CZ35280U1

CZ35280U1 - Dvouvrstvá náhrada kůže

Info

Publication number: CZ35280U1
Application number: CZ202138920U
Authority: CZ
Inventors: Lucy Vojtová; Vojtová Lucy doc. Ing., Ph.D.; Veronika Pavliňáková; Pavliňáková Veronika Mgr., Ph.D.; Katarína Kacvinská; Katarína Ing. Kacvinská; Jan Žídek; Žídek Jan Mgr., Ph.D.; Břetislav Lipový; Ph.D. MBA Lipový Břetislav doc. MUDr.; Jakub Holoubek; Jakub MUDr Holoubek; Martin Knoz; Knoz Martin MUDr., Ph.D.; Martin FALDYNA; Faldyna Martin MVDr., Ph.D.; Eduard Göpfert; Göpfert Eduard MVDr., Ph.D.; Monika Vícenová; Monika Mgr. Vícenová
Original assignee: Vysoké Učení Technické V Brně; Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i.; Fakultní Nemocnice Brno
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2021-07-27

Description

Předmětem technického řešení je dvouvrstvá, plně vstřebatelná, náhrada kůže pro léčbu kožních defektů obsahující spodní biopolymemí porézní část a horní nanovlákennou část z biodegradabilních polymerů modifikovanou bioaktivními látkami urychlujícími hojení.

Dosavadní stav techniky

Hojení kožních ran je složitý proces zahrnující interakce mezi buňkami, mediátory, cytokiny, remodelací matrice a neurovaskulámím systémem. Úspěšnost hojení kůže se významně zvýšila s použitím náhrad připravených na míru z biomateriálů napodobujících extracelulámí matrix kůže a její vlastnosti (např. pevnost a pružnost). Biomateriály jsou klíčovou součástí různých krytů ran a náhrad tkáňového inženýrství. Náhrady musí splňovat určité požadavky, jako je biokompatibilita, biologická rozložitelnost, dočasná mechanická podpora, propustnost a propojovací póry vhodné pro podporu buněčné integrace. Nejčastějším materiálem pro náhradu kůže je kolagen. Kolagen je nejhojnější protein v lidském těle, kde působí jako strukturní stavební blok extracelulámí matrix, který se nachází ve většině nativních tkání. Kolagen je také málo zánětlivý, biologicky odbouratelný, biokompatibilní a bioresorbovatelný biopolymer. Má vysokou afinitu kvodě, dobrou buněčnou kompatibilitu, nízkou antigenicitu a schopnost podporovat regeneraci tkání. Nedokonalosti kolagenu lze eliminovat kombinací kolagenu s jinými biomateriály a/nebo bioaktivními molekulami.

Oxidovaná celulóza a chitosan jsou biologicky odbouratelné polysacharidy a vykazují biologickou aktivitu. Oxidovaná celulóza se široce používá jako hojivý a hemostatický materiál s vynikajícími vlastnostmi, jako je vysoká vstřebatelnost, antibakteriální a antivirové vlastnosti, a netoxické a antiadhezivní účinky. Chitosan vykazuje jedinečné vlastnosti, jako je biokompatibilita, biologická rozložitelnost, baktericidní účinek a schopnost zpracování na mikrovlákna a nanovlákna. Chitosan se používá v různých biomedicínských aplikacích, jako jsou nosiče léčiv, chirurgické nitě a materiály pro hojení ran. Kromě toho může chitosan fungovat jako můstek ke zvýšení účinnosti zesíťování v materiálech na bázi kolagenu kvůli velkému počtu aminoskupin v jeho molekulárním řetězci.

Nové možnosti v léčbě a zlepšení vlastností materiálů pro tkáňové inženýrství kůže mohou zajistit biologicky účinné látky na bázi růstových faktorů. Nalezení vhodné koncentrace růstových faktorů a způsob jejich dodání do místa určení je klíčovým faktorem pro jejich použití v tkáňovém inženýrství a regenerativní medicíně. Bylo zjištěno, že např. růstové faktory obsažené v krevních derivátech mají vhodné vlastnosti pro tkáňové inženýrství a regenerativní medicínu. Plazma bohatá na krevní destičky (PRP), která se získává od pacienta (autologně), od dárců (alogenně) nebo od zvířat (xenogenně), obsahuje endogenní růstové faktory např. transformující růstový faktor-βΐ (TGF-βΙ), růstové faktory podobné inzulínu (IGF) 1 a 2, vaskulámí endoteliální růstový faktor (VEGF), fibroblastový růstový faktor 2 (FGF2) a růstový faktor hepatocytů (HGF), dále i plazmatické proteiny, jako je fibrin, fibronektin a vitronektin. PRP v kombinaci s kolagenem a biokeramikou byla již použita v inženýrství kostní tkáně in vivo (CZ 307053).

Fibroblastový růstový faktor 2 (FGF2) je jedním z rodiny savčích fibroblastových růstových faktorů, která se skládá z nejméně 23 členů (22 dosud identifikovaných u lidí). FGF2 je polypeptidový mitogen stimulující životaschopnost buněk, spojený s hojením ran, a také hraje roh v mitogenezi mezenchymálních buněk.

Ideální náhrada pro náhradu kůže by měla být biokompatibilní, netoxická a biodegradovatelná. Během jejího rozpadu vzniká nová tkáň, která náhradu v konečné fázi nahradí. Kromě

- 1 CZ 35280 UI odpovídajícího chemického složení by měla mít náhrada podobné mechanické vlastnosti jako původní tkáň. Posledním neméně důležitým faktorem pro ideální nosič je jeho vnitřní struktura s dostatečně velkými a propojenými póry pro migraci buněk a zejména živin, včetně prorůstání cév. Umělé kožní náhrady na bázi kolagenu řídící proces hojení ran se v současné době používají v léčbě chronických kožních defektů a akutních ran. Závažným problémem je však jejich vysoká cena a rizika pocházející z infekčních komplikací.

V ČR jsou registrovány k použití dvě dvouvrstevné náhrady dermis. První žních je Integra® (Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA) obsahující lidský kolagen I + glykosaminoglykan (GAG) a silikonovou vrstvu s tloušťkou 1,3 mm. Druhou je Nevelia® (Symatese Aesthetic, Chaponost, France), která je složena z třídimenzionální porézní matrice složené z bovinního kolagenu typu I kryté silikonovou membránou. Obě tyto náhrady dermis vyžadují dvoukrokový proces, prvním krokem je samotná aplikace a druhým krokem poté odstranění silikonové membrány a krytí tenkým dermo-epidermálním štěpem (v odstupu 3 až 4 týdnů). V ČR je registrována také jednovrstevná dermální náhrada Matriderm® (MedSkin Solution Dr. Suwelack AG, Billerbeck, Německo). Jedná se o vysoce porézní materiál (velikost pórů je mezi 35 a70pm) různé tloušťky (0,5 mm, 1,0 mm a 2,0 mm). Samotná membrána obsahuje nativní (nesíťovaný) bovinní kolagen typu I, II a V, spolu s hydrolyzátem a-elastinu, který je opět bovinního původu a je získán z ligamentum nuchae (GfN Herstellung von Naturextrakten GmbH. Michelbach, Německo).

Podstata technického řešení

Předmětem předkládaného technického řešení je náhrada kůže obsahující první vrstvu z porézní pěny tvořené kolagenem a polysacharidem v hmotnostním poměru 9:1 až 1:9, s výhodou 1:1, s velikostí pórů v rozmezí 50 až 450 mikrometrů; a druhou vrstvu tvořenou nanovlákny biokompatibilního polymeru vybraného ze skupiny chitosanu, polykaprolaktonu, kyseliny polymléčné, kyseliny polyglykolové, kopolymeru kyseliny mléčné a glykolové, kopolymeru kyseliny mléčné, glykolové a polyethylenglykolu, polydioxanonu, polyanhydridů, polyhydroxybutyrátu, polyvinylalkoholu, kyseliny hyaluronové, želatiny, kolagenu, elastinu, oxidované celulózy, karboxymethylcelulózy a jejich směsí.

Polysacharidem je s výhodou chitosan, oxidovaná celulóza nebo karboxymethylcelulóza. Tyto polysacharidy jsou biokompatibilní, bioresorbovatelné a mají antibakteriální vlastnosti.

Nanovlákenná vrstva z biokompatibilních polymerů jez alespoň jednoho polymeru vybraného ze skupiny bioresorbovatelných polymerů chitosanu, polykaprolaktonu, kyseliny polymléčné, kyseliny polyglykolové, kopolymeru kyseliny mléčné a glykolové, kopolymeru kyseliny mléčné, glykolové a polyethylenglykolu, polydioxanonu, polyanhydridů, polyhydroxybutyrátu, polyvinylalkoholu, kyseliny hyaluronové, želatiny, kolagenu, elastinu, oxidované celulózy, karboxymethylcelulózy a jejich směsí. Tyto polymery jsou biokompatibilní, dobře zvláknitelné, a mají dobré mechanické vlastnosti.

Nanovlákenná vrstva tvoří mukoadheživní membránu, která zajišťuje dobrou přilnavost k epidermálnímu autoštěpu, kterým se celá náhrada při použití nakonec překryje.

Nanovlákny se standardně rozumí vlákna, jejichž průměr je v rozmezí 10 až 1000 nm. Taková nanovlákna lze připravit např. metodami elektrostatického zvlákňování.

Nanovlákennávrstva biokompatibilního polymeruje s výhodou elastická.

S výhodou má nanovlákenná vrstva velikost pórů v rozmezí 0,5 až 10 mikrometrů.

Nanovlákenná vrstva tvoří s výhodou 0,1 až 20 hmota. % z hmotnosti celé náhrady kůže.

-2 CZ 35280 UI

Nanovlákenná vrstva je s výhodou s porézní pěnou spojena zesítěním, zejména zesítěním s použitím činidel vybraných ze skupiny N-(3 -dimethylaminopropyl) -N'-ethylkarbodiimidu hydrochloridu (EDC), N-hydroxysukcinimidu (NHS), aldehydů (glutaraldehydů, formaldehydů), kyselin (citrónové, tříselné nebo alginové), enzymů (transglutaminázy, lysyloxidázy), přírodních síťovadel (genipinu, riboflavinů), epoxidových sloučenin (glycerol diglycidyl éterů, glycerol triglycedyl éterů a ethylenglykol glycidyl éterů), tetrakis hydroxymethyl fosfonium sulfátu ajodistanu, nebo zesítěním fyzikálními vlivy (jako je teplo, záření gamma, UV nebo E-beam).

V porézní pěně a/nebo v nanovlákenné vrstvě mohou být adsorbovány bioaktivní látky, zejména polymery/kopolymery odvozené od katecholaminů a/nebo růstový faktor. Růstový faktor může být vybrán ze skupiny zahrnující transformující růstový faktor-β (TGF-β) 1, 2 a 3, růstové faktory podobné inzulínu (IGF) 1 a 2, vaskulámí endoteliální růstový faktor (VEGF), fibroblastový růstový faktor (FGF) 2, 7 a 10, růstový faktor hepatocytů (HGF), růstové faktory podobné inzulínu (IGF) 1 a 2, vaskulámí endoteliální růstový faktor (VEGF) A, B, C, D a E, fibroblastový růstový faktor (FGF) 2, 7 a 10, epidermální růstový faktor (EGF), růstový faktor krevních destiček (PDGF) AA, BB, AB a CC a růstový faktor hepatocytů (HGF). Katecholaminem může být například p-3,4-dihydroxyfenylalanin nebo dopamin.

S výhodou jev porézní pěně a/nebo v nanovlákenné vrstvě adsorbován fibroblastový' růstový faktor FGF2. Tak lze využít jeho účinky pro urychlení prorůstání nativních fibroblastů a cév.

S výhodou je v porézní pěně a/nebo v nanovlákenné vrstvě adsorbován polydopamin vzniklý polymerací dopaminu, který zajišťuje lepší mechanické vlastnosti aprokrvení novotvořené kůže.

Celková tloušťka náhrady kůže je s výhodou v rozmezí 0,5 až 4 mm.

Na animálním modelu Velkého bílého prasete byla potvrzena účinná funkce kožní náhrady podle předkládaného technického řešení, která urychlila hojení a regeneraci poraněné tkáně pokožky v celé tloušťce defektu kůže v jednom kroku postupu léčby. Hodnocení bylo prováděno pomocí kutometrie (elasticita kůže), imunohistochemickým barvením histologických řezů (kapilarita) a pomocí genové exprese mRNA různých prozánětlivých, protizánětlivých a pro-léčivých proteinů.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad A - srovnávací příklad

Polymemí pěna tvořená kolagenem a zesítěná

Polymemí pěna je založena na lyofilizované suspenzi bovinního kolagenu typu I. Studená (4 °C) vodná kolagenová suspenze s koncentrací 0,5 hmota. % byla homogenizována a bubliny vzduchu byly odstředěny centrifugou. Kašovitá polymemí směs byla vylita do formy (5x5 cm), zmrazená v lyofilizátoru a postupně lyofilizována při -35 °C a tlaku pod 1 mBar (100 Pa) po dobu 15 hodin (Martin Christ Epsilon 2-1 OD) s následovaným sekundárním sušicím procesem při 25 °C a tlakem pod 0,01 mBar (1 Pa) až do poklesu Ap (aby změna tlaku byla pod 10 %). Lyofilizované porézní vzorky byly následně stabilizovány chemickým síťováním použitím činidel N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylkarbodiimidu hydrochloridu (EDC) a N-hydroxysukcinimidu (NHS) v poměru 2:1a následně 2x promyty 0,lM roztokem Na2HPO4po dobu 30 minut a Ix ultračistou vodou, také po dobu 30 minut. Po síťování byly vzorky opět zmrazený a znovu zlyofilizovány (dle výše uvedených parametrů).

-3 CZ 35280 UI

Příklad B - srovnávací příklad

Polymerní pěna tvořená kolagenem a chitosanem a zesítěná

Polymerní pěna je založena na lyofílizované suspenzi bovinního kolagenu typu I za přídavku resorbovatelného polysacharidu s antibakteriálními vlastnostmi - chitosanu. Vypočítané množství chitosanu ve hmotnostním poměru 1:1 bylo pomalu přidáno ke studené (4 °C) vodné kolagenové suspenzi s koncentrací 0,5 hmoto. %. Biopolymemí směs byla homogenizována a bubliny vzduchu byly odstředěny centrifugou. Dále byl postup stejný jako v Příkladu A.

Připraveny byly stejným postupem i další polymerní pěny, kde byl poměr chitosanu ke kolagenu variován v rozmezí 1:9 až 9:1.

Příklad C - srovnávací příklad

Polymerní pěna tvořená kolagenem a oxidovanou celulózou a zesítěná

Polymerní pěna je založena na lyofílizované suspenzi bovinního kolagenu typu I za přídavku resorbovatelného polysacharidu s antibakteriálními vlastnostmi - vápenaté soli oxidované celulózy. Příprava materiálu byla stejná jako v Příkladu B.

Příklad D - srovnávací příklad

Polymerní pěna tvořená kolagenem a karboxymethylcelulózou a zesítěná

Polymerní pěna je založena na lyofílizované suspenzi bovinního kolagenu typu I za přídavku resorbovatelného polysacharidu - sodné soli karboxymethylcelulózy. Příprava materiálu byla stejná jako v Příkladu B.

Příklad 1

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymerní pěny tvořené kolagenem a nanovlákennou vrstvu

Kompozitní náhrada pro řešení kožních defektů je složená ze zesíťované lyofílizované pěny z bovinního kolagenu typu I připravené dle Příkladu A. Pěna je dále umístěna na nosnou textilii přístroje na elektrostatické zvlákňování (Nanospider, Elmarco, ČR) a je potažena amfífílními nanovlákny ze směsi želatiny, polykaprolaktonu a oxidované celulózy v hmotnostním poměru 70/30/10 (při vzdálenosti elektrody 15 mm, napětí 54 kV, proudu 3 μΑ a rychlosti nosné textilie 50 mm/min) z 99% kyseliny octové jako rozpouštědla.

Příklad 2

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymerní pěny tvořené kolagenem a chitosanem a nanovlákennou vrstvu

Kompozitní náhrada pro řešení kožních defektů je složená ze zesíťované lyofílizované pěny bovinního kolagenu typu I a chitosanu připravené dle Příkladu B. Amfífílní nanovlákna byla nanesena na připravenou pěnu postupem podle Příkladu 1.

Příklad 3

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymerní pěny tvořené kolagenem a oxidovanou celulózou a nanovlákennou vrstvu

-4 CZ 35280 UI

Kompozitní náhrada pro řešení kožních defektů je složená ze zesíťované lyofilizované pěny bovinního kolagenu typu I a oxidované celulózy připravené dle Příkladu C. Amfifilní nanovlákna byla nanesena na připravenou pěnu postupem podle Příkladu 1.

Příklad 4

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a chitosanem a nanovlákennou vrstvu

Kompozitní náhrada pro řešení kožních defektů je složená ze zesíťované lyofilizované pěny bovinního kolagenu typu I a chitosanu připravené dle Příkladu C. Amfifilní nanovlákna byla nanesena na připravenou pěnu postupem podle Příkladu 1.

Příklad 5

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a nanovlákennou vrstvu, zesítěná

Kompozitní náhrada pro řešení kožních defektů je složená z lyofilizované pěny z bovinního kolagenu typu I, na kterou jsou nanesena nanovlákna a celá dvouvrstvá je nakonec zesíťována pro zvýšení stability in vivo. Studená (4 °C) vodná kolagenová suspenze s koncentrací 0,5 hmota. % byla homogenizována a bubliny vzduchu byly odstředěny centrifugou. Kašovitá polymemí směs byla vylita do formy, zmrazená v lyofilizátom a postupně lyofilizována při -35 °C a tlaku pod 1 mBar (100 Pa) po dobu 15 hodin (Martin Christ Epsilon 2-1 OD) s následovaným sekundárním sušicím procesem při 25 °C a tlakem pod 0,01 mBar (1 Pa) až do poklesu Ap (aby změna tlaku byla pod 10 %). Na lyofilizované porézní vzorky byla nanesena amfifilní nanovlákna postupem podle Příkladu 1. Následně byla dvouvrstvá stabilizována chemickým síťováním použitím činidel N-(3 -dimethylaminopropyl) -N' -ethylkarbodiimidu hydrochloridu (EDC) a N-hydroxysukcinimidu (NHS) v poměru 2:1. Vzorky byly dále 2x promyty 0,lM roztokem Na2HPO4 po dobu 30 minut a Ix ultračistou vodou, také po dobu 30 minut. Po síťování byly vzorky opět zmrazený a znovu lyofilizovány (dle výše).

Příklad 6

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a chitosanem a vrstvu nanovláken, zesítěná

Polymemí pěna je založena na lyofilizované suspenzi bovinního kolagenu typu I za přídavku chitosanu. Vypočítané množství chitosanu ve hmotnostním poměru 1:1 bylo pomalu přidáno ke studené (4 °C) vodné kolagenové suspenzi s koncentrací 0,5 hmota. %. Biopolymemí směs byla homogenizována a bubliny vzduchu byly odstředěny centrifugou. Dále byly vzorky potaženy vrstvou nanovláken a zesítěny stejně jako v Příkladu 5.

Připraveny byly i další náhrady obsahující polymemí pěny, kde byl poměr chitosanu ke kolagenu variován v rozmezí 1:9 až 9:1.

Příklad 7

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a oxidovanou celulózou a vrstvu nanovláken, zesítěná

Polymemí pěna je založena na lyofilizované suspenzi bovinního kolagenu typu I za přídavku oxidované celulózy. Vypočítané množství oxidované celulózy ve hmotnostním poměm 1:1 bylo pomalu přidáno ke studené (4 °C) vodné kolagenové suspenzi s koncentrací 0,5 hmota. %.

- 5 CZ 35280 UI

Biopolymemí směs byla homogenizována a bubliny vzduchu byly odstředěny centrifugou. Dále byly vzorky potaženy vrstvou nanovláken a zesítěny stejně jako v Příkladu 5.

Připraveny byly i další náhrady obsahující polymemí pěny, kde byl poměr oxidované celulózy ke kolagenu variován v rozmezí 1:9 až 9:1.

Příklad 8

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a karboxymethylcelulózou a vrstvu nanovláken, zesítěná

Polymemí pěna je založena na lyofílizované suspenzi bovinního kolagenu typu I za přídavku karboxymethylcelulózy. Vypočítané množství oxidované celulózy ve hmotnostním poměm 1:1 bylo pomalu přidáno ke studené (4 °C) vodné kolagenové suspenzi s koncentrací 0,5 hmota. %. Biopolymemí směs byla homogenizována a bubliny vzduchu byly odstředěny centrifugou. Dále byly vzorky potaženy vrstvou nanovláken a zesítěny stejně jako v Příkladu 5.

Připraveny byly i další náhrady obsahující polymemí pěny, kde byl poměr karboxymethylcelulózy ke kolagenu variován v rozmezí 1:9 až 9:1.

Příklad 9

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a vrstvu nanovláken, zesítěná a s adsorbovaným polydopaminem

Polymemí pěna je založena na lyofílizované suspenzi bovinního kolagenu typu I a potažená vrstvou nanovláken a následně zesítěná. Dvouvrstvá byla připravena podle Příkladu 5. Následně byla dvouvrstvá modifikována polydopaminem, kdy po chemickém síťování náhrady směsí EDC/NHS a posledním promytí náhrady v čisté vodě je dvouvrstvá zalita roztokem hydrochloridu dopaminu (2 mg/ml) připraveným v 0,0IM Tris HC1. Vzorek byl udržován v dopaminu po dobu 24 hodin. Polymerace dopamin hydrochloridu probíhala při pokojové teplotě za aerobních podmínek a vedla k černě zbarvenému polydopaminu (PDA). Následně byl vzorek 4krát vymyt destilovanou vodou, dokud nezmizel veškerý nevázaný polydopamin, který se jako černý roztok uvolňoval do promývací vody. Následně byl vzorek podmhé lyofilizován postupem dle Příkladu A.

Příklad 10

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a chitosanem a vrstvu nanovláken, zesítěná a s adsorbovaným polydopaminem

Polymemí pěna je založena na lyofílizované suspenzi bovinního kolagenu typu I a chitosanu, potažená vrstvou nanovláken a následně zesítěná stejně jako v Příkladu 6. Následně byla dvouvrstvá modifikována polydopaminem postupem dle Příkladu 9.

Příklad 11

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a oxidovanou celulózou a vrstvu nanovláken, zesítěná a s adsorbovaným polydopaminem

Polymemí pěna je založena na lyofílizované suspenzi bovinního kolagenu typu I a oxidované celulózy, potažená vrstvou nanovláken a následně zesítěná stejně jako v Příkladu 7. Následně byla dvouvrstvá modifikována polydopaminem postupem dle Příkladu 9.

-6CZ 35280 UI

Příklad 12

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a karboxymethylcelulózou a vrstvu nanovláken, zesítěná a s adsorbovaným polydopaminem

Polymemí pěna je založena na lyofilizované suspenzi bovinního kolagenu typu I a karboxymethylcelulózy, potažená vrstvou nanovláken a následně zesítěná stejně jako v Příkladu 8. Následně byla dvouvrstvá modifikována polydopaminem postupem dle Příkladu 9.

Příklad 13

Dvouvrstvá náhrada obsahující vrstvu polymemí pěny tvořené kolagenem a chitosanem a vrstvu nanovláken, zesítěná a s adsorbovaným FGF2

Polymemí pěna je založena na lyofilizované suspenzi bovinního kolagenu typu I a chitosanu, potažená vrstvou nanovláken a následně zesítěná stejně jako v Příkladu 6 s tím rozdílem, že před lyofilizací po zesítění EDC/NHS byla dvouvrstvá zalita roztokem fibroblastového růstového faktoru 2 - FGF2, tak aby výsledná koncentrace FGF2 byla 0,1 pg/cm². Následně byly vzorky opět zmrazený a lyofilizovány.

Příklad 14

Polymemí pěna je založena na lyofilizované suspenzi bovinního kolagenu typu I a chitosanu, potažená vrstvou nanovláken a následně zesítěná stejně jako v Příkladu 13 stím rozdílem, že koncentrace roztoku fibroblastového růstového faktoru 2 - FGF2 byla 1 pg/cm². Následně byly vzorky opět zmrazený a zlyofilizovány.

Příklad 15

Polymemí pěna je založena na lyofilizované suspenzi bovinního kolagenu typu I a chitosanu, potažená vrstvou nanovláken a následně zesítěná stejně jako v Příkladu 13 stím rozdílem, že koncentrace roztoku fibroblastového růstového faktoru 2 - FGF2 byla 10 pg/cm². Následně byly vzorky opět zmrazený a lyofilizovány.

Příklad 16

Jednovrstvé náhrady připravené ve srovnávacích příkladech A až D, a dvouvrstvé náhrady připravené v příkladech 1 až 8, 10 byly podrobeny dynamické mechanické analýze pro testování maximální pevnosti a prodloužení v suchém i hydratovaném stavu.

Měření bylo provedeno v jednoosém deformačním testu. Vzorky byly nařezány na proužky o délce 40 mm a šířce 10 mm. Tloušťka byla různá podle typu vzorku (0,5 až 1,5 mm). Vzorky byly upevněny do držáku ve střední poloze. Vzdálenost mezi dvěma konci držáků byla nastavena na 10 mm. První mechanické testování bylo provedeno při teplotě místnosti 23 °C a druhé testování v hydratovaném stavu v ultračisté vodě při teplotě 37 °C ve vestavěné komoře obklopující držáky. Vztah mezi napětím a tlakem byl znázorněn tahovými křivkami, ve kterých byla zaznamenána maximální prodloužení při mezní pevnosti v tahu. Měření byla provedena na dynamickém mechanickém analyzátoru RSA-G2 (TA Instruments lne., USA).

-7 CZ 35280 UI

Tab. 1: Provnání výsledků mechanických vlastností: vliv nanovláken - jednovrstvá vs. dvojvrstva.

	Maximální pevnost	Maximální pevnost	Prodloužení	Prodloužení
Označení příkladu	suchý stav (kPa)	mokrý stav (kPa)	suchý stav (%)	mokrý stav (%)
Příklad A	88	27	3,2	7,7
Příklad B	46	8	7,8	12,4
Příklad C	187	9	4,2	9,9
Příklad D	33	2	9,4	17,9
Příklad 1	100	20	3,1	12,5
Příklad 2	56	15	8,1	21,9
Příklad 3	220	7	2,1	17,9
Příklad 4	40	3	10,9	29,9
Příklad 5	120	30	5,1	9,9
Příklad 6	61	14	6,4	37,8
Příklad 7	260	9	3,3	9,1
Příklad 8	340	15	8,4	22,4
Příklad 10	160	36

Z Tab. 1 je patrné, že nanesení vrstvy nanovláken zvyšuje maximální pevnost náhrady především v suchém stavu a tím zlepšuje manipulovatelnost náhrady. Nanovlákna také zvyšují prodloužení (elasticitu) náhrady především v mokrém stavu, která je takto použitelná právě pro náhradu kůže.

Příklad 17

Jednovrstvé náhrady připravené ve srovnávacích příkladech A až D, a dvouvrstvé náhrady připravené v příkladech 1 až 8 byly podrobeny měření velikosti pórů (vrstvy pěny i vrstvy nanovláken) pomocí rastrovací elektronové mikroskopie (SEM).

Morfologie náhrad byla zkoumána pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM, Tescan MIRA3, Česká republika). Všechna pozorování byla prováděna v režimu emise sekundárních elektronů s vysokým napětím 10 kV. Pro lepší rozlišení byly vzorky potaženy 20nm vrstvou zlata. Velikost pórů připravených materiálů byla vypočítána ze snímků SEM pomocí softwaru ImageJ. Póry byly hodnoceny z 5-ti různých SEM obrázků každého vzorku se zorným polem 1,5 mm. Průměrná velikost pórů byla vypočítána pomocí 150 naměřených hodnot ze snímků SEM.

Tloušťka dvoj vrstvy byla měřena mikrometrem.

Tab. 2: Provnání výsledků velikosti pórů a tloušťky náhrad: vliv nanovláken - jednovrstvá vs. dvojvrstva.

	SEM (pěny)	SEM (nanovlákna)	Tloušťka dvouvrstvy
Označení příkladu	velikost pórů (pm)	velikost pórů (pm)	(mm)
Příklad A	258		1,2
Příklad B	200		2,0
Příklad C	150		0,5
Příklad D	379		2,4

- 8 CZ 35280 UI

Příklad 1	243	2,32	1,4
Příklad 2	297	4,11	2,2
Příklad 3	224	5,23	0,7
Příklad 4	361	2,96	2,5
Příklad 5	227	3,05	1
Příklad 6	215	0,95	1,4
Příklad 7	182	2,68	0,4
Příklad 8	292	3,87	2,4
Příklad 10	265	0,98	0,7

Z Tab. 2 je patrné, že nanovlákenné dvouvrstvy mají na povrchu velmi malou velikost pórů v řádu jednotek mikrometrů. Tímto je zajištěna neprůchodnost jak pro bakterie, tak i pro fíbroblasty, aby se nedostaly z dermis do horní vrstvy epidermis. Všechny vzorky mají propojené póry ve spodní pěnové vrstvě, jejichž velikost je v rozmezí od 150 až 400 mikrometrů, což zajišťuje správný přísun živin skrz dvouvrstvu a také vhodnou velikost pórů pro adhezi a proliferaci fíbroblastů. Celková tloušťka dvouvrstvy byla v rozmezí 0,4 až 2,5 mm. Nanovlákna v příkladech 1 až 4 zvyšují průměrně tloušťku náhrady o cca 0,2 mm (pouze o nanesená nanovlákna), kdežto u materiálů podle příkladů 5 až 8 se oproti jedno vršte vnému materiálu celková tloušťka o cca 0,2 až 0,3 mm snížila po celkovém zesítění obou vrstev dohromady, kdy dochází ke smrštění vrstev.

Příklad 18

Pro některé vzorky byla na animálním modelu sledována kapilarita, tj. plošná hustota cévek (%), po implantaci do místa defektu kůže.

Kožní náhrada byla sterilizována ethylenoxidem a skladována v exikátoru do doby, než byla chirurgicky implantována do místa defektu kůže na animálním modelu Velkého bílého prasete. Po třech měsících hojení byla v narkóze z místa kožních defektů prasete odebrána tkáň pro histologické zpracování a analýzy. Tkáň byla fixovaná v 4% roztoku formaldehydu a byla standardně zpracována na formol-parafinové bloky. Z bloků byly zhotoveny 4 mikrometry silné tkáňové řezy, které byly barveny hematoxylinem-eosinem a imunohistochemicky na průkaz hladkosvalového aktinu (SMA - smooth muscle actin), který je exprimován ve stěně kapilár. Řezy byly následně morfólogicky vyhodnocovány na úrovni optické mikroskopie. Byla posuzována přítomnost defektu, granulační tkáně, vaziva, zánětlivé celulizace, cizorodých těles a přítomnost obrovských mnohojademých makrofágů. Imunohistochemické barvení na hladkosvalový aktin umožnilo vyhodnocení přítomnosti a počtu novotvořených krevních kapilár pomocí analýzy obrazu. Výsledkem je plošná hustota cévek vyjádřená v % z povrchu v histologickém snímku barveného SMA.

Z výsledků je patrné, že nanovlákenná vrstva zajišťuje lepší kapilaritu (vyšší plošnou hustotu kapilár) novotvořené kůže o zhruba 1,5 až 3 x.

Tab. 3: Kapilarita (počet cévek) v histologickém vzorku po 3 měsících hojení.

	Kapilarita
Označení příkladu	plošná hustota cévek (%)
Příklad A	1,8
Příklad B	3,5
Příklad C	3,7
Příklad 1	5,5

-9CZ 35280 UI

Příklad 2	6,5
Příklad 3	5,5
Příklad 6	6,5
Příklad 10	6,9
Příklad 13	9,6
Příklad 14	11,5
Příklad 15	14,7

Příklad 19

Pro některé vzorky byla na animálním modelu sledována genová exprese mRNA a bylo provedeno hodnocení jizvy podle Yeonga.

Vzorky kůže (každý přibližně 10 mg) odebrané v narkóze prasete v 6. měsíci hojení z ošetřených defektů byly nakrájené na plátky o tloušťce menší než 0,5 cm a po operaci umístěny přímo do stabilizačního roztoku RNAlater (Qiagen, Německo) a skladovány při -70 °C až do izolace RNA. Před izolací RNA byly kožní tkáně homogenizovány v 1 ml TRI Reagent RT (Molecular Research Center, lne., USA) s 10 kuličkami Zirconia/Silica o průměru 2,3 mm (BioSpec Products, lne., USA) pomocí přístroje MagNA Lyser (Roche Diagnosics, Mannheim, Německo). Fáze RNA byla získána po oddělení s použitím 4-bromanisolu, po kterém následoval purifikační postup s použitím sady RNeasy Kit (Qiagen, Tubingen, Německo). V posledním kroku byla získána celková RNA do 15 ul vody prosté RNáz. RNA byla reverzně transkribována reverzní transkriptázou M-MLV (200 U/μΙ, Invitrogen) a primerem oligo (dT) RT (Generi Biotech, Hradec Králové, Česká republika) při teplotě 37 °C po dobu 1,5 hodiny. cDNA byla až do použití skladována při -20 °C. qPCRbyla provedena v triplikátech na přítroji LightCycler480 (Roche Applied Science, Penzberg, Německo). V qPCR byly použity primery specifické pro 9 sledovaných genů (GOI) chemokinů a cytokinů a 3 house-keepingové geny jako kandidátní referenční geny (REF) (Generi Biotech, Hradec Králové, Česká republika, tabulka 2). Ze tří house-keepingových genů byl pomocí programu NormFinder vybrán jako referenční gen hydroxymethylbilan syntáza (HMBS) s minimální variabilitou genové exprese mezi všemi testovanými vzorky. HMBS také sloužil jako pozitivní interní kontrola qPCR. Na základě hodnot kvantifikačního cyklu Cq stanoveného v qPCR pro geny GOI a REF (k normalizaci dat) byl s pomocí vzorce [l/(2^CqG0I)]/[l/(2^CqREF)] proveden výpočet genové exprese. Specifita amplikonů byla potvrzena pomocí testu teploty tání (program LightCycler 480 1.5.1.62, Roche Life Science).

V Tab. 4 jsou uvedeny hodnoty genové exprese mRNA proteinu VEGF (Vascular endothelial growth factor), jehož přítomnost zajišťuje lepší prokrvení a vaskularizaci novotvořené kůže (stimuluje tvorbu krevních cév). Čím je tato hodnota vyšší, tím vyšší je prokrvení novotvořené kůže. Superioritní jsou hodnoty nad 1, které byly zaznamenány u obou testovaných vzorků dvouvrstev s nanovlákny oproti velmi nízkým hodnotám pro-hojivého faktoru VEGF získaného u jedno vrstevných materiálů.

Hodnocení jizvy dle Yeonga

Yeongova škála je stupnice vyvinutá k hodnocení jizev, respektivě obrazové dokumentace jizev. Zahrnuje hodnocení jednotlivých vlastností jizvy a vzhledu jizvy. Hodnoceny jsou čtyři vlastnosti jizvy, tj. soulad barvy jizvy, vzhled povrchujizvy, výška (prominence jizvy), tloušťkajizvy u každé fotografie jizvy. Každá vlastnost je hodnocena známkami -1 až 4, přičemž -1 znamená nejlepší výsledek, 4 znamená nejhorší výsledek. Rozmezí celkových hodnot je tedy -4 až 16, čím je výsledná hodnota nižší (blíže 0), tím je kvalita jizvy lepší. Z výsledků je patrné, že nanovlákna především u materiálu kol/chit zlepšila kvalitu jizvy oproti jednovrstvému materiálu.

- 10CZ 35280 UI

Tab. 4: Výsledky genové exprese mRNA (faktoru VEGF) a hodnocení hojení jizvy dle Yeonga po 6 měsících hojení.


Označení příkladu	mRNA	Hojení/Yeong
Příklad A	0,23	2,7
Příklad B	0,69	4,8
Příklad 1	1,07	2,8
Příklad 2	i,n	4,2
Příklad 6	i,n	4,8
Příklad 13	1,66	5,3
Příklad 14	1,34	4,0
Příklad 15	1,77	4,6

Příklad 20

Pro dvouvrstvé náhrady podle příkladů 6 a 10 bylo provedeno hodnocení elasticity jizvy kutometrií a hodnocení hojení jizvy dle V AS.

Hodnocení elasticity jizvy kutometrií

Pro účely objektivizace visko-elastických vlastností vzniklých jizevnatých formací se celosvětově používá zejména kutometrie. Pro tyto účely jsme použili přístroj Cutometer® MPA 580 (Courage+Khazaka electronic GmbH, Cologne, Německo). Během měření dochází k periodickému nasávání (sukční část neboli on-time fáze) trvání a relaxaci (off-time fáze) sledované oblasti do otvoru o velikosti 2 mm ve speciální sondě. Obě fáze byly konstantní z pohledu času (trvaly 2,0 vteřiny) a pravidelně se opakovaly ve třech měřeních. Velikost podtlaku vyvíjeného přístrojem byla nastavena na 450 mbar (45 000 Pa).

Hodnotí se několik důležitých parametrů (faktoriálů), které reprezentují jednotlivé vlastnosti kůže (konečná deformace, redeformace, viskózní deformace, biologická elasticita, tuhost apod.). Pro naše účely jsme vybraly jeden z nej důležitějších parametrů - R0. Tento parametr reprezentuje tzv. konečnou deformaci, tedy první maximální amplitudu v rámci sukční části kutometrického cyklu (čím je vyšší hodnota, tím je kůže poddajnější, elastičtější, tedy se lépe deformuje).

Pro kožní náhradu podle Příkladu 6 byla zjištěna hodnota 0,012;

pro náhradu podle Příkladu 10 (modifikovanou dopaminem) byla zjištěna hodnota 0,020.

Pro náhrady modifikované různými koncentracemi FGF2 byly zjištěny následující hodnoty:

náhrada podle Příkladu 13: 0,017;

náhrada podle Příkladu 14: 0,015;

náhrada podle Příkladu 15: 0,019.

Hodnocení hojení jizvy dle VAS

VAS škála slouží k obrazovému hodnocení jizvy. Hodnoceny jsou vaskularita jizvy, pigmentace jizvy, kontura jizvy a individuální pocit pozorovatele (hodnotitele). Celkový počet bodů je od 0 bodů do 100 bodů za každou vlastnost. Hodnocen je i celkový součet individuálních skóre. Čím nižší je celkový počet bodů (čím se blíží více 0), tím je kvalita jizvy lepší.

- 11 CZ 35280 UI

Pro kožní náhradu podle Příkladu 6 byla zjištěna hodnota 104,71;

pro náhradu podle Příkladu 10 byla zjištěna hodnota 98,6.

Pro náhrady modifikované různými koncentracemi FGF2 byly zjištěny následující hodnoty: náhrada podle Příkladu 13: 75,5;

náhrada podle Příkladu 14: 91,82;

náhrada podle Příkladu 15: 95,3.

Z výsledků všech testů je patrné, že modifikace polydopaminem (náhrada podle Příkladu 10 ve srovnání s náhradou podle Příkladu 6) zlepší celkovou pevnost náhrady v suchém i mokrém stavu a částečně zvýší velikost pórů pěny (u nanovláken je hodnota srovnatelná). Polydopamin zřejmě také síťuje celkovou dvouvrstvu, protoje její tloušťka téměř poloviční oproti původní jednovrstvé. Mírně zvýšená j e kapilarita a výrazně pak kutometrie - elasticita kůže. Celková hodnota hodnocení kvality jizvy dle VAS je lepší u vzorku s polydopaminem.

Dále je z výsledků všech testů viditelné, že přídavek FGF2 výrazně podpořil kapilaritu (prokrvení) novotvořené kůže, jejíž hodnota stoupala s koncentrací FGF2. Výrazně lepší byly naměřeny i hodnoty kutometrie (elasticity jizvy) s nej lepší hodnotou pro použití FGF2 o koncentraci 10 pg/ml. Výrazně lepší byly i hodnoty pro-hojivého proteinu VEGF pro vzorky s FGF2 včetně hodnocení kvality hojení jizvy dle VAS v 6. měsíci hojení.

Průmyslová využitelnost

Technické řešení se týká porézní, plně vstřebatelné náhrady pro akcelerovanou regeneraci kůže. Náhrada kůže podle technického řešení je určena pro klinické použití v popáleninové a plastické chirurgii pro vyplnění defektu kůže např. po popálení, úrazu nebo extrakci nádoru.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Náhrada kůže obsahující první vrstvu z porézní pěny tvořené kolagenem a polysacharidem v hmotnostním poměru 9:1 až 1:9, s velikostí pórů v rozmezí 50 až 450 mikrometrů, vyznačující se tím, že dále obsahuje druhou vrstvu tvořenou nanovlákny polymeru vybraného ze skupiny polymerů chitosanu, polykaprolaktonu, kyseliny polymléčné, kyseliny polyglykolové, kopolymeru kyseliny mléčné a glykolové, kopolymeru kyseliny mléčné, glykolové a polyethylenglykolu, polydioxanonu, polyanhydridů, polyhydroxybutyrátu, kyseliny hyaluronové, želatiny, kolagenu, elastinu, oxidované celulózy, karboxymethylcelulózy a jejich směsí.
2. Náhrada kůže podle nároku 1, vyznačující se tím, že polysacharidem je chitosan, oxidovaná celulóza a/nebo karboxymethylcelulóza.
3. Náhrada kůže podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že druhá vrstva tvořená nanovlákny má velikost pórů v rozmezí 0,5 až 10 mikrometrů.
4. Náhrada kůže podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že druhá vrstva tvořená nanovlákny tvoří 0,1 až 20 hmota. % z hmotnosti celé náhrady kůže.
5. Náhrada kůže podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že druhá vrstva tvořená nanovlákny je s porézní pěnou spojena chemickým zesítěním.
6. Náhrada kůže podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že v první a/nebo druhé vrstvě je adsorbována alespoň jedna bioaktivní látka vybraná ze skupiny zahrnující polymery/kopolymery katecholaminů a růstové faktory.
7. Náhrada kůže podle nároku 6, vyznačující se tím, že růstový faktor je vybrán ze skupiny zahrnující transformující růstový faktor-β 1, 2 a 3, růstové faktory podobné inzulínu 1 a 2, vaskulámí endoteliální růstový faktor A, B, C, D a E, fibroblastový růstový faktor 2, 7 a 10, epidermální růstový faktor, růstový faktor krevních destiček AA, BB, AB a CC a růstový faktor hepatocytů.
8. Náhrada kůže podle nároku 6, vyznačující se tím, že katecholaminem je 3,4-dihydroxyfenylalanin a/nebo dopamin.
9. Náhrada kůže podle nároku 6, vyznačující se tím, že bioaktivní látkou je fibroblastový růstový faktor 2 a/nebo polydopamin.
10. Náhrada kůže podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že celková tloušťka náhrady kůže je v rozmezí 0,5 až 4 mm.