970. Cleavage of structurai proteins during the assembiy of tbe head of bacteriophage T4. Nátuře 227: 680-685. 22. Lam, T.T., T.-P.K. Nguyen, R.R. Montgomery, F.S. Kantor, E. Fikrig, and R.A. Flaveil. 1994. Outer sumce proteins E and F of Borreiia burgdorferi, 10 tbe agent of Lyme disease. Infect. Immun. 62:290-298. 23. Margoiis. N., and P.A. Rosa. 1993. Regulation of expression of major outer surface proteins in Borreiia burgdorferi. Infect. Immun. 61:2207-2210. 15 24. Masuzawa, T., H. Kawabata. Y. Beppu, K. Miyamoto. M. Nakao. N. Sáto, K. Muramatsu, R.C. Jobnson, and Y. Yanagibara. 1994. Characterisadon of monocionai antibodies for identificadon of Borreiia japonica. isolates from Ixodes ovams. Microbioi. Immunoi. 38:393-398. 20 25. Miller, A.M., V.L. MacKay, and K.A. Nasmyth. 1985. Idendňcadon and comparison of two sequence eiements that confer ceii-cype specinc cranscription in yeast. Nátuře 314: 598-603. 25a. Miller, J.F., J.J. Mekaianos, and S. Falkow. 1989. Co-ordinate reguiarion 25 and sensory transducdon in tbe controi of bacterial viruience. Science 243:916-922. 26. Needleman. S.B., and C.D. Wunsch. 1970. A generál metbod applicable to the seareb for similarides in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 48:443-453. 30 27. Nguyen, T.-P.K., T.T. Lam, S.W. Barthold, S.R. Telford, EU, R.A. Flaveil, and E. Fikrig. 1994. Pardal destrucdon of Borreiia burgdorferi within deks that engorged on OspE- or OspF-immunised mice. Infect. Immun. 62:2079-2084. 35 28. Norris, S.J., C.J. Carter, J.K. Howell, and A.G. Barbour. 1992. Low-passage-associated proteins of Borreiia burgdorferi B31: Characterisadon and 27 moiecuiar cioning of OspD, a surface-exposed, piasmid-encoded lipoprotein.

Infect. Inunun. 60:4662^*672. 29. 0'Farrei, P.H. 1975. High resoiution two-dimensional poly-acryiamide gel 5 electrophoresis. J. Bioi. Chem. 250:4007-4021. 30. Padula, S.J., A Sampieri. F. Dias, A. Szczepanski, and R.W. Ryan. 1993. Moiecuiar characterisation and expression of p23 (OspC) from a North American strain of Borreiia burgdorieri. Infect. Immun. 61:5097-5105. 10 31. Preac-Mursic, V., B.Wílske, E.Patsouris. S. Jauris, G. Will, E. Soutschek, S. Rainhardt, G. Leimert, U. Klockmann. and P. Mehraein. 1992. Active immunisation witii pC protein of Borreiia burgdorieri protects gerbils against B. burgdorieri inrecaon. Infection 20: 342-349. 15 32. Reindl, Μ., B. Redl, and G. Stóffler. 1993. Isolation and analvsis of a linear piasmid-located gene of Borreiia burgdorieri B29 encoding a 27 kDa suriace Iipoprotein (P27) and its overexpression in Eschericbia coii. Mol. Microbioi. 8:1115-1124. 20 33. Reindl, Μ., B. Redl, and G. Stóffler. 1994. A restriction map of the ospAB operon containing linear piasmid of Borreiia garinii B29, p.57-60.In: R. Cevenini, V. Sambri, M. Placa, (eds.) Advances in Lyme Borreiiosis research. Proč. of the VI. Int. Conf. on Lyme Borreiiosis. Boiogna. Italy. 25 34. Sadziene, A., B. Wilske, M.S. Ferdows, and A.G. Barbour. 1993. The cryptic ospC gene of Borreiia burgdorieri B31 is located on a circuiar piasmid. Infect. Immun. 61:2192-2195. 30 35. Schaible, U.E., L. Gem, R. Wailich, M.D. Kramer, M.Prester, and M.M.

Simon. 1993. Disrinct pattems of protective antibodies are generated against Borreiia burgdorferi in mice experimentally inocuiated with high and low doses of antigen. Immunol. Lett. 36:219-226. 35 36. Schaibie, U.E., M.D. Kramer, K. Eichmann, M. Modolell, C. Museteanu, and M.M. Simon. 1990. Monoclonal andbodies specific for the outer surface protein A (OspA) of Borreiia burgdorferi prevent Lyme borreiiosis in severe 28 combined immunodeííciency (scid) mice. Proč. Nati. Acad. Sci USA 87: 3768- :/ /2. 37. Sciiaible, U.E., M.D. Kramer, C. Museteanu, G. Zimrner, H. Mossmann, 5 and M.M. Simon. 1989. The severe combined immunodeficiency (scid) mouše. A laboratory modei for the anaiysis of Lyme arthritis and carditis. J. Exp. Med. 170:1427-1432. 38. Schaible, U.E., R. Wallich, M.D. Kramer, L. Gem, J.F. Anderson, C. 10 Museteanu, and M.M. Simon. 1993. Immune sera to individuai Borreiia burgdorferi isolates oř recombinant OspA thereof protéct SCID mice against infection with homologous strains but oniy partiaily or nt at ail agaisnt those of different OspA/OspB genotype. Vaccine 11:1049-1054. 15 39. Schouls, L.M., H.G.J. van der Heide, and J.D.A. van Embden. 1991.

Characterisation of the 35-Sdiodaiton Treponema pallidum subsp. pallidum recombinant lipoprotein TmpC and antibody response to lipidated and noniipidated T.pallidum antigens. Infect. Immun. 59:3536-3546. 20 40. Simon, M.M., U.E. Schaibie, M.D. Kramer, C.Eckerskom. C. Museteanu, H.K. Můller-Hermeíink. and R. Wallich. 1991. Recombinant outer surřace protein A from Borreiia burgdorřeri induces antibodies protective against spirochetal infection in mice. J. Infect. Dis. 164: 123-132.

25 41. Simon, M.M., U.E. Schaibie, R. Wallich, and M.D. Kramer. 1991. A mouše modei for Borreiia burgdorferi infection: Approach to a vaccine against Lyme disease. Immunol. Today 12:11-16. 42. Simpson, W.J., W. Burgdorfer, M.E. Schrumpf, R.H. Karstens, and T.G. 30 Schwan. 1991. Antibody to a 39-kilodalton Borreiia burgdorferi antígen (P39) as a markér for infection in experimentaily and naturaily inocuiated animais. J. Clin. Microbiol. 29:236-243. 43. Simpson, W.J., W. Cieplak, M.E. Schrumpf, A. G. Barbour, and T.G. 35 Schwan. 1994. Nucieotide seauence and anaiysis of the gene in Borreiia burgdorferi encoding the immunogenic P39 antigen. FEMS Microbiol. Lea. 119:381-388. 29 44. Steere, A.C. 1989. Lyme disease. N. Eagl. J. Med. 321:586-596. 45. Wallicii, R., C. Heimes, U.E. Schaiole, Y. Lobet, S.E. Moter, M.D. Kramer, and M.M. Simon. 1992. Evaluadon of genetic divergence among 5 Bonelia burgdorferi isoiates by use of OspA, fla, HSP60, and HSP70 gene probes. Infect. Immun. 60:4856-4866. 46. Wailich, R., S.E. Moter, M.M. Simon, K. Fonet, A. Heiberger, and M.D. Kramer. 1990. The Borreiia burgdorferi flageilum-associated 41-kilodalton antigen 10 (flageilin): Molecuiar cioning, expression, and ampiificarion of che gene. Infect. Immun. 58:1711-1719.

47. Wailich. R., U.E. Schaiole, M.M.Simon, A. Heiberger, and M.D. Kramer. 1989. Cioning and sequencing of the gene encoding the outer surface protein A 15 (OspA) of a European Borreiia burgdorřeri isolate. Nucieic Acids Res. 17:8864. 48. Wailich. R.T M.M. Simon, H. Honnann, S.E. Moter, U.E. Schaibie, and M.D. Kramer. 1993. Molecuiar and immunoiogicai characterisation of novel poiymoiphic lipoprotein of Borreiia burgdoríeri. Infect. Immun. 61:4158-4166. 20 49. Wailich, R., et ai. Unpublished data. 50. Wilske, B., A.G. Barbour, S.Bergstróm, N. Burman, B.I. Restrepo, P.A. Rosa. T. Schwan. E. Soutschek. and R. Wailich. 1992. Antigenic variation and 25 strain heterogeneity in Borreiia spp. Res. Microbioi. 143:583-596. 51. Wu, H.C. 1987 Posttranslational modification and processing of memberane proteins in bacteria, p. 37-74; In: M. Inouye (ed.) Bacteriai outer membranes as model systems. John Wiley & Sons, lne., New York. 30 52. Wu, H.C. and M. Tokunaga. 1986. Biogenesis of lipoproteins in bacteria. Curr. Top. Microbioi. Immunoi. 125:127-157. 30 (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel (A) Jméno: Max Plaňek Gesellschaft zur Forderung der Wissenschaft e V (B) Ulice: Busenstrasse 10 (C) Město: Gottingen (E) Země: Německo (F) Poštovní kod (ZIP): D-3400 (A) Jméno: Deutsches Krebsforschungszentrum Stitung des offentilichen Rechts (B) Ulice: Im Neuenheimer Feld 280 (C) Město: Heildelberg (E) Země: Německo (F) Poštovní kod (ZIP): D-6900 (ii) Název vynálezu: Vakciny (iii) Počet sekvencí: 2 (iv) Počítačová čtecí forma: (A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatibilní

(C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (EPO) (2) informace pro sekvenci č.l: (i) Sekvenční charakteristiky: (A) délka: 196 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová 31 (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetický: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Původní zdroj: (A) organismus: B.burgdorferi

(B) jednotlivý izolát: Osp G (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 1:

Met Asn tys I

Lys Mec Lvs Asn Leu Ile Ile Cys Ala Val Phe Val Leu S 10 1S

Ile Ile Ser Cys Lys Ile Asp Ala Ser Ser Glu Asp Leu Lys Gin Asn 20 25 30

Val Lvs Glu Lys Val Glu Gly Phe Leu Asp Lys Glu Leu Met Gin Gly 35 40 45

Asp Asp Pro Asn Asn Ser Leu Phe Asn Pro Pro Pro Val Leu Pro Ala 50 53 SQ

Ser Ser His Asp Asn Thr Pro Val Leu Lys Ala Val Gin Ala Lys Asp S5 70 75 30

Gly Gly Gin Gin Glu Gly Lys Glu Glu Lys Glu Lys Glu Ile Gin Glu 85 90 95

Leu Lys Asp Lys Ile Asp Lys Arg Lys Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg 100 105 HO

Lys Lys Phe Gin Glu Phe Lys Glu Gin Val Glu Ser Ala Thr Gly Glu US 120 125

Ser Thr Glu Lys Val Lys Lys Gin Gly Asn Ile Gly Gin Lys Ala Leu 130 135 140 32

Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Gly Val Asn Gly Ser Tyr Ser Val Asn Asp

145 ISO 1S5 ISO

Gly Thr Asn Thr Asn Asp Phe Val Lys Lys Val Ile Asp Asp Ala Leu

165 170 17S

Lys Asn Ile Glu Glu Glu Leu Glu Lys Leu Ala Glu Pro Gin Asn Ile 130 185 19°

Glu Asp Lys Lys 19 S (2) Informace pro sekvenci č.2: (i) Sekvenční charakteristiky: (A) délka: 591 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetický: ne (v) (iv) Anti-sense: ne Původní zdroj: (A) organismus: Borrelia burgdorferi 33 (B) kmen: zs7 (vii) Bezprostřední zdroj:

(B) klon: ospG (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 2* :gat aatttcttgc A7GAATAAGA AAA7GAAAAA 7T7AA77A7T TG7GCAGT 50 AAGA77GA7G C3AG7AG7GA AGA777AAAA CAAAA7G7AA AAGAAAAAG7 7GAAGGA777 120 77AGA7AAAG AGT7AA7GCA AGGTGAC3AT CC7AA7AACA GTC7G777AA 7CCACCACCA 130 G7A77GCCGG CAAG77CCCA CGATAACACA CCCG7AT7AA AAGCGG7GCA AGCAAAAGA7 240 GG7GG7CAAC AAGAAGGAAA AGAAGAGAAA GAAAAAGAAA 77CAAGAA77 AAAGGA7AAA 300 A7AGA7AAAA GAAAAAAAGA A77AGAAGAG GC7AGAAAGA AA777CAAGA A777AAAGAA 350 CAAG77GAAT CTGCAAC7GG AGAAAG7AC7 GAGAAAG77A AAAAACAAGG AAA7A77GGA 420 CAAAAAGCT7 7AAAG7A7GC 7AAAGAAT7G GG7G7AAA7G GAAGTTAT7C 7G77AA7GA7 430 GG7AC7AA7A C7AA7GA777 7G7AAAAAAG G77A7AGA7G A7GC7C77AA AAA7A77GAG 540 GAAGAACT7G AAAAGC7AGC AGAGCC7CAA AA7A7AGAAG A7AAAAAA7A A 551 34

Tabulka 1: Lipoproteiny zevního povrchu Borrelia burgdorferi jméno | zdroj| délka| MW 1 pi| plasmid |podobnost| odkaz. | (kmen| (aa) | (kDa) 1 1 loc. |s OspG(%)| OspA ZS7 273 29.3 8.9 49 kb linear 48.4 (47) OspB B31 296 31.8 9.9 49 kb linear 43.1 (4) OspC B31 210 22.3 8.6 26 kb cirkul. 41.8 (30) OspD B31 257 28.4 5.2 38 kb linear 45.6 (28) OspE N40 171 19.2 8.1 45 kb 52.9 (22) OspF N40 230 26.1 5.3 45 kb 64.9 (22) tato OspG ZS7 196 22 5.2 55 kb studie P27 B29 248 28.9 8.6 49 kb linear 45.2 (32) 35

Tabulka 2: Vývoj klinické artritidy u jednotlivých SCID myší neošetřených nebo předem ošetřených i.p. jednotlivým imunitním sérem a následně inokulovaných lxlO3 Borrelia burdorferi ZS7

Transfer. myš kliň. artritida za cenu p.i. rekultivace sérum č. 6 13 18 20 27 (ucho) None 1 - + / + + +/+ + + +/ + - - ++/+ + + 2 . (±)/(±) + / + o. NMS 1 (±)/± + / + + +/+ + + +/ + - - ++/ + + + [5 μ$/: myš] 2 ±J(±) +/+ ťt/ťt + +/+- - ++/+ + + 3 (±)/(±) +/+ T* P“/ T* “ - ++/ + + “P IS anti-KP I - - - - - - (DBA/2) 2 - - - - - - [4,5 μg spec. * a d± - - - ±/(±) - ig/i 4 - • - (±)/- ±J- - IS anti-lO^ 1 ±/- - - - - (C.B-17) 2 - -l± - - - - [4,4 μg spec. ** - - - - - - lg/: myš j 4 ±/± -/i * - ±/- - IS anti- 1 (±)/(±) - - - (±)/- - lipOspA 2 ±J± - - - - - (BALB/c) [5 μ 3 - - - - - - g spec. 4 - - - -/(±) - - lg/ myš IS anti- 1 - (+)/(+) ±!- +/4- + + +/ + + 4. recOspG 2 - (+)/(+) ±/± (+)/(+) + +/+T + (BALB/c) [72 3 - (+)/(+) ξ/ξ + +/ + - - -r -r/ -r + ng spec. 4 - (+yc+) (-1-)/+ + +/ + - - ++/++ + lg/'· myš mAb LA 10* 1 - - - (±)/± (+)/(+) *r [5 μg spec. 2 - (+)/(+) +/ + + +/ + - - + +/4- + lg/i myš .*] 3 - (+)/(+) +/ + + +/ + - - ++/(+) + 4 • (+)/(+) O.Í./IX + +/ + - - ++/4- + + mAB LA2* [5 1 - - - « • « spec. 2 - ±/- (±)/- - - - Ig/imyš:] j - ±/- - - - - 4 • - - - - -

Hodnocení: ++ těžká, + méně těžká, (+) střední, ± mírný otok, (±) hraniční otok, zarudnutí, - žádné klinické známky na pravém nebo levém tibiotarsálním skloubení. * mAb byly popsány dříve (20, 35, 39)

Claims (11)

1. 36 PATENTOVÉ NÁROKY 1. Purifikovaný Osp G z B.burgdorferi nebo jeho imunologicky funkční derivát.
2. 2. Purifikovaný Osp G z B.burgdorferi, vyznačuj ící se tím, že má zřejmou molekulární hmotnost 22 kDa, izoelektrický bod PI okolo 5,2, a má 196 aminokyselin, nebo jeho imunologicky funkční derivát.
3. 3. Purifikovaný OspG z B.burgdorferi jak je v podstatě daný na Obrázku 1.
4. 4. Purifikovaný OspG podle nároku 3, mající z alespoň 80 % homologii s aminokyselinovou sekvencí danou na Obrázku 1.
5. 5. Purifikovaný OspG podle nároků pro použití v lékařství.
6. 6. Kompozice vakciny obsahující dále purifikovaný OspG podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4.
7. 7. Kompozice vakciny podle nároku 6 obsahující dále jiný antigen B.burgdorferi.
8. 8. Kompozice vakciny podle nároku 6, obsahující dále OspA antigen B.burgdorferi.
9. 9. Kompozice vakciny podle jakéhokoliv z nároků 6-8 obsahující dále QS21 nebo 3D-MPL. 37 5 10 15 20 25 30 ί Ό I £o<

   Ό O)

   to. Ní O (V). O O CO, i— O ;c ; Zr; O
10. 10. Použiti OspG antigenu podle nároků 1 až 4 pro přípravu vakciny pro imunoprofylak-tickou nebo imunoterapeutickou léčbu pacientů trpících nebo vnímavých k Lymské chorobě.
11. 11. Izolovaná DNA sekvence kódující OspG protein nebo jeho imunologicky funkční derivát podle nároků 1 až 4. 13. Izolovaná DNA sekvence kódující OspG protein podle nároku 12 vyznačující se tím, že má sekvenci v podstatě danou na Obrázku 1. 14. Expresní vektor obsahující DNA sekvenci podle nároků 12 až 13. 15. Hostitelská buňka transformovaná DNA sekvencí podle nároku 12 nebo 13. 16. Způsob produkce purifikovaného OspG podle nároků 1 až 4 vyznačující se t í m, že zahrnuje transformování buněk expresním vektorem podle nároku 14 a izolování kultury těchto buněk a izolování výsledného proteinu. 17. Způsob produkce vakciny obsahující OspG podle nároků 1 až 4 vyznačující se t í m, že zahrnuje smísení uvedeného OspG nebo jeho funkčního derivátu s farmaceuticky přijatelným excipientem. 18. Diagnostický kit, obsahující OspG B.burgdorferi. Z