CZ34578U1 - Sada asociovaných markerů jednonukleotidových polymorfismů v souboru znaků genotypů rodu Pisum L. - Google Patents

Description

Sada asociovaných markérů jednonukleotidových polymorfismů v souboru znaků genotypů rodu Pisum L.

Oblast techniky

Technické řešení se týká testovací sady asociovaných SNP markérů s vybranými specifickými agronomicky významnými znaky u genotypů rodu Pisum L. (hrách). Jedná se o samosprašné krajové odrůdy, současné odrůdy, šlechtitelské materiály a plané příbuzné druhy rodu Pisum.

Dosavadní stav techniky

Současné tendence ve šlechtění hrachu mění v minulosti zažité zvyklosti dělení hrachu na hrách polní - jedlý (bělokvětá rostlina s kulatými semeny žluté či zelené barvy), hrách krmný (peluška barevně kvetoucí rostlina s kulatými semeny hnědé až černé barvy) a hrách dřeňový (bělokvětá rostlina se svraštělým povrchem semen žluté nebo zelené barvy). Díky novým poznatkům a zejména vzhledem k dietetickým požadavkům konzumentů a potravinářského průmyslu se produkují odrůdy dřeňového hrachu s barevným květem a osemením, u nichž se dá předpokládat větší obsah hořkých látek v semenech, případně v konzumovaných zelených luscích, a které mají navíc redukovanou listovou plochou.

V ČR existuje šlechtitelský program zaměřený na šlechtění a semenářství odrůd dřeňového hrachu (P. sativum subsp. sativum var. medullaré) využitelných ve společnosti SEMO a. s. Smržice. Šlechtitelský program je zaměřen na tvorbu odrůd s redukovanou listovou plochou, květenstvím nahloučeným v horní části rostlin a s rezistencí k houbovým a virovým onemocněním. Odrůdy se vyznačují odolností k padlí (Erysiphe pisi f. sp. pisi) a fůsáriovému vadnutí F. oxysporum f. sp. pisi rasa 1 a rasa 2, částečnou odolností k Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Thielaviopsis basicola a odolností k semenem přenosné virové mozaice (PSbMV).

Šlechtění hrachu polního a krmného (pelušky) probíhá v konvenčních podmínkách ve společnosti Selgen a.s. U polního hrachu se jedná výhradně o odrůdy s redukovanou listovou plochou, i když v jejich portfoliu lze nalézt i starší odrůdy listového typu registrované v minulosti. Odrůdy krmného hrachu, určené především na zelenou hmotu, jsou prozatím výhradně listového typu. Šlechtění polního a krmného hrachu je zaměřeno obecně na vyšší výnos semen, což přirozeně zahrnuje i vyšší úroveň rezistence k chorobám a škůdcům.

Výhodou pro pěstování hrachu je geneticky založená ochrana proti houbovým chorobám, virovým chorobám a škůdcům, což obecně zjednodušuje pěstitelskou technologii a zvyšuje produkci. Z tohoto hlediska není podstatný rozdíl v pěstování odrůd listových, nebo odrůd s redukovanou listovou plochou.

Výhodou odrůd s redukovanou listovou plochou je větší odolnost proti poléhání a větší prosvětlenost porostu, díky které nedochází ke vzniku příznivých podmínek pro rozvoj houbových chorob. Naopak odrůdy listového typu poskytují vyšší výnos zelené hmoty, díky zastínění povrchu půdy jsou odolnější k suchu, avšak s logickými riziky uvedenými výše. Moderní odrůdy polního a dřeňového hrachu dosáhly jak z hlediska agrotechnického, tak z hlediska kvality produktu pro potravinářské a krmivářské účely vysoké úrovně a z pohledu dalšího zlepšování konvenčními šlechtitelskými postupy de facto svého stropu. Dostupná diverzita v rámci kulturního hrachu, respektive genových zdrojů, je prakticky vyčerpána, využití planých druhů/forem rodu Pisum je limitováno omezenou křížitelností a pracností a rovněž časovou náročností nezbytného zpětného křížení. Klasická (necílená) mutageneze je rovněž málo efektivní. Využití nadějných technik genových manipulací (klasická transgenoze; nové šlechtitelské techniky, tzv. NBT) brání konzervativní legislativa EU spojená s diskriminujícími finančně neúnosnými požadavky na testování takto vzniklých odrůd. Vědecky progresivním a zároveň legislativně průchodným v EU se tak stává zejména šlechtění s použitím markérů (MAS = Marker-Assisted Selection). Užitný

-1 CZ 34578 UI vzor spočívá v nalezení/identifikaci molekulárních DNA markérů (zde SNP = Single-Nucleotide Polymorphism; jednonukleotidový polymorfismus) spojených s hospodářsky významnými kvantitativními a kvalitativními znaky hrachu. Těsná vazba markéru s genem/geny pro předmětný znak a jeho rychlá, spolehlivá a finančně příznivá identifikace posune klasickou selekci fenotypu během vegetace v polních podmínkách na kvalitativně vyšší úroveň preselekce a výběru rodičů pro hybridizaci již v laboratorních podmínkách (např. i s využitím techniky analýzy polovin semen). Kombinací metod molekulární genetiky (včetně recentního „přečtení“ kompletního genomu hrachu s velikostí 4,45 Gb) a bioinformatiky tak bude dán šlechtitelům hrachu k dispozici účinný nástroj (sada SNP markérů) pro zpřesnění, zrychlení a finanční zefektivnění procesu selekce a pro tvorbu kvalitativně nových a konkurenceschopných odrůd hrachu.

Polymorfismy nukleových kyselin se vyznačují přítomností variabilních pozic v DNA, v nichž se vyskytují dvě nebo více variant alel, které jsou v populaci zastoupeny v určité frekvenci. Jednonukleotidový polymorfismus (SNP) označuje variabilní stav pouze v jediném nukleotidu na konkrétním místě v genomu. SNP se mohou vyskytovat napříč celým genomem. V kódujících nebo regulačních sekvencích DNA mohou ovlivnit výsledný fenotyp daného jedince, avšak jejich častější výskyt je zaznamenán v nekódujících oblastech DNA, kde však mohou být ve vazbě s geny ovlivňujícími fenotypový projev zkoumaného znaku. Genetický marker je detekovatelný gen nebo variabilní sekvence DNA, u které je známo její umístění na chromozomu nebo kontigu. Lze je rozdělit na markéry fenotypové, jejichž projevem je pozorovatelný rozdíl ve fenotypovém projevu alel, biochemické, u nichž je možno detekovat vznik rozdílných proteinových produktů (izoenzymů), a DNA markéry, které se liší na úrovni sekvencí nukleotidů. Mezi DNA markéry patří markéry založené na restrikčním štěpením (např. RFLP), markéry založená na PCR a celogenomové markéry založené na sekvenaci DNA, ke kterým se řadí i detekce a analýza SNP. Využití celogenomových markérů je vhodné pro studium genetické variability mezi populacemi i uvnitř populací mezi zkoumanými jedinci, pro zkoumání kvantitativních znaků a pro identifikaci asociovaných SNP markérů ve vazbě ke konkrétním sledovaným fenotypovým projevům.

Použití DNA markérů ve šlechtění umožňuje efektivně a cíleně směřovat geneticky podmíněnou vlastnost plodin v požadované alelické skladbě do genotypů jedinců určených k tvorbě odrůdy. U znaků, které jsou založeny několika geny s velkým účinkem na projev znaku, se ve šlechtění využívá tzv. markerově asistovaná selekce (MAS), naopak u znaků, které jsou založeny více geny s malým účinkem na projev znaku, se využívá genomická selekce (GS). I když je koncept DNA markérů používán při šlechtění prakticky standardně, limitující je znalost DNA markérů konkrétního znaku u konkrétní plodiny. Metody získání DNA markérů asociovaných s fenotypovými znaky využitelnými při šlechtění jsou výsledkem genetického mapování. Genetické mapování založené na analýze mapovací populace vzniklé z křížení rodičů kontrastních v analyzovaných fenotypových znacích (RILs, Nils atd.) se v minulosti používalo ve spojení s analýzou v nižším počtu DNA markérů, dle dostupných možností. Tento způsob mapování je časově náročný, často navázaný na konkrétní rodiče mapovací populace, a při nižších počtech DNA markérů byl u něj problém s nedostatečným rozlišením.

S příchodem možností sledování velkého počtu DNA markérů napříč genomy velkého množství jedinců mohou být využity i metody asociačního mapování bez nutnosti tvorby mapovací populace. Celogenomové asociační mapování (GWAS, Genome-Wide Association Study) je založeno na statistickém hledání asociace ve velkém množství markérů s vyšší hustotou napříč celým genomem. Navíc jsou pro výpočet asociace SNP s fenotypovým znakem uzpůsobeny statistické modely, které dokážou odfiltrovat zavádějící vlivy, jako je struktura populace nebo příbuznost jedinců. Vývoj statistických modelů pro celogenomovou asociaci prošel v poslední době rychlým vývojem, kdy použitý statistický model BLINK je jedním z výpočetně nej efektivnějších modelů, který vykazuje nízkou mim falešně pozitivních výsledků - viz Huang, M., et al. 2019. BLINK: A package for the next level of genome-wide association studies with both individuals and markers in the millions. Gigascience giyl54. doi: 10.1093/gigascience/giyl 5 4.

-2CZ 34578 UI

Metody detekce SNP se v posledních letech významně rozvíjejí. Pro identifikaci jednotlivých jednonukleotidových polymorfismů lze použít protokoly založené na hybridizaci, kdy je daná varianta polymorfní alely detekována pomocí specifické sondy s navázaným fluorescenčním barvivém, nebo protokoly využívající enzymy, např. restrikční endonukleázy při CAPS, nebo polymerázy při PCR, anebo lze využít metody založené na sekvenování genomu souboru zkoumaných jedinců. Mezi metody detekce založené na sekvenaci patří resekvenace, která je vhodná pro celogenomové genotypování druhů, zejména s nízkou velikostí genomu. Na druhou stranu pro genomy s vyšší velikostí genomu se v současnosti nejvíce používá metoda celogenomového sekvenování genomu s redukovanou komplexitou (ddRADseq, GBS, DArTseq atd.), kdy jsou knihovny genomických fragmentů připraveny pomocí výběru jen konkrétní části genomu získané na základě štěpení restrikčními endonukleázami a omezením velikosti fragmentů. Právě metoda DArTseq byla použita pro detekci SNP celogenomového genotypu rostlin rodu Pisum L., které byly dále použity pro celogenomovou asociační analýzu. Metoda DArTseq využívá masivního sekvenování nové generace (NGS). Pro tento účel je vytvořena sekvenační knihovna, která pokrývá pouze vybranou část genomu rostlin. Taje následně sekvenována v režimu vysokého pokrytí. K redukci komplexity je využíván systém kombinace dvou restrikčních enzymů, z nichž jeden je navíc metylačně sensitivní. V porovnání s jinými metodami redukce komplexity genomu se DArTseq zaměřuje na unikátní oblasti v genomu, které jsou často typické pro genové oblasti s vysokou informativní hodnotou. Výsledky jsou bioinformaticky zpracovány, přičemž jsou detekovány zejména jednonukleotidové polymorfismy napříč celým genomem. Vysoké pokrytí sekvenace navíc umožňuje správně odhalit i alelické stavy u polyploidních nebo hybridních jedinců. Výsledky celogenomového genotypování jsou následně propojeny s pozorovanými fenotypovými daty při celogenomové asociační studii (GWAS), jejímž výsledkem je identifikace konkrétních SNP markérů asociovaných s danými fenotypovými projevy.

Hrách patří mezi nej rozšířenější druhy luskovin, pěstuje se v celém mírném pásmu převážně jako jarní plodina pro lidskou výživu a krmivo pro hospodářská zvířata. Je pěstován především pro semena, která mají vysoký obsah bílkovin (21 až 24 % hrubých bílkovin), asi 2 x vyšší než obiloviny. Skladba aminokyselin je rovněž příznivější než u obilovin, neboť má více nepostradatelných (simých) aminokyselin, jakož i vyšší obsah vitaminů i minerálních látek. V poslední době je registrován zvýšený zájem spotřebitelů o obsah rezistentního škrobu a karotenoidů. Z hlediska krmivářského je žádoucí snížení obsahu antinutričních látek (zejména trypsininhibitorů TIA a kyseliny fýtové) omezujících stravitelnost bílkovin a některých minerálů, zejména fosforu. V krmivářském průmyslu je u nás hrách nedoceněn a značná část produkce se vyváží. Pro krmné účely se hrách využívá jako šrot ze suchých zrn, jako zelené krmení, siláž a senáž. Krmné použití má i hrachovina (pokud není desikována). Méně známé je, že hrách je využitelný i ve farmaceutickém průmyslu a při výrobě škrobu pro speciální průmyslové použití. Pro lidskou výživu se spotřebuje méně než 10 % produkce.

Největším environmentálním kladem hrachu je fixace vzdušného dusíku symbiotickými bakteriemi ajeho exkrece do půdy. Výhodné jsou dále jeho fýtosanitámí účinky, mimořádná meliorační schopnost, která pomáhá zlepšovat fýzikální stav půdy, a schopnost vázat další makroprvky a mikroprvky nepostradatelné ve výživě rostlin.

S tím souvisí pozitivní vliv na úrodnost půd a vyváženost komplexu osevních sledů, kdy hrách je významný přerušovač jednostranného čerpání živin a udržovatel vyváženosti půdní mikroflory. Přestože je hrách napadán různými chorobami a škůdci, jeho zařazování do osevního postupu má souhrnně pozitivní účinek i na přirozený útlum šíření škodlivých organizmů v komplexu rostlinné produkce. V celkovém efektu se pak snižuje potřeba aplikace chemických prostředků, což má pozitivní vliv na životní prostředí. Průměrné zvýšení výnosu následné plodiny v osevním postupu (obilovin) se udává hodnotou cca 1 tuny/ha, tj. zvýšení produkce asi o 20 %.

Hrách je samosprašný, kleistogamický - k opylení dochází před otevřením květu. Hrách je diploidní (2n = 14), velikost genomu je cca 4,45 Gb (KreplakJ. et al. 2019. “A Reference Genome for Pea Provides Insight into Legume Genome Evolution. ” Nature Genetics 51(9): 1411-22).

-3CZ 34578 UI

Všechny typy kulturního hrachu se snadno vzájemně kříží, kulturní hrách (Pisum sativum L.) je částečně křižitelný s planými formami/druhy rodu Pisum (P. fulvum, P. elatius, P. abyssinicum), které představují donory zejména některých rezistencí vůči biotickým či abiotickým faktorům (Byrne, O.M., Hardie, D.C., Khan, T, Yan, G. (2008): Genetic analysis of pod and seed resistance to pea weevil in a Pisum sativum x P. fulvum interspecific cross. Aust. J. Agric. Res. 59: 854--862). V současnosti je popsáno a lokalizováno cca 360 genů Pisum - viz Swiecicki W (2019): The Cataloque of Pisum Genes. Agencja Řekl. Kraetiffi Poznaň. ISBN 987-83-953357-0-9. Vysoká odborná úroveň šlechtění polního i dřeňového hrachu v ČR má dlouhou tradici, což dosvědčuje řada odrůd licencovaných v zahraničí (např. cv. Bohatýr 1980 licencován po celém světě; cv. Protecta2010, Rakousko; cv. Eso 2012, Dánsko, Švédsko, USA, Kanada, Rakousko, Rusko).

Tvar semen hrachu je buď kulatý, nebo svraštělý a barva může být zelená, žlutá, nebo do hnědá s různou kresbou. Velikost, barva a tvar semen jsou velmi variabilní znaky. Blixt (Blixt, S. 1972. Mutation genetics in Pisum. Agr. Hort. Genet. 30, 1 293) uvádí, že je minimálně 45 známých genů, které mají vliv na vlastnosti semen. Spotřebitelé pro přímý konzum upřednostňují zelenosemenné odrůdy, pro krmivářské účely není barva semen rozhodující.

Délka lodyhy se pohybuje od 20 do 220 cm, lodyha je poléhavá, vystoupavá, nebo popínavá. Listy jsou obvykle sudozpeřené, zakončené úponky, které se přichycují k opoře. Lístkyjsou oválné, nebo podlouhle vejčité, přisedlé.

Jako výsledek spontánní mutace objevil Goldenberg (Goldenberg, J. B. 1965. „afila“, a new mutation in pea (Pisum sativum E). Boletin Genetico, 1, 27 31) tzv. afila typ rostliny hrachu, která měla přeměněny listy na úponky. Obdobný typ hrachu cestou indukované mutace získal později Jaranowski (Jaranowski, J. 1976. Gamma--ray induced mutations in Pisum arvense L. s. I. Gen. Polonica 17, 479-495), a začal jej využívat ve šlechtitelských programech. Přes počáteční skepticismus ostatních šlechtitelů, zapříčiněný domnělým poklesem výnosu zrna zaviněným silným snížením asimilační plochy, převládají v současné době ve Státní odrůdové knize ve skupině polního hrachu odrůdy tohoto typu. Podobná situace je u odrůd dřeňového hrachu.

Celkový obsah bílkovin hrachu je nižší než v sójové mouce a vyšší než v obilovinách. Je různý u jednotlivých odrůd, avšak v průměru se pohybuje kolem 25 % (Carrouée, B. a Gatel, F. 1995. Peas - Utilisation in animal feeding, UNIP - ITCF, 2-nd ed., 1-99). Jsou důležitou biologicky aktivní látkou významnou zejména pro krmivářské a potravinářské odvětví. Jejich obsah je do značné míry odrůdovou záležitostí, ačkoliv na jejich obsahu se rovněž významně podílejí půdní, klimatické a agrotechnické podmínky.

Největší podíl semene hrachu tvoří škrob. Hrách jako významný zdroj škrobu je možno rozdělit podle přítomnosti alel R/r (r - rugosus), přičemž s charakterem škrobových zrn souvisí i tvar semen:

1. Hrách zrnový - Pisum sativum L. ssp. sativum var. sativum (genotyp RR nebo Rr) se vyznačuje kulatými hladkými semeny, oválnými škrobovými zrny, která jsou kulovitě hladká, nerozštěpená, homogenní (Chloupek, O. 2000. Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Academia Praha, vyd. 2).

2. Hrách dřeňový - Pisum sativum L. ssp. sativum var. medullare (genotyp rr ) se svrasklými semeny má škrobová zrna rozštěpena, s velmi širokým spektrem velikosti škrobových zrn, ve kterém je především vysoký podíl malých zrn, zrna jsou nepravidelného tvaru, často s radiálními rýhami - viz Chloupek, O. 2000.

Kooistra (Kooistra, E. 1962. On the differences between smooth and three types of wrinkled peas. Euphytica 11, 357-373), identifikoval mutaci v lokusu rb, která se projevuje jako hrách se svrasklými semeny, ale s vlastnostmi škrobu charakteristickými pro hrách s kulatými semeny. Z tohoto důvodu bývají genotypy tohoto charakteru označovány jako tzv. intermediámí. Tato

-4CZ 34578 UI druhá rugosus mutace byla označená rb. Výskyt této mutace snižuje obsah škrobu na 35 % v sušině, na rozdíl od r však rb mutace zvyšuje obsah amylopektinu na 75 % (Wang, T. L. a Hedley, C. L. 1993. Genetic and developmental analysis of the Seed. In: Casey, R. a Davies, D. R. (Ed.) Peas: Genetics, molecular biology and biotechnology, CAB Wallingford, International Press, Oxford, 217-236).

Z houbových chorob nadzemních částí patří k nej významnějším patogenní houba Erysiphe pisi (syn. E. polygon!) - padlí. V teplejších oblastech (Austrálie, Španělsko) napadá klíční rostliny, které následně hynou, v chladnějších podmínkách houba vytváří bílé povlaky na stoncích, listech a dozrávajících luscích, snižuje hmotnost semen a prodlužuje dobu dozrávání (Tiwari, K, et al. 1997. Pathogenic variation in Erysiphe pisi, the causal organism of powdery mildew of pea. Canadian Journal of Plant Pathology. 19, 267-271). Zvláštních pokusů můžeme potvrdit, že houba může způsobit snížení výnosu o 30 až 50 %.

Z komplexu viróz má velký hospodářský význam výrůstková mozaika hrachu (PEMV). Viróza se projevuje barevnými a morfblogickými změnami u napadených rostlin (Musil, M., et al. 1981. Diagnostika vírusov strukovín a ďatelovín. Veda, Bratislava, 1-175), které jsou oslabené a náchylnější ke komplexu kořenových a krčkových hnilob. Virózy jsou většinou přenášeny prostřednictvím hmyzích přenašečů (mšice, třásněnky) nebo osivem.

Technické řešení si klade za úkol navrhnout nové SNP markéry asociované s významnými specifickými vlastnostmi Pisum, které jsou využitelné pro další šlechtění, a to s využitím aktuálních metod molekulární biologie a bioinformatického zpracování získaných dat. Výsledkem je ucelená sada nových markérů vycházející z analýzy širokého souboru genotypů rodu Pisum, které pokrývají variabilitu tohoto zkoumaného rostlinného druhu.

Podstata technického řešení

Řešením je sada o počtu 70 markérů, která je uvedena v následující tabulce.

-5CZ 34578 UI

Barva osemení: hnědá-černá
Pořa dí SNP	SNP ID	Chr omo -zom	Pozice na chromozo mu	FDR adjuste dpvahie	Alely (referen ční/ alternat ivní)	Pozice SNP	Přilehlá sekvence
1.	3548417F0- 40:G>A-40:G>A	6	68269751	0,0000	G/A	40	TGCAGTCTGACATAGATCAAATCAAAACAATGGTAGAGCAGAATGTTCCTGAAGGAGTCA ATTCTCAAG
2.	3537428 |F|060:G>A-60:G>A	7	338375944	0,0000	G/A	60	TGCAGATGGCCATCCAGTCTCACTCACAACTATCTTCAAATCCGACCCTCCCACTTTCGCG AGAGCAGC
3.	3564001F0- 37:G>T-37:G>T	3	240646918	0,0000	G/T	37	TGCAGCAGCAAAATACCCCCTAGAATGATTCATTGTTGTTTCCTCCATCATCCATGTCCCG AGACGAGG
4.	5932509 |F|0- 31:G>T-31:G>T	5	23291179	0,0000	G/T	31	TGCAGAGGTCCCCTCTTGGCCTTGAGAAATAGAATATATTCTGTTTGCTTGAGTTTTCTCAT TTACATT
5.	8174454F0- 53:A>T-53:A>T	1	131989346	0,0000	A/T	53	TGCAGCCACTAGCTTAGTCATGAGAAGCATACAAATATAAATTCAACTTTGATATGAGTCT TGTTGATT
6.	3547530F0- 29:A>C-29:A>C	6	384256365	0,0000	A/C	29	TGCAGGTTTGGTTCAGTTTTTTAGAGGTTATTGTGGTGTGCCGGATGCGGTTCTTTACAGA TCGGAAGA
7.	8174130F0- 60:G>T-60:G>T	2	375686609	0,0000	G/T	60	TGCAGACTTTTTCAAAGAACACGAATAAAGCTCCTTTATAACGTATGCCCTACAATTCACG GTTGCTCC
8.	3563413F0- 64:T>C-64:T>C	2	280227850	0,0000	T/C	64	TGCAGAAGGCGCATTGCATTTGAATTGTGATGTTATGCAGATATCATGGTAGGAAAAAAC GTAATGAAG
9.	3566484|F|0- 30:T>G-30:T>G	5	476800256	0,0000	T/G	30	TGCAGTTCATAAGGTTGGATCTTATATACTTGTTTTTCCAATGATATGTTACAGATCGGAA GAGCGGTT
10.	3556278F0- 32:T>C-32:T>C	5	516168199	0,0000	T/C	32	TGCAGATTCAGAGGAAAGATTACAAAGGGTGGTCTCAAATTGACATATTGTCATCGGTAG GCATTTTTG
11.	5948091F0- 38:G>A-38:G>A	6	167899276	0,0000	G/A	38	TGCAGCCCCTAACACCTTCATTGTGTTAGCTTTGAAGGGGTGGATTTAGTCCCACGTTGCT TAGAGATA
12.	5932438F0- 13:G>T-13:G>T	6	18296910	0,0000	G/T	13	TGCAGAGATCTTCGGTAAAAGAGAAGGAACTTCTAAGAGGTCTAAGAAAATCTGAAGTG ATCTGTTTTT
13.	3546197F0- 35:C>T-35:C>T	5	561741561	0,0000	C/T	35	TGCAGTGATCTAGTGTAAGATGAAATTGAATAAAACGACAGAAATAAAATCTTCTAAAGT TAGCCTTTT
14.	5943759F0- 67:A>C-67:A>C	2	400044562	0,0000	A/C	67	TGCAGAATCAAAATCACCCACAATGAGTGTTGCCACTTCAAATGCAGTTGGAAGATTGTG TGTTCGAAG
15.	3557295 |F|056:C>A-56:C>A	5	569041296	0,0000	C/A	56	TGCAGTACTTAGAACATTCATTAGGAATATAACCAGAAAGAACTTCACATATTTTCCGTTA CAGATCGG
16.	3552647F0- 64:C>T-64:C>T	6	24145088	0,0000	C/T	64	TGCAGTTTTACTAGTATTTGAGAGATGATCATTCCTAAAATACTTAGCACATTATAATCCA ATCCATTC
17.	3554364 |F|0- 19:T>C-19:T>C	2	417215838	0,0002	T/C	19	TGCAGATTCTATCATGCTGTCCTTATTAGAATCAAGTTCAAGTAGTTCATTTACAGATCGG AAGAGCGG
18.	3568932F0- 67:C>T-67:C>T	6	20288540	0,0002	C/T	67	TGCAGTTCCAATTGATATTATAGAAGAAAAAGTGATCCCCGGTTCTTCGTTCGTGCATGGT TTTCTCCC
19.	3554929F0- 34:C>T-34:C>T	4	30049806	0,0007	C/T	34	TGCAGCCACAACAAGATATGAAATTTCAATCCAACGGTTGCTAGATGAAAGATGAAAATG GCATAAAAG
20.	8054971F0- 19:C>A-19:C>A	2	736706	0,0012	C/A	19	TGCAGATCTCTAAAACACCCTACTGCTTGCAAGCTAAACCGTATCTTTTCGTCCGCGAACG TCGCCTTC
21.	5926955F0- 9:G>T-9:G>T	6	342820319	0,0012	G/T	9	TGCAGAATAGGAAACCATGAATAAACCAAGATATGAATTATAAGCAAAGCACCATGCTG CACAAACTGA
22.	5934380 |F|0- 5:T>C-5:T>C	5	148395993	0,0016	T/C	5	TGCAGTAAATTCCGCAGGAACGTCCTCAAGTAAATCCGCAGGAAATTCCTATTCCATAGG TAAATCCAC
23.	5948762F0- 10:A>C-10:A>C	4	23172841	0,0017	A/C	10	TGCAGCCGATATATGCGATTATATTGTGTGAAATATTACAAAACAAAATGATACTCCCTCC GTCCCAAA
24.	3560365F0- 8:T>C-8:T>C	3	249074577	0,0018	T/C	8	TGCAGTAATTGAATGTGGTCACCCAAGCCAAAGCCATCAGGAAGGTTAGATAATGGCCGT TTCCTCTTT
25.	3536595 |F|018:A>G-18:A>G	6	22954138	0,0019	A/G	18	TGCAGAGTCAGGCATGTCATAGTTTATCACAATATTCACACGTTCAATGTCAATTCCTCTG CCAACCAA
26.	5925910F0- 40:G>T-40:G>T	6	20241848	0,0045	G/T	40	TGCAGCTGAAGAACGAATTGCTGAGAGAAGGGAAATGTTAGGCGGCGTTTTTTTTTTTTTA CAGATCGG
27.	3543105 |F|0- 44:C>T-44:C>T	3	103867444	0,0188	C/T	44	TGCAGGATTCCCAATCTGCATCTGTGAAGCCAGTGAGGGTGAGACTGGAAGCTGATTTGA AGAGGAGGC
28.	3547132F0- 10:T>C-10:T>C	1	10503846	0,0188	T/C	10	TGCAGGTACATTGCTTAGCTTTACTTGAAACTCAAGTTACAGATCGGAAGAGCGGTTCAG CAGGAATGC
29.	41127764F0- 43:A>G-43:A>G	6	20241848	0,0189	A/G	43	TGCAGCTGAAGAACGAATTGCTGAGAGAAGGGAAATGTTATGCAGCGTTTTTTTTTTACA GATCGGAAG
30.	5925911F0- 43:A>G-43:A>G	6	20241848	0,0387	A/G	43	TGCAGCTGAAGAACGAATTGCTGAGAGAAGGGAAATGTTATGCAGCGTTTTTTTTTTTTTA CAGATCGG
31.	3564961F0- 54:C>A-54:C>A	4	424571419	0,0387	C/A	54	TGCAGAAAAACATTCTCGTCAATAACTTATTCCTACGAATACCGAGACGTGTCTCACAATC AATACTAC

-6CZ 34578 UI

Barva osemení: žlutá-zelená
Pořadí SNP	SNP ID	Chro mozom	Pozice na chromozo mu	FDR adjuste dpvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozi ce SNP	Přilehlá sekvence
32.	26138634F0 -59:G>C59:G>C	1	312174063	0,0034	G/C	59	TGCAGAGATTCTAGGAATAGCGAGTTCTCTATAAAAAAACACCTATCAAATGCTTAGTA GCACTGATGC
Barva osemení: žlutá-vosková
Pořadí SNP	SNP ID	Chro mozom	Pozice na chromozo mu	FDR adjuste dpvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozi ce SNP	Přilehlá sekvence
33.	5926955F0- 9:G>T-9:G>T	6	342820319	0,0000	G/T	9	TGCAGAATAGGAAACCATGAATAAACCAAGATATGAATTATAAGCAAAGCACCATGCTG CACAAACTGA
34.	41128749|F|0 -26:C>G- 26:C>G	2	7304744	0,0000	C/G	26	TGCAGCGGGTAACAAATTCAAATATGCAGTCAACACTTTACATACTAGTTCATCTGTGGA ACATTCCGA

35.	3554930F0 -31:G>T31:G>T	1	63371816	0,0000	G/T	31	TGCAGTTTTCCGGCGGAGACTTCTGGAAGAAGGAGAGTATTGATTTCTGGCGATTCATGTT CACTCGGT
36.	4657889F0 -18:C>G18:C>G	6	468395777	0,0001	C/G	18	TGCAGAAACACCATGGACCTGCCATTTAGCATTAGATATTACAGATCGGAAGAGCGGTTC AGCAGGAAT
37.	4655082F0 -42:T>A42:T>A	3	282503438	0,0003	T/A	42	TGCAGAAAAATGTGGGTTGTGTAAGCTAAATGATGGAGTAACTGTTCTACCTAAATCAAT GTGCTGTAA
38.	3641028F0 -25:C>G25:C>G	4	395704306	0,0337	C/G	25	TGCAGTAGAAGATCAAAGTGCACAACAAAATTGGTGTCACAAACAGAATCCAAGTAGTGT CCATTATTT
39.	3562889F0 -36:A>C36:A>C	5	561561232	0,0337	A/C	36	TGCAGCATTTAGGCCAGTCATGAATTTGGGTTTGGAAGTGATGGAAAAGCCTAAAAGAAA GAATGTTAA
Typ listu (afila)
Pořa dí SNP	SNP ID	Chrom o-zom	Pozice na chromozo mu	FDR adjuste dpvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozi ce SNP	Přilehlá sekvence
40.	5916407F0 -53:G>T53:G>T	2	412418325	0,0000	G/T	53	TGCAGGACAATTGGTTAGATGACTAAAATAACGACCTTGGGGGATTGGGTTCAGGTCAAA ATTTTATTG
41.	5954172F0 -21:A>G21:A>G	7	360834050	0,0000	A/G	21	TGCAGCCCAAAACTTTGCTATAACCAAAATGTTTGTTAGCTTATGAGTGAGCTAAATTGAC TTTTTTTA
42.	5954790F0 -18:G>A18:G>A	6	15049686	0,0003	G/A	18	TGCAGCCCAACAGATATGGCACTGGTGGCAACAGGAGGTGGTGATGATAAAGGATTTCTC TGGCAGATC
Délka rostliny
Pořa dí SNP	SNP ID	Chrom o-zom	Pozice na chromozo mu	FDR adjuste dpvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozi ce SNP	Přilehlá sekvence
43.	354193 l|F|0 -16:G>A- 16:G>A	1	347726949	0,0000	G/A	16	TGCAGGATTGTATACTGATCCTTTCCTTGTATAATTTACAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCA GGAATGCC
44.	26139139F 0-49:A>G49:A>G	6	95904097	0,0000	A/G	49	TGCAGCGACGATTTGGAACAATCTCTAAGAGTGTTTTCTTCAGAAGAACAGTCCTCGTTTG TTTGAGCT
45.	3565297F0 -43:A>G43:A>G	6	328893473	0,0001	A/G	43	TGCAGATTGCATAGAAAAATAAATTCAACTAGTCCAACATATAATGCACACAGTTTGATG TTATATGAC
46.	5252219F0 -8:C>G8:C>G	5	558157641	0,0031	C/G	8	TGCAGTGTCTTTCGACCAATAAAAGAGCTGCTTTACAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGG AATGCCGAG
47.	5961490F0 -64:G>T64:G>T	1	337020914	0,0279	G/T	64	TGCAGGATGGCATTGATAAGAAGCTATCTATATACTTCTGATTGGCACATACATACCTTTT TTTGTTGT
48.	5952661F0 -17:C>T17:C>T	1	33227572	0,0323	C/T	17	TGCAGTAGCCCCCGCGCCGAAGTCGGCGGTGAAGAGTTCTTCAACGCTGATGCCACGGAT AAACGAGCT
49.	3543926F0 -21:OG- 21:C>G	5	559611157	0,0350	C/G	21	TGCAGAAACAGAGTAGAAAGTCCATACAAGTCAAACTTCAAAATTTCTTACAGATCGGAA GAGCGGTTC

CZ 34578 UI

N-látky v sušině
Pořa dí SNP	SNP ID	Chromozom	Pozice na chromozomu	FDR adjust ed pvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozi ce SNP	Přilehlá sekvence
50.	3544450F 0-21:G>T21:G>T	5	517367686	0,0000	G/T	21	TGCAGAGAGAATGACTTTTTTGATATAATCTCATGAAGCAAGATTGCTGAGGCCAA AATAGAAAGTTCC
51.	5252187F 0-25:T>C25:T>C	7	144545303	0,0306	T/C	25	TGCAGAACTAATCCAACCTGCAATGTGAATGCACTTCGGTTCCACTCCAAAATTCA TGAATTTCATTGG
Odolnost k padlí
Pořa dí SNP	SNP ID	Chromozom	Pozice na chromo-zomu	FDR adjust ed pvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozi ce SNP	Přilehlá sekvence
52.	3548971F 0-26:G>A26:G>A	1	339139149	0,0000	G/A	26	TGCAGCCTGCAAAGGGCCTGGATCGGGCAACAAAAATGTAGCCTGTTTGTATCCCA AAAAGCCTAAATC
53.	411267651 F|013:C>A13:C>A	1	111861628	0,0001	C/A	13	TGCAGAGTAACGGCGCTGGAAAAAGTTCTCCTTTATCCCAGTGATGGATGCTCTTTA TATAGAGCTTTG
54.	3554973F 0-43:A>G43:A>G	1	214421023	0,0001	A/G	43	TGCAGTGTTTGGACATAACCAAACACAAGCTTTACATGTTTGAATACACAATAAGG AGTGTAAAACTTG
55.	3553560F 0-49:G>T49:G>T	1	336972369	0,0081	G/T	49	TGCAGAAGGCTCAAAAAAGATAGAACTTAGATATGTACCACCTAAAAGCGCTTCTT TTCGATCACTGTA
56.	4661881F 0-12:T>C12:T>C	5	177998863	0,0083	T/C	12	TGCAGAAGGGATTGGTATCTCCGATTTATGATGATGTTGTCGTCATGCCCAATTATG ACGATGAATCAA
57.	3550303F 0-ll:G>T11:G>T	1	56025041	0,0083	G/T	11	TGCAGAAGTAAGAAAGGAGTCTTGTATGATATCAAGCCTAAGAAGAAAAAAAATG AGACATGATAACAT
58.	5934728F 0-24:A>G24:A>G	2	420364763	0,0099	A/G	24	TGCAGTATGTCTATGACCATTTTGATCAAAAATTGAACCTCCAACCTTAGTCCCATA AACATGATCATA
59.	3537073F 0-12:T>C12:T>C	4	82246307	0,0160	T/C	12	TGCAGAAGTGAGTACAGTTTGTTGAGTGTTACTGAGTACTAGTGTCAACCCTATATA TCTGGGTTATTG
Odolnost k PEMVR
Pořa dí SNP	SNP ID	Chromozom	Pozice na chromozomu	FDR adjust ed pvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozi ce SNP	Přilehlá sekvence
60.	3541931|F| 0-16:G>A16:G>A	1	347726949	0,0000	G/A	16	TGCAGGATTGTATACTGATCCTTTCCTTGTATAATTTACAGATCGGAAGAGCGGTTC AGCAGGAATGCC
61.	3544005F 0-42:G>T42:G>T	1	140960206	0,0100	G/T	42	TGCAGGCATCTTATTTATGTTCTGTTCTGTGGTGTAATCTTTGTATCTTTAGGCATTG CTTATGCCTTG
62.	411242451 F|05:A>C5:A>C	1	209396847	0,0169	A/C	5	TGCAGAAAATTGTGTTGGAATGTTATGGTTGCTGATTCAGTTTAGTITTTATGTCAA TTCAATATGATT
63.	3549708F 0-34:T>C- 34:T>C	1	362126959	0,0216	T/C	34	TGCAGCACCGACACCTATGAAAAATGTGTGTCCGTGTAAATGTCTGAAAGTGACAC CGAAGTTTGTGAT
64.	5916488F 0-45:T>A45:T>A	7	413460604	0,0357	T/A	45	TGCAGTAAAATGGACGGAAAGCAGGAGATTTCCCAAAAAATAAAATAGACACTCA AAATTTCTCCGATC
65.	19221983| F|023:C>T23:C>T	1	258079738	0,0357	C/T	23	TGCAGATACATTGCTTCAATGCACGCGGTACTTATTTATTTTGCTTCAAATTTTTTGC CCTTGCATTCT

-8CZ 34578 UI

Počet větví
Pořa dí SNP	SNP ID	Chromozom	Pozice na chromozo mu	FDR adjusted pvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozice SNP	Přilehlá sekvence
66.	3558311|F| 0-35:C>T35:C>T	5	569 851 034	0,0000	C/T	35	TGCAGCAGCAATAGAATCTCCTCAATAAACACTAACATTACAGATCGGAAGAGC GGTTCAGCAGGAATG
67.	5964873F 0-42:T>C42:T>C	4	333 240 207	0,0009	T/C	42	TGCAGCCTAGCCAACACAATCCATTTCAATCCAACAAGCAGGTCATGCGTTACA GATCGGAAGAGCGGT
Semeno povrch
Pořa dí SNP	SNP ID	Chromozom	Pozice na chromozo mu	FDR adjusted pvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozice SNP	Přilehlá sekvence
68.	3552439F 0-25:C>T25:C>T	3	65691152	0,0000	C/T	25	TGCAGGTTTTTTACTTCTCTTTATTCCCATCTACTAGTTCTATTTGCATATTCATTT TCTAACTATTTT
Škrob v sušině
Pořa dí SNP	SNP ID	Chromozom	Pozice na chromozo mu	FDR adjusted pvalue	Alely (referenční/ alternativní)	Pozice SNP	Přilehlá sekvence
69.	3552439F 0-21:T>C- 21:T>C	3	65691152	0,0005	T/C	21	TGCAGGTTTTTTACTTCTCTTTATTCCCATCTACTAGTTCTATTTGCATATTCATTT TCTAACTATTTT
70.	3545762F 0-12:T>C12:T>C	1	255505856	0,0022	T/C	12	TGCAGGGATAACTTCGATTGGTGTCCGAGGAAACAATTCTGTCTGTGTCGTTACT CAGAAAAAAGTTCC

Příklady uskutečnění technického řešení

Předmětem užitného vzoruje sada o počtu 70 SNP markérů, které byly vybrány na základě analýzy 564 genotypů hrachu (Pisum L.). Pozice markérů na jednotlivých chromozomech je jednoznačně určena - viz tabulka.

Vybrané genotypy hrachu (Pisum) pocházejí z registrovaných komerčních odrůd rodu Pisum, ze zdrojů rezistence k houbovým a virovým patogenům využívaných ve šlechtění, z odrůd/linií z kolekce z Ruska (získaných v projektu KONTAKT), z planých druhů/forem rodu Pisum, z vlastního novošlechtění polního a dřeňového hrachu společností Agritec a SEMO a z mutantních linií s nízkým obsahem kyseliny fýtové. Výběr byl proveden tak, aby pokrýval genetickou diverzitu druhu a zároveň obsahoval šlechtitelský materiál selektovaný ve vybraných znacích.

Při bioinfbrmatickém zpracování dat byla využita referenční sekvence P. sativum via (KreplakJ. et al. 2019. “A Reference Genome for Pea Provides Insight into Legume Genome Evolution. ” Nature Genetics 51(9): 1411-22), která je dostupná v online databázi:

(https://urgi.versailles.inra.fr/Species/Pisum/Pea-Genome-project). Referenční sekvence je dostupná ve formě chromozomů, na kterých jsou lokalizovány asociované SNP v tabulce.

Hodnocení genotypu rostlin

Pro zjištění SNP variant byla použita metoda DArTseq analýzy sekvenování knihoven DNA s redukovanou komplexitou. DNA byla extrahována z 564 genotypů hrachu na pracovišti UEB AV ČR Olomouc, v.v.i., kde byl čerstvý materiál nejprve lyofilizován a poté homogenizován pomocí skleněných kuliček. Pro vlastní izolaci byl použit NucleoSpin Plant II kit (Macherey-Nagel). Byla zkontrolována kvalita DNA a poté každý vzorek naředěn na požadovanou koncentraci. Izolovaná DNA byla zaslána do Diversity Arrays Technology Pty Ltd, Canberra, Austrálie, k vlastní analýze genotypu pomocí DArTSeq analýzy. Výsledkem DArTseq analýzy jsou celogenomová genotypová data SNP polymorfismů pro 564 vzorků. Genotypová data byla dále filtrována na chybějící informace, frekvenci minoritní alely a mapována k aktuální verzi genomu hrachu.

-9CZ 34578 UI

Hodnocení fenotypu u vybraných znaků

Dalším krokem bylo hodnocení fenotypů rostlin Pisum pro vybrané znaky:

1. Barva osemení

2. Semeno - povrch

3. Typ listu (afíla)

4. Délka rostliny

5. Počet větví

6. Obsah N-látek v sušině

7. Obsah škrobu v sušině

8. Odolnost k padlí (Erysiphe pisi f.sp. pisi)

9. Odolnost k viru PEMV (Pea Enation Mosaic Virus)

Hodnocení fenotypu bylo prováděno na základě Klasifikátoru rodu Pisum (Pavelková, A., et al. 1986. Klasifiátor genus Pisum L. Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha - Ruzyně. „Genové zdroje “ č. 32) v průběhu vegetace vizuálně (barva květu, citlivost/rezistence vůči houbovým chorobám a virózám; detekce/determinace virů byla provedena ELISA testem s použitím příslušných komerčních kitů) a po sklizni numericky měřením či vážením (morfologie rostlin, výnos lusků/semen, barva a tvar semen, HTS, analýzy obsahových látek - obsah N-látek v sušině, škrobu). Chemické analýzy byly prováděny dle ČSN či interních metodik společnosti Agritec. Hodnocení odolnosti k padlí Erysiphe pisi bylo prováděno ve skleníkových testech. Zjištěné hodnoty byly zaneseny do tabulek jako podklad pro asociační analýzu.

Hodnocení byla provedena výše uvedenými metodami a jejich výsledky byly využity pro vytvoření predikčního modelu kvantitativních znaků, na jejichž základě bude prováděna genomická selekce polygenně založeného ABC znaku.

Hodnocení jednotlivých znaků se provádělo na základě Klasifikátoru pro rod Pisum L. na stupnici 1-3-5-7-9, kde pro odolnost vůči patogenu (padlí, PEMV) znamená: 1 - velmi nízká, 3 - nízká, 5 - střední, 7 - vysoká a 9 - velmi vysoká.

Pro barvu osemení bylo hodnocení následovně: 1 - světležlutá, 2 - žlutorůžová, 3 - vosková, 4 - žlutozelená, 5 - šedozelená, 6 - tmavozelená, 7 - světlehnědá, 8 - hnědá, 9 - černá.

Typ listu byl hodnocen na posloupné stupnici 1 až 8, přitom znamená: 1 - bezlístkový, 3 - částečně bezlístkový, 5 - sudozpeřený, 7 - lichozpeřený, 8 - nepárově mnohonásobně zpeřený.

Pro délku rostlin se vycházelo ze stupnice 1 až 9, kde znamená: 1 - velmi krátká <30 cm, 2 - velmi krátká až krátká 30 až 45 cm, 3 - krátká 46 až 60 cm, 4 - krátká až střední 61 až 80 cm, 5 - střední 81 až 100 cm, 6 - střední až dlouhá 101 až 120 cm, 7 - dlouhá 121 až 140 cm, 8 - dlouhá až velmi dlouhá 141 až 160 cm, 9 - velmi dlouhá >160 cm.

Obsah N-látek v sušině byl hodnocen na základě stupnice 1 až 9 přičemž byl: 1 - velmi nízký < 15 %, 2 - velmi nízký až nízký 15,0 až 18,0 %, 3 - nízký 18,1 až 21,0 %, 4 - nízký až střední 21,1 až 24,0 %, 5 - střední 24,1 až 27,0 %, 6 - střední až vysoký 27,1 až 30,0 %, 7 - vysoký 30,1 až 33,0 %, 8 - vysoký až velmi vysoký 33,1 až 36,0 %, 9 - velmi vysoký > 36,0 %.

Pro hodnocení obsahu škrobu v sušině semen je samostatná stupnice pro dřeňový hrách a samostatná stupnice pro polní hrách. Pro genotypy dřeňového hrachu je stupnice: 1 - velmi nízký < 18 %, 2 - velmi nízký až nízký 18,01 až 21,55 %, 3 - nízký 21,56 až 25,10 %, 4 - nízký až střední 25,11 až 28,70 %, 5 - střední 28,71 až 32,20 %, 6 - střední až vysoký 32,21 až 35,80 %, 7 - vysoký 35,81 až 39,30 %, 8 - vysoký až velmi vysoký 39,31 až 42,90 %, 9 - velmi vysoký > 42,90 %. Pro genotypy polního hrachu je stupnice: 1 - velmi nízký < 45,00 %, 2 - velmi nízký až nízký 45,01 až 46,50 %, 3 - nízký 46,51 až 48,00 %, 4 - nízký až střední 48,01 až 49,50 %,

-10CZ 34578 UI

- střední 49,51 až 51,00 %, 6 - střední až vysoký 51,01 až 52,50 %, 7 - vysoký 52,51 až 54,00 %,

- vysoký až velmi vysoký 54,01 až 55,50 %, 9 - velmi vysoký > 55,50 %.

Byl hodnocen počet větví na stupnici 1 až 9 následovně: 1 - chybí 0, 2 - velmi slabé větvení 0,1 až 1,0, 3 - slabé 1,1 až 2,0,4 - slabé až střední 2,1 až 3,0, 5 - střední 3,1 až 4,0, 6 - střední až silné 4,1 až 5,0, 7 - silné 5,1 až 6,0, 8 - silné až velmi silné 6,1 až 7, 9 - velmi silné > 7,0.

Povrch semen byl hodnocen pomocí stupnice 1 až 5, kde: 1 - hladký, 2 - mělce vrásčitý, 3 - dolíčkatý, 4 - přerušovaně vrásčitý, 5 - vrásčitý.

Celogenomová asociační analýza GWAS

Výsledky genotypového a fenotypového hodnocení byly použity pro celogenomovou asociační analýzu. GWAS asociační analýza SNP genotypových a fenotypových dat referenční populace byla provedena metodou modelu BLINK (Bayesian-information and Linkage-disequilibrium Iteratively Nested Keyway) zabudovaného v softwaru GAPIT v3. Výběr statisticky významných SNP markérů pro vybrané znaky byl určen dle asociace vyjádřené P hodnotou korigovanou na mnohonásobné testování FDR (false-discovery rate) menší než <0,05 metodou BenjaminiHochberg.

Claims (1)

1. NÁROK NA OCHRANU

   1. Sada asociovaných SNP markérů jednonukleotidových polymorfismů v souboru znaků

   5 genotypů rodu Pisum L. k využití pro další šlechtění, vyznačující se tím, že obsahuje následující markéry:

   Barva osemení: hnědá-černá Pořa dí SNP SNP ID Chrom o-zom Pozice na chromozo mu FDR adjuste dpvalue Alely (referenční / alternativn 0 Pozic e SNP Přilehlá sekvence 1. 3548417F 0-40:G>A40:G>A 6 68269751 0,0000 G/A 40 TGCAGTCTGACATAGATCAAATCAAAACAATGGTAGAGCAGAATGTTCCTGAAGGAGTCAA TTCTCAAG 2. 3537428F 0-60:G>A60:G>A - 338375944 0,0000 G/A 60 TGCAGATGGCCATCCAGTCTCACTCACAACTATCTTCAAATCCGACCCTCCCACTTTCGCGA GAGCAGC 3. 3564001F 0-37:G>T37:G>T 3 240646918 0,0000 G/T 37 TGCAGCAGCAAAATACCCCCTAGAATGATTCATTGTTGTTTCCTCCATCATCCATGTCCCGA GACGAGG 4. 5932509F 0-31:G>T31:G>T 5 23291179 0,0000 G/T 31 TGCAGAGGTCCCCTCTTGGCCTTGAGAAATAGAATATATTCTGTTTGCTTGAGTTTTCTCATT TACATT 5. 8174454F 0-53:A>T53:A>T 1 131989346 0,0000 A/T 53 TGCAGCCACTAGCTTAGTCATGAGAAGCATACAAATATAAATTCAACTTTGATATGAGTCTT GTTGATT 6. 3547530F 0-29:A>C29:A>C 6 384256365 0,0000 A/C 29 TGCAGGTTTGGTTCAGTTTTTTAGAGGTTATTGTGGTGTGCCGGATGCGGTTCTTTACAGATC GGAAGA 7. 8174130F 0-60:G>T60:G>T 2 375686609 0,0000 G/T 60 TGCAGACTTTTTCAAAGAACACGAATAAAGCTCCTTTATAACGTATGCCCTACAATTCACGG TTGCTCC 8. 3563413F 0-64:T>C64:T>C 2 280227850 0,0000 T/C 64 TGCAGAAGGCGCATTGCATTTGAATTGTGATGTTATGCAGATATCATGGTAGGAAAAAACGT AATGAAG 9. 3566484F 0-30:T>G30:T>G 5 476800256 0,0000 T/G 30 TGCAGTTCATAAGGTTGGATCTTATATACTTGTTTTTCCAATGATATGTTACAGATCGGAAGA GCGGTT 10. 3556278F 0-32:T>C32:T>C 5 516168199 0,0000 T/C 32 TGCAGATTCAGAGGAAAGATTACAAAGGGTGGTCTCAAATTGACATATTGTCATCGGTAGG CATTTTTG 11. 5948091F 0-38:G>A38:G>A 6 167899276 0,0000 G/A 38 TGCAGCCCCTAACACCTTCATTGTGTTAGCTTTGAAGGGGTGGATTTAGTCCCACGTTGCTTA GAGATA 12. 5932438F 0-13:G>T13:G>T 6 18296910 0,0000 G/T 13 TGCAGAGATCTTCGGTAAAAGAGAAGGAACTTCTAAGAGGTCTAAGAAAATCTGAAGTGAT CTGTTTTT 13. 3546197F 0-35:C>T35:C>T 5 561741561 0,0000 C/T 35 TGCAGTGATCTAGTGTAAGATGAAATTGAATAAAACGACAGAAATAAAATCTTCTAAAGTT AGCCTTTT 14. 5943759F 0-67:A>C67:A>C 2 400044562 0,0000 A/C 67 TGCAGAATCAAAATCACCCACAATGAGTGTTGCCACTTCAAATGCAGTTGGAAGATTGTGTG TTCGAAG 15. 3557295F 0-56:C>A56:C>A 5 569041296 0,0000 C/A 56 TGCAGTACTTAGAACATTCATTAGGAATATAACCAGAAAGAACTTCACATATTTTCCGTTAC AGATCGG 16. 3552647F 0-64:C>T- 64:C>T 6 24145088 0,0000 C/T 64 TGCAGTTTTACTAGTATTTGAGAGATGATCATTCCTAAAATACTTAGCACATTATAATCCAAT CCATTC

   17. 3554364F0 -19:T>C19:T>C 2 417215838 0,0002 T/C 19 TGCAGATTCTATCATGCTGTCCTTATTAGAATCAAGTTCAAGTAGTTCATTTACAGATC GGAAGAGCGG 18. 3568932F0 -67:C>T67:C>T 6 20288540 0,0002 C/T 67 TGCAGTTCCAATTGATATTATAGAAGAAAAAGTGATCCCCGGTTCTTCGTTCGTGCATG GTTTTCTCCC 19. 3554929F0 -34:C>T34:C>T 4 30049806 0,0007 C/T 34 TGCAGCCACAACAAGATATGAAATTTCAATCCAACGGTTGCTAGATGAAAGATGAAAA TGGCATAAAAG 20. 8054971F0 -19:C>A- 19:C>A 2 736706 0,0012 C/A 19 TGCAGATCTCTAAAACACCCTACTGCTTGCAAGCTAAACCGTATCTTTTCGTCCGCGAA CGTCGCCTTC 21. 5926955F0 -9:G>T9:G>T 6 342820319 0,0012 G/T 9 TGCAGAATAGGAAACCATGAATAAACCAAGATATGAATTATAAGCAAAGCACCATGC TGCACAAACTGA 22. 5934380F0 -5:T>C5:T>C 5 148395993 0,0016 T/C 5 TGCAGTAAATTCCGCAGGAACGTCCTCAAGTAAATCCGCAGGAAATTCCTATTCCATA GGTAAATCCAC 23. 5948762F0 -10:A>C- 10:A>C 4 23172841 0,0017 A/C 10 TGCAGCCGATATATGCGATTATATTGTGTGAAATATTACAAAACAAAATGATACTCCC TCCGTCCCAAA 24. 3560365F0 -8:T>C8:T>C 3 249074577 0,0018 T/C 8 TGCAGTAATTGAATGTGGTCACCCAAGCCAAAGCCATCAGGAAGGTTAGATAATGGCC GTTTCCTCTTT 25. 3536595F0 -18:A>G18:A>G 6 22954138 0,0019 A/G 18 TGCAGAGTCAGGCATGTCATAGTTTATCACAATATTCACACGTTCAATGTCAATTCCTC TGCCAACCAA 26. 5925910F0 -40:G>T40:G>T 6 20241848 0,0045 G/T 40 1GCAGC1GAAGAACGAA11GC1GAGAGAAGGGAAA1G11AGGCGGCG11111111111 TTACAGATCGG 27. 3543105 F0 -44:C>T44:C>T 3 103867444 0,0188 C/T 44 TGCAGGATTCCCAATCTGCATCTGTGAAGCCAGTGAGGGTGAGACTGGAAGCTGATTT GAAGAGGAGGC 28. 3547132F0 -10:T>C10:T>C 1 10503846 0,0188 T/C 10 TGCAGGTACATTGCTTAGCTTTACTTGAAACTCAAGTTACAGATCGGAAGAGCGGTTC AGCAGGAATGC 29. 41127764 |F| 0-43:A>G43:A>G 6 20241848 0,0189 A/G 43 TGCAGCTGAAGAACGAATTGCTGAGAGAAGGGAAATGTTATGCAGCGTTTTTTTTTTA CAGATCGGAAG 30. 592591 l|F|0 -43:A>G43:A>G 6 20241848 0,0387 A/G 43 TGCAGCTGAAGAACGAATTGCTGAGAGAAGGGAAATGTTATGCAGCGTTTTTTTTTTTT TACAGATCGG

   -12CZ 34578 UI

   31. 3564961F0 -54:C>A54:C>A 4 424571419 0,0387 C/A 54 TGCAGAAAAACATTCTCGTCAATAACTTATTCCTACGAATACCGAGACGTGTCTCACA ATCAATACTAC Barva osemení: žlutá-zelená Pořad í SNP SNP ID Chromo -zom Pozice na chromozom u FDR ad juste dpvalue Alely (referenční/ alternativní ) Pozic e SNP Přilehlá sekvence 32. 26138634F 0-59:G>C59:G>C 1 312174063 0,0034 G/C 59 TGCAGAGATTCTAGGAATAGCGAGTTCTCTATAAAAAAACACCTATCAAATGCTTAGTA GCACTGATGC Barva osemení: žlutá-vosková Pořad ÍSNP SNP ID Chromo -zom Pozice na chromozom u FDR ad juste dpvalue Alely (referenční/ alternativní ) Pozic e SNP Přilehlá sekvence 33. 5926955F0 -9:G>T9:G>T 6 342820319 0,0000 G/T 9 TGCAGAATAGGAAACCATGAATAAACCAAGATATGAATTATAAGCAAAGCACCATGCTG CACAAACTGA 34. 41128749F 0-26:C>G- 26:C>G 2 7304744 0,0000 C/G 26 TGCAGCGGGTAACAAATTCAAATATGCAGTCAACACTTTACATACTAGTTCATCTGTGGA ACATTCCGA

   35. 3554930F0 -31:G>T- 31:G>T 1 63371816 0,0000 G/T 31 TGCAGTTTTCCGGCGGAGACTTCTGGAAGAAGGAGAGTATTGATTTCTGGCG ATTCATGTTCACTCGGT 36. 4657889F0 -18:C>G18:C>G 6 468395777 0,0001 C/G 18 TGCAGAAACACCATGGACCTGCCATTTAGCATTAGATATTACaGATCGGAAG AGCGGTTCAGCAGGAAT 37. 4655082F0 -42:T>A42:T>A 3 282503438 0,0003 T/A 42 TGCAGAAAAATGTGGGTTGTGTAAGCTAAATGATGGAGTAACTGTTCTACCT AAATCAATGTGCTGTAA 38. 3641028F0 -25:C>G- 25:C>G 4 395704306 0,0337 C/G 25 TGCAGTAGAAGATCAAAGTGCACAACAAAATTGGTGTCACAAACAGAATCC AAGTAGTGTCCATTATTT 39. 3562889F0 -36:A>C36:A>C 5 561561232 0,0337 A/C 36 TGCAGCATTTAGGCCAGTCATGAATTTGGGTTTGGAAGTGATGGAAAAGCCT AAAAGAAAGAATGTTAA Typ listu (afila) Pořa dí SNP SNP ID Chrom o-zom Pozice na chromozo mu FDR ad juste dpvalue Alely (referenční/ alternativní) Pozice SNP Přilehlá sekvence 40. 5916407F0 -53:G>T- 53:G>T 2 412418325 0,0000 G/T 53 TGCAGGACAATTGGTTAGATGACTAAAATAACGACCTTGGGGGATTGGGTTC AGGTCAAAATTTTATTG 41. 5954172F0 -21:A>G21:A>G 7 360834050 0,0000 A/G 21 TGCAGCCCAAAACTTTGCTATAACCAAAATGTTTGTTAGCTTATGAGTGAGC TAAATTGACTTTTTTTA 42. 5954790F0 -18:G>A18:G>A 6 15049686 0,0003 G/A 18 TGCAGCCCAACAGATATGGCACTGGTGGCAACAGGAGGTGGTGATGATAAA GGATTTCTCTGGCAGATC Délka rostliny Pořa dí SNP SNP ID Chrom o-zom Pozice na chromozo mu FDR ad juste dpvalue Alely (referenční/ alternativní) Pozice SNP Přilehlá sekvence 43. 354193 l|F|0 -16:G>A- 16:G>A 1 347726949 0,0000 G/A 16 TGCAGGATTGTATACTGATCCTTTCCTTGTATAATTTACAGATCGGAAGAGCG GTTCAGCAGGAATGCC 44. 26139139F 0-49:A>G- 49:A>G 6 95904097 0,0000 A/G 49 TGCAGCGACGATTTGGAACAATCTCTAAGAGTGTTTTCTTCAGAAGAACAGT CCTCGTTTGTTTGAGCT 45. 3565297F0 -43:A>G43:A>G 6 328893473 0,0001 A/G 43 TGCAGATTGCATAGAAAAATAAATTCAACTAGTCCAACATATAATGCACACA GTTTGATGTTATATGAC 46. 5252219F0 -8:C>G8:C>G 5 558157641 0,0031 C/G 8 TGCAGTGTCTTTCGACCAATAAAAGAGCTGCTTTACAGATCGGAAGAGCGGT TCAGCAGGAATGCCGAG 47. 5961490F0 -64:G>T- 64:G>T 1 337020914 0,0279 G/T 64 TGCAGGATGGCATTGATAAGAAGCTATCTATATACTTCTGATTGGCACATAC ATACCTTTTTTTGTTGT 48. 5952661F0 -17:C>T17:C>T 1 33227572 0,0323 C/T 17 TGCAGTAGCCCCCGCGCCGAAGTCGGCGGTGAAGAGTTCTTCAACGCTGATG CCACGGATAAACGAGCT 49. 3543926F0 -21:OG- 21:C>G 5 559611157 0,0350 C/G 21 TGCAGAAACAGAGTAGAAAGTCCATACAAGTCAAACTTCAAAATTTCTTACA GATCGGAAGAGCGGTTC N-látky v sušině Pořa dí SNP SNP ID Chrom o-zom Pozice na chromozo mu FDR ad juste dpvalue Alely (referenční/ alternativní) Pozice SNP Přilehlá sekvence

   50. 3544450F0- 21:G>T- 21:G>T 5 517367 686 0,0000 G/T 21 TGCAGAGAGAATGACTTTTTTGATATAATCTCATGAAGCAAGATTGCTGAGGCCAAAATAGA AAGTTCC 51. 5252187F0- 25:T>C- 25:T>C 7 144545 303 0,0306 T/C 25 TGCAGAACTAATCCAACCTGCAATGTGAATGCACTTCGGTTCCACTCCAAAATTCATGAATTT CATTGG

   CZ 34578 UI

   Odolnost k padlí Pořa dí SNP SNP ID Chromo -zom Pozice na chrom o-zomu FDR ad juste dpvalue Alely (referenční / alternativn 0 Pozi ce SNP Přilehlá sekvence 52. 3548971F0- 26:G>A- 26:G>A 1 3391391 49 0,0000 G/A 26 TGCAGCCTGCAAAGGGCCTGGATCGGGCAACAAAAATGTAGCCTGTTTGTATCCCAAAAAGC CTAAATC 53. 41126765F0- 13:C>A13:C>A 1 1118616 28 0,0001 C/A 13 TGCAGAGTAACGGCGCTGGAAAAAGTTCTCCTTTATCCCAGTGATGGATGCTCTTTATATAGA GCTTTG 54. 3554973F0- 43:A>G- 43:A>G 1 2144210 23 0,0001 A/G 43 TGCAGTGTTTGGACATAACCAAACACAAGCTTTACATGTTTGAATACACAATAAGGAGTGTA AAACTTG 55. 3553560F0- 49:G>T- 49:G>T 1 3369723 69 0,0081 G/T 49 TGCAGAAGGCTCAAAAAAGATAGAACTTAGATATGTACCACCTAAAAGCGCTTCTTTTCGAT CACTGTA 56. 4661881F0- 12:T>C- 12:T>C 5 1779988 63 0,0083 T/C 12 TGCAGAAGGGATTGGTATCTCCGATTTATGATGATGTTGTCGTCATGCCCAATTATGACGATG AATCAA 57. 3550303F0- 11:G>T- 11:G>T 1 5602504 1 0,0083 G/T 11 TGCAGAAGTAAGAAAGGAGTCTTGTATGATATCAAGCCTAAGAAGAAAAAAAATGAGACAT GATAACAT 58. 5934728F0- 24:A>G- 24:A>G 2 4203647 63 0,0099 A/G 24 TGCAGTATGTCTATGACCATTTTGATCAAAAATTGAACCTCCAACCTTAGTCCCATAAACATG ATCATA 59. 3537073F0- 12:T>C- 12:T>C 4 8224630 7 0,0160 T/C 12 TGCAGAAGTGAGTACAGTTTGTTGAGTGTTACTGAGTACTAGTGTCAACCCTATATATCTGGG TTATTG Odolnost k PEMVR Pořa dí SNP SNP ID Chromo -zom Pozice na chromo zomu FDR ad juste dpvalue Alely (referenční / alternativn 0 Pozi ce SNP Přilehlá sekvence 60. 354193 1F0- 16:G>A- 16:G>A 1 3477269 49 0,0000 G/A 16 TGCAGGATTGTATACTGATCCTTTCCTTGTATAATTTACAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGG AATGCC 61. 3544005F0- 42:G>T- 42:G>T 1 1409602 06 0,0100 G/T 42 TGCAGGCATCTTATTTATGTTCTGTTCTGTGGTGTAATCTTTGTATCTTTAGGCATTGCTTATG CCTTG 62. 41124245F0- 5:A>C-5:A>C 1 2093968 47 0,0169 A/C 5 TGCAGAAAATTGTGTTGGAATGTTATGGTTGCTGATTCAGTTTAGTTTTTATGTCAATTCAATA TGATT 63. 3549708F0- 34:T>C- 34:T>C 1 3621269 59 0,0216 T/C 34 TGCAGCACCGACACCTATGAAAAATGTGTGTCCGTGTAAATGTCTGAAAGTGACACCGAAGT TTGTGAT 64. 5916488F0- 45:T>A- 45:T>A 7 4134606 04 0,0357 T/A 45 TGCAGTAAAATGGACGGAAAGCAGGAGATTTCCCAAAAAATAAAATAGACACTCAAAATTT CTCCGATC 65. 19221983 |F|0- 23:C>T- 23:C>T 1 2580797 38 0,0357 C/T 23 TGCAGATACATTGCTTCAATGCACGCGGTACTTATTTATTTTGCTTCAAATTTTTTGCCCTTGC ATTCT Počet větví Pořa dí SNP SNP ID Chromo -zom Pozice na chromo zomu FDR ad juste dpvalue Alely (referenční / alternativn » Pozi ce SNP Přilehlá sekvence

   66. 355831 1F0- 35:C>T- 35:C>T 5 569 851 034 0,0000 C/T 35 TGCAGCAGCAATAGAATCTCCTCAATAAACACTAACATTACAGATCGGAAGAGCGGTTCAG CAGGAATG 67. 5964873F0- 42:T>C- 42:T>C 4 333 240 207 0,0009 T/C 42 TGCAGCCTAGCCAACACAATCCATTTCAATCCAACAAGCAGGTCATGCGTTACAGATCGGAA GAGCGGT Semeno povrch Pořa dí SNP SNP ID Chro mozom Pozice na chromozo mu FDR adjuste dpvalue Alely (referenční / alternativn 0 Pozic e SNP Přilehlá sekvence 68. 3552439F0- 25:C>T- 25:C>T 3 65691152 0,0000 C/T 25 TGCAGGTTTTTTACTTCTCTTTATTCCCATCTACTAGTTCTATTTGCATATTCATTTTCTAACTA TTTT Škrob v sušině Pořa dí SNP SNP ID Chro mozom Pozice na chromozo mu FDR adjuste dpvalue Alely (referenční / alternativn 0 Pozic e SNP Přilehlá sekvence 69. 3552439F0- 21:T>C- 21:T>C 3 65691152 0,0005 T/C 21 TGCAGGTTTTTTACTTCTCTTTATTCCCATCTACTAGTTCTATTTGCATATTCATTTTCTAACTA TTTT 70. 3545762F0- 12:T>C- 12:T>C 1 255505856 0,0022 T/C 12 TGCAGGGATAACTTCGATTGGTGTCCGAGGAAACAATTCTGTCTGTGTCGTTACTCAGAAAA AAGTTCC