CZ32879U1 - SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 virus detection kit in biological material - Google Patents

SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 virus detection kit in biological material Download PDF

Info

Publication number
CZ32879U1
CZ32879U1 CZ2019-36090U CZ201936090U CZ32879U1 CZ 32879 U1 CZ32879 U1 CZ 32879U1 CZ 201936090 U CZ201936090 U CZ 201936090U CZ 32879 U1 CZ32879 U1 CZ 32879U1
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
pcr
probe
reverse primer
primers
Prior art date
Application number
CZ2019-36090U
Other languages
Czech (cs)
Inventor
Radek ÄŚmejla
Lucie Valentová
Original Assignee
VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o. filed Critical VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o.
Priority to CZ2019-36090U priority Critical patent/CZ32879U1/en
Publication of CZ32879U1 publication Critical patent/CZ32879U1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast technikyTechnical field

Řešení se týká sady primerů a sond pro PCR detekci virů Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV), Strawberry crinkle virus (SCV), Strawberry vein banding virus (SVBV), Strawberry mottle virus (SMoV) a Strawberry polerovirus-1 (SPV-1) v biologickém materiálu.The solution relates to a set of primers and probes for PCR detection of Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV), Strawberry crinkle virus (SCV), Strawberry vein banding virus (SVBV), Strawberry mottle virus (SMoV) and Strawberry polerovirus-1 (SPV-1) ) in biological material.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Jahody patří mezi velmi vyhledávané ovoce a v České republice má jejich pěstování dlouholetou tradici. Pro úspěšnou produkci této komodity je proto nezbytné sledovat zdravotní stav nejen produkčních výsadeb, ale zejména rozmnožovacího materiálu, neboť jahodníkové plochy jsou obměňovány po třech až čtyřech letech produkce.Strawberries are among the most sought after fruits and in the Czech Republic their cultivation has a long tradition. For the successful production of this commodity, it is therefore necessary to monitor the health of not only production plantations, but especially propagating material, since strawberry areas are changed after three to four years of production.

Mezi hlavní příčiny snížení výnosů patří choroby jahodníku, které jsou způsobeny viry, a to: Virové okrajové žloutnutí listů jahodníku, původce: Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV); Virová kadeřavost jahodníku, původce: Strawberry crinkle virus (SCV); Virové lemování žilek jahodníku, původce: Strawberry vein banding virus (SVBV); a Virová strakatost jahodníku, původce: Strawberry mottle virus (SMoV). Všechny výše uvedené viry se primárně přenáší mšicemi (Chaelosiphon spp.) a vegetativním množením rostlinného materiálu. Nedávno byl popsán nový virus nazvaný Strawberry polerovirus 1 (SPV-1), který se v komplexu s ostatními viry též podílí na virovém chřadnutí jahodníku (Xiang Y, 2015). Uvádí se, že se ztráty na výnosech mohou pohybovat od 30 % u infekcí způsobených jedním virem až do 80 %, kdy se jedná o mnohočetné infekce výše uvedenými viry (Thompson JR, 2003).The main causes of yield reduction are strawberry diseases caused by viruses, namely: Viral edge yellowing of strawberry leaves, caused by: Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV); Strawberry crinkle virus (SCV); Strawberry vein banding virus originator: Strawberry vein banding virus (SVBV); and Strawberry mottle virus (SMoV). All of the above viruses are primarily transmitted by aphids (Chaelosiphon spp.) And vegetative propagation of plant material. Recently, a new virus called Strawberry Polerovirus 1 (SPV-1) has been described, which, in combination with other viruses, is also involved in strawberry viral wasting (Xiang Y, 2015). It has been reported that yield losses can range from 30% for single virus infections up to 80% when multiple infections with the above viruses (Thompson JR, 2003).

Vzhledem k tomu, že neexistuje pro virové choroby žádná účinná léčba, je jediným možným způsobem ochrany rostlin jahodníků preventivní ochrana, která spočívá v používání bezvirózního rozmnožovacího materiálu, potlačení výskytu přenašečů a včasná a přesná diagnostika, pokud již dojde k infekci.Since there is no effective treatment for viral diseases, the only possible way to protect strawberry plants is preventive protection, which consists in the use of virus-free propagation material, the control of vectors and the timely and accurate diagnosis of infection.

V současnosti se k detekci příslušných virů používají metody PCR, a to jak v klasickém uspořádání s detekcí amplikonů pomocí gelové elektroforézy, tak i real-time PCR. Nevýhodou těchto přístupů je nutnost provádět separátní detekce pro jednotlivé viry, což analýzu prodlužuje a prodražuje. Řešením může být návrh multiplexního PCR systému. Multiplexní PCR detekci virů SMYEV, SCV, SVBV a SMoV navrhl Thompson JR (2003). Metoda však není založena na principu real-time PCR a pro odlišení jednotlivých virů využívá rozdílné délky příslušných PCR amplikonů od 219 bp pro SMoV po 422 bp pro SVBV Z tohoto přístupu též plynou limitace detekce, která není kvantitativní, vzhledem k odlišným délkám jednotlivých fragmentů se liší účinnosti detekce jednotlivých virů a je méně senzitivní (uváděný detekční limit maximálně do ředění 1/200, pro virus SMYEV až 1/500). Navíc tato metoda neřeší současnou detekci viru SPV-1.Currently, PCR methods are used to detect the respective viruses, both in a classical arrangement with the detection of amplicons by gel electrophoresis and by real-time PCR. The disadvantage of these approaches is the need to perform separate detection for individual viruses, which makes the analysis longer and more expensive. The solution may be a multiplex PCR system design. Multiplex PCR detection of SMYEV, SCV, SVBV and SMoV viruses was designed by Thompson JR (2003). However, the method is not based on the real-time PCR principle and uses different lengths of respective PCR amplicons from 219 bp for SMoV to 422 bp for SVBV to distinguish individual viruses. This approach also results in non-quantitative detection limitations due to different lengths of individual fragments. it differs in the detection efficiency of individual viruses and is less sensitive (the detection limit stated is up to a dilution of 1/200, for SMYEV up to 1/500). In addition, this method does not address the simultaneous detection of SPV-1.

Nevýhodou všech uvedených přístupů je tedy nemožnost provádět současnou kvalitativní nebo kvantitativní detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 v jedné reakci a nutnost provádět separátní PCR reakce pro každý virus zvlášť, což analýzu prodlužuje a prodražuje.The disadvantage of all these approaches is therefore the inability to perform simultaneous qualitative or quantitative detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in one reaction and the need to perform separate PCR reactions for each virus separately, which makes the analysis longer and more expensive.

Podstata technického řešeníThe essence of the technical solution

Nedostatky dle současného stavu techniky - nemožnost provádět současnou kvalitativní nebo kvantitativní detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 a nutnost provádět individuální PCR reakce pro detekci jednotlivých virů - odstraňuje sada primerů a sond pro PCR detekci virůShortcomings of the prior art - the inability to perform simultaneous qualitative or quantitative detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 and the need to perform individual PCR reactions for the detection of individual viruses - eliminates a set of primers and probes for PCR detection of viruses

- 1 CZ 32879 U1- 1 GB 32879 U1

SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 v biologickém materiálu podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery a značené hybridizační sondy, jejichž sekvence jsouSMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in biological material according to the invention, which comprises primers and labeled hybridization probes whose sequences are

SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)

SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Sonda 1)SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Probe 1)

CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1) ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2) TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Sonda 2) TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Sonda 3) ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2) ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3) AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (reverse primer 1) ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2) TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Probe 2) TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Probe 3) ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2) ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3) AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)

SEQ ID NO. 3SEQ ID NO. 3

SEQ ID NO. 4SEQ ID NO. 4

SEQ ID NO. 5SEQ ID NO. 5

SEQ ID NO. 6SEQ ID NO. 6

SEQ ID NO. 7SEQ ID NO. 7

SEQ ID NO. 8SEQ ID NO. 8

SEQ ID NO. 9SEQ ID NO. 9

SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Sonda 4)SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Probe 4)

SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)

SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5)SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5)

SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)

SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Sonda 5)SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Probe 5)

SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6)SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6)

SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)

SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Sonda 6)SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Probe 6)

SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7), kde hybridizační sondy jsou vhodně označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce, přičemž pro PCR detekci viru SMYEV obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsouSEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7), wherein the hybridization probes are suitably labeled for their simultaneous detection during the PCR reaction, wherein the PCR detection of SMYEV comprises a set of primers and a labeled hybridization probe whose sequences are

SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)

SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Sonda 1)SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Probe 1)

SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1), pro PCR detekci viru SCV obsahuje sada primery a značené hybridizační sondy, jejichž sekvence jsouSEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1), for PCR detection of SCV contains a set of primers and labeled hybridization probes whose sequences are

SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)

SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Sonda 2)SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Probe 2)

SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Sonda 3)SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Probe 3)

SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)

SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3),SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3)

-2CZ 32879 U1 pro PCR detekci viru SVBV obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsouThe SVBV PCR detection kit contains a primer set and a labeled hybridization probe whose sequences are

SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)

SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Sonda 4)SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Probe 4)

SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)

SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5), pro PCR detekci viru SMoV obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsouSEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5), for PCR detection of SMoV contains a set of primers and a labeled hybridization probe whose sequences are

SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)

SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Sonda 5)SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Probe 5)

SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6), a pro PCR detekci viru SPV-1 obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsouSEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6), and for PCR detection of SPV-1, it contains a set of primers and a labeled hybridization probe whose sequences are

SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)

SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Sonda 6)SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Probe 6)

SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).

Výše uvedené sady primerů a sond jsou vhodné pro současnou nebo individuální kvalitativní nebo kvantitativní detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 v biologickém materiálu s vysokou specificitou metodou založenou na metodě PCR. Metodou PCR se rozumí klasické uspořádaní PCR reakce s detekcí amplikonů pomocí gelové elektroforézy nebo digitální PCR nebo real-time PCR využívající k detekci interkalační barviva nebo různě značené hybridizační sondy podle technického řešení a další varianty metody PCR známé odborníkovi v oboru. Ve výhodném provedení technického řešení je PCR produkt detekován v reálném čase pomocí realtime PCR, a ještě výhodněji pomocí značených hybridizačních sond. V jedné PCR reakci je tak možné stanovit konkrétní virus zvýše uvedených virů, který je zodpovědný za vznik onemocnění.The above primer and probe sets are suitable for simultaneous or individual qualitative or quantitative detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in high specificity biological material by a PCR-based method. The PCR method is understood to be the classical arrangement of the PCR reaction with the detection of amplicons by gel electrophoresis or digital PCR or real-time PCR using the detection dye or differently labeled hybridization probes according to the invention and other variants of the PCR method known to the person skilled in the art. In a preferred embodiment of the invention, the PCR product is detected in real time by realtime PCR, and even more preferably by means of labeled hybridization probes. Thus, in a single PCR reaction, it is possible to determine a particular virus of the aforementioned viruses which is responsible for the disease.

Hybridizační sondy mohou být pro účely jejich detekce značeny fluorescenčně, radioaktivně, neradioaktivně nebo dalšími způsoby známými odborníkovi v oboru. Ve výhodném provedení technického řešení jsou hybridizační sondy pro detekci jednotlivých virů značeny fluorescenčně, a ještě výhodněji pomocí odlišných fluoroforů pro jednotlivé viry, což umožňuje jejich současnou detekci v jedné PCR reakci.Hybridization probes may be labeled for fluorescent, radioactive, non-radioactive or other methods known to those skilled in the art for detection purposes. In a preferred embodiment of the invention, hybridization probes for detecting individual viruses are fluorescently labeled, and even more preferably, using different fluorophores for individual viruses, allowing their simultaneous detection in a single PCR reaction.

Návrh sad primerů a hybridizačních sond podle technického řešení pro detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 byl proveden v několika krocích: 1) Analýza sekvencí dostupných izolátů těchto virů; 2) Porovnání specificity detekce těchto izolátů s primery z dosavadního stavu techniky; 3) Návrh sad primerů a hybridizačních sond pro detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1.The design of primer sets and hybridization probes according to the technical solution for the detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 was performed in several steps: 1) Sequence analysis of available isolates of these viruses; 2) Comparison of the specificity of detection of these isolates with prior art primers; 3) Design of primer sets and hybridization probes for the detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 viruses.

Detekce virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 může být dle provedení technického řešení provedena v jakémkoliv rostlinném materiálu, s výhodou je rostlinným materiálem list.The detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 viruses can be carried out in any plant material according to an embodiment of the invention, preferably the plant material is a leaf.

Prvním krokem detekce virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 v rostlinném materiálu je izolace celkové RNA a její přepis na cDNA pomocí RNA-dependentní DNA polymerázy a sady náhodných primerů metodami známými v oboru.The first step of detecting SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in plant material is to isolate total RNA and transcribe it to cDNA by RNA-dependent DNA polymerase and a set of random primers by methods known in the art.

-3 CZ 32879 U1-3 GB 32879 U1

Vytvořená cDNA je následně analyzována na přítomnost nukleové kyseliny virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 metodou PCR sadami primerů a hybridizačních sond podle technického řešení.The generated cDNA is subsequently analyzed for the presence of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 nucleic acids by PCR with primer sets and hybridization probes according to the invention.

Příklady provedení technického řešení jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a žádným způsobem neomezují rozsah této přihlášky, která je vymezena připojeným nárokem a podrobně popsána v popisu technického řešení. Odborník v oboru bude schopen učinit různé modifikace použitého způsobu PCR a uvedených primerů tak, aby nedošlo ke snížení specificity PCR detekce. Modifikací primerů se rozumí zejména zkrácení nebo prodloužení na 3‘ a/nebo 5‘ konci nebo záměna nukleotidů nebo kombinace těchto modifikací, které zachovávají alespoň 80% identitu k uvedeným sekvencím.Examples of embodiments of the invention are given by way of illustration only and are not to be construed as limiting the scope of this application, which is defined by the appended claim and described in detail in the specification. A person skilled in the art will be able to make various modifications to the PCR method used and the primers mentioned so as not to reduce the specificity of the PCR detection. Primer modification means, in particular, truncation or extension at the 3 ‘and / or 5‘ end, or nucleotide replacement, or a combination of these modifications, which retain at least 80% identity to said sequences.

Příklady uskutečnění technického řešeníExamples of technical solutions

Příklad 1: Návrh sekvencí primerů a sondExample 1: Design of primer and probe sequences

Sekvence různých izolátů virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 byly získány z databáze sekvencí GenBank. Pro analýzu variability sekvencí byla použita metoda multiple alignment v programu ClustalW. Specificita primerů byla stanovena jejich namapováním na uspořádané sekvence a zhodnocením konzervovanosti cílových úseků. Pro navržení sad primerů a hybridizačních sond byly použity konzervované oblasti genomu virů vykazující nejvyšší sekvenční homologii napříč všemi izoláty.The sequences of various isolates of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 were obtained from the GenBank sequence database. Multiple alignment in ClustalW was used to analyze sequence variability. The specificity of the primers was determined by mapping them to the aligned sequences and assessing the conservation of the target regions. Preserved regions of the viral genome showing the highest sequence homology across all isolates were used to design primer sets and hybridization probes.

Primery a hybridizační sondy byly navrženy pomocí programu Vector NTI Advance (Tabulka 1).Primers and hybridization probes were designed using the Vector NTI Advance program (Table 1).

Tabulka 1. Přehled primerů a sond pro detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV1.Table 1. Overview of primers and probes for the detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV1.

SEQ ID NO. SEQ ID NO. Popis Description Virus Virus Referenční sekvence GenBank: pozice GenBank reference sequence: position Sekvence (Dle IUPAC: Y zastupuje C nebo T; R zastupuje Anebo G; S zastupuje G nebo C; W zastupuje A nebo T) Sequence (According to IUPAC: Y represents C or T; R represents A or G; S represents G or C; W stands for A or T) SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 1 Forward primer 1 Forward primer SMY EV SMY EV NC 003794: 27-50 NC 003794: 27-50 CCCTCCTGACGTACACAACAACT G CCCTCCTGACGTACACAACAACT G SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 2 Sonda 1 Probe 1 SMY EV SMY EV NC 003794: Y=T 62-89 KR350471: Y=C 67-94 NC 003794: Y = T 62-89 KR350471: Y = C 67-94 TACTCTAGTYGCCATCGAGGTAC AGTGC TACTCTAGTYGCCATCGAGGTAC AGTGC SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 3 Reverse primer 1 Reverse primer 1 SMY EV SMY EV NC 003794: 94-114 NC 003794: 94-114 CCGTGAGGGAGGAGAATACGC CCGTGAGGGAGGAGAATACGC SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 4 Forward primer 2 Forward primer 2 SCV SCV MH129615: R=A 9850-9873 MH129616: R=G 9861-9884 MH129615: R.dbd.A 9850-9873 MH129616: R.dbd.G 9861-9884 ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGT T ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGT T SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 5 Sonda 2 Probe 2 SCV SCV MHI296I5: Y=T 9877-9902 AY331387: Y=C 1408-1433 MHI29615: Y = T 9877-9902 YY331387: Y = C 1408-1433 TCTCAATAYGATTGTACATACCGC AT TCTCAATAYGATTGTACATACCGC AT

-4CZ 32879 U1-4GB 32879 U1

SEQ ID NO. 6 SEQ ID NO. 6 Sonda 3 Probe 3 scv scv MH129616: 9888-9913 MH129616: 9888-9913 TCTCAATACGATTGCACATATCGC AT TCTCAATACGATTGCACATATCGC AT SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 7 Reverse primer 2 Reverse primer 2 scv scv MH129615: Y=T 9903-9926 MH129616: Y=C 9914-9937 MH129615: Y = T9903-9926 MH129616: Y-C 9914-9937 ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 8 Reverse primer 3 Reverse primer 3 scv scv AY331387: 1436-1457 AY331387: 1436-1457 ACTTGATTATCCCCCATCCCCA ACTTGATTATCCCCCATCCCCA SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 9 Forward primer 3 Forward primer SVBV SVBV NC 001725: s=c 1960-1989 KX950840: S=G 163-192 NC 001725: s = c 1960-1989 KX950840: S = G 163-192 AATATCTGTCTTTACTTGATSATG AACTTG AATATCTGTCTTTACTTGATSATG AACTTG SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 10 Sonda 4 Probe 4 SVBV SVBV NC 001725: R=G 2008-2037 KX950840: R=A 211-240 NC 001725: R = G 2008-2037 KX950840 R = A 211-240 AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAA GARATGA AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAA GARATGA SEQ ID NO. 11 SEQ ID NO. 11 Reverse primer 4 Reverse primer 4 SVBV SVBV NC 001725: 2040-2061 NC 001725: 2040-2061 CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC SEQ ID NO. 12 SEQ ID NO. 12 Reverse primer 5 Reverse primer 5 SVBV SVBV KX950840: 245-267 KX950840: 245-267 CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 13 Forward primer 4 Forward primer 4 SMoV SMoV NC 003445: Y=T 6264-6286 KU200457: Y=C 5553-5575 NC 003445: Y = T 6264-6286 KU200457: Y = C 5553-5575 GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT SEQ ID NO. 14 SEQ ID NO. 14 Sonda 5 Probe 5 SMoV SMoV NC 003445: W=A 6328-6353 KU200457: W=T 5617-5642 NC 003445: W = A 6328-6353 KU200458: W = T 5617-5642 ACAGGWGGCACTGTTTACAGTG TTCC ACAGGWGGCACTGTTTACAGTG TTCC SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 15 Dec Reverse primer 6 Reverse primer 6 SMoV SMoV NC 003445: R=A, Y=T 6357-6377 KU200457: R=G, Y=C 5646-5666 NC 003445: R = A, Y = T 6357-6377 KU200457: R = G, Y = C, 5646-5666 TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG SEQ ID NO. 16 SEQ ID NO. 16 Forward primer 5 Forward primer SPV-1 SPV-1 NC 025435: 2255-2275 NC 025435: 2255-2275 CAACTGGGGTCGTACACTCGC CAACTGGGGTCGTACACTCGC SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. 17 Sonda 6 Probe 6 SPV-1 SPV-1 NC 025435: 2280-2302 NC 025435: 2280-2302 ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA SEQ ID NO. 18 SEQ ID NO. 18 Reverse primer 7 Reverse primer 7 SPV-1 SPV-1 NC 025435: 2304-2323 NC 025435: 2304-2323 GGCCAGCCGAATCCTTTGAC GGCCAGCCGAATCCTTTGAC

Nasedání primerů a sond na referenční sekvence ukazuje Tabulka 2.The fitting of the primers and probes to the reference sequences is shown in Table 2.

Tabulka 2: Nasedání příměrů a sond použitých pro detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1. Místa pro nasedání přímeni a sond jsou vyznačena točně. Podtržením je vyznačeno nasedání primerů a sond v reverzní orientací.Table 2: Attaching primers and probes used to detect SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 viruses. Straightening and probing points are marked in turn. The underlining indicates the annealing of primers and probes in reverse orientation.

ZíZí

StoHundred

OO

Φ dJΦ dJ

ΦΦ

OO

0-4 ”0 íx0-4 ”0 ix

G co *0G co * 0

GG

Φ β -HΒ β -H

T>T>

ΦΦ

ΉΉ

GG

Q řdQ řd

Q-!Q-!

toit

HH

M •HM • H

ΦΦ

X*X *

ΦΦ

TT

4Z -H >N íi4Z -H >

Ti «Τ SdTi «Τ Sd

Φ β ΉΦ β Ή

Sd aSd a

'-Ϊ3'-Ϊ3

Φ toΦ it

Φ oΦ o

PftfPftf

Ή -HΉ -H

to to it it o < O < to it to it to it <5 <5 £ £ to it rte rte Λ Λ O O ÍJ ÍJ o O £ £ ž-i ž-i Ž OF s with to it to it >5 > 5 g G 23 Š 23 Š g G r-· í> r- · í> • to • it to O to O s with O to About it 5 5 to  it 2 S 2 S • o • o £ to £ it £ £ O to About it SK SŽ SK SŽ ň n S5 .< S5. < H O HIM o O £; O £; O Q to Q to Η 0 Η 0 a 3 and 3 M & M & to it w íř w íř to it £> to £> it 85 $4 85 $ 4 O5 O 5 U> U> u; «; at; «; W ME W ME d, d, « « ««

• to • it - V ' - V ' o υ o υ vto 0^0 vto 0 ^ 0 55 O 55 O TI S to 55 TI S 55 to it to to it it fit to fit to \>;rt Q 0 S rt Q 0 S H H .5^4 M to to .5 ^ 4 M to do it to it 2 < 2 < Φ Q &< ·ΐ» Φ Q & <ΐ »

•H U• H U

XΦXΦ

Φ ΌΦ Ό

PP

a.and.

XX

GG

X • H >NX • H> N

OO

L<L <

Φ to <3 τ φ to φ tí oΦ to <3 τ φ to φ t o

dJ τdJ τ

JJ* JJ * < < u at •v •in U AT i and s with to it Q Q o O Q Q to it O O «< «< re re to it $3 $ 3 1^ 1 ^ w? w? sš sš A: AND: to it 7! 7! e E to it to it to it 0 0 O O to it 0 0 <5 <5 35: 35: x£ x £ to it o O to it g G to it M M Γ Γ O Λ O Λ © < © < tů here >5 > 5 a and i? and? « « v? in? g < G < to it to it to it íí íí O O to it ϋ ϋ P P Q Q to O to O « Q « Q ζ_ϊ ζ_ϊ § § to it to it íž »C íž »C o O Q Q «e» "E" jž jž to it § § S WITH to it to it Ó O o O O O S: WITH: Fj Fj £ £ ΰ ΰ Š WITH to: it: to it 0» 0 » O O fcj fcj w w <3 <3 in in £S £ S £ft £ ft •Ί» • Ί » fj fj u at to it ¢5 to To 5 to < < í and c< c < i.h i.h 0 0 $ $ to it »> »> C‘ C' 3 3 to it ť> ť> to it u at U AT C C 6 6 & & to it to it to it Em Em to it to it <) <) a and to it Em Em to it to it O O Ct Ct b b Ó O o O to it ·* · * < < to it to it to it to it O O to it to it J.9 J.9 d d to it < < to it to it to it <5 <5 O O < < to it to to it it ¢5 ¢ 5 O O to it to it to it U AT Q Q to íJ to íJ to to it it to it to it to to it it g G 8 8 i and to it g G to it to it

ta iw to 1» to ífi ¢5 £4 Em < <ta iw to 1 to to i 5 £ 4 Em <<

SM fc* to toSM fc * do it

C’« <ŤS >ΛC ’« <«»

H í>H í>

t»t »

1Λ1Λ

I*U1I * U1

í*3 wí * 3 w

-6CZ 32879 U1-6GB 32879 U1

Příklad 2: Simplexová kvalitativní detekce viru SMYEV v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádáníExample 2: Simplex Qualitative Detection of SMYEV in Biological Material by Classical PCR

Pro detekci viru SMYEV byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufř (Top-Bio); 2,5 mM MgCE; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:For detection of SMYEV virus, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the PCR reaction with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCE; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each. The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)

SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1).SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.PCR amplification was performed in a Cl000 PCR cycler (Biorad) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20 sec, 58 ° C / 20 sec, 72 ° C / 20 sec.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 4% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru SMYEV byl identifikován proužek o velikosti 88 bp.After completion of the reaction, the resulting PCR amplicons were analyzed electrophoretically on a 4% agarose gel. A band of 88 bp was identified in positive samples for the presence of SMYEV.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SMYEV.Positive findings obtained by PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SMYEV has been confirmed in all cases.

Příklad 3: Simplexová kvalitativní detekce viru SCV v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádáníExample 3: Simplex qualitative detection of SCV in biological material by classical PCR method

Pro detekci viru SCV byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufř (Top-Bio); 2,5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:To detect SCV virus, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the PCR reaction with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each. The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)

SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)

SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3).SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.PCR amplification was performed in a Cl000 PCR cycler (Biorad) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20 sec, 58 ° C / 20 sec, 72 ° C / 20 sec.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 4% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru SCV byl identifikován proužek o velikosti 77 bp.After completion of the reaction, the resulting PCR amplicons were analyzed electrophoretically on a 4% agarose gel. Positive samples for the presence of SCV identified a 77 bp band.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SCV.Positive findings obtained by PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SCV was confirmed in all cases.

-7 CZ 32879 U1-7 GB 32879 U1

Příklad 4: Simplexová kvalitativní detekce viru SVBV v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádáníExample 4: Simplex Qualitative Detection of SVBV Virus in Biological Material by Classical PCR Method

Pro detekci viru SVBV byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:For detection of SVBV virus, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the PCR reaction with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each. The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)

SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)

SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5).SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.PCR amplification was performed in a Cl000 PCR cycler (Biorad) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20 sec, 58 ° C / 20 sec, 72 ° C / 20 sec.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 4% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru SVBV byl identifikován proužek o velikosti 102 bp.After completion of the reaction, the resulting PCR amplicons were analyzed electrophoretically on a 4% agarose gel. Positive samples for the presence of SVBV virus identified a band of 102 bp.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SVBV.Positive findings obtained by PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SVBV was confirmed in all cases.

Příklad 5: Simplexová kvalitativní detekce viru SMoV v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádáníExample 5: Simplex Qualitative Detection of SMoV in Biological Material by Classical PCR

Pro detekci viru SMoV byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:For detection of SMoV, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the PCR reaction with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each. The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)

SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6).SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.PCR amplification was performed in a Cl000 PCR cycler (Biorad) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20 sec, 58 ° C / 20 sec, 72 ° C / 20 sec.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 4% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru SMoV byl identifikován proužek o velikosti 114 bp.After completion of the reaction, the resulting PCR amplicons were analyzed electrophoretically on a 4% agarose gel. Positive samples for the presence of SMoV identified a 114 bp band.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SMoV.Positive findings obtained by PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SMoV was confirmed in all cases.

Příklad 6: Simplexová kvalitativní detekce viru SPV-1 v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádáníExample 6: Simplex Qualitative Detection of SPV-1 in Biological Material by Classical PCR Method

Pro detekci viru SPV-1 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:For detection of SPV-1, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the PCR reaction with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each. The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)

SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.PCR amplification was performed in a Cl000 PCR cycler (Biorad) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20 sec, 58 ° C / 20 sec, 72 ° C / 20 sec.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 4% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru SPV-1 byl identifikován proužek o velikosti 69 bp.After completion of the reaction, the resulting PCR amplicons were analyzed electrophoretically on a 4% agarose gel. A band of 69 bp was identified in positive samples for the presence of SPV-1.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SPV-1.Positive findings obtained by PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SPV-1 was confirmed in all cases.

Příklad 7: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru SMYEV v biologickém materiálu metodou real-time PCRExample 7: Simplex qualitative and quantitative detection of SMYEV in biological material by real-time PCR

Pro detekci viru SMYEV byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.For detection of SMYEV virus, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the real-time PCR reaction.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SMYEV použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (TopBio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (Biotium). V reakci byly použity tyto primery:In a preferred embodiment of the invention, an intercalating dye is used for real-time PCR detection of SMYEV with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA polymerase (TopBio); 500 nM primers each; 1x EvaGreen (Biotium). The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)

SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1).SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20s, 58 ° C / 20s, 72 ° C / 20s, with fluorescence reading in HRM channel.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SMYEV.Positive findings obtained by real-time PCR were verified by melting analysis to determine the characteristic melting curve of specific PCR amplicons and direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SMYEV has been confirmed in all cases.

V ještě výhodnějším provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SMYEV použito fluorescenčně značené hybridizační sondy s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP každý; 1U CombiIn an even more preferred embodiment of the invention, fluorescently labeled hybridization probes are used for real-time PCR detection of SMYEV with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi

-9CZ 32879 U1-9GB 32879 U1

Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 200 nM sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:Taq DNA polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each; 200 nM probe. The following primers and probe were used in the reaction:

SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)

SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Sonda 1)SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Probe 1)

SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1).SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycles of 94 ° C / 20 s, 58 ° C / 20 s, 72 ° C / 20 s, with fluorescence reading in the appropriate channel according to the type of probe labeling.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SMYEV.Positive findings obtained by real-time PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparison with the sequence database. SMYEV has been confirmed in all cases.

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost viru SMYEV stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy SMYEV o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru SMYEV ve vzorku.In a preferred embodiment, the presence of SMYEV has been quantitated. Four SMYEV standards of known concentration in decimal dilutions were added to the real-time PCR run to construct a calibration curve. A calibration curve was used for positive samples to determine the concentration of SMYEV in the sample.

Příklad 8: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru SCV v biologickém materiálu metodou real-time PCRExample 8: Simplex qualitative and quantitative detection of SCV in biological material by real-time PCR

Pro detekci viru SCV byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.To detect SCV virus, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the real-time PCR reaction.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SCV použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufř (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (TopBio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (Biotium). V reakci byly použity tyto primery:In a preferred embodiment of the invention an intercalating dye is used for real-time PCR detection of SCV with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA polymerase (TopBio); 500 nM primers each; 1x EvaGreen (Biotium). The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)

SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)

SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3).SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20s, 58 ° C / 20s, 72 ° C / 20s, with fluorescence reading in HRM channel.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SCV.Positive findings obtained by real-time PCR were verified by melting analysis to determine the characteristic melting curve of specific PCR amplicons and direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SCV was confirmed in all cases.

V ještě výhodnějším provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SCV použito stejně fluorescenčně značených hybridizačních sond s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufř (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 200 nM každá sonda. V reakci byly použity tyto primery a sondy:In an even more preferred embodiment of the present invention, equally fluorescently labeled hybridization probes are used for real-time PCR detection of SCV with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each; 200 nM each probe. The following primers and probes were used in the reaction:

SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)

- 10CZ 32879 U1- 10GB 32879 U1

SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Sonda 2)SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Probe 2)

SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Sonda 3)SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Probe 3)

SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)

SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3).SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sond.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling of 94 ° C / 20 s, 58 ° C / 20 s, 72 ° C / 20 s, with fluorescence reading in the appropriate channel according to the type of probe labeling.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SCV.Positive findings obtained by real-time PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparison with the sequence database. SCV was confirmed in all cases.

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost viru SCV stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy SCV o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru SCV ve vzorku.In a preferred embodiment, the presence of SCV has been quantitated. Four SCV standards of known concentration in decimal dilutions were added to the real-time PCR run to construct a calibration curve. A calibration curve was used in positive samples to determine the SCV concentration in the sample.

Příklad 9: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru SVBV v biologickém materiálu metodou real-time PCRExample 9: Simplex qualitative and quantitative detection of SVBV in biological material by real-time PCR

Pro detekci viru SVBV byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.For detection of SVBV virus, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the real-time PCR reaction.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SVBV použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufř (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (TopBio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (Biotium). V reakci byly použity tyto primery:In a preferred embodiment of the invention, an intercalating dye is used for real-time PCR detection of SVBV with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA polymerase (TopBio); 500 nM primers each; 1x EvaGreen (Biotium). The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)

SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)

SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5).SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20s, 58 ° C / 20s, 72 ° C / 20s, with fluorescence reading in HRM channel.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SVBV.Positive findings obtained by real-time PCR were verified by melting analysis to determine the characteristic melting curve of specific PCR amplicons and direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SVBV was confirmed in all cases.

V ještě výhodnějším provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SVBV použito fluorescenčně značené hybridizační sondy s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufř (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 200 nM sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:In an even more preferred embodiment of the invention, fluorescently labeled hybridization probes are used for real-time PCR detection of SVBV with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each; 200 nM probe. The following primers and probe were used in the reaction:

SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)

SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Sonda 4)SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Probe 4)

- 11 CZ 32879 U1- 11 GB 32879 U1

SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)

SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5).SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycles of 94 ° C / 20 s, 58 ° C / 20 s, 72 ° C / 20 s, with fluorescence reading in the appropriate channel according to the type of probe labeling.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SVBVPositive findings obtained by real-time PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparison with the sequence database. SVBV was confirmed in all cases

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost viru SVBV stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy SVBV o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru SVBV ve vzorku.In a preferred embodiment, the presence of SVBV has been quantitated. Four SVBV standards of known concentration in decimal dilutions were added to the real-time PCR run to construct a calibration curve. A calibration curve was used for positive samples to determine the concentration of SVBV in the sample.

Příklad 10: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru SMoV v biologickém materiálu metodou real-time PCRExample 10: Simplex qualitative and quantitative detection of SMoV in biological material by real-time PCR

Pro detekci viru SMoV byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.For detection of SMoV, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the real-time PCR reaction.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SMoV použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (TopBio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (Biotium). V reakci byly použity tyto primery:In a preferred embodiment of the invention, an intercalating dye is used for real-time PCR detection of SMoV with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA polymerase (TopBio); 500 nM primers each; 1x EvaGreen (Biotium). The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)

SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6).SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20s, 58 ° C / 20s, 72 ° C / 20s, with fluorescence reading in HRM channel.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SMoVPositive findings obtained by real-time PCR were verified by melting analysis to determine the characteristic melting curve of specific PCR amplicons and direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SMoV was confirmed in all cases

V ještě výhodnějším provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SMoV použito fluorescenčně značené hybridizační sondy s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 200 nM sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:In an even more preferred embodiment of the invention, fluorescently labeled hybridization probes are used for real-time PCR detection of SMoV with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each; 200 nM probe. The following primers and probe were used in the reaction:

SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)

SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Sonda 5)SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Probe 5)

SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6).SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6).

- 12CZ 32879 U1- 12GB 32879 U1

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycles of 94 ° C / 20 s, 58 ° C / 20 s, 72 ° C / 20 s, with fluorescence reading in the appropriate channel according to the type of probe labeling.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SMoV.Positive findings obtained by real-time PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparison with the sequence database. SMoV was confirmed in all cases.

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost viru SMoV stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy SMoV o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru SMoV ve vzorku.In a preferred embodiment, the presence of SMoV has been quantitated. Four SMoV standards of known concentration in decimal dilutions were added to the real-time PCR run to construct a calibration curve. A calibration curve was used for positive samples to determine the SMoV concentration in the sample.

Příklad 11: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru SPV-1 v biologickém materiálu metodou real-time PCRExample 11: Simplex qualitative and quantitative detection of SPV-1 in biological material by real-time PCR

Pro detekci viru SPV-1 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.For detection of SPV-1, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the real-time PCR reaction.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SPV-1 použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (TopBio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (Biotium). V reakci byly použity tyto primery:In a preferred embodiment of the invention, an intercalating dye is used for real-time PCR detection of SPV-1 with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA polymerase (TopBio); 500 nM primers each; 1x EvaGreen (Biotium). The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)

SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20s, 58 ° C / 20s, 72 ° C / 20s, with fluorescence reading in HRM channel.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SPV-1.Positive findings obtained by real-time PCR were verified by melting analysis to determine the characteristic melting curve of specific PCR amplicons and direct sequencing of PCR amplicons and comparing their sequence with the sequence database. SPV-1 was confirmed in all cases.

V ještě výhodnějším provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru SPV-1 použito fluorescenčně značené hybridizační sondy s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 200 nM sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:In an even more preferred embodiment of the present invention, fluorescence-labeled hybridization probes are used for real-time PCR detection of SPV-1 with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each; 200 nM probe. The following primers and probe were used in the reaction:

SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)

SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Sonda 6)SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Probe 6)

SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycles of 94 ° C / 20 s, 58 ° C / 20 s, 72 ° C / 20 s, with fluorescence reading in the appropriate channel according to the type of probe labeling.

- 13 CZ 32879 U1- 13 GB 32879 U1

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru SPV-1.Positive findings obtained by real-time PCR were verified by direct sequencing of PCR amplicons and comparison with the sequence database. SPV-1 was confirmed in all cases.

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost viru SPV-1 stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy SPV-1 o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru SPV-1 ve vzorku.In a preferred embodiment, the presence of SPV-1 has been quantitated. Four standards of decimal dilution SPV-1 were added to the real-time PCR run to construct a calibration curve. A calibration curve was used for positive samples to determine the concentration of SPV-1 in the sample.

Příklad 12: Současná multiplexová kvalitativní detekce virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádáníExample 12: Simultaneous multiplex qualitative detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in biological material by classical PCR

Pro současnou detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufř (Top-Bio); 2,5 mM MgCh; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:For simultaneous detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the PCR reaction with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each. The following primers were used in the reaction:

SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)

SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1)SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1)

SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)

SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)

SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3)SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3)

SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)

SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)

SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5)SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5)

SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)

SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6)SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6)

SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)

SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.PCR amplification was performed in a Cl000 PCR cycler (Biorad) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycling 94 ° C / 20 sec, 58 ° C / 20 sec, 72 ° C / 20 sec.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 4% agarózovém gelu.After completion of the reaction, the resulting PCR amplicons were analyzed electrophoretically on a 4% agarose gel.

U vzorků pozitivních na přítomnost viru SMYEV byl identifikován proužek o velikosti 88 bp; u vzorků pozitivních na přítomnost viru SCV byl identifikován proužek o velikosti 77 bp;A 88 bp band was identified in SMYEV positive samples; a 77 bp band was identified in SCV positive samples;

u vzorků pozitivních na přítomnost viru SVBV byl identifikován proužek o velikosti 102 bp; u vzorků pozitivních na přítomnost viru SMoV byl identifikován proužek o velikosti 114 bp; u vzorků pozitivních na přítomnost viru SPV-1 byl identifikován proužek o velikosti 69 bp. U vícenásobně pozitivních vzorků na přítomnost virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 byly identifikovány příslušné proužky.a sample of 102 bp was identified in samples positive for SVBV; a sample of 114 bp was identified in SMoV positive samples; a sample of 69 bp was identified in SPV-1 positive samples. Multiple positive specimens for the presence of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 have been identified with appropriate bands.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR v tomto uspořádání byly porovnány s výsledky ze simplexových detekcí virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1, které již byly sekvenačněPositive findings obtained by PCR in this arrangement were compared with results from simplex detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1, which were sequenced

- 14CZ 32879 U1 ověřeny. Ve všech případech nálezy ze současné detekce všech pěti virů v jedné PCR reakci souhlasily s výsledky ze simplexových reakcí.- 14GB 32879 U1 verified. In all cases, the findings from the simultaneous detection of all five viruses in one PCR reaction were consistent with the results from the simplex reactions.

Příklad 13: Současná multiplexová kvalitativní a kvantitativní detekce virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 v biologickém materiálu metodou real-time PCRExample 13: Simultaneous multiplex qualitative and quantitative detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in biological material by real-time PCR

Pro detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.For detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1, total RNA was isolated from infected plants using the Ribospin ™ Plant kit (GeneAll). The isolated RNA was used to prepare cDNA using random primers (Roche) and M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). The prepared cDNA was used as a template for the real-time PCR reaction.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 použito odlišně fluorescenčně značených hybridizačních sond specifických pro příslušný virus s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufř (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 200 nM každá sonda. V reakci byly použity tyto primery a sondy:In a preferred embodiment of the invention, differently fluorescently labeled virus-specific hybridization probes are used for real-time PCR detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 with the following reaction conditions: 2 μΐ cDNA; 1x PCR Blue reaction buffer (Top-Bio); 2.5 mM MgCl 2; 200 μΜ dNTP each; 1U Combi Taq DNA Polymerase (Top-Bio); 500 nM primers each; 200 nM each probe. The following primers and probes were used in the reaction:

SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)

SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Sonda 1)SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Probe 1)

SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1)SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1)

SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)

SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Sonda 2)SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Probe 2)

SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Sonda 3)SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Probe 3)

SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)

SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3)SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3)

SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)

SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Sonda 4)SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Probe 4)

SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)

SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5)SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5)

SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)

SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Sonda 5)SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Probe 5)

SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6)SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6)

SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)

SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Sonda 6)SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Probe 6)

SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; 40x cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.The real-time PCR reaction was run in a Rotor-Gene Q (Qiagen) with the following temperature profile: 94 ° C / 5 minutes; 40x cycles of 94 ° C / 20 s, 58 ° C / 20 s, 72 ° C / 20 s, with fluorescence reading in the appropriate channel according to the type of probe labeling.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR v tomto uspořádání byly porovnány s výsledky ze simplexových detekcí virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1, které již byly sekvenačněPositive findings obtained by PCR in this arrangement were compared with results from simplex detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1, which were sequenced

- 15 CZ 32879 U1 ověřeny. Ve všech případech nálezy ze současné detekce všech pěti virů v jedné PCR reakci souhlasily s výsledky ze simplexových reakcí.- 15 GB 32879 U1 verified. In all cases, the findings from the simultaneous detection of all five viruses in one PCR reaction were consistent with the results from the simplex reactions.

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Koncentrace virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 u pozitivních vzorků byla stanovena podle příslušné kalibrační křivky.In a preferred embodiment, the presence of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 has been quantitated. Four standards of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 of known concentration in decimal dilutions were added to the real-time PCR run to construct a calibration curve. The concentrations of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in positive samples were determined according to the appropriate calibration curve.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Nově navržené primery a hybridizační sondy byly optimalizovány pro použití v sadě pro současnou kvalitativní a kvantitativní detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 v jedné PCR reakci. Nové sady primerů a hybridizačních sond tedy oproti dosavadnímu stavu techniky zrychlují, zpřesňují a zlevňují diagnostiku onemocnění jahodníku, které je způsobeno viry SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1.The newly designed primers and hybridization probes have been optimized for use in the kit for simultaneous qualitative and quantitative detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in a single PCR reaction. Thus, novel primer and hybridization probe sets accelerate, refine and cheaper the diagnosis of strawberry disease caused by SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 compared to the prior art.

Seznam použité literaturyList of used literature

Thompson JR, Wetzel S, Klerks MM, Vašková D, Schoen CD, Spak J, Jelkmann W. Multiplex RT-PCR detection of four aphid-bome strawberry viruses in Fragaria spp. in combination with a plant mRNA specific intemal control. J Virol Methods. (2003) 111(2):85-93.Thompson JR, Wetzel S, Klerks MM, Vaskova D, Schoen CD, Spak J, Jelkmann W. Multiplex RT-PCR detection of four aphid-bome strawberry viruses in Fragaria spp. In combination with plant mRNA specific intemal control. J Virol Methods. (2003) 111 (2): 85-93.

Xiang Y, Bernardy M, Bhagwat B, Wiersma PA, DeYoung R, Bouthillier M. The complete genome sequence of a new polerovirus in strawberry plants firom eastem Canada showing strawberry dechne symptoms. Arch Virol. (2015) 160(2):553-6.Xiang Y, Bernardy M, Bhagwat B, Wiersma PA, DeYoung R, Bouthillier M. Arch Virol. (2015) 160 (2): 553-6.

NÁROKY NA OCHRANUPROTECTION REQUIREMENTS

Claims (18)

1. Sada primerů a sond pro současnou PCR detekci virů SMYEV, SCV, SVBV, SMoV a SPV-1 v biologickém materiálu, vyznačující se tím, že obsahuje primery a značené hybridizační sondy, jejichž sekvence jsouA set of primers and probes for the simultaneous PCR detection of SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 in biological material, characterized in that it comprises primers and labeled hybridization probes whose sequences are SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Sonda 1)2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Probe 1) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1)3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Sonda 2)5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Probe 2) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Sonda 3)6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Probe 3) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3)8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Sonda 4)10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Probe 4) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5)12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Sonda 5)14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Probe 5) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6)15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Sonda 6)17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Probe 6) SEQ ID NO.SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7),18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7) - 16CZ 32879 U1 kde hybridizační sondy jsou označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce, přičemž pro PCR detekci viru SMYEV obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou- 16CZ 32879 U1 wherein the hybridization probes are labeled for their simultaneous detection during a PCR reaction, wherein the PCR detection of SMYEV comprises a set of primers and a labeled hybridization probe whose sequences are SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1)SEQ ID NO. 1: CCCTCCTGACGTACACAACAACTG (Forward primer 1) SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Sonda 1)SEQ ID NO. 2: TACTCTAGTYGCCATCGAGGTACAGTGC (Probe 1) SEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1), pro PCR detekci viru SCV obsahuje sada primery a značené hybridizační sondy, jejichž sekvence jsouSEQ ID NO. 3: CCGTGAGGGAGGAGAATACGC (Reverse primer 1), for PCR detection of SCV contains a set of primers and labeled hybridization probes whose sequences are SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2)SEQ ID NO. 4: ACAGTRTGCGCTTTAGAGGTTGTT (Forward primer 2) SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Sonda 2)SEQ ID NO. 5: TCTCAATAYGATTGTACATACCGCAT (Probe 2) SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Sonda 3)SEQ ID NO. 6: TCTCAATACGATTGCACATATCGCAT (Probe 3) SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2)SEQ ID NO. 7: ACCTGATTATCTCCCATYCCCATT (Reverse primer 2) SEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3), pro PCR detekci viru SVBV obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsouSEQ ID NO. 8: ACTTGATTATCCCCCATCCCCA (Reverse primer 3), for PCR detection of SVBV contains a set of primers and a labeled hybridization probe whose sequences are SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3)SEQ ID NO. 9: AATATCTGTCTTTACTTGATSATGAACTTG (Forward primer 3) SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Sonda 4)SEQ ID NO. 10: AGTTACAGGTACTTGTAGCAAAAGARATGA (Probe 4) SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4)SEQ ID NO. 11: CGTCTTCGCTGCTGCTGTAGTC (Reverse primer 4) SEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5), pro PCR detekci viru SMoV obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsouSEQ ID NO. 12: CATCTTCACTGCTGCTGCTGTAG (Reverse primer 5), for PCR detection of SMoV contains a set of primers and a labeled hybridization probe whose sequences are SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4)SEQ ID NO. 13: GTAGGACACCGGCTCTTGGYAGT (Forward primer 4) SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Sonda 5)SEQ ID NO. 14: ACAGGWGGCACTGTTTACAGTGTTCC (Probe 5) SEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6) a pro PCR detekci viru SPV-1 obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsouSEQ ID NO. 15: TTGGRTCGTCACCTGAYCTCG (Reverse primer 6) and for PCR detection of SPV-1 contains a set of primers and a labeled hybridization probe whose sequences are SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5)SEQ ID NO. 16: CAACTGGGGTCGTACACTCGC (Forward primer 5) SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Sonda 6)SEQ ID NO. 17: ACCTACCCTGAACTCGCCGAACA (Probe 6) SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).SEQ ID NO. 18: GGCCAGCCGAATCCTTTGAC (Reverse primer 7).
CZ2019-36090U 2019-04-04 2019-04-04 SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 virus detection kit in biological material CZ32879U1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-36090U CZ32879U1 (en) 2019-04-04 2019-04-04 SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 virus detection kit in biological material

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-36090U CZ32879U1 (en) 2019-04-04 2019-04-04 SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 virus detection kit in biological material

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ32879U1 true CZ32879U1 (en) 2019-05-21

Family

ID=66633836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-36090U CZ32879U1 (en) 2019-04-04 2019-04-04 SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 virus detection kit in biological material

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ32879U1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114592093A (en) * 2022-03-28 2022-06-07 北京农学院 Primer for fluorescence quantitative detection of strawberry mottle virus and application thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114592093A (en) * 2022-03-28 2022-06-07 北京农学院 Primer for fluorescence quantitative detection of strawberry mottle virus and application thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hajizadeh et al. Development and validation of a multiplex RT-PCR method for the simultaneous detection of five grapevine viroids
US8389221B2 (en) Method of detecting H5 or H7 avian influenza virus
Bester et al. Real-time RT-PCR high-resolution melting curve analysis and multiplex RT-PCR to detect and differentiate grapevine leafroll-associated virus 3 variant groups I, II, III and VI
JP6286419B2 (en) Primer and probe sets used for genetic polymorphism discrimination and their use
Hasiów-Jaroszewska et al. Detection of Pepino mosaic virus isolates from tomato by one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
Majumder et al. Simultaneous detection of four garlic viruses by multiplex reverse transcription PCR and their distribution in Indian garlic accessions
Shen et al. Detection of Papaya leaf distortion mosaic virus by reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification
Mason et al. Potentiality of methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) in identifying genes involved in tomato response to tomato yellow leaf curl sardinia virus
RU2504585C1 (en) Set of oligodesoxyribonycleotide primers and fluorescent-marked probe for identification of rna of human coronavirus associated with severe sharp respiratory syndrome
Park et al. Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChMVd)
Kwon et al. Reverse transcription polymerase chain reaction-based system for simultaneous detection of multiple lily-infecting viruses
Li et al. Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of an emerging potyvirus: Tomato necrotic stunt virus
Majumder et al. Simultaneous detection of Onion yellow dwarf virus and Shallot latent virus in infected leaves and cloves of garlic by duplex RT-PCR
Offei et al. Molecular variation of Potato yellow vein virus isolates
Almasi Establishment and application of a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Grapevine fanleaf virus
CZ32879U1 (en) SMYEV, SCV, SVBV, SMoV and SPV-1 virus detection kit in biological material
CN112626275A (en) Primer pair and method for detecting or assisting in detecting southern tomato viruses based on one-step RT-PCR technology
Xu et al. Development of reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of infectious bursal disease virus
Barrett-Muir et al. Investigation of varicella-zoster virus variation by heteroduplex mobility assay
McCord et al. Genotyping sugarcane for the brown rust resistance locus Bru 1 using unlabeled probe melting
Pappi et al. Development of three duplex real-time RT-PCR assays for the sensitive and rapid detection of a phytoplasma and five viral pathogens affecting stone fruit trees
JP4491276B2 (en) Method and kit for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence
Pahalawatta et al. Incidence and relative prevalence of distinct caulimoviruses (genus Caulimovirus, family Caulimoviridae) associated with dahlia mosaic in Dahlia variabilis
Ma et al. Recombinase polymerase amplification assay for sensitive and rapid detection of southern rice black-streaked dwarf virus in plants
WO2016167320A1 (en) Method for detecting genetic mutation

Legal Events

Date Code Title Description
FG1K Utility model registered

Effective date: 20190521

MK1K Utility model expired

Effective date: 20230404