CZ36546U1 - Souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii - Google Patents
Souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii Download PDFInfo
- Publication number
- CZ36546U1 CZ36546U1 CZ2022-40099U CZ202240099U CZ36546U1 CZ 36546 U1 CZ36546 U1 CZ 36546U1 CZ 202240099 U CZ202240099 U CZ 202240099U CZ 36546 U1 CZ36546 U1 CZ 36546U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- solution
- agent
- sample
- kit
- kit according
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 59
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims description 30
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 title claims description 19
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 102
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 claims description 55
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 claims description 55
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 50
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 40
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 36
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 35
- 229910000487 osmium oxide Inorganic materials 0.000 claims description 33
- JIWAALDUIFCBLV-UHFFFAOYSA-N oxoosmium Chemical compound [Os]=O JIWAALDUIFCBLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 25
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 25
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 19
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 16
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 15
- 238000004382 potting Methods 0.000 claims description 15
- BYDYILQCRDXHLB-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylpyridine-2-carbaldehyde Chemical compound CC1=CN=C(C=O)C(C)=C1 BYDYILQCRDXHLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LJTFFORYSFGNCT-UHFFFAOYSA-N Thiocarbohydrazide Chemical compound NNC(=S)NN LJTFFORYSFGNCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 claims description 10
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 9
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 claims description 8
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012024 dehydrating agents Substances 0.000 claims description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 8
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 claims description 8
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 claims description 8
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000264 sodium ferrocyanide Substances 0.000 claims description 6
- 235000012247 sodium ferrocyanide Nutrition 0.000 claims description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 4
- GTSHREYGKSITGK-UHFFFAOYSA-N sodium ferrocyanide Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] GTSHREYGKSITGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- GAPRPFRDVCCCHR-UHFFFAOYSA-N 3-bromoprop-1-ynyl(trimethyl)silane Chemical compound C[Si](C)(C)C#CCBr GAPRPFRDVCCCHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 3
- LYQGMALGKYWNIU-UHFFFAOYSA-K gadolinium(3+);triacetate Chemical compound [Gd+3].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O LYQGMALGKYWNIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- ZFMIEZYJPABXSU-UHFFFAOYSA-J hafnium(4+);tetraacetate Chemical compound [Hf+4].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O ZFMIEZYJPABXSU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 3
- RLJMLMKIBZAXJO-UHFFFAOYSA-N lead nitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[Pb]O[N+]([O-])=O RLJMLMKIBZAXJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940079877 pyrogallol Drugs 0.000 claims description 3
- JPDBEEUPLFWHAJ-UHFFFAOYSA-K samarium(3+);triacetate Chemical compound [Sm+3].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O JPDBEEUPLFWHAJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- OSCVBYCJUSOYPN-UHFFFAOYSA-K ytterbium(3+);triacetate Chemical compound [Yb+3].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O OSCVBYCJUSOYPN-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 claims description 2
- UETZVSHORCDDTH-UHFFFAOYSA-N iron(2+);hexacyanide Chemical compound [Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] UETZVSHORCDDTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(6+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+6].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims 2
- MZUSCVCCMHDHDF-UHFFFAOYSA-N P(=O)(=O)[W] Chemical compound P(=O)(=O)[W] MZUSCVCCMHDHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 159
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 102
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 76
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 60
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 18
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 14
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 10
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 9
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 8
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 8
- 239000002685 polymerization catalyst Substances 0.000 description 8
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 8
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- 238000001350 scanning transmission electron microscopy Methods 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001198 high resolution scanning electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- -1 lanthanide acetates Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001723 curing Methods 0.000 description 2
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- GDVRUDXLQBVIKP-HQHREHCSSA-N 1-O-galloyl-beta-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 GDVRUDXLQBVIKP-HQHREHCSSA-N 0.000 description 1
- 229920000296 Glucogallin Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013007 heat curing Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960003010 sodium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N uranium Chemical compound [U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U] DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
- B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
- B65D85/00—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials
- B65D85/30—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials for articles particularly sensitive to damage by shock or pressure
- B65D85/42—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials for articles particularly sensitive to damage by shock or pressure for ampoules; for lamp bulbs; for electronic valves or tubes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/2806—Means for preparing replicas of specimens, e.g. for microscopal analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii
Oblast techniky
Technické řešení se týká oblasti zpracovávání biologických vzorků před jejich vyhodnocením pomocí elektronových mikroskopů, konkrétně soupravy chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii, jako je skenovací elektronová mikroskopie s fokusovaným svazkem iontů neboli FIB SEM, sériově bloková skenovací elektronová mikroskopie neboli SBF SEM nebo micro-array tomografie neboli MAT.
Dosavadní stav techniky
Řada metod biologické elektronové mikroskopie vyžaduje, aby odvodněný biologický materiál tvořící vzorek byl nakrájen buď do tenkých vrstev neboli ultratenkých řezů s tloušťkou do 100 nm pro transmisní elektronovou mikroskopii neboli TEM a skenovací transmisní elektronovou mikroskopii neboli STEM nebo aby byl postupně odkrajován/odprašován ve řezech/vrstvách s tloušťkou od 5 nm pro metody 3D skenovací elektronové mikroskopie neboli 3D SEM. Aby bylo možné řezů/vrstev těchto tlouštěk dosáhnout, musí být biologický vzorek složitě zpracováván a nakonec zpevněn zalitím do vhodné pryskyřice. Celý postup začíná nejčastěji chemickou fixací, následuje kontrastování pomocí sloučenin těžkých kovů, dehydratace, prosycení vzorku vhodnou pryskyřicí a končí polymerizací. V současné době existuje velké množství různých postupů, které vykazují tyto společné prvky:
Chemická fixace poskytuje stabilizaci odebraného vzorku a zamezení jeho degradace. Chemická fixace je založena na postupné reakci glutaraldehydu/formaldehydu a oxidu osmičelého s buněčnými komponentami. K odvodnění se používají nejčastěji organická rozpouštědla jako etanol či aceton. Těmi se postupně nahradí volná voda v biologickém preparátu. Dalším krokem je infiltrace preparátu vhodnou, nejčastěji epoxidovou pryskyřicí, rozpuštěnou v dehydratačním činidle. Po prosycení čistou pryskyřicí je vzorek umístěn do vhodné zalévací formy a polymerizován za zvýšené teploty.
Pro nové pokročilé metody biologické elektronové mikroskopie, k nimž patří i metody umožňující 3D rekonstrukci analyzovaného vzorku, se často používá k tvorbě obrazu signálu zpětně odražených elektronů neboli BSE zobrazení. Kontrast v tomto zobrazovacím módu závisí na přítomnosti atomů těžkých kovů, které je nutné do biologického materiálu přidat během procesu přípravy vzorků. Obecně jsou biologické vzorky tvořeny lehkými prvky, které nedostatečně rozptylují primární elektrony a následkem toho výsledný obraz vykazuje nízký kontrast. Za první kontrastující činidlo je považován oxid osmičelý, který se používá během fixace a který reaguje převážně s lipidy v buněčné ultrastruktuře. Pro metody využívající BSE zobrazení neposkytuje rutinní jednostupňové kontrastování oxidem osmičelým dostatečný kontrast. Proto se využívá opakovaných inkubací vzorku v roztoku oxidu osmičelého v kombinaci se sloučeninami zvyšujícími jeho depozit v buněčné ultrastruktuře. Takovými sloučeninami je například thiokarbohydrazid. Tyto postupy jsou označovány jako tzv. „OTO postupy“ (Seligman A. M. et al., A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH), J. Cell Biol, 1966, p. 424-432). Další sloučeninou je kyselina tannová, využívána k tzv. „OTAO postupu“ (Katsumoto T. et al., The effect of tannic acid on the preservation of tissue culture cells for scanning electron microscopy, J. El. Micro., 1981, p. 177-182). Navíc se během odvodnění vzorky kontrastují dalšími roztoky obsahujícími těžké kovy jako jsou uran nebo olovo, zejména pomocí Waltonova roztoku nebo roztoku octanu uranylu. Celkově zpracování vzorku při pokojové teplotě působením různých chemikálií, včetně zalití do vhodné pryskyřice a polymerizace trvá cca 5 pracovních dní. V další fázi přípravy je třeba zalitý vzorek opracovat do požadovaného tvaru.
- 1 CZ 36546 U1
Například pro sériovou blokovou skenovací elektronovou mikroskopii neboli SBF SEM se vzorek trimuje do podoby krychle o straně 400x400 μm, která se přilepí vhodným lepidlem k držáku preparátů. Celý povrch vzorku se pokryje dobře vodivou vrstvou kovu, aby se minimalizovalo možné nabíjení, které se u této metody často vyskytuje.
Nevýhodou těchto řešení je, že pro zpracování biologických vzorků pro výše zmíněné elektronové mikroskopie je třeba v laboratoři připravit řadu roztoků s definovaným složením, osmolaritou a pH. Navíc některé patří mezi speciální chemikálie, které mají často omezenou trvanlivost nebo jsou velmi jedovaté, jako např. oxid osmičelý nebo octan uranylu, což je problematické z hlediska manipulace a bezpečné likvidace nespotřebovaných nebo použitých roztoků.
Úkolem technického řešení je připravit soupravu chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii, která by umožňovala snadnou, rychlou a bezpečnou přípravu biologických vzorků při pokojové teplotě, a dále by vzorky připravené pomocí této soupravy chemických činidel splňovali výše zmíněné požadavky na vlastnosti biologických vzorků pro jejich pozorování technikami 3D skenovací elektronové mikroskopie neboli SEM a transmisní elektronové mikroskopie neboli TEM.
Podstata technického řešení
Vytčený úkol je vyřešen pomocí soupravy chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii, která zahrnuje alespoň po jednom z následujících činidel: fixační činidlo, promývací činidlo, dehydratační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium. Podstata technického řešení spočívá v tom, že alespoň fixační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium jsou v soupravě uspořádané v oddělených a uzavřených baleních pro jednorázové nebo opakované použití. Každé z činidel je v soupravě v uzavřeném balení v množství od 0,1 do 100 ml. Taková souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků umožňuje snadnou, rychlou a bezpečnou přípravu biologických vzorků při pokojové teplotě, přičemž vzorky takto připravené splňují požadavky na vlastnosti biologických vzorků pro jejich pozorování technikami 3D skenovací elektronové mikroskopie neboli SEM a transmisní elektronové mikroskopie neboli TEM.
Fixační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium můžou být v soupravě uspořádané v oddělených a uzavřených baleních pro jednorázové nebo opakované použití, přičemž každé z činidel je v uzavřeném balení v množství od 0,1 do 0,5 ml. Takový objem je vhodný pro přípravu jednotlivých vzorků bez potřeby skladování přebytečných chemikálii.
Fixační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium můžou být v soupravě uspořádané v oddělených a uzavřených baleních pro jednorázové nebo opakované použití, přičemž každé z činidel je v uzavřeném balení v množství od 0,5 do 1,0 ml. Takový objem je vhodný pro přípravu dvou až pěti vzorků najednou a to bez potřeby dalšího skladování nepoužitých, přebytečných chemikálii. Další možností je použití takového objemu v případě, že je potřeba připravit dva až pět vzorků v průběhu několika týdnů v rámci trvanlivosti jednotlivých chemikálií.
Fixační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium můžou být v soupravě uspořádané v oddělených a uzavřených baleních pro jednorázové nebo opakované použití, přičemž každé z činidel je v uzavřeném balení v množství od 0,1 do 5,0 ml. Takový objem je vhodný pro přípravu maximálně 10 vzorků najednou a to bez potřeby dalšího skladování nepoužitých, přebytečných chemikálii. Další možností je použití takového objemu v případě, že je potřeba připravit 10 vzorků v průběhu několika týdnů v rámci trvanlivosti jednotlivých chemikálií.
Fixační činidlo může být vybráno ze skupiny: glutaraldehyd, formaldehyd, oxid osmičelý a/nebo jejich kombinace. Vybrané činidla jsou běžně používaná k fixaci biologických vzorků a s ohledem na jednotlivé popsané metody elektronové mikroskopie.
- 2 CZ 36546 U1
Inkubační činidlo může být vybráno ze skupiny: kyselina tannová, síran sodný, thiokarbohydrazid, pyrogallol, ferokyanid draselný, ferokyanid sodný a/nebo jejich kombinace. Tyto inkubační činidla jsou vybrány s ohledem na zvyšující efekt osmifikace vzorku díky jejich použití.
Kontrastující činidlo může být vybráno ze skupiny: citrát olovnatý, dusičnan olovnatý neboli Waltonův roztok, hexakyanoželeznatan sodný, hexakyanoželeznatan draselný, octany lanthanoidů, octan hafnia, kyselina fosfowolframová a/nebo jejich kombinace. Octany lanthanoidů můžou být vybrány ze skupiny: octan samaria, octan gadolinia, octan ytterbia, octan lutecia, octan neodymu a/nebo jejich kombinace. Kontrastující činidla jsou vybrána dle nejvyšších kontrastujících vlastností známých chemikálií a s ohledem na vybrané metody elektronové mikroskopie.
Zalévacím médiem může být epoxidová pryskyřice a/nebo metakrylátová pryskyřice. Tyto zalévací média jsou vybrána s ohledem na jejich dobré vlastnosti a manipulovatelnost za různých laboratorních podmínek. Pufrovacím činidlem používaným i k promývání může být roztok kakodylátu sodného.
Souprava dále může zahrnovat přídavnou látku promývacího nebo fixačního činidla vybranou ze skupiny: chlorid vápenatý, hydroxid sodný/draselný, glukóza, sacharóza a/nebo jejich kombinace. Tyto látky slouží k úpravě vlastností použitých roztoků, jako je například pH roztoku použitím hydroxidu sodného a/nebo hydroxidu draselného či jeho osmolarita použitím glukózy a/nebo sacharózy. Chlorid vápenatý dále zabraňuje poškození ultrastruktury mitochondrií.
Dehydratačním činidlem může být ethanol a/nebo aceton. Takové dehydratační činidla jsou lehce skladovatelné za obvyklých podmínek a v malých množstvích mají malou toxicitu pro člověka, který s nimi manipuluje.
Uzavřené balení může být tvořeno plastovou mikrozkumavkou nebo skleněnou špičkou. Mikrozkumavka je s výhodou opatřena kapátkem. Takové uzavřené balení poskytuje jednoduchou manipulaci při přípravě biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii i za běžných podmínek a laboratoře s omezeným vybavením.
Všechna chemická činidla v uzavřených baleních můžou být uspořádaná ve společném přepravním obalu, kterým je s výhodou papírová nebo plastová krabice. Taková přepravná krabice zabezpečuje, že jsou všechny části soupravy bezpečně přepraveny k uživateli a že obsahuje všechny potřebné komponenty pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii.
Výhody soupravy chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii podle tohoto technického řešení spočívá v tom, že umožňuje snadnou, rychlou a bezpečnou přípravu biologických vzorků při pokojové teplotě. Dávky jednotlivých roztoků se pohybují v množství od 0,1 do 0,5 ml na přípravu jednoho vzorku o velikosti 1 až 2 mm3. Další výhodou soupravy chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii je, že jednotlivá chemická činidla jsou umístěny v plastových mikrozkumavkách s kapátkem, přičemž po jejich otevření se obsah lehce vymáčkne do reakční kapsle. Výjimkou je roztok oxidu osmičelého, jehož dávka je zatavena ve skleněné špičce. Po jejím odlomení je možné roztok nalít do reakční kapsle. Je tak vyloučen kontakt roztoku a par oxidu osmičelého s kůží a povrchem očí uživatele. Další výhodou soupravy chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii je nahrazení kontrastování vzorku roztokem octanu uranylu roztokem octanu neodymu.
Příklady uskutečnění technického řešení
V příkladech 1 až 4 je popsáno složení soupravy pro přípravu preparátů pro různé metody elektronové mikroskopie, které využívají zalití biologického materiálu do epoxidové pryskyřice.
- 3 CZ 36546 UI
V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění byl biologický materiál neboli vzorek zalitý do metakrylátové pryskyřice. Příklady uvádějí stručný popis protokolu, který byl použit v daném případě, složení soupravy a podrobný návod, odpovídající použitému protokolu. Mezi vybrané metody, kdy je možné soupravu pro přípravu biologického materiálu použít, patří 3D analýza ve vysokorozlišovacím skenovacím elektronovém mikroskopu neboli HRSEM pomocí odprašování tenkých vrstev fokusovaným svazkem iontů v komoře mikroskopu neboli FIB HRSEM. Dalším příkladem je použití přímého odkrajování ultratenkých řezů v preparátové komoře mikroskopu, přičemž tato metoda je známá jako sériově bloková skenovací elektronová mikroskopie neboli SBF SEM. Další aplikační možností je protokol pro 3D analýzu pomocí HRSEM za použití microarray tomografie neboli MAT SEM. Poslední protokol je určen pro přípravu vzorku pro ultrastrukturální studie pomocí transmisní elektronové mikroskopie neboli TEM nebo skenovací transmisní elektronové mikroskopie STEM.
Důležitou součástí soupravy podle tohoto technického řešení je podrobný návod s přesnými pokyny, jak při přípravě vzorku postupovat. Složení sady může být modifikováno podle protokolu, který je vybrán pro přípravu daného preparátu. Souprava je připravena v různých variantách optimalizovaných pro jednotlivé aplikace.
Pro účely popisu příkladů uvedených v tomto technickém řešení je použita zkratka RT pro pokojovou teplotu, která je zpravidla určena v rozmezí od 20 do 22 °C. Dále pro účely popisu tohoto technického řešení je používán pojem dd voda, který popisuje redestilovanou vodu.
Příklad 1: Složení soupravy pro přípravu preparátu pro metodu FIB SEM podle protokolu OTOTO
V tomto případě byla souprava založena na modifikovaném Deerinckově protokolu, uvedeno v tabulce 1, zahrnujícím vícenásobnou inkubaci vzorku v oxidu osmičelém a thiokarbohydrazidu. Oproti původnímu protokolu byla fixace oxidem osmičelým a hexakyanoželeznatanem draselným ve třetím kroku rozdělena do dvou po sobě následujících kroků, což zvýšilo hloubku penetrace osmiových iontů do fixovaného materiálu. Radioaktivní octan uranylu byl nahrazen v tomto protokolu octanem neodymitým. Waltonův roztok byl vodný roztok obsahující dusičnan olovnatý, který fungoval taktéž jako kontrastující činidlo a přispíval ke zvýšení výsledného obrazového kontrastu vzorku v BSE zobrazení. Jako zalévací médium byla použita epoxidová pryskyřice, která vykazovala po vytvrdnutí teplem dostatečnou tvrdost, aby mohla být odkrajována nebo odprašována v tenkých vrstvách v komoře HRSEM. Takto připravený protokol je uveden v tabulce 1.
Tabulka 1: Protokol OTOTO
| Krok | Úkon | Čas | Teplota |
| 1 | fixace 2% glutaraldehydu 0,1 M pufrem kakodylátu sodného | 1-12 h | 4 °C |
| 2 | promytí promývacím roztokem (4% glukóza v 0,1 M pufru kakodylátu sodného) | 3x5 min | RT |
| 3 | inkubace 2% oxidem osmičelým ve vodě | 30 min | RT |
| 4 | inkubace 1,5% ferokyanidem draselným ve vodě | 30 min | RT |
| 5 | promytí dd voda | 3x5 min | RT |
| 6 | inkubace 1% thiokarbohydrazidu ve vodě | 20 min | RT |
| 7 | promytí dd voda | 3x5 min | RT |
| 8 | inkubace 1% oxidem osmičelým ve vodě | 30 min | RT |
| 9 | promytí dd voda | 3x5 min | RT |
-4CZ 36546 UI
| 10 | inkubace 1% thiokarbohydrazidcm ve vodě | 20 min | RT |
| 11 | promytí dd voda | 3x5 min | RT |
| 12 | inkubace 1% oxidem osmičelýni ve vodě | 30 min | RT |
| 13 | promytí dd voda | 4x10 min | RT |
| 14 | inkubace 0,5% octanem neodymitým v dd vodě | přes noc | 4 |
| 15 | promytí dd voda | 3x5 min | RT |
| 16 | inkubace s Waltonovým roztokem | 2 hod | 50 |
| 17 | promytí dd voda | 3x5 min | RT |
| 18 | dehydratace acetonovou řadou 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100% | 15 min | RT |
| 19 | infiltrace epoxidovou pryskyřici s acetonem v poměru 1:2 | 60 min | RT |
| 20 | infiltrace epoxidovou pryskyřicí s acetonem v poměru 1:1 | 60 min | RT |
| 21 | infiltrace epoxidovou pryskyřici s acetonem v poměru 2:1 | 60 min | RT |
| 22 | Čistá epoxidová pryskyřice | přes noc | |
| 23 | výměna za novou čistou epoxidovou pryskyřici - do fonniček/kapslí _ | ||
| 24~ | vytvrzeni - polymerizace | ”48hod” | 60 |
Složení soupravy:
Souprava pro přípravu jednoho preparátu byla složena ze souboru dávek chemických činidel ve vhodné koncentraci připravených k okamžitému použití pro fixaci, dehydrataci, infiltraci a zalití daného biologického vzorku, dále z návodu a příslušenství.
Dávky chemických roztoků a jejich označení:
F1 fixace 2% glutaraldehyd v 0,1 M pufru kakodylátu sodného (1 dávka o objemu 1 ml),
F2 2% oxid osmičelý v redestilované vodě (3 dávky s 0,2 ml roztoku),
F3 1,5% ferokyanid draselný v redestilované vodě (1 dávka o objemu 1 ml),
PÍ 4% glukóza v 0,1 M pufru kakodylátu sodného (objem 3 ml),
II 1% thiokarbohydrazid v redestilované vodě (objem 1 ml),
K1 0,5% octan neodymitý v redestilované vodě (objem 1 ml),
K2 Waltonův roztok (objem 1 ml),
D 100% aceton (objem 10 ml),
W redestilovaná voda (objem 20 ml),
R zalévací médium bez katalyzátoru polymerizace,
RK katalyzátor polymerizace.
- 5 CZ 36546 U1
Nádobky na odpadní tekutiny:
O1 odpad na redestilovanou vodu a vodné roztoky,
O2 odpad na organické rozpouštědla a zalévací médium.
Podrobný návod přípravy vzorku pomocí této soupravy podle protokolu OTOTO:
Krok 1: Fixace
Vzorek vložte do reakční kapsle označené F1, kde je fixační činidlo. Vzorek zde ponechejte minimálně 4 hodiny před dalším zpracováním při RT nebo 12 hodin pokud jej umístíte do lednice. Po uplynutí této doby byl použitý fixační činidlo odsajte a to pomocí plastové pipetky s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 2: Promytí
Vzorek postupně třikrát promyjte roztokem ze zkumavky s označením P1. Při každém promytí roztok o objemu cca 0,5 ml nakapejte pomocí kapátka, které nasadíte přímo na zkumavku po odstranění plastového uzávěru zkumavky P1. Promývací roztok nechte působit cca 5 min, potom jej z reakční nádobky odsajte pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 3: Post-fixace
Odlomte špičku skleněné ampule s označením F2 a roztok nakapejte ke vzorku. Reakční kapsli okamžitě uzavřete a nechte roztok působit 30 minut při RT. Po uplynutí této doby odsajte přebytečný roztok plastovou jednorázovou pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 4: Post-fixace
Do reakční nádoby ke vzorku přidejte roztok ze zkumavky označené F3 a nechte jej působit opět 30 minut při RT. Po uplynutí této doby odsajte přebytečný roztok pipetou O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 5: Promytí
Vzorek postupně třikrát promyjte redestilovanou vodou z lahvičky s označením W. Použijte pro to plastovou mikropipetku s označením W. Nechte působit cca 5 min, potom promývací roztok z reakční nádobky odsajte pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 6: Inkubace
Ke vzorku přidejte polovina objemu inkubačního roztoku ze zkumavky I1 na 20 minut při pokojové teplotě, a potom roztok odsajte pipetou O1 do odpadní nádoby O1.
Krok 7: Promytí
Vzorek promyjte 3x redestilovanou vodou v objemu 0,5 ml, kterou přenesete pomocí plastové pipety s označením W z lahvičky s označením W. Promývací roztok nechte působit po dobu 5 minut a přebytek roztoku odsajte pipetou O1 a přeneste do odpadní nádoby O1.
- 6 CZ 36546 U1
Krok 8: Post-fixace
Odlomte špičku druhé skleněné ampule s označením F2 a roztok nakapejte ke vzorku. Reakční kapsli okamžitě uzavřete a nechte roztok působit 30 minut při RT. Po uplynutí této doby odsajte přebytečný roztok plastovou jednorázovou pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 9: Promytí
Opakujte krok 7.
Krok 10: Inkubace
Opakujte krok 6 s druhou polovinou roztoku I1.
Krok 11: Promytí
Opakujte krok 7.
Krok 12: Post-fixace
Opakujte krok 8 s třetí ampulí s označením F2.
Krok 13: Promytí
Opakujte krok 7.
Krok 14: Kontrastování 1
Ke vzorku přidejte dávku roztoku ze zkumavky s označením K1 a nechejte jej působit 12 hodin při teplotě lednice (4 °C). Potom přebytek roztoku odsajte pipetou O1 do odpadní nádoby O1.
Krok 15: Promytí
Opakujte krok 7.
Krok 16: Kontrastování 2
Ke vzorku přidejte dávku roztoku ze zkumavky s označením K2. Reakční kapsli uzavřete a vložte do vodní lázně, tedy jiné větší nádobky s teplou vodou (cca 50 °C). Po 2 hodinách reakční kapsli z lázně vyjměte. Otevřete ji, odsajte přebytek roztoku pomocí pipety O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 17: Promytí
Opakujte krok 7. Po posledním promytí odsajte z reakční kapsle pouze polovinu promývacího roztoku.
Krok 18: Dehydratace
Ke zbývajícímu roztoku v reakční kapsli přidejte 0,2 ml 100% acetonu (D) ze zásobní lahvičky pomocí mikropipetky a lehce s reakční kapslí zatřepejte. Po 15 minutách odsajte polovinu roztoku z reakční kapsle pipetou O1 do odpadní nádoby O1. Přidejte dalších 0,2 ml 100% acetonu (D). Vždy po 15 min tento postup dvakrát zopakujte. Potom odsajte veškerý dehydratační roztok pipetou O2 do odpadní nádoby O2 a ke vzorku přidejte mikropipetou 0,5 ml 100% acetonu
- 7 CZ 36546 U1 z nádobky D. Výměnu roztoků provádějte rychle tak, aby nedošlo k vyschnutí vzorku v reakční nádobce. Po 5 minutách čistý aceton v reakční nádobce vyměňte za čerstvý bezvodý aceton. Tento postup ještě jednou zopakujte, a použité roztoky slévejte do odpadní nádoby O2. Při poslední výměně opět odsajte pouze polovinu dehydratačního činidla.
Krok 19: Infiltrace
K roztoku v reakční kapsli přidejte první dávku epoxidové pryskyřice v objemu cca 0,2 ml ze zkumavky s označením R pomocí mikropipetky, lehce protřepte a nechte roztok na vzorek působit 1 hod při RT. Následně odsajte polovinu roztoku pipetou s označením O2 do odpadní nádobky O2. Ke vzorku přidejte další dávku epoxidové pryskyřice ve stejném objemu a roztok opatrně promíchejte a opět ponechte působit 1 hod. Tento postup opakujte ještě jednou.
Krok 19: Zalévání
V poslední dávce čisté epoxidové pryskyřice o objemu 0,5 ml ponechte vzorek 24 hod v lednici při teplotě 4 °C. Potom pomocí párátka vzorek přeneste do zalévací formy vyplněné zčásti čistou epoxidovou pryskyřicí ze zkumavky R, do které byl předtím přidán obsah kapsle s označením RK a promíchán párátkem. Do zalévací formy pak přidejte ke vzorku štítek s označením a doplňte epoxidovou pryskyřici tak, aby dutiny ploché formy nebo obsah kapsle byly plné.
Krok 20: Polymerizace
Vzorky zalité v epoxidové pryskyřici spolu s nádobkou O2 umístěte do termostatu nastaveném na teplotu 60 °C a nechte je zde po dobu 48 hod.
Příslušenství soupravy:
Reakční nádobka, ve které probíhá reakce mezi zpracovávaným vzorkem a chemickými činidly, obsahuje fixační činidlo pro první krok zpracování vzorku a má označení F1. Dále souprava obsahuje plastové mikropipety, injekční stříkačky a jehly v potřebném množství a s příslušným označením k transportu chemických činidel do a z reakční nádoby, zalévací formičky nebo kapsle. Souprava dále obsahuje drobné nástroje k úpravě velikosti vzorku, krájecí podložku, štítky pro označení zalitého preparátu a ochranné pomůcky, např. respirátor, rukavice. Jednotlivá chemická činidla jsou v soupravě uložené v uzavřeném balení tvořeným plastovou mikrozkumavkou, a dále oxid osmičelý je uložený v uzavřeném balení tvořeným skleněnou špičkou. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění jsou jednotlivá chemická činidla v soupravě uložené v uzavřeném balení tvořeným plastovou mikrozkumavkou opatřenou kapátkem, přičemž oxid osmičelý je uložený v uzavřeném balení tvořeným skleněnou špičkou. Celá souprava chemických činidel je uspořádaná ve společném přepravném obalu tvořeným plastovou krabicí. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění je společným přepravným obalem papírová krabice.
Příklad 2: Složení soupravy pro přípravu preparátu pro metodu SBF SEM podle protokolu TAO
Složení soupravy vycházelo z protokolu používajícího kyselinu tannovou jako inkubačního činidla, která zlepšila výslednou distribuci atomů těžkých kovů ve vzorku. Tento protokol se osvědčil pro přípravu větších preparátů s velikostí přesahující 0,5 mm. Využito bylo také rozdělení postfixace oxidem osmičelým a ferokyanidem sodným do dvou po sobě jdoucích kroků. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění byl použitý ferokyanid draselný. Acetát uranylu byl nahrazen v prvním kontrastovacím kroku octanem neodymitým. V druhém kroku byl použit Waltonův roztok. Epoxidová pryskyřice typu Epon nebo Hard Plus byla použitá jako zalévací médium. Takto připravený protokol je uveden v tabulce 2
- 8 CZ 36546 UI
Tabulka 2: Protokol ΊΑΟ
| Krok | Úkon | Čas | Teplota |
| 1 | fixace vzorku roztokem 2,5% glutaraldehydu v 0,15 M kakodylátu sodném (pH = 7,4) | 4-12 hod | 4 °C |
| 2 | promytí a úprava vzorku - 0,15 M kakodylátem sodným s 0,002 M chloridem vápenatým | 3x5 min | RT |
| 3 | postfixace 2% oxid osmičelý v dd voda | 1,5 hod | RT |
| 4 | postfixace 2,5% ferokyanidu sodného/draselného v dd voda | 1,5 hod | RT |
| 5 | promytí dd voda | 2x15 min | RT |
| 6 | inkubace 1 % kyselinou tannovou v dd vodě | 30 min | RT |
| 7 | promytí 1% vodný roztok síranu sodného | 5 min | RT |
| S | inkubace 0,5% octanem neodymitým v dd vodě | 12 hod | 4 °C |
| 9 | promytí dd voda | 2x15 min | RT |
| 10 | kontrastování Waltonovým roztokem | 2 hod | 50 °C |
| 11 | promytí dd voda | 2x15 min | RT |
| 12 | dehydratace acetonovou řadou 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100% | 15 min | RT |
| 13 | infiltrace směsí epoxidové pryskyřice aceton 1:2 | 60 min | RT |
| 14 | infiltrace směsí epoxidové pryskyřice aceton 1:1 | 60 min | RT |
| 15 | infiltrace směsí epoxidové pryskyřice aceton 2:1 | 60 min | RT |
| 16 | Čistá epoxidová pryskyřice | přes noc | |
| 17 | výměna za novou čistou epoxidovou pryskyřici — do formičck/kapslí | ||
| 18 | vy tvrzení - polymerizace | 48 hod | 60 °C |
Složení soupravy:
Souprava pro přípravu jednoho preparátu nebo více preparátů byla složena ze souboru příslušných dávek chemických činidel ve vhodné koncentraci připravených k okamžitému použití pro fixaci, dehydrataci, infiltraci a zalití daného biologického vzorku, dále z návodu a příslušenství.
Dávky chemických roztoků a jejich označení:
F1 fixace 2% glutaraldehyd v 0,15 M pufru kakodylátu sodného (1 dávka o obj. 1 ml),
F2 2% oxid osmičelý v redestilované vodě (1 dávka o objemu 0,2 ml roztoku),
F3 2,5% ferokyanid draselný ve vodě (1 dávka o objemu 1 ml),
PÍ 0,15 M pufru kakodylátu sodného s přídavkem chloridu vápenatého o koncentraci 0,002 M (objem 3 ml),
II 1% kyselina tanová (LMW Galloylglucose) v redestilované vodě (objem 1 ml),
1 % vodný roztok síranu sodného
K1 0,5% octan neodymitý v redestilované vodě (objem 1 ml),
K2 Waltonův roztok (objem 1 ml),
D 100% aceton (objem 10 ml),
-9CZ 36546 U1
W redestilovaná voda (objem 10 ml),
R zalévací médium bez katalyzátoru polymerizace,
RK katalyzátor polymerizace.
Nádobky na odpadní tekutiny:
O1 odpad na redestilovanou vodu a vodné roztoky,
O2 odpad na organické rozpouštědla a zalévací médium.
Podrobný návod přípravy vzorku pomocí této soupravy podle protokolu TAO
Krok 1: Fixace
Vzorek vložte do reakční zkumavky označené F1, kde je fixační činidlo. Vzorek zde ponechejte minimálně 4 hodiny před dalším zpracováním při RT nebo 12 hodin pokud jej umístíte do lednice. Po uplynutí této doby fixační činidlo odsajte a to pomocí plastové pipetky s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 2: Promytí
Vzorek postupně třikrát promyjte roztokem ze zkumavky s označením P1. Při každém promytí roztok o objemu cca 0,5 ml nakapejte pomocí kapátka, které nasadíte přímo na zkumavku P1 po odstranění plastového uzávěru. Promývací roztok nechte působit cca 5 min, potom jej z reakční nádobky odsajte pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 3: Post-fixace
Odlomte špičku skleněné ampule s označením F2 a roztok nakapejte ke vzorku. Reakční kapsli okamžitě uzavřete a nechte roztok působit 90 minut při RT. Po uplynutí této doby odsajte přebytečný roztok plastovou jednorázovou pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 4: Post-fixace
Do reakční nádoby ke vzorku přidejte roztok ze zkumavky označené F3 a nechte jej působit opět 90 minut při RT. Po uplynutí této doby odsajte přebytečný roztok pipetou O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 5: Promytí
Vzorek postupně dvakrát promyjte redestilovanou vodou z lahvičky s označením W. Použijte pro to plastovou mikropipetku s označením W. Nechte působit cca 15 min, potom promývací roztok z reakční nádobky odsajte pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 6: Inkubace
Do reakční zkumavky nakapejte dávku roztoku ze zkumavky I1 a nechte působit 30 minut při pokojové teplotě. Potom roztok odsajte pipetou O1 do odpadní nádoby O1.
- 10 CZ 36546 U1
Krok 7: Promytí
Ke vzorku přidejte roztok z mikrozkumavky s označení I2. Po 5 minutách působení roztok odeberte pipetou O1 a přeneste do odpadní nádoby O1.
Krok 8: Kontrastování 1
Ke vzorku přidejte dávku roztoku ze zkumavky s označením K1 a nechejte jej působit 12 hodin při teplotě lednice (4 °C). Potom přebytek roztoku odsajte pipetou O1 do odpadní nádoby O1.
Krok 9: Promytí
Opakujte krok 5.
Krok 10: Kontrastování 2
Ke vzorku přidejte dávku roztoku ze zkumavky s označením K2. Reakční kapsli uzavřete a vložte do vodní lázně, tedy jiné větší nádobky s teplou vodou (cca 50 °C). Po 2 hodinách reakční kapsli z lázně vyjměte. Otevřete ji, odsajte přebytek roztoku pomocí pipety O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 11: Promytí
Opakujte krok 5. Po druhém promytí odsajte z reakční kapsle pouze polovinu promývacího roztoku.
Krok 12: Dehydratace
Ke zbývajícímu roztoku v reakční kapsli přidejte 0,2 ml 100% acetonu (D) ze zásobní lahvičky pomocí mikropipetky a lehce s reakční kapslí zatřepejte. Po 15 minutách odsajte polovinu roztoku z reakční kapsle pipetou O1 do odpadní nádoby O1. Přidejte dalších 0,2 ml 100% acetonu (D). Vždy po 15 min tento postup dvakrát zopakujte. Potom odsajte veškerý dehydratační roztok pipetou O2 do odpadní nádoby O2 a ke vzorku přidejte mikropipetou 0,5 ml 100% acetonu z nádobky D. Výměnu roztoků provádějte rychle tak, aby nedošlo k vyschnutí vzorku v reakční nádobce. Po 5 minutách čistý aceton v reakční nádobce vyměňte za čerstvý bezvodý aceton. Tento postup ještě jednou zopakujte, a použité roztoky slévejte do odpadní nádoby O2. Při poslední výměně opět odsajte pouze polovinu dehydratačního činidla.
Krok 13: Infiltrace
K roztoku v reakční kapsli přidejte první dávku epoxidové pryskyřice v objemu cca 0,2 ml ze zkumavky s označením R pomocí mikropipetky, lehce protřepte a nechte roztok na vzorek působit 1 hod při RT. Následně odsajte polovinu roztoku pipetou s označením O2 do odpadní nádobky O2. Ke vzorku přidejte další dávku epoxidové pryskyřice ve stejném objemu a roztok opatrně promíchejte a opět ponechte působit 1 hod. Tento postup opakujte ještě jednou.
Krok 14: Zalévání
V poslední dávce čisté epoxidové pryskyřice o objemu 0,5 ml ponechte vzorek 24 hod v lednici při teplotě 4 °C. Potom pomocí párátka vzorek přeneste do zalévací formy vyplněné zčásti čistou epoxidovou pryskyřicí ze zkumavky R, do které byl předtím přidán obsah kapsle s označením RK a promíchán párátkem. Do zalévací formy pak přidejte ke vzorku štítek s označením a doplňte epoxidovou pryskyřici tak, aby dutiny ploché formy nebo obsah kapsle byly plné.
- 11 CZ 36546 UI
Krok 15: Polymerizace
Vzorky zalité v epoxidové pryskyřici spolu s nádobkou 02 umístěte do termostatu nastaveném na teplotu 60 °C a nechte je zde po dobu 48 hod.
Příslušenství soupravy
Reakční nádobka, ve které probíhá reakce mezi zpracovávaným vzorkem a chemickými činidly, obsahuje fixační činidlo pro první krok zpracování vzorku a má označení Fl. Dále souprava obsahuje plastové mikropipety, injekční stříkačky a jehly v potřebném množství a s příslušným označením k transportu chemických činidel do a z reakční nádoby, zalévací formičky nebo držák pro daný typ SEM v případě použití metody zalití s minimálním množstvím epoxidové pryskyřice. Souprava dále obsahuje drobné nástroje k úpravě velikosti vzorku, kráječi podložku, štítky pro označení zalitého preparátu a ochranné pomůcky, např. respirátor, rukavice. Jednotlivá chemická činidla jsou v soupravě uložené v uzavřeném balení tvořeným plastovou mikrozkumavkou, a dále oxid osmičelý je uložený v uzavřeném balení tvořeným skleněnou špičkou. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění jsou jednotlivá chemická činidla v soupravě uložené v uzavřeném balení tvořeným plastovou mikrozkumavkou opatřenou kapátkem, přičemž oxid osmičelý je uložený v uzavřeném balení tvořeným skleněnou špičkou. Celá souprava chemických činidel je uspořádaná ve společném přepravném obalu tvořeným plastovou krabicí. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění je společným přepravným obalem papírová krabice.
Příklad 3: Složení soupravy pro přípravu preparátu pro metodu MAT neboli microarray tomografie podle protokolu HUA
Tento protokol byl modifikovanou verzí protokolu, který byl poprvé publikován skupinou Hua et al. Byl založen stejně jako v případě OTOTO protokolu na vícenásobné inkubaci vzorku v roztoku oxidu osmičelého a thiokarbohydrazidu. Postfixace oxidem osmičelým a ferokyanidem draselným byla rozdělena do dvou kroků, aby se zvýšila hloubka penetrace osmiových iontů do fixovaného materiálu. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění byl použitý ferokyanid sodný. Fixační činidla obsahující aldehydy byly pufrovány a následný promývací roztok obsahoval přídavek chloridu vápenatého k ochraně mitochondrií při fixaci oxidem osmičelým. Acetát uranylu byl nahrazen v prvním kontrastovacím kroku octanem neodymitým, v druhém kroku byl použit Waltonův roztok. Epoxidová pryskyřice typu Epon nebo Hard Plus byla použitá jako zalévací médium. Takto připravený protokol je uveden v tabulce 3.
Tabulka 3: Protokol HUA.
| Krok | Úkon | Čas | Teplota |
| 1 | fixace vzorku roztokem 2,5% glutaraldehydu v 0,15 M kakodylátu sodném (pH = 7,4) | 12 hod | 4 °C |
| 2 | promytí a úprava vzorku - 0,15 M kakodylátem sodným s 0,002 M chloridem vápenatým | 3x5 min | RT |
| 3 | postfixace 2% oxid osmičelý v dd voda | 1,5 hod | RT |
| 4 | postfixace 2,5% ferokyanidu sodného/draselného v dd voda | 1,5 hod | RT |
| 5 | promytí dd voda | 2x15 min | RT |
| 6 | inkubace 1% thiokarbohydrazinem | 45 min | 40 |
- 12 CZ 36546 UI
| 7 | promytí dd voda | 2x15 min | RT |
| 8 | postfixace 2% oxid osmičelý v dd voda | 1,5 hod | RT |
| 9 | promytí dd voda | 2x15 min | RT |
| 10 | kontrastování 1% octanem neodymitým v dd vodě | 12 hod 2 hod | 4 °C/ 50 °C |
| 11 | promytí dd voda | 2x15 min | RT |
| 12 | kontrastování Waltonovým roztokem | 2 hod | 50 |
| 13 | promytí dd voda | 2x15 min | RT |
| 14 | dehydratace acetonovou řadou 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100% | 15 min | RT |
| 15 | infiltrace směsí epoxidová pryskyřice aceton 1:2 | 60 min | RT |
| 16 | infiltrace směsí epoxidová pryskyřice aceton 1:1 | 60 min | RT |
| 17 | infiltrace směsí epoxidová pryskyřice aceton 2:1 | 60 min | RT |
| 18 | čistá epoxidová pryskyřice | přes noc | |
| 19 | výměna za novou čistou epoxidovou přyskyřici - do formiček/kapslí | ||
| 20 | vytvrzení - polymerizace | 48 hod | 60 °C |
Složení soupravy:
Souprava pro přípravu jednoho preparátu se skládá ze souboru chemických činidel ve vhodné koncentraci a dávce připravených k okamžitému použití pro fixaci, dehydrataci, infiltraci a zalití daného biologického vzorku, dále z návodu a příslušenství.
Dávky chemických roztoků a jejich označení:
F1 fixace 2% glutaraldehyd v 0,15 M pufru kakodylátu sodného (1 dávka o obj. 1 ml),
F2 2% oxid osmičelý v redestilované vodě (2 dávky, každá o objemu 0,2 ml roztoku),
F3 2,5% ferokyanid draselný ve vodě (1 dávka o objemu 0,5 ml),
PÍ 0,15 M pufru kakodylátu sodného s přídavkem chloridu vápenatého v koncentraci 0,002 M (objem 3 ml),
II 1% thiokarbohydrazid v redestilované vodě (objem 1 ml),
K1 0,5% octan neodymitý v redestilované vodě (objem 0,5 ml),
K2 Walton roztok (objem 1 ml),
D 100% aceton (objem 10 ml),
W redestilovaná voda (objem 20 ml),
R zalévací médium bez katalyzátoru polymerizace,
RK katalyzátor polymerizace.
- 13 CZ 36546 U1
Nádobky na odpadní tekutiny:
O1 odpad na redestilovanou vodu a vodné roztoky,
O2 odpad na organické rozpouštědla a zalévací médium.
Podrobný návod přípravy vzorku při použití této soupravy:
Krok 1: Fixace
Vzorek vložte do reakční zkumavky označené F1, kde je fixační činidlo. Vzorek zde ponechejte minimálně 4 hodiny před dalším zpracováním při RT nebo 12 hodin pokud jej umístíte do lednice. Po uplynutí této doby fixační činidlo odsajte a to pomocí plastové pipetky s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 2: Promytí
Vzorek postupně třikrát promyjte roztokem ze zkumavky s označením P1. Při každém promytí roztok o objemu cca 0,5 ml nakapejte pomocí kapátka, které nasadíte přímo na zkumavku P1 po odstranění plastového uzávěru. Promývací roztok nechte působit cca 5 min, potom jej z reakční nádobky odsajte pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 3: Post-fixace
Odlomte špičku skleněné ampule s označením F2 a roztok nakapejte ke vzorku. Reakční kapsli okamžitě uzavřete a nechte roztok působit 90 minut při RT. Po uplynutí této doby odsajte přebytečný roztok plastovou jednorázovou pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 4: Post-fixace
Do reakční nádoby ke vzorku přidejte roztok ze zkumavky označené F3 a nechte jej působit opět 90 minut při RT. Po uplynutí této doby odsajte přebytečný roztok pipetou O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 5: Promytí
Vzorek postupně dvakrát promyjte redestilovanou vodou z lahvičky s označením W. Použijte pro to plastovou mikropipetku s označením W. Nechte působit cca 15 min, potom promývací roztok z reakční nádobky odsajte pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 6: Inkubace
Do reakční zkumavky nakapejte dávku roztoku ze zkumavky I1. Reakční zkumavku uzavřete a vložte na 45 minut do vodní lázně - větší nádobky s teplou vodou (cca 40 °C). Potom reakční nádobu otevřete a roztok odsajte pipetou O1 do odpadní nádoby O1.
Krok 7: Promytí
Opakujte krok 5.
Krok 8: Post-fixace:
Odlomte špičku druhé skleněné ampule s označením F2 a roztok nakapejte ke vzorku. Reakční kapsli okamžitě uzavřete a nechte roztok působit 90 minut při RT. Po uplynutí této doby odsajte
- 14 CZ 36546 U1 přebytečný roztok plastovou jednorázovou pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 7: Promytí
Opakujte krok 5.
Krok 8: Kontrastování 1
Ke vzorku přidejte dávku roztoku ze zkumavky s označením K1 a nechejte jej působit 12 hodin při teplotě lednice (4 °C). Potom přebytek roztoku odsajte pipetou O1 do odpadní nádoby O1.
Krok 9: Promytí
Opakujte krok 5.
Krok 10: Kontrastování 2
Ke vzorku přidejte dávku roztoku ze zkumavky s označením K2. Reakční kapsli uzavřete a vložte do vodní lázně, tedy jiné větší nádobky s teplou vodou (cca 50 °C). Po 2 hodinách reakční kapsli z lázně vyjměte. Otevřete ji, odsajte přebytek roztoku pomocí pipety O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 11: Promytí
Opakujte krok 5. Po druhém promytí odsajte z reakční kapsle pouze polovinu promývacího roztoku.
Krok 12: Dehydratace
Ke zbývajícímu roztoku v reakční kapsli přidejte 0,2 ml 100% acetonu (D) ze zásobní lahvičky pomocí mikropipetky a lehce s reakční kapslí zatřepejte. Po 15 minutách odsajte polovinu roztoku z reakční kapsle pipetou O1 do odpadní nádoby O1. Přidejte dalších 0,2 ml 100% acetonu (D). Vždy po 15 min tento postup dvakrát zopakujte. Potom odsajte veškerý dehydratační roztok pipetou O2 do odpadní nádoby O2 a ke vzorku přidejte mikropipetou 0,5 ml 100% acetonu z nádobky D. Výměnu roztoků provádějte rychle tak, aby nedošlo k vyschnutí vzorku v reakční nádobce. Po 5 minutách čistý aceton v reakční nádobce vyměňte za čerstvý bezvodý aceton. Tento postup ještě jednou zopakujte, a použité roztoky slévejte do odpadní nádoby O2. Při poslední výměně opět odsajte pouze polovinu dehydratačního činidla.
Krok 13: Infiltrace
K roztoku v reakční kapsli přidejte první dávku epoxidové pryskyřice v objemu cca 0,2 ml ze zkumavky s označením R pomocí mikropipetky, lehce protřepte a nechte roztok na vzorek působit 1 hod při RT. Následně odsajte polovinu roztoku pipetou s označením O2 do odpadní nádobky O2. Ke vzorku přidejte další dávku epoxidové pryskyřice ve stejném objemu a roztok opatrně promíchejte a opět ponechte působit 1 hod. Tento postup opakujte ještě jednou.
Krok 14: Zalévání
V poslední dávce čisté epoxidové pryskyřice o objemu 0,5 ml ponechte vzorek 24 hod v lednici při teplotě 4 °C. Potom pomocí párátka vzorek přeneste do zalévací formy vyplněné zčásti čistou epoxidovou pryskyřicí ze zkumavky R, do které byl předtím přidán obsah kapsle s označením RK a promíchán párátkem. Do zalévací formy pak přidejte ke vzorku štítek s označením a doplňte epoxidovou pryskyřici tak, aby dutiny ploché formy nebo obsah kapsle byly plné.
- 15 CZ 36546 UI
Krok 15: Polymerizace
Vzorky zalité v epoxidové pryskyřici spolu s nádobkou 02 umístěte do termostatu nastaveném na teplotu 60 °C a nechte je zde po dobu 48 hod.
Příslušenství soupravy
Reakční nádobka, ve které probíhá reakce mezi zpracovávaným vzorkem a chemickými činidly, obsahuje fixační činidlo pro první krok zpracování vzorku a má označení Fl. Dále souprava obsahuje plastové mikropipety, injekční stříkačky a jehly v potřebném množství a s příslušným označením k transportu chemických činidel do a z reakční nádoby, zalévací formičky nebo kapsle. Souprava dále obsahuje drobné nástroje k úpravě velikosti vzorku, kráječi podložku, štítky pro označení zalitého preparátu a ochranné pomůcky, např. respirátor, rukavice. Jednotlivá chemická činidla jsou v soupravě uložené v uzavřeném balení tvořeným plastovou mikrozkumavkou, a dále oxid osmičelý je uložený v uzavřeném balení tvořeným skleněnou špičkou. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění jsou jednotlivá chemická činidla v soupravě uložené v uzavřeném balení tvořeným plastovou mikrozkumavkou opatřenou kapátkem, přičemž oxid osmičelý je uložený v uzavřeném balení tvořeným skleněnou špičkou. Celá souprava chemických činidel je uspořádaná ve společném přepravném obalu tvořeným plastovou krabicí. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění je společným přepravným obalem papírová krabice.
Příklad 4: Protokol vhodný pro přípravu vzorků pro transmisní elektronový mikroskop neboli TEM nebo skenovací elektronový mikroskop pracující v transmisním modu neboli STEM
Složení soupravy vychází z rutinního protokolu používaného pro zalévání živočišných nebo rostlinných tkání, buněčných suspenzí malých organismů apod, a pro ultrastrukturální studie. Kontrastování bylo prováděno na ultratenkých řezech. V jiných nezobrazených příkladech uskutečnění byl do protokolu zařazen kontrastovací krok pomocí vodných roztoků solí olova či lanthanoidů. Základní protokol je uveden v tabulce 4.
Tabulka 4: Protokol ΊΕΜ.
| Krok | Úkon | Čas | Teplota |
| 1 | fixace vzorku roztokem 2,5% glutaraldehydu v 0,15 M pufru kakodylátu sodného | 4 12 hod | RT |
| 2 | promytí promývacím roztokem (4% glukóza v 0,1 M pufru kakodylátu sodného) | 3x15 min | RT |
| 3 | Inkubace 1:1 pufr kakodylátu sodného + oxid osmičelý | 3-4 hod (rostlinný vz.) 2 hod (živočišný vz.) | RT |
| 4 | promytí promývacím roztokem (4% glukóza v 0,1 M pufru kakodylátu sodného) | 3x15 min | RT |
| 5 | dehydratace acetonovou řadou 30 % aceton | 15 min | RT |
| 6 | dehydratace acetonovou řadou 50 % aceton | 15 min | RT |
| 7 | dehydratace acetonovou řadou 70 % aceton | 15 min | RT |
| 8 | dehydratace acetonovou řadou 80 % aceton | 15 min | RT |
| 9 | dehydratace acetonovou řadou 90 % aceton | 15 min | RT |
| 10 | dehydratace acetonovou řadou 95 % aceton | 15 min | RT |
| 11 | dehydratace acetonovou řadou 100 % aceton | 15 min | RT |
| 12 | převedení do epoxidové pryskyřice, 1:2 epoxidová pryskyřice: aceton | 60 min | RT |
| 13 | převedeni do epoxidové pryskyřice, 1:1 epoxidová pryskyřice: aceton | 60 min | RT |
- 16CZ 36546 UI
| 14 | převedeni do epoxidové pryskyřice, 2:1 epoxidová pryskyřice: aceton | 60 min | RT |
| 15 | čistá epoxidová pryskyřice | 24 hod | RT |
| 16 | zalití do formiček/kapsli - vytvrzeni | 48 hod | 60 |
Složení soupravy:
Souprava pro přípravu jednoho preparátu se skládala ze souboru chemických činidel v dávkách pro zpracování jednoho či více vzorků s vhodnou koncentraci připravených k okamžitému použití pro fixaci, dehydrataci, infiltraci a zalití daného biologického vzorku, dále z návodu a příslušenství.
Dávky chemických roztoků a jejich označení:
F1 fixace 2% glutaraldehyd v 0,15 M pufru kakodylátu sodného (1 dávka o obj. 1 ml),
F2 4% oxid osmičelý v redestilované vodě (0,2 ml roztoku),
PÍ 4% glukóza v 0,1 M pufru kakodylátu sodného (objem 6 ml),
D 100% aceton (objem 10 ml),
W redestilovaná voda (objem 20 ml),
R zalévací médium bez katalyzátoru polymerizace,
RK katalyzátor polymerizace.
Nádobky na odpadní tekutiny:
Ol odpad na redestilovanou vodu a vodné roztoky, odpad na organické rozpouštědla a zalévací médium.
Podrobný návod přípravy vzorku pomocí této soupravy podle protokolu TEM:
Krok 1: Fixace
Vzorek vložte do reakční kapsle označené Fl, kde je fixační činidlo. Vzorek zde ponechejte minimálně 4 hodiny před dalším zpracováním při RT nebo 12 hodin pokud jej umístíte do lednice. Po uplynutí této doby byl použitý fixační činidlo odsajte a to pomocí plastové pipetky s označením Ol a přeneste jej do odpadní nádoby Ol.
Krok 2: Promytí
Vzorek postupně třikrát promyjte roztokem ze zkumavky s označením Pl. Při každém promytí roztok o objemu cca 0,5 ml nakapejte pomocí kapátka, které nasadíte přímo na zkumavku po odstranění plastového uzávěru zkumavky Pl. Promývací roztok nechte působit cca 15 min, potom jej z reakční nádobky odsajte pipetou s označením Ol a přeneste jej do odpadní nádoby Ol. V posledním kroku promývání odsajte pouze polovinu roztoku z reakční kapsle.
Krok 3: Post-fixace
Odlomte špičku skleněné ampule s označením F2 a roztok přidejte do zbytku promývacího roztoku v reakční zkumavce. Reakční kapsli okamžitě uzavřete a nechte roztok působit 3 až 4 hodiny
- 17CZ 36546 U1 v případě zpracování rostlinného materiálu při RT nebo 2 hodiny při zpracování živočišného materiálu při RT. Po uplynutí této doby odsajte přebytečný roztok plastovou jednorázovou pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 4: Promytí
Vzorek postupně třikrát promyjte roztokem ze zkumavky s označením P1. Při každém promytí roztok o objemu cca 0,5 ml nakapejte pomocí kapátka, které nasadíte přímo na zkumavku po odstranění plastového uzávěru zkumavky P1. Promývací roztok nechte působit cca 15 min, potom jej z reakční nádobky odsajte pipetou s označením O1 a přeneste jej do odpadní nádoby O1.
Krok 5: Dehydratace
Ke zbývajícímu roztoku v reakční kapsli přidejte 0,2 ml 100% acetonu (D) ze zásobní lahvičky pomocí mikropipetky a lehce s reakční kapslí zatřepejte. Po 15 minutách odsajte polovinu roztoku z reakční kapsle pipetou O1 do odpadní nádoby O1. Přidejte dalších 0,2 ml 100% acetonu (D). Vždy po 15 min tento postup dvakrát zopakujte. Potom odsajte veškerý dehydratační roztok pipetou O2 do odpadní nádoby O2 a ke vzorku přidejte mikropipetou 0,5 ml 100% acetonu z nádobky D. Výměnu roztoků provádějte rychle tak, aby nedošlo k vyschnutí vzorku v reakční nádobce. Po 5 minutách čistý aceton v reakční nádobce vyměňte za čerstvý bezvodý aceton. Tento postup ještě jednou zopakujte, a použité roztoky slévejte do odpadní nádoby O2. Při poslední výměně opět odsajte pouze polovinu dehydratačního činidla.
Krok 6: Infiltrace
K roztoku v reakční kapsli přidejte první dávku epoxidové pryskyřice v objemu cca 0,2 ml ze zkumavky s označením R pomocí mikropipetky, lehce protřepte a nechte roztok na vzorek působit 1 hod při RT. Následně odsajte polovinu roztoku pipetou s označením O2 do odpadní nádobky O2. Ke vzorku přidejte další dávku epoxidové pryskyřice ve stejném objemu a roztok opatrně promíchejte a opět ponechte působit 1 hod. Tento postup opakujte ještě jednou.
Krok 7: Zalévání
V poslední dávce čisté epoxidové pryskyřice o objemu 0,5 ml ponechte vzorek 24 hod v lednici při teplotě 4 °C. Potom pomocí párátka vzorek přeneste do zalévací formy vyplněné zčásti čistou epoxidovou pryskyřicí ze zkumavky R, do které byl předtím přidán obsah kapsle s označením RK a promíchán párátkem. Do zalévací formy pak přidejte ke vzorku štítek s označením a doplňte epoxidovou pryskyřici tak, aby dutiny ploché formy nebo obsah kapsle byly plné.
Krok 8: Polymerizace
Vzorky zalité v epoxidové pryskyřici spolu s nádobkou O2 umístěte do termostatu nastaveném na teplotu 60 °C a nechte je zde po dobu 48 hod.
Příslušenství soupravy:
Reakční nádobka, ve které probíhá reakce mezi zpracovávaným vzorkem a chemickými činidly, obsahuje fixační činidlo pro první krok zpracování vzorku a má označení F1. Dále souprava obsahuje plastové mikropipety, injekční stříkačky a jehly v potřebném množství a s příslušným označením k transportu chemických činidel do a z reakční nádoby, zalévací formičky nebo kapsle. Souprava dále obsahuje drobné nástroje k úpravě velikosti vzorku, krájecí podložku, štítky pro označení zalitého preparátu a ochranné pomůcky, např. respirátor, rukavice. Jednotlivá chemická činidla jsou v soupravě uložené v uzavřeném balení tvořeným plastovou mikrozkumavkou. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění jsou jednotlivá chemická činidla v soupravě uložené v uzavřeném balení tvořeným plastovou mikrozkumavkou opatřenou kapátkem. Celá souprava
- 18 CZ 36546 U1 chemických činidel je uspořádaná ve společném přepravném obalu tvořeným plastovou krabicí. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění je společným přepravným obalem papírová krabice.
Příklad 5: Další modifikace popsaných složení soupravy chemických činidel dle protokolů OTOTO, TAO, HUA, TEM
Vybrané protokoly byly dále použity v jiných nezobrazených příkladech uskutečnění, kde bylo vybráno jiné fixační činidlo a to formaldehyd, nebo kombinace formaldehydu, oxidu osmičelého a/nebo glutaraldehydu. Dále bylo v jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění použito inkubační činidlo pyrogallol, kyselina tannová, síran sodný, thiokarbohydrazid a/nebo jejich kombinace. Jako kontrastující činidlo bylo použito v jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění citrát olovnatý, hexakyanoželeznatan sodný, octan samaria, octan gadolinia, octan ytterbia, octan lutecia, octan neodymu a/nebo octan hafnia, kyselina fosfowolframová a/nebo jejich kombinace.
V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění bylo promývací nebo fixační činidlo dále opatřeno přídavní látkou vybranou ze skupiny: sacharóza a/nebo její kombinace s chloridem vápenatým a/nebo glukózou. V jiném nezobrazeném příkladu uskutečnění bylo dále jako dehydratační činidlo použitý ethanol. V těchto nezobrazených příkladech uskutečnění bylo použito každé z činidel v uzavřeném balení v množství od 0,1 do 100 ml.
Průmyslová využitelnost
Soupravu chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii, které je nutné zalévat do epoxidové pryskyřice nebo metakrylátové pryskyřice před jejich vizualizací pomocí elektronové mikroskopie lze podle tohoto technického řešení využít k přípravě biologických vzorků ve výzkumných laboratořích a výzkumných institucích v oblasti biologie a biomedicíny.
Claims (15)
1. Souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii, zahrnující alespoň po jednom z následujících činidel: fixační činidlo, promývací činidlo, dehydratační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo, a zalévací médium, vyznačující se tím, že alespoň fixační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium jsou v soupravě uspořádané v oddělených a uzavřených baleních pro jednorázové nebo opakované použití, přičemž každé z činidel je v uzavřeném balení v množství od 0,1 do 100 ml.
2. Souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň fixační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium jsou v soupravě uspořádané v oddělených a uzavřených baleních pro jednorázové nebo opakované použití, přičemž každé z činidel je v uzavřeném balení v množství od 0,1 do 0,5 ml.
3. Souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň fixační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium jsou v soupravě uspořádané v oddělených a uzavřených baleních pro jednorázové nebo opakované použití, přičemž každé z činidel je v uzavřeném balení v množství od 0,5 do 1,0 ml.
4. Souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň fixační činidlo, inkubační činidlo, kontrastující činidlo a zalévací médium jsou v soupravě uspořádané v oddělených a uzavřených baleních pro jednorázové nebo opakované použití, přičemž každé z činidel je v uzavřeném balení v množství od 0,1 do 5,0 ml.
5. Souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že fixační činidlo je vybráno ze skupiny: glutaraldehyd, formaldehyd, oxid osmičelý a/nebo jejich kombinace.
6. Souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že inkubační činidlo je vybráno ze skupiny: kyselina tannová, síran sodný, thiokarbohydrazid, pyrogallol, ferokyanid draselný, ferokyanid sodný a/nebo jejich kombinace.
7. Souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že kontrastující činidlo je vybráno ze skupiny: citrát olovnatý, dusičnan olovnatý, hexakyanoželeznatan sodný, hexakyanoželeznatan draselný, octan samaria, octan gadolinia, octan ytterbia, octan lutecia, octan neodymu a octan hafnia, kyselina fosfowolframová a/nebo jejich kombinace.
8. Souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že zalévacím médiem je epoxidová pryskyřice a/nebo metakrylátová pryskyřice.
9. Souprava podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že fixační činidlo a/nebo promývací činidlo a/nebo inkubační činidlo obsahuje kakodylát sodný.
10. Souprava podle nároku 9, vyznačující se tím, že dále zahrnuje přídavnou látku promývacího nebo fixačního činidla vybranou ze skupiny: chlorid vápenatý, glukóza, sacharóza a/nebo jejich kombinace.
11. Souprava podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že dehydratačním činidlem je ethanol a/nebo aceton.
12. Souprava podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že uzavřené balení je tvořeno plastovou mikrozkumavkou nebo skleněnou špičkou.
13. Souprava podle nároku 12, vyznačující se tím, že mikrozkumavka je opatřena kapátkem.
- 20 CZ 36546 U1
14. Souprava podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že všechna chemická činidla v uzavřených baleních jsou uspořádána ve společném přepravním obalu.
15. Souprava podle nároku 14, vyznačující se tím, že přepravním obalem je papírová nebo plastová krabice.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2022-40099U CZ36546U1 (cs) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | Souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2022-40099U CZ36546U1 (cs) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | Souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ36546U1 true CZ36546U1 (cs) | 2022-11-14 |
Family
ID=84104965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2022-40099U CZ36546U1 (cs) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | Souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ36546U1 (cs) |
-
2022
- 2022-07-25 CZ CZ2022-40099U patent/CZ36546U1/cs active IP Right Grant
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240027309A1 (en) | Simple fixation and stabilisation | |
| Kiernan | Histological and histochemical methods | |
| Tapia et al. | High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy | |
| AU2008264205B2 (en) | Method and basket apparatus for transporting biological samples | |
| CA1279245C (en) | Method and device for disinfecting biological fluids and container for same | |
| US5429797A (en) | Safe dialdehydes useful as decontaminants, fixatives, preservatives and embalming agents | |
| EP2866017A1 (en) | Method for rendering biological material transparent and processing kit for rendering biological material transparent | |
| EP3162883A1 (en) | Jig for vitrification preservation of cells or tissues | |
| Bozzola | Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells | |
| DE69333586T2 (de) | Verfahren und zusammensetzung zur konservierung von antigenen und verfahren zur verwendung von durch selbiges verfahren hergestellten zytologischem material | |
| Bozzola | Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells | |
| CN111165469A (zh) | 一种液基薄层细胞保存液及其制备方法 | |
| CZ36546U1 (cs) | Souprava chemických činidel pro přípravu biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii | |
| RU2676712C1 (ru) | Среда для заключения гистологических срезов | |
| Ruben et al. | Serial section radioautography of the inner ear: histological technique | |
| Vajta et al. | Disadvantages and benefits of vitrification | |
| Everts et al. | Transmission electron microscopy of bone | |
| Caldas et al. | Transmission Electron Microscopy Studies of Dengue Viruses | |
| Greenhalgh et al. | Chapter XX Electron Microscopy | |
| Sachse et al. | Metal-tagging transmission electron microscopy and immunogold labeling on Tokuyasu cryosections to image influenza A virus ribonucleoprotein transport and packaging | |
| Miranda-Saksena et al. | Preparation of Herpes Simplex Virus-Infected Primary Neurons for Transmission Electron Microscopy | |
| Small et al. | Whole-mount electron microscopy of the cytoskeleton: negative staining methods | |
| Nuckels et al. | Histological preparation of embryonic and adult zebrafish eyes | |
| Richardson et al. | NPC Structure in model organisms: transmission electron microscopy and immunogold labeling using high-pressure freezing/freeze substitution of yeast, worms, and plants | |
| Stirling | General tissue preparation methods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20221114 |