CZ309885B6 - Triterpeny s inhibiční aktivitou na Hedgehog signální dráhu pro použití při léčbě nádorových onemocnění - Google Patents

Triterpeny s inhibiční aktivitou na Hedgehog signální dráhu pro použití při léčbě nádorových onemocnění Download PDF

Info

Publication number
CZ309885B6
CZ309885B6 CZ2022-277A CZ2022277A CZ309885B6 CZ 309885 B6 CZ309885 B6 CZ 309885B6 CZ 2022277 A CZ2022277 A CZ 2022277A CZ 309885 B6 CZ309885 B6 CZ 309885B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dien
oxolupa
oic acid
oxolupan
isothiazol
Prior art date
Application number
CZ2022-277A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2022277A3 (cs
Inventor
Milan Urban
Ivo Frydrych
Lucie Borková
Marián HAJDÚCH
Marián Hajdúch
Barbora Vránová
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ2022-277A priority Critical patent/CZ309885B6/cs
Publication of CZ2022277A3 publication Critical patent/CZ2022277A3/cs
Publication of CZ309885B6 publication Critical patent/CZ309885B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
    • C07J63/008—Expansion of ring D by one atom, e.g. D homo steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Předmětem předkládaného řešení jsou terpenoidní deriváty obecného vzorce I, ve kterém,------ je jednoduchá nebo dvojná vazba; A, X, Y a Z jsou vzájemně nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří CH, C, N, NH, O, S; přičemž nejvýše jeden z A, X, Y, Z je O nebo S; R1 je vybrán ze skupiny -CH2OH, -CH2O(CH2)nCH3, -CH2OC(O)(CH2)nCH3, -COOH, ‑COO(CH2)nCH3 a -COO(CH2)Ph, -COOCH2OC(O)CH3, kde nezávisle n = 0 až 5; a jejich farmaceuticky přijatelné soli. Terpenoidní derivátry vzorce I významně inhibují Hedgehog buněčnou signální dráhu a jsou využitelné pro léčbu nádorových onemocnění.

Description

Vynález se týká triterpenů, které významně inhibují Hedgehog (Hh) buněčnou signální dráhu a jejich využití při léčbě nádorových onemocnění dependentních na této signální dráze. Jedná se o triterpenické sloučeniny substituované zejména v poloze 2 aromatickým heterocyklickým substituentem. Tyto sloučeniny je možné využít pro inhibici Hh dráhy v nádorových buňkách a tím způsobit inhibici jejich růstu nebo buněčnou smrt, což ve výsledku omezí velikost nádoru. Využití se předpokládá zejména ve farmaceutickém průmyslu.
Dosavadní stav techniky
Triterpeny patří do skupiny přírodních látek, které mají mnoho biologických aktivit, z nichž nejvýznamnější je selektivní aktivita proti nádorovým onemocněním (Dzubak P., Hajduch M., Vydra D., Hustova Biedermann D., Markova L., Urban M., Sarek J. Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 394-411). Mechanismus účinku u triterpenů je již studován řadu let a bylo objeveno několik způsobů, kterým triterpeny inhibují růst rakovinných buněk, případně způsobují selektivně jejich smrt, velmi studovaná je např. inhibice proteasomu (K. Quian, S.-Y. Kim, H.-Y. Hung, L. Huang, C.-H. Chen, K.-H. Lee: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 5944). V roce 2010 byla popsána u kyseliny betulinové, jednoho z významných triterpenů, inhibiční aktivita proti signální dráze Hh u rhabdomyosarkomu (M. Eichenmuller et al., Br. J. Cancer 2010, 103, 43), avšak u této sloučeniny není tento účinek dostatečně vysoký, aby byl využitelný v potenciální léčbě nádorových onemocnění. Předkládaný vynález se týká nových molekul modifikovaných triterpenů, které Hh dráhu inhibují výrazně více a jsou tak využitelné pro budoucí léčbu nádorových onemocnění.
Přibližně 25 % všech lidských nádorů vyžaduje Hh signalizaci pro zachování proliferační aktivity. V několika typech lidských nádorů, jako je např. bazocelulární karcinom (BCC), glioblastom nebo meduloblastom je Hh signalizace konstitutivně aktivovaná v důsledku přítomnosti mutací v klíčových proteinech Hh signální dráhy PTCH a SMO, což vede ke Gli zprostředkované transkripční aktivaci a progresi nádoru. U dalších typů nádorů závislých na Hh signalizaci jako je nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC) nebo nádor prostaty bylo popsáno, že některé buněčné linie odvozené od těchto nádorů vykazují hyperaktivovaný Hh signaling, který jim přináší agresivní růstové vlastnosti vedoucí k jejich omezené citlivosti vůči známým Hh antagonistům. Bylo zjištěno, že hlavní příčinou hyperaktivované Hh signalizace spojované se zvýšenou tumorigenicitou je overexprese klíčového transkripčního faktoru Gli-1.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nové generace terpenoidních derivátů, které vykazují silnou a selektivní cytotoxickou a protinádorovou aktivitu u nádorových buněk a tkání závislých na aktivaci signální dráhy Shh. Triterpenové deriváty podle tohoto vynálezu vykazují silné cytotoxické a protinádorové účinky u buněčných linií s overexprimovaným Gli1 transkripčním faktorem (A549, DU145), kde selhávají běžně klinicky používané Hh inhibitory. Tyto triterpenové deriváty velmi významně redukují expresi Gli1 na úrovni proteinu u obou výše zmíněných linií a v důsledku toho také expresi Gli1 transkripčních cílů klíčových pro přežití (Bcl2) a proliferaci (Cyklin D1, N-MYC) nádorových buněk. Zřetelný zásah do Hh signalizace byl prokázán rovněž použitím dvou různých reportérových liniích, kde tyto deriváty velmi výrazně inhibují Gli1 aktivaci.
Předmětem tohoto vynálezu jsou terpenoidní deriváty obecného vzorce I,
- 1 CZ 309885 B6
(I) ve kterém,
------je jednoduchá nebo dvojná vazba;
A, X, Y a Z jsou vzájemně nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří CH, C, N, NH, O, S; přičemž nejvýše jeden z A, X, Y, Z je O nebo S;
R1 je vybrán ze skupiny -CH2OH, -CH2O(CH2)nCH3, -CH2OC(O)(CH2)nCH3, -COOH, -COO(CH2)nCH3 a -COO(CH2)Ph, -COOCH2OC(O)CH3, kde nezávisle n = 0 až 5;
a jejich farmaceuticky přijatelné soli.
V případě, že je v molekule enantiomerní uhlík, zahrnuje tento vynález také racemáty a také opticky aktivní izomery a jejich směsi.
Ve zvláště výhodných provedeních je R1 -CH2OH, -CH2OC(O)CH3, -COOH, -COOCH3, -COO(CH2)Ph, -COOCH2OC(O)CH3.
V některých výhodných provedeních je jeden z A, X, Y, Z heteroatom, tedy N, O, S nebo NH; a ostatní tři substituenty jsou CH.
V dalších výhodných provedeních jsou dva z A, X, Y, Z heteroatom, tedy N, O, S nebo NH (přičemž nejvýše jeden z nich je O nebo S); a zbývající dva substituenty jsou CH.
V jiných výhodných provedeních jsou tři z A, X, Y, Z heteroatom, tedy N, O, S nebo NH (přičemž nejvýše jeden z nich je O nebo S); a zbývající substituent je CH.
Nej výhodněji tvoří aromatický kruh obsahující A, X, Y, Z ve vzorci I strukturu tetrazolu, triazolu, thiadiazolu, oxadiazolu, imidazolu, pyrrazolu, thiazolu, isothiazolu, oxazolu, isoxazolu, pyrrolu, thiofenu, furanu.
V textu zkratka „Ph“ znamená fenyl, a zkratka „Bn“ znamená benzyl.
Zejména výhodnými sloučeninami jsou sloučeniny vybrané ze skupiny: 2-(tetrazol-5-yl)-3oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(l,2,3-triazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(l,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(l,2,3-oxadiazol-4yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(l,2,3-oxadiazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien28-ová kyselina; 2-(l,2,5-oxadiazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(1,3,4oxadiazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(1,2,3-thiadiazol-4-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(l,2,3-thiadiazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(l,2,5-thiadiazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(l,3,4-thiadiazol2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(imidazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28ová kyselina; 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-4-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(oxazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien
-2CZ 309885 B6
28-ová kyselina; 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-3-yl)-3oxolupa- 1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-4-yl)-3-oxolupa- 1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-2-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-ová kyselina; 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(furan-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(tetrazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,3triazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,3-oxadiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,3-oxadiazol-5-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,3,4-oxadiazol2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,3-thiadiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2(1,2,3-thiadiazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,5-thiadiazol-3-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(imidazol-2-yl)3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrazol-3yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiazol-2yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiazol-5yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2(isothiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28ol; 2-(oxazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28ol; 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28ol; 2-(isoxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-ol; 2-(pyrrol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-ol; 2-(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-ol; 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(furan-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28ol; Methyl 2-(tetrazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(1,2,3-triazol-4-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(1,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(imidazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(pyrrazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-oát; Methyl 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(thiazol-5-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(isothiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(oxazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(oxazol4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(isoxazol-4-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2(pyrrol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-oát; Methyl 2-(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(thiofen-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Methyl 2(furan-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(tetrazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-oát; Benzyl 2-(1,2,3-triazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát;
Benzyl 2-(1,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(imidazol-2-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(pyrrazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-oát; Benzyl 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(thiazol-4-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(thiazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(isothiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-oát; Benzyl 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(oxazol-2-yl)3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-oát; Benzyl 2-(isoxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(isoxazol-5-yl)3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(pyrrol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-oát; Benzyl 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa
- 3 CZ 309885 B6
1,20(29)-dien-28-oát; Benzyl 2-(furan-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát; 2-(tetrazol-5-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(1,2,3-triazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(1,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(imidazol-2-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(pyrrazol-3yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-yl acetát; 2-(thiazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(isothiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2(isothiazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(oxazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien28-yl acetát; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(isoxazol-4yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(pyrrol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28yl acetát; 2-(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(furan-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-yl acetát; 2-(tetrazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(1,2,3triazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(1,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(imidazol-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(pyrrazol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(thiazol-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(thiazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(isothiazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(oxazol-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(oxazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(isoxazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(pyrrol-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(thiofen-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2(furan-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(furan-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina.
Rozumí se, že jednotlivé výhodné sloučeniny jsou zde zahrnuty i ve formě farmaceuticky přijatelných solí.
Farmaceuticky přijatelnými solemi jsou zejména soli s alkalickými kovy, amoniem nebo aminy, nebo adiční soli s kyselinami.
V případě, že je v molekule enantiomerní uhlík, zahrnuje tento vynález také racemáty a opticky aktivní izomery a jejich směsi.
Nejvýhodnějšími sloučeninami podle vynálezu jsou terpenoidní deriváty vybrané ze skupiny zahrnující: 2-(tetrazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(1,2,3-triazol-4-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(1,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(imidazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(imidazol-4-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(thiazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isothiazol5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(oxazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(isoxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(furan-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2
- 4 CZ 309885 B6 (tetrazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,3-triazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28ol; 2-(1,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(imidazol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-ol; 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrazol-3-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiazol-5-yl)-3-oxolupa1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isothiazol-4-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(oxazol-2-yl)3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(oxazol-5-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isoxazol-4-yl)3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrol-2-yl)3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiofen-2-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(furan-2-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(furan-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(tetrazol-5-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(1,2,3-triazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(1,2,4-triazol-3yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(imidazol-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(imidazol-4yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-4-yl)3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiazol-4-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-3-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-5-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(oxazol-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(oxazol-4-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-3-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-5-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-3-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiofen-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiofen-3-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(furan-2-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(furan-3-yl)-3-oxolupan28-ová kyselina.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mají širokou škálu biologických aktivit, zejména selektivně zabíjejí nádorové buňky s aktivovanou Shh signální dráhou, jsou zvláště užitečné ve farmaceutických aplikacích použitelných k léčbě nádorových onemocnění a odpovídají spektru účinků požadovaného od látek určených k takové léčbě.
Předkládaný vynález tedy poskytuje sloučeniny podle vynálezu pro použití jako léčiva.
Vynález s výhodou poskytuje sloučeniny obecného vzorce I pro použití při léčbě nádorových onemocnění, zejména vybraných z nemalobuněčného karcinomu plic, nádoru prostaty, bazocelulárního karcinomu, glioblastomu a meduloblastomu.
Předkládaný vynález dále poskytuje farmaceutické přípravky obsahující jednu nebo více sloučenin obecného vzorce I společně s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem.
Farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují zejména rozpouštědla, plniva, pojiva, desintegranty, lubrikanty, povrchově aktivní látky, emulgátory, suspenzní činidla, a/nebo konzervanty.
Farmaceutické přípravky
Vhodné cesty pro systémovou aplikaci jsou orální, inhalační, injekční (intravazální, intramuskulární, subkutánní), bukální, sublingualní a nasální. Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta a místě onemocnění, kromě ostatních ohledů známých klinikovi.
Farmaceutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou
- 5 CZ 309885 B6 např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.
Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.
Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je manitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují pomocné látky, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspenze mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, dextran, polyvinylpyrolidon nebo želatinu.
Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely.
Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.
Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství, které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,01 až 1 g, s výhodou 0,1 až 0,5 g.
Objasnění výkresů
Obrázek 1. Účinek sloučenin 6 (A), 7 (B) a pozitivní kontroly GANT-61 (C) na Gli1 aktivaci a buněčnou viabilitu měřený na reportérové linii U87MG-Gli-FLuc -příklad 9. Data jsou vyjádřena jako procenta kontroly (100 %) a představují průměr ze tří nezávislých experimentů se znázorněnou směrodatnou odchylkou.
Obrázek 2. Účinek sloučenin 6 a 7 na expresi Glil transkripčního faktoru a jeho transkripčních cílů v buňkách A549 (A) a DU145 (B) - příklad 11. Protilátka proti GAPDH byla použita jako vnitřní kontrola naneseného množství vzorků.
Příklady uskutečnění vynálezu
Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu bez omezení jeho rozsahu. Pokud není uvedeno jinak, všechna procenta a podobná množství jsou vztažena na hmotnost. Výchozí materiály lze získat z komerčních zdrojů (Sigma, Aldrich, Fluka atd.) nebo je lze připravit níže popsaným způsobem.
Teploty tání byly stanoveny buď pomocí bodotávku Buchi B-545 nebo přístroje STUART SMP30. Infračervená spektra byla měřena na stroji Nicolet Avatar 370 FTIR a zpracována pomocí OMNIC 9.8.372. DRIFT znamená Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform. Ή a 13C experimenty byly měřeny na stroji Jeol ECX-500SS (500 MHz for Ή) a VarianUNITY Inova
- 6 CZ 309885 B6
400 (400 MHz for Ή) s využitím CDCh, deuterovaného dimethylsulfoxidu DMSO-de, CD3OD nebo deuterovaného tetrahydrofuranu THF-ds jako rozpouštědel (teplota při měření byla 25 °C). Chemické posuny (δ) byly referencovány vůči signálům zbytkových rozpouštědel (CDCh, DMSO-de, CD3OD or THF-ds) a jsou reportovány v ppm. Interakční konstanty (J) jsou reportovány v jednotkách Hertz (Hz). NMR spektra byla interpretována pomocí programů ACD/NMR Processor Academie Edition 12.01, MestReNova 6.0.2-5475 nebo JEOL Delta v5.0.5.1. HRMS byly provedeny na přístroji “LC-MS Orbitrap Elite high-resolution mass spectrometer with electrospray ionization (Dionex Ultimate 3000, Thermo Exactive plus, MA, USA).” Spektra byla zaznamenána jak v pozitivním tak negativním módu a v rozsahu 100 až 1000 m/z. Vzorky byly rozpuštěny v MeOH (methanolu) a injektovány do hmotnostního spektrometru prostřednictvím autosampleru připojenému k výstupu z HPLC: předkolona Phenomenex Gemini (C18, 50 x 2 mm, 2,6 pm), isokratická mobilní fáze MeOH/voda/HCOOH 95:5:0.1. Průběh reakcí byl monitorováni pomocí tenkovrstvé chromatografie (TLC) na deskách Kieselgel 60 F254 (Merck) s detekcí pomocí UV záření (254 nm) a následně postříkáním 10% vodným roztokem H2SO4 a zahřátím na 150 °C až 200 °C. Standardní čištění bylo prováděno pomocí kolonové chromatografie na silikagelu 60 (Merck 7734).
Syntéza vybraných sloučenin obecného vzorce I
Některé chráněné molekuly je možno získat podle reakčního schémata:
Výchozí trifiátv 1
Příklad 1 Výchozí trifláty 1 byly získány z komerčně dostupných triterpenických diosfenolů reakcí s Tf2NPh (N-fenyl-bis(trifluoromethansulfonimid); 2 ekvivalenty), DMAP (dimethylaminopyridin; 0,1 ekvivalentu) a TEA (triethylamin; 3 ekvivalenty) po dobu 2 h za laboratorní teploty v dichlormethanu pod inertní atmosférou. Výtěžky po chromatografií na silikagelu se pohybovaly mezi 80 a 90 %.
Obecný postup A: Postup probíhá v prostředí bez přístupu vzduchu. Kulatá baňka vybavená magnetickým míchadlem a šeptem byla nechána promývat proudem dusíku po dobu 10 minut. Výchozí sloučeniny a činidla byly rozpuštěny a přidány do vychlazené baňky v tomto pořadí: triflát 1 (1 ekvivalent) v 1,4-dioxanu, boronová kyselina (2 ekvivalenty) v 2-propanolu a dále bezvodý uhličitan draselný (2 ekvivalenty) ve vodě. Poté byl přidán katalyzátor - PdC12(PPh3)2 (2 molární %). Baňka byla připojena na zpětný chladič a reakční směs byla zahřívána k varu (85 °C), stále pod dusíkem. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC odebíraných vzorků (mobilní fáze Toluen/Ether 10:1) a obvyklá doba reakce byla mezi 2 až 16 h. Po skončení reakce byla směs nalita do dělicí nálevky s vodným roztokem NH4CI, extrahována do ethyl acetáta, promyta solankou a vodou do neutrálního pH. Spojené organické fáze byly vysušeny bezvodým MgSO4 a rozpouštědla odpařeny. Surový produkt byl chromatografován na sloupci silikagelu (mobilní fáze viz jednotlivé příklady).
Příklad 2: Benzyl 2-(fůran-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-oát (Sloučenina 2)
Do reakce byl předložen benzyl 2-trifluoromethansulfono-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (200 mg; 0,289 mmol) a 2-furanylboronová kyselina, které byly nechány reagovat podle obecného postupu A. Bylo získáno 98 mg (56 %) sloučeniny 2 jako pevná bílá látka; sumární vzorec: C41H52O4; IČ (DRIFT): 2939,26, 2862,04, 1728,52 (C=O), 1677,47 (C=C), 1134,20 (CO), 740,01; 1H NMR (500 MHz, CDCb): δ 7,48 (s, 1H, H-1), 7,39 - 7,29 (m, 6H, furan-2-yl, Ph), 6,81 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 6,39 (dd, J = 3,3, 1,8 Hz, 1H, furan-2-yl), 5,16 (d, J = 12,3 Hz, 1H, PhCH2-a), 5,10 (d, J = 12,3 Hz, 1H, Ph-CH2-b), 4,75 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H29-a), 4,62 (dd, J = 2,1, 1,4 Hz, 1H, H-29-b), 3,04 (td, J = 10,9, 4,8 Hz, 1H, H-19), 1,69 (s, 3H, CH3 skupina H-30), 1,16 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 1,04 (s, 3H), 0,96 (s, 3H), 0,84 (s, 3H, 5 x CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): δ 202,69, 175,90, 152,47, 150,57, 149,53, 141,31, 136,62, 128,66, 128,46, 128,26, 125,95, 111,71, 109,92, 109,53, 65,95, 56,68, 52,55, 49,52, 47,06, 45,47, 45,02, 42,87, 41,73, 38,93, 38,65, 37,09, 33,74, 32,24, 30,71, 29,64, 28,86, 25,82, 21,74, 21,66, 19,53, 16,38, 14,71; HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C41H53O4 [M+H]+ 609,3938, nalezeno 609,3942.
Příklad 3: Benzyl 2-(furan-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (Sloučenina 3)
Do reakce byl předložen Benzyl 2-trifluoromethansulfono-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (200 mg; 0,289 mmol) a 3-furanylboronová kyselina, které byly nechány reagovat podle obecného postupu A. Bylo získáno 143 mg (81 %) sloučeniny 3 jako pevná bílá látka; sumární vzorec: C41H52O4; IČ (DRIFT): 2941,99, 2867,88, 1722,84 (C=O), 1671,70 (C=C), 1148,70, 1125,00 (C-O); 1H NMR (500 MHz, CDCb): δ 7,95 (m, 1H, furan-3-yl), 7,40 - 7,30 (m, 6H, Ph + furan-3-yl), 7,17 (s, 1H, H-1), 6,50 (dd, J = 1,8, 0,7 Hz, 1H, furan-3-yl), 5,17 (d, J = 12,3 Hz, 1H, PhCH2-a), 5,11 (d, J = 12,3 Hz, 1H, PhCH2-b), 4,76 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H29-a), 4,64 (dd, J = 2,1, 1,4 Hz, 1H, H29-b), 3,05 (td, J = 10,9, 4,7 Hz, 1H, H-19), 1,71 (s, 3H, CH3 skupina H-30), 1,17 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 1,04 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,85 (s, 3H, 5 x CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): δ 204,15, 175,89, 153,55, 150,64, 142,47, 141,75, 136,61, 128,66, 128,45, 128,27, 127,53, 120,80, 109,87, 108,17, 65,96, 56,68, 52,64, 49,51, 47,04, 45,33, 45,00, 42,87, 41,71, 39,10, 38,61, 37,08, 33,75, 32,22, 30,73, 29,63, 28,91, 25,81, 21,70, 19,62, 19,57, 19,50, 16,37, 14,73; HRMS (ESI): m/z vypočítáno C41H53O4 [M+H]+ 609,3938, found 609,3944.
Příklad 4: Benzyl 2-(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (Sloučenina 4)
Do reakce byl předložen Benzyl 2-trifluoromethansulfono-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (200 mg; 0,289 mmol) a 2-thiofenylboronová kyselina, které byly nechány reagovat podle obecného postupu A. Bylo získáno 106 mg (59 %) sloučeniny 4 jako pevná bílá látka; sumární vzorec: C41H52O3S; IČ (DRIFT): 2943,36, 2868,13, 1723,21 (C=O), 1670,85 (C=C), 1170,98, 1148,99, 1124,82, 696,02; 1H NMR (500 MHz, CDCb): δ 7,40 - 7,32 (m, 5H, Ph), 7,31 (s, 1H, H-1), 7,27 - 7,24 (m, 2H), 6,98 (dd, J = 5,1, 3,7 Hz, 1H, thiphen-2-yl), 5,17 (d, J = 12,3 Hz, 1H, PhCH2-a), 5,11 (d, J = 12,3 Hz, 1H, PhCH2-b), 4,76 (d, J = 1,7 Hz, 1H, H29-a), 4,64 (d, J = 1,3 Hz, 1H, H29-b), 1,71 (s, 3H, CH3 skupina H-30), 1,19 (s, 3H), 1,14 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,85 (s, 3H, 5 x CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCb): δ 203,51, 175,89, 153,86, 150,59, 138,41, 136,61, 129,55, 128,66, 128,46, 128,27, 126,75, 125,80, 124,93, 109,89, 65,96, 56,68, 52,57, 49,49, 47,04, 45,40, 44,92, 42,87, 41,73, 39,38, 38,61, 37,07, 33,68, 32,22, 30,72, 29,63, 28,95, 25,80, 21,73, 21,61, 19,57, 19,51, 19,46, 16,36, 14,73; HRMS (ESI): m/z vypočteno pro C41H53O3S [M+H]+ 625,3710, nalezeno 625,3715.
Příklad 5: Benzyl 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (Sloučenina 5)
- 8 CZ 309885 B6
Do reakce byl předložen Benzyl 2-trifluoromethansulfono-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (200 mg; 0,289 mmol) a 3-thiofenylboronová kyselina, které byly nechány reagovat podle obecného postupu A. Bylo získáno 126 mg (70 %) sloučeniny 5 jako pevná bílá látka; sumární vzorec: C41H52O3S; IČ (DRIFT): 2940,17, 2865,96, 1725,73 (C=O), 1673,13 (C=C), 1143,02, 751,62, 657,08; 1H NMR (500 MHz, CDCb): δ 7,55 (dd, J = 3,0, 1,2 Hz, 1H, thiophen-3-yl), 7,40 - 7,30 (m, 5H, Ph), 7,26 - 7,24 (m, 1H, thiophen-3-yl), 7,24 (s, 1H, H-1), 7,18 (dd, J = 5,1, 1,3 Hz, 1H, thiophene-3-yl), 5,17 (d, J = 12,3 Hz, 1H, PhCH2-a), 5,11 (d, J = 12,3 Hz, 1H, PhCH2-b), 4,75 (d, J = 1,9 Hz, 1H, H-29a), 4,64 - 4,61 (m, 1H, H-29b), 3,05 (td, J = 10,9, 4,8 Hz, 1H, H-19), 1,70 (s, 3H, CH3 skupina H-30), 1,18 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,05 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,85 (s, 3H, 5 x CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCh): δ 204,54, 175,89, 154,69, 150,58, 137,17, 136,61, 130,77, 128,66, 128,45, 128,27, 126,89, 124,97, 123,07, 109,89, 65,95, 56,68, 52,67, 49,50, 47,04, 45,55, 45,04, 42,85, 41,69, 39,11, 38,64, 37,08, 33,72, 32,23, 30,71, 29,63, 28,97, 25,83, 21,79, 21,57, 19,60, 19,55, 19,46, 16,35, 14,71; HRMS (ESI): m/z vypočteno pro C41H53O3S [M+H]+625,3710, nalezeno 625,3703.
Příklad 6: 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina (Sloučenina 6)
Benzyl 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (sloučenina 2) (86 mg; 0,141 mmol) byla rozpuštěna v suchém dichlormethanu (2,0 ml). Poté byl přidán TBDMSH (t-butyldimethylsilyl hydrid; 94 μl; 0,564 mmol), triethylamin (63 μL; 0,451 mmol) a Pd(OAc)2 (15,8 mg; 0,071 mmol). Po 24 h byly přidány další dva ekvivalenty TBDMSH a 1,6 ekvivalentů triethylaminu a po dalších 24 h byla reakce ukončena. Reakční směs byla zpravována nalitím do vody, extrakcí do EtOAc, organické podíly byly spojeny a vysušeny bezvodým MgSO4 a surový meziprodukt byl rozpuštěn 1,4-dioxanu (3 ml) s přídavkem 1M roztoku TBAF v THF (40 μl). Po dalších 2 h byla směs znovu zpracována stejným způsobem a produkt byl chromatografován na silikagelu (mobilní fáze Hex/EtOAc 2:1 + 1 % THF + 0,5 % CH3COOH). Bylo získáno 24 mg (33 %) sloučeniny 6; sumární vzorec C34H46O4; IČ (DRIFT): 2939,79, 1690,47, 1453,50, 1398,55, 884,65, 815,50, 730,19; 1H NMR (500 MHz, CDCb): δ 7,50 (s, 1H, H-1), 7,32 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,40 (dd, J = 3,3, 1,8 Hz, 1H, furan-2-yl), 4,78 (d, J = 1,7 Hz, 1H, H-29a), 4,65 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-29b), 3,04 (td, J = 10,7, 4,8 Hz, 1H, H-19), 1,72 (s, 3H, CH3 skupina H-30), 1,17 (s, 3H), 1,14 (s, 3H), 1,08 (s, 3H), 1,05 (s, 3H), 1,01 (s, 3H, 5 x CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCla): δ 202,66, 181,53, 152,32, 150,36, 149,50, 141,33, 126,01, 111,74, 110,08, 109,59, 56,52, 52,54, 49,33, 47,04, 45,48, 44,99, 42,92, 41,78, 38,95, 38,90, 37,21, 33,76, 32,27, 30,69, 29,85, 29,79, 28,87, 25,77, 21,73, 21,65, 19,56, 19,53, 16,56, 14,76; HRMS (ESI): m/z vypočteno pro C34H47O4 [M+H]+ 519,3469, nalezeno 519,3470.
Příklad 7: 2-(furan-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina (Sloučenina 7)
Benzyl 2-(furan-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-oát (sloučenina 3) (64 mg; 0,105 mmol) byla rozpuštěna v suchém dichlormethanu (2,0 ml). Poté byl přidán t-butyldimethylsilyl hydrid (70 μl; 0,42 mmol), triethylamin (47 μL; 0,336 mmol) a Pd(OAc)2 (11,8 mg; 0,0525 mmol). Po 24 h byly přidány další dva ekvivalenty TBDMSH a 1,6 ekvivalentů triethylaminu a po dalších 24 h byla reakce ukončena. Reakční směs byla zpracována nalitím do vody, extrakcí do EtOAc, organické podíly byly spojeny a vysušeny bezvodým MgSO4 a surový meziprodukt byl rozpuštěn 1,4dioxanu (3 ml) s přídavkem 1M roztoku TBAF v THF (40 μl). Po dalších 2 h byla směs znovu zpracována stejným způsobem a produkt byl chromatografován na silikagelu (mobilní fáze Hex/EtOAc 2:1 + 1 % THF + 0,5 % CH3COOH). Bylo získáno 29 mg (53 %) sloučeniny 7; sumární vzorec C34H46O4; IČ (DRIFT): 2932,04, 2868,91, 1689,79, 1673,68, 1450,85, 1188,19, 883,67, 796,52, 754,01; 1H NMR (500 MHz, CDCh): δ 7,97 - 7,95 (m, 1H), 7,37 (t, J = 1,7 Hz, 1H, furan-3-yl), 7,18 (s, 1H, H-1), 6,51 (dd, J = 1,9, 0,7 Hz, 1H, furan-3-yl), 4,78 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-29a), 4,66 (dd, J = 2,0, 1,4 Hz, 1H, H-29b), 3,04 (td, J = 10,8, 4,8 Hz, 1H, H-19), 1,73 (s,
- 9 CZ 309885 B6
3H, CH3 skupina H-30), 1,17 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,07 (s, 3H), 1,04 (s, 3H), 1,02 (s, 3H, 5 x CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCb): δ 204,12, 180,74, 153,42, 150,43, 142,49, 141,79, 127,61, 120,78, 110,03, 108,17, 56,47, 52,64, 49,31, 47,01, 45,34, 44,97, 42,93, 41,76, 39,13, 38,83, 37,19, 33,78, 32,25, 30,69, 29,85, 29,78, 28,92, 25,77, 21,68, 19,65, 19,56, 19,49, 16,56, 14,77; HRMS (ESI): m/z vypočteno C34H47O4 [M+H]+ 519,3469, nalezeno 519,3475.
Tabulka 1. Připravené lupanové deriváty vzorce I, kde ------jsou dvojné vazby (Ac = acetyl)
Substituenty CHN analýza MS analýza
Sloučenina A X Y Z R1 [%C, %H, %N] [vypočteno/nalezeno] [M+H]+
8 N NH N N COOH 71,51/71,26, 8,52/8,37, 10,76/10,71 521
9 NH N N CH COOH 73,95/74,11, 8,73/8,81, 8,09/8,01 520
10 N N CH N COOH 73,95/73,88, 8,73/8,70, 8,09/8,24 520
11 O N N CH COOH 73,81/73,79, 8,52/8,47, 5,38/5,47 521
12 S N N CH COOH 71,60/71,54, 8,26/8,29, 5,22/5,21 537
13 NH N CH CH COOH 76,41/76,54, 8,94/9,07, 5,40/5,51 519
14 CH NH N CH COOH 76,41/76,55, 8,94/9,18, 5,40/5,50 519
15 N CH NH CH COOH 76,41/76,57, 8,94/9,17, 5,40/5,32 519
16 S CH CH N COOH 73,98/73,87, 8,47/8,51, 2,61/2,54 536
17 CH S CH N COOH 73,98/74,09, 8,47/8,39, 2,61/2,61 536
18 O CH N CH COOH 76,26/76,15, 8,73/8,84, 2,70/2,80 520
19 CH O CH N COOH 76,26/76,14, 8,73/8,49, 2,70/2,69 520
20 NH CH CH CH COOH 78,87/78,89, 9,15/9,02, 2,71/2,90 518
21 CH NH CH CH COOH 78,87/78,79, 9,15/9,22, 2,71/2,60 518
22 S CH CH CH COOH 76,36/76,45, 8,67/8,59 535
23 CH S CH CH COOH 76,36/76,27, 8,67/8,66 535
24 N NH N N CH2OH 73,48/73,12, 9,15/9,41, 11,06/10,94 507
25 N N CH NH CH2OH 76,00/76,01, 9,37/9,28, 8,31/8,20 506
26 O N N CH CH2OH 75,85/75,77, 9,15/9,16, 5,53/5,48 507
27 S N N CH CH2OH 73,52/73,65, 8,87/8,78, 5,36/5,39 523
28 N NH CH CH CH2OH 78,53/78,69, 9,59/9,63, 5,55/5,55 505
29 CH NH N CH CH2OH 78,53/78,47, 9,59/9,40, 5,55/5,49 505
30 N CH NH CH CH2OH 78,53/78,54, 9,59/9,27, 5,55/5,31 505
31 S CH CH N CH2OH 75,96/75,99, 9,08/9,08, 2,68/2,55 522
32 CH S CH N CH2OH 75,96/75,90, 9,08/9,18, 2,68/2,57 522
33 O CH N CH CH2OH 78,37/78,45, 9,37/9,29, 2,77/2,69 506
34 CH O CH N CH2OH 78,37/78,44, 9,37/9,47, 2,77/2,74 506
35 NH CH CH CH CH2OH 81,06/80,94, 9,80/9,78, 2,78/2,82 504
36 CH NH CH CH CH2OH 81,06/80,90, 9,80/9,79, 2,78/2,69 504
37 S CH CH CH CH2OH 78,41/78,37, 9,29/9,31 520
38 CH S CH CH CH2OH 78,41/78,50, 9,29/9,33 520
39 N NH N N COOBn 74,72/74,91, 8,25/8,07, 9,17/9,10 611
- 10 CZ 309885 B6
Substituenty CHN analýza MS analýza
Sloučenina A X Y Z R1 [%C, %H, %N] [vypočteno/nalezeno] [M+H]+
40 NH N N CH COOBn 76,81/76,94, 8,43/8,51, 6,89/6,78 610
41 NH N CH CH COOBn 78,91/78,92, 8,61/8,54, 4,60/4,55 609
42 CH NH N CH COOBn 78,91/78,87, 8,61/8,63, 4,60/4,52 609
43 N CH NH CH COOBn 78,91/78,90, 8,61/8,71, 4,60/4,71 609
44 S CH CH N COOBn 76,76/76,79, 8,21/8,07, 2,24/2,26 626
45 CH S CH N COOBn 76,76/76,69, 8,21/8,29, 2,24/2,04 626
46 O CH N CH COOBn 78,78/78,90, 8,43/8,51, 2,30/2,25 610
47 CH O CH N COOBn 78,78/78,93, 8,43/8,40, 2,30/2,26 610
48 NH CH CH CH COOBn 81,01/81,13, 8,79/8,59, 2,30/2,27 608
49 CH NH CH CH COOBn 81,01/79,87, 8,79/8,90, 2,30/2,38 608
50 S CH CH CH COOBn 78,80/78,64, 8,39/8,27 625
51 CH S CH CH COOBn 78,80/78,94, 8,39/8,40 625
52 N NH N N CH2OAC 72,23/72,34, 8,82/8,96, 10,21/10,33 549
53 NH N N CH CH2OAC 74,55/74,42, 9,02/8,98, 7,67/7,57 548
54 N CH NH CH CH2OAC 76,88/76,79, 9,22/9,11, 5,12/5,14 547
55 O CH N CH CH2OAC 76,74/76,65, 9,02/8,80, 2,56/2,64 548
56 S CH N CH CH2OAC 74,56/74,68, 8,76/8,84, 2,48/2,51 564
57 NH CH CH CH CH2OAC 79,22/79,07, 9,42/9,50, 2,57/2,63 546
58 CH NH CH CH CH2OAC 79,22/79,31, 9,42/9,37, 2,57/2,48 546
59 CH S CH CH CH2OAC 76,82/76,68, 8,95/8,76 563
Tabulka 2. Připravené lupanové deriváty vzorce I, kde------jsou jednoduché vazby (Ac = acetyl)
Substituenty CHN analýza MS analýza
Sloučenina A X Y Z R1 [%C, %H, %N] [vypočteno/nalezeno] [M+H]+
60 N NH N N COOH 70,96/71,13, 9,22/9,27, 10,68/10,54 525
61 N NH N CH COOH 73,38/73,24, 9,43/9,37, 8,02/7,89 524
62 N N CH NH COOH 73,38/73,22, 9,43/9,50, 8,02/8,15 524
63 NH N CH CH COOH 75,82/75,77, 9,64/9,54, 5,36/5,41 523
64 CH N NH CH COOH 75,82/75,87, 9,64/9,50, 5,36/5,38 523
65 N CH NH CH COOH 75,82/75,76, 9,64/9,84, 5,36/5,27 523
66 S CH CH N COOH 73,43/73,39, 9,15/9,07, 2,59/2,38 540
67 CH S CH N COOH 73,43/73,40, 9,15/9,02, 2,59/2,45 540
68 O CH N CH COOH 75,68/75,57, 9,43/9,51, 2,67/2,75 524
69 CH O CH N COOH 75,68/75,74, 9,43/9,36, 2,67/2,77 524
70 NH CH CH CH COOH 78,26/78,17, 9,85/9,91, 2,68/2,75 522
71 CH NH CH CH COOH 78,26/78,12, 9,85/9,74, 2,68/2,63 522
72 S CH CH CH COOH 75,79/75,67,9,35/9,43 539
73 CH S CH CH COOH 75,79/75,70,9,35/9,28 539
- 11 CZ 309885 B6
Substituenty CHN analýza MS analýza
Sloučenina A X Y Z R1 [%C, %H, %N] [vypočteno/nalezeno] [M+H]+
74 O CH CH CH COOH 78,12/78,17, 9,64/9,59 523
75 CH O CH CH COOH 78,12/78,18, 9,64/9,74 523
76 N NH N N CH2OH 72,90/72,98, 9,87/9,93, 10,97/10,80 511
77 N NH CH N CH2OH 75,40/75,54, 10,08/9,99, 8,24/8,14 510
78 NH N CH CH CH2OH 77,90/77,84, 10,30/10,25, 5,51/5,44 509
79 N CH NH CH CH2OH 77,90/77,98, 10,30/10,13, 5,51/5,57 509
80 S CH CH N CH2OH 75,38/75,42, 9,78/9,81,2,66/2,71 526
81 CH S CH N CH2OH 75,38/75,60, 9,78/9,68,2,66/2,61 526
82 O CH N CH CH2OH 77,75/77,69, 10,08/9,97, 2,75/2,86 510
83 CH O CH N CH2OH 77,75/77,87, 10,08/10,15, 2,75/2,65 510
84 NH CH CH CH CH2OH 80,42/80,38, 10,52/10,43, 2,76/2,84 508
85 CH NH CH CH CH2OH 80,42/80,42, 10,52/10,57, 2,76/2,71 508
86 S CH CH CH CH2OH 77,81/77,74, 9,99/10,14, 6,10/6,24 525
87 CH S CH CH CH2OH 77,81/77,70, 9,99/9,87, 6,10/6,06 525
88 O CH CH CH CH2OH 80,26/80,17, 10,30/10,17 509
89 CH O CH CH CH2OH 80,26/80,33, 10,30/10,31 509
90 N NH N N COOBn 74,23/74,26, 8,85/8,79, 9,11/9,18 615
91 NH N N CH COOBn 76,31/76,31, 9,03/9,12, 6,85/6,78 614
92 NH N CH CH COOBn 78,39/78,19, 9,21/9,27, 4,57/4,62 613
93 N CH NH CH COOBn 78,39/78,19, 9,21/9,26, 4,57/4,51 613
94 CH S CH N COOBn 76,27/76,39, 8,80/8,78, 2,22/2,17 630
95 O CH N CH COOBn 78,26/78,38, 9,03/8,87, 2,28/2,13 614
96 CH O CH N COOBn 78,26/78,28, 9,03/8,99, 2,28/2,24 614
97 NH CH CH CH COOBn 80,48/80,39, 9,39/9,45, 2,29/2,17 612
98 CH NH CH CH COOBn 80,48/80,41, 9,39/9,34, 2,29/2,31 612
99 S CH CH CH COOBn 78,30/78,17, 8,97/8,79 629
100 CH S CH CH COOBn 78,30/78,42, 8,97/8,98 629
101 O CH CH CH COOBn 80,35/80,19, 9,21/9,16 613
102 CH O CH CH COOBn 80,35/80,26, 9,21/9,25 613
103 NH CH CH CH CH2OAC 78,64/78,55, 10,08/10,01, 2,55/2,71 550
104 CH S CH CH CH2OAC 76,28/76,31, 9,60/9,59 567
105 CH O CH CH CH2OAC 78,50/78,47, 9,88/9,71 551
Příklad 8: Cytotoxicita sloučenin 6 a 7 vůči buněčným liniím odvozeným od nádorů závislých na Hh signální dráze
Lidská buněčná linie DU145 odvozená od nádoru prostaty byla získána z ATCC (Americká sbírka ověřených buněčných kultur) a kultivována v RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) médiu doplněném o 10% (obj./obj.) fetální hovězí sérum (FBS). Lidské LNCaP buňky odvozené od nádoru prostaty byly získány z ATCC a kultivovány v RPMI 1640 médiu doplněném o 10% FBS. Lidská buněčná linie HOP-62 odvozená od nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC) byla získána z DSMZ (Německá sbírka mikroorganismů a ověřených buněčných kultur) a
- 12 CZ 309885 B6 kultivována v RPMI 1640 médiu doplněném o 10% FBS. Lidská buněčná linie NCI-H322 odvozená od nemalobuněčného karcinomu plic byla získána z ECACC (Evropská sbírka ověřených buněčných kultur) a kultivována v RPMI 1640 médiu doplněném o 10% FBS. Lidská buněčná linie NCI-H522 odvozená od nemalobuněčného karcinomu plic byla získána z ATCC a kultivována v RPMI 1640 médiu doplněném o 10% FBS. Lidská buněčná linie A549 odvozená od nádoru plic byla získána z ATCC a kultivována v Dulbekově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném o 10% FBS. Lidská buněčná linie DAOY odvozená od meduloblastomu byla získána z ATCC a kultivována v Eaglově minimálním základním médiu (EMEM) doplněném o 10% FBS. Lidská buněčná linie T98G odvozená od glioblastomu byla získána z ATCC a kultivována v EMEM médiu doplněném o 10% FBS, 1 mM pyruvát sodný a 1 mM směs neesenciálních aminokyselin. Všechny výše zmíněné linie byly kultivovány při 37 °C v atmosféře 5% CO2 s 95% vlhkostí v limitu pasáže do ATCC (DSMZ,ECACC) + 10. Pro zjištění cytotoxicity sloučenin byl použit standardní MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)2-(4-sulfophenyl)-2 H-tetrazolium) test založený na redukci tetrazoliové soli (MTS) mitochondriálními dehydrogenasami metabolicky aktivních buněk. Pro testování byly buňky vysety do 384-jamkové transparentní destičky s růstovým povrchem upraveným pro práci s tkáňovými kulturami v objemu 25 pl na jamku a koncentraci 15 000 buněk/ML (DU145, LNCaP, HOP-62, A549, DAOY, T98G) nebo 30 000 buněk/ML (NCI-H322, NCI-H522). Následující den byly buňky ovlivněny sloučeninami 6 nebo 7 v koncentračním rozmezí 50 až 0,0975 pM (faktor ředění 2) a kultivace v přítomnosti sloučenin probíhala 72 hodin. Pro každou linii byly vymezeny rovněž kontrolní jamky, kde byl přidán DMSO v koncentraci 0,1 % (obj./obj.). Po uplynutí 72 hodin bylo do každé jamky pipetováno 5 pl roztoku MTS/PMS (fenazin methosulfát) a inkubace probíhala dále po dobu 1 až 4 hodiny v závislosti na buněčné linii. Následně byla změřena absorbance při 490 nm na multifunkčním modulárním čtecím zařízení EnVision (PerkinElmer). Hodnota IC50 (střední inhibiční koncentrace) byla zjištěna pomocí programu Dotmatics.
Tabulka 3. Cytotoxicita sloučenin 6 a 7 vyjádřená hodnotami IC50 (pM) na buněčných líních odvozených od různých typů solidních tumorů závislých na Hh signální dráze. Hodnoty IC50 reprezentují průměrnou hodnotu ± SMODCH (směrodatná odchylka) ze tří nezávislých experimentů.
Buněčná linie / typ nádoru Sloučenina 6 Sloučenina 7
Prostata
DU145 7,9 ± 0,6 12,8 ± 0,9
LNCaP NA 18,8 ± 1,7
NSCLC
HOP-62 NA 17,0 ± 1,6
NCI-H322 NA 20,2 ± 2,3
NCI-H522 NA 21,1 ± 1,9
A549 12,1 12,1 ± 1,1
Meduloblastom
DAOY NA 23,5 ± 2,2
Glioblastom
T98G 12,5 ± 0,9 20,4 ± 1,9
aNA - nebylo měřeno
Příklad 9: Inhibiční účinek nových triterpenů na Gli1 zprostředkovanou transkripční aktivitu
Pro testování inhibiční aktivity na Gli1 zprostředkovanou transkripci byla připravena reportérová linie U87MG-Gli-FLuc odvozená od lidské glioblastomové linie U87MG získané z ATCC a kultivované v EMEM médiu doplněném o 10% FBS, 1 mM pyruvát sodný a 1 mM směs neesenciálních aminokyselin. Buňky U87MG byly transdukovány komerčním lentivektorem exprimujícím Gli1 responsivní luciferasu a následně kultivovány několik dní v přítomnosti
- 13 CZ 309885 B6 selekčního antibiotika puromycinu pro získání heterogenní populace buněk stabilní exprimující Gli1 responsivní luciferasu. Test byl proveden v 96-jamkové bílé neprůhledné mikrodestičce. U87MG-Gli-FLuc buňky byly přeneseny do Opti-MEM media s redukovaným obsahem 0,5 % (obj./obj.) FBS a vysety na panel v objemu 100 μ! suspenze na jamku a koncentraci 8x104/ML. Následující den byly do jamek přidány sloučeniny 6 a 7 v koncentračním rozmezí 12,5 až 0,78μΜ (faktor ředění 2) a kultivace probíhala dalších 24 hodin. Kontrolní buňky byly ovlivněny DMSO v koncentraci 0,1 % (obj./obj.) a jako pozitivní kontrola byl použit GANT-61, specifický inhibitor Gli1 a Gli2. Po uplynutí 24 hodin byly panely temperovány 30 minut na pokojovou teplotu a následně bylo do každé jamky přidáno 100 μl Britelite plus reagencie (PerkinElmer). Panely byly umístněny na třepačku pro dosažení kompletní buněčné lyze a po 3 minutách byla změřena luminescence na multifunkčním modulárním čtecím zařízení EnVision. Na obrázku 1 jsou sloupcovým grafem znázorněny hodnoty luminescence, korelující s mírou aktivace Gli1, přepočtené na procenta kontroly (hodnota 100). K odlišení specifické inhibice Gli1 aktivace od nespecifické buněčné odpovědi (inhibice proliferace/buněčná smrt) byl proveden simultálně za stejných podmínek MTS test v 96-jamkových transparentních panelech. Hodnoty absorbance přepočtené na procento kontroly (hodnota 100) jsou znázorněny na Obrázku 1 bodovým spojnicovým grafem. Z výsledků je patrné, že použitím koncentrací sloučenin 6 a 7 postačujících k inhibici Gli1 aktivace nedochází ke zřetelné inhibici proliferace nebo indukci buněčné smrti. Specifická inhibice Gli1 aktivace sloučeninami 6 a 7 tedy jednoznačně předchází inhibici proliferace nebo indukci buněčné smrti. Na buněčném a rovněž nebuněčném modelu byla také vyloučena možná přímá interakce sloučenin 6 a 7 se samotným reportérem (Fluc), která by mohla vést k falešně pozitivním výsledkům (není ukázáno).
Příklad 10: Inhibice endogenní Hh signalizace novými triterpeny
Pro účely dalšího prokázání účinku nových triterpenů na Hh signalizaci byla použita komerční reporterová linie Gli Reporter-NIH3T3 (BPS Bioscience), kultivovaná v DMEM médiu doplněném o 10% BCSS (telecí sérum s doplněným železem) a pod selekčním tlakem Geneticinu (500μg/ML) při 37°C v atmosféře 5% CO2 s 95% vlhkostí v limitu pasáže do BPS Bioscience + 4. Buněčná linie Gli Reporter-NIH3T3 exprimuje gen světluškové luciferasy (FLuc) pod kontrolou Gli responzivního elementu stabilně integrovaného do NIH3T3 buněk. Exprese FLuc koreluje s aktivací Hh signální dráhy. Linie je validována prostřednictvím odpovědi na stimulaci mSHH (myší Sonic Hedgehog) a účinku komerčně dostupných Hh inhibitorů (Cyklopamin). Test byl proveden v 384-jamkové bílé neprůhledné mikrodestičce. Gli Reporter-NIH3T3 buňky byly přeneseny do Opti-MEM média s redukovaným obsahem 0,5 % (obj./obj.) BCSS, doplněným o 1% roztok neesenciálních aminokyselin, 1mM pyruvát sodný a 10mM HEPES a vysety na panel v objemu 25 μl suspenze na jamku a koncentraci 2,5x105/ML. Následující den byly do jamek přidány sloučeniny 6 a 7v koncentračním rozmezí 16 až 0,25 μM (faktor ředění 2) a inkubace probíhala 2 hodiny. Poté byly do jamek přidány stimulátory mSHH v koncentraci 0,25 a 0,5 μg/ML a SAG (syntetický SMO agonista) v koncentraci 2 a 4 nM. Zahrnuty byly rovněž kontroly představující buňky ovlivněné DMSO v koncentraci 0,1 % (obj./obj.), dále buňky ovlivněné pouze samotnou sloučeninou 6 nebo 7 a rovněž buňky ovlivněné samotným stimulátorem mSHH nebo SAG. Inkubace buněk probíhala dalších 24 až 30 hodin od přidání mSHH/SAG. Následně byly panely temperovány 30 minut na pokojovou teplotu a poté bylo do každé jamky přidáno 25 μl Britelite plus reagencie. Panely byly umístněny na třepačku pro dosažení kompletní buněčné lyze a po 3 minutách byla změřena luminescence na multifunkčním modulárním čtecím zařízení EnVision. V tabulce 4 jsou uvedeny hodnoty IC50 pro inhibici mSHH nebo SAG indukované reportérové aktivity sloučeninami 6 a 7. Výsledky ukazují, že obě sloučeniny jsou účinné inhibitory Hh signalizace. Pro kalkulaci IC50 v programu Dotmatics byly použity pouze netoxické koncentrace sloučenin 6 a 7 na základě výsledků simultánně provedeného MTS testu (není ukázáno).
Tabulka 4. Inhibiční účinek sloučenin 6 a 7 na endogenní Hh signalizaci. Hodnoty IC50 (μM) reprezentují průměrnou hodnotu ± SMODCH (směrodatná odchylka) ze tří nezávislých experimentů. Hodnoty IC50 byly počítány z rozdílů naměřených hodnot luminiscencí u
- 14 CZ 309885 B6 mSHH/SAG stimulovaných a nestimulovaných buněk v přítomnosti sloučenin 6 a 7. Rozdíl hodnot luminiscence u mSHH/SAG stimulovaných a nestimulovaných buněk v nepřítomnosti sloučenin 6 a 7 byl nastaven jako 100 %.
mSHH (μg/ML) stimulace SAG (nM) stimulace
0,25 0,5 2 4
Sloučenina 6 3,5±0,5 1,9±0,2 4,5±0,6 3,8±0,4
Sloučenina 7 3,2±0,3 2,4±0,3 3,5±0,2 4,1±0,4
Příklad 11: Inhibiční účinek nových triterpenů na expresi Glil a Glil-transkripčních cílů
Lidská buněčná linie A549 odvozená od nádoru plic byla získána z ATCC a kultivována v DMEM médiu doplněném o 10% FBS při 37 °C v atmosféře 5% CO2 s 95% vlhkostí v limitu pasáže do ATCC + 10. Lidská buněčná linie DU145 odvozená od nádoru prostaty byla získána z ATCC a kultivována v RPMI 1640 médiu doplněném o 10% FBS při 37 °C v atmosféře 5% CO2 s 95% vlhkostí v limitu pasáže do ATCC + 10. Buňky A549 a DU145 byly vysety do kultivačních lahví o růstové ploše 75 cm2 v objemu 25 ml buněčné suspenze o hustotě 7x104 buněk na mililitr. Následující den byly do lahví přidány testované sloučeniny 6 a 7 v koncentracích 10, 20 a 40 μΜ. Kontrolní buňky byly ovlivněny DMSO v koncentraci 0,1 % (obj./obj.). Po uplynutí 24 hodin byly buňky enzymaticky uvolněny z povrchu lahve, promyty PBS a lyzovány na ledu v 200 μl RIPA (Radioimunoprecipitační testovací pufr) pufru za občasného vortexování po dobu 30 minut. Následně byly buněčné lyzáty centrifugovány (15000 rpm, 20 minut, 4 °C) a v odebraných supernatantech byla stanovena koncentrace proteinů metodou BCA (test na Bicinchoninovou kyselinu). Supernatanty byly smíchány s 4x koncentrovaným Laemmliho pufrem a povařeny 5 minut při 95 °C. Takto připravené vzorky byly naneseny do jamek 10% polyakrylamidového gelu v množství 40 μg celkového proteinu na jamku a elektroforeticky separovány v přítomnosti SDS (dodecylsíran sodný). Proteiny byly poté přeblotovány z gelu na nitrocelulózovou membránu o porozitě 0,2 μm. Membrána byla blokována 2 hodiny v 5% roztoku BSA (hovězí sérový albumin) v TBS/T (tris-pufrovaný fyziologický roztok s 0,1 % (obj./obj.) Tween 20). Membrány byly následně inkubovány v přítomnosti specifických primárních protilátek proti Gli1, Cyklinu D1, N-MYC, Bcl-2 a GAPDH (všechny Abcam) naředěných v roztoku TBS/T v poměru 1:1000 přes noc při 4 °C. Následující den byly membrány promyty 4x po dobu 5 minut v roztoku TBS/T a inkubovány v králičí sekundární protilátce naředěné v poměru 1:10000 v roztoku TBS/T po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Po uplynutí inkubační doby byly membrány promyty 4x po dobu 5 minut v roztoku TBS/T a inkubovány 5 minut v přítomnosti chemiluminiscenční reagencie ECL Prime (Amersham). Detekce luminiscenčního signálu byla provedena pomocí přístroje Odyssey FC (LI-COR Biosciences). Výsledky ukazuje obrázek 2.

Claims (8)

1. Terpenoidní derivát obecného vzorce I,
(I) ve kterém,
------je jednoduchá nebo dvojná vazba;
A, X, Y a Z jsou vzájemně nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří CH, C, N, NH, O, S; přičemž nejvýše jeden z A, X, Y, Z je O nebo S;
R1 je vybrán ze skupiny -CH2OH, -CH2O(CH2)nCH3, -CH2OC(O)(CH2)nCH3,
-COOH, COO(CH2)nCH3 a -COO(CH2)Ph, -COOCH2OC(O)CH3, kde nezávisle n = 0 až 5; nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.
2. Terpenoidní derivát obecného vzorce I podle nároku 1, kde R1 je -CH2OH, -CH2OC(O)CH3, COOH, COOCH3, COO(CH2)Ph, -COOCH2OC(O)CH3.
3. Terpenoidní derivát obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kde aromatický kruh obsahující A, X, Y, Z ve vzorci I je vybrán ze skupiny tetrazolu, triazolu, thiadiazolu, oxadiazolu, imidazolu, pyrrazolu, thiazolu, isothiazolu, oxazolu, isoxazolu, pyrrolu, thiofenu, a furanu.
4. Terpenoidní derivát obecného vzorce I, vybraný ze skupiny 2-(tetrazol-5-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(l,2,3-triazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(l,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(imidazol-2-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(pyrrazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-ovákyselina; 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ovákyselina; 2-(thiazol-4-yl)-3oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-4-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(oxazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien28-ová kyselina; 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-4-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-2-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien28-ová kyselina; 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(furan-3-yl)-3oxolupa-l,20(29)-dien-28-ová kyselina; 2-(tetrazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(1,2,3triazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(l,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(imidazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28ol; 2-(pyrrazol-3-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-( pyrrazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien28-ol; 2-(thiazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien28-ol; 2-(thiazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupa-1,20(29)dien-28-ol; 2-(isothiazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ol; 2-(oxazol-2-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ol; 2-(oxazol-5-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupal,20(29)-dien-28-ol; 2-(isoxazol-4-yl)-3-oxolupa-l,20(29)-dien-28-ol; 2-(isoxazol-5-yl)-3-
- 16CZ 309885 B6 oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrol-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(pyrrol-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiofen-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(thiofen-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(furan-2-yl)-3-oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(furan-3-yl)-3oxolupa-1,20(29)-dien-28-ol; 2-(tetrazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(1,2,3-triazol-4-yl)3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(1,2,4-triazol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(imidazol-2-yl)3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(imidazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrazol-3-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-( pyrrazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiazol-2-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiazol-5-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-4-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isothiazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(oxazol-2-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(oxazol-4-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(oxazol-5-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-4-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(isoxazol-5-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-2-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(pyrrol-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiofen-2-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(thiofen-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina; 2-(furan-2-yl)-3oxolupan-28-ová kyselina; 2-(furan-3-yl)-3-oxolupan-28-ová kyselina.
5. Terpenoidní derivát obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití jako léčivo.
6. Terpenoidní derivát obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití při léčbě nádorových onemocnění.
7. Terpenoidní derivát obecného vzorce I pro použití podle nároku 6, kde nádorové onemocnění je vybráno ze skupiny nemalobuněčného karcinomu plic, nádoru prostaty, bazocelulárního karcinomu, glioblastomu a meduloblastomu.
8. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více terpenoidových derivátů obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný excipient.
CZ2022-277A 2022-06-21 2022-06-21 Triterpeny s inhibiční aktivitou na Hedgehog signální dráhu pro použití při léčbě nádorových onemocnění CZ309885B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2022-277A CZ309885B6 (cs) 2022-06-21 2022-06-21 Triterpeny s inhibiční aktivitou na Hedgehog signální dráhu pro použití při léčbě nádorových onemocnění

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2022-277A CZ309885B6 (cs) 2022-06-21 2022-06-21 Triterpeny s inhibiční aktivitou na Hedgehog signální dráhu pro použití při léčbě nádorových onemocnění

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2022277A3 CZ2022277A3 (cs) 2024-01-10
CZ309885B6 true CZ309885B6 (cs) 2024-01-10

Family

ID=89429311

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2022-277A CZ309885B6 (cs) 2022-06-21 2022-06-21 Triterpeny s inhibiční aktivitou na Hedgehog signální dráhu pro použití při léčbě nádorových onemocnění

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ309885B6 (cs)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007112043A2 (en) * 2006-03-23 2007-10-04 Advanced Life Sciences Inc. Synthetic pentacyclic triterpenoids and derivatives of betulinic acid and betulin
WO2018205038A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Tetra Bio-Pharma Inc. Compositions comprising cannabinoids and terpenes useful in the treatment of cancer and vascular ocular disorders via inhibition of hedgehog signalling

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007112043A2 (en) * 2006-03-23 2007-10-04 Advanced Life Sciences Inc. Synthetic pentacyclic triterpenoids and derivatives of betulinic acid and betulin
WO2018205038A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Tetra Bio-Pharma Inc. Compositions comprising cannabinoids and terpenes useful in the treatment of cancer and vascular ocular disorders via inhibition of hedgehog signalling

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUPTA, NIDHI, ET AL.: "Synthesis of novel benzylidene analogues of betulinic acid as potent cytotoxic agents", EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 135, pages 517 - 530, XP085047614, ISSN: 0223-5234, DOI: 10.1016/j.ejmech.2017.04.062 *
LEONG, KOK HOONG, ET AL.: "Induction of intrinsic apoptosis in leukaemia stem cells and in vivo zebrafish model by betulonic acid isolated from Walsura pinnata Hassk (Meliaceae)", PHYTOMEDICINE, vol. 26, pages 11 - 21, XP018527301, ISSN: 0944-7113 *
PETTIT, GEORGE R., ET AL.: "Antineoplastic agents. 595. Structural modifications of betulin and the X-ray crystal structure of an unusual betulin amine dimer1", JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS, vol. 77, no. 4, 2 April 2014 (2014-04-02), pages 863 - 872, ISSN: 1520-6025 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2022277A3 (cs) 2024-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11059795B2 (en) Androgen receptor modulators and methods for their use
US12109179B2 (en) Pharmaceutical compositions and combinations comprising inhibitors of the androgen receptor and uses thereof
US11485713B2 (en) Androgen receptor modulators and methods for their use
US11731986B2 (en) Inhibitors of low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMPTP) and uses thereof
US9765063B2 (en) Amido compounds as RORγt modulators and uses thereof
KR20210144827A (ko) 안드로겐 수용체의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물 및 조합물 및 그의 용도
KR101471999B1 (ko) Ｇｓｋ-3 저해제
US20110112079A1 (en) Phosphodiesterase inhibitors
KR20220004978A (ko) 단백질 분해 표적 키메라 리간드로서 사용하기 위한 안드로겐 수용체 조절제 및 방법
US20210395238A1 (en) Nadph oxidase 4 inhibitors
EP1419770A1 (en) Apo ai expression accelerating agent
US20140200215A1 (en) Lysophosphatidic acid receptor antagonists
US20220380378A1 (en) Androgen receptor modulators and methods for their use
Kharbanda et al. Novel benzothiazole based sulfonylureas/sulfonylthioureas: design, synthesis and evaluation of their antidiabetic potential
WO2013038136A1 (en) BI-AROMATIC AND TRI-AROMATIC COMPOUNDS AS NADPH OXIDASE 2 (Nox2) INHIBITORS
KR20200116912A (ko) 카르복실산기를 포함하는 질소-함유 벤조헤테로시클 화합물, 이의 제조 방법 및 이의 용도
CZ309885B6 (cs) Triterpeny s inhibiční aktivitou na Hedgehog signální dráhu pro použití při léčbě nádorových onemocnění
WO2017161524A1 (zh) 丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂及其应用
Morishita et al. Synthesis and evaluation of a novel series of 2, 7-substituted-6-tetrazolyl-1, 2, 3, 4-tetrahydroisoquinoline derivatives as selective peroxisome proliferator-activated receptor γ partial agonists
RU2797622C2 (ru) Модуляторы андрогенового рецептора и способы их применения
WO2024211785A1 (en) Usp2 inhibitors and methods of using the same for the treatment of diseases
CA3172149A1 (en) Selective non-cyclic nucleotide activators for the camp sensor epac1
US20230373934A1 (en) Androgen receptor modulators and methods for their use
Ambedkar et al. Identification of a Novel 1, 2 Oxazine That Can Induce Apoptosis by Targeting NF-κB in Hepatocellular Carcinoma Cells