CZ309446B6 - Means for cryopreservation of human or animal cells - Google Patents
Means for cryopreservation of human or animal cells Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309446B6 CZ309446B6 CZ2017-396A CZ2017396A CZ309446B6 CZ 309446 B6 CZ309446 B6 CZ 309446B6 CZ 2017396 A CZ2017396 A CZ 2017396A CZ 309446 B6 CZ309446 B6 CZ 309446B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mmol
- solution
- trehalose
- cells
- amount
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
Prostředek pro kryoprezervaci lidských nebo zvířecích buněkMeans for cryopreservation of human or animal cells
Oblast technikyField of technology
Vynález se týká prostředku pro uchování lidských nebo zvířecích buněk při velmi nízkých teplotách. Dále se vynález týká použití pufrováného nebo nepufrováného vodného roztoku trehalózy k dlouhodobému uskladnění kmenových buněk při velmi nízkých teplotách.The invention relates to a means for preserving human or animal cells at very low temperatures. Furthermore, the invention relates to the use of a buffered or non-buffered aqueous solution of trehalose for long-term storage of stem cells at very low temperatures.
Dosavadní stav technikyCurrent state of the art
Kmenové buňky jsou pro svůj multipotentní potenciál velmi ceněná frakce v biofarmaceutickém průmyslu. Jejich omezená životnost ex vivo je v současné době řešena jejich kryoprezervaci, tj. hlubokým zmražením na teplotu -18 °C až -196 °C. Hluboce zamražené kmenové buňky je možné kdykoliv v případě potřeby použít a jejich životnost je v takovém stavu prodloužena o několik let. Klíčovým krokem v celém procesu mražení kmenových buněk je roztok, ve kterém jsou buňky uloženy. Jeho složení je zásadní pro výsledné vlastnosti buněk po jejich rozmražení. Z hlediska biofarmaceutického průmyslu a současných pravidel pro použití buněk k terapeutickým účelům je žádoucí, aby rozmražené buňky bylo možné přímo aplikovat pacientovi bez dalších kroků promývání či centrifůgace buněk. Tento fakt klade velké nároky především na složení roztoku s ohledem na bezpečnost jednotlivých komponent v roztoku obsažených. Pro kryoprezervaci buněk se běžně používá dimethylsulfoxid (DMSO), ethylenglykol či glycerol.Stem cells are a highly valued fraction in the biopharmaceutical industry for their multipotent potential. Their limited life ex vivo is currently solved by their cryopreservation, i.e. by deep freezing to a temperature of -18 °C to -196 °C. Deep-frozen stem cells can be used at any time if necessary, and their lifespan is extended by several years in this state. A key step in the entire stem cell freezing process is the solution in which the cells are stored. Its composition is crucial for the resulting properties of the cells after they are thawed. From the point of view of the biopharmaceutical industry and the current rules for the use of cells for therapeutic purposes, it is desirable that the thawed cells can be directly applied to the patient without further steps of washing or centrifuging the cells. This fact places great demands on the composition of the solution with regard to the safety of the individual components contained in the solution. Dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol or glycerol are commonly used for cryopreservation of cells.
Nevýhoda použití těchto kryoprotektivních látek je jejich nezanedbatelná cytoxicita a významné nežádoucí vedlejší účinky při podání pacientům. Proto jsou vyvíjeny kryoprotektivní roztoky, které jsou primárně založeny na použití netoxických složek při zachování kryoprezervačních vlastností.The disadvantage of using these cryoprotective agents is their significant cytotoxicity and significant adverse side effects when administered to patients. Therefore, cryoprotective solutions are developed, which are primarily based on the use of non-toxic components while maintaining cryopreservation properties.
Jako velmi potentní složka kryoprotektivních roztoků se ukazuje trehalóza. Trehalóza, disacharid glukózy, je syntetizována nižšími organizmy v případech, kdy jsou vystaveny stresu, chladu, vysokým teplotám nebo vysušení, je známa jako protistresový faktor. Trehalóza, na rozdíl od DMSO, neprochází buněčnou membránou a při mražení chrání buňky extracelulámě díky mírné dehydrataci buněk.Trehalose appears to be a very potent component of cryoprotective solutions. Trehalose, a disaccharide of glucose, is synthesized by lower organisms in cases where they are exposed to stress, cold, high temperatures or desiccation, it is known as an anti-stress factor. Trehalose, unlike DMSO, does not pass through the cell membrane and during freezing protects the cells extracellularly due to slight dehydration of the cells.
Dash a kolektiv testovali trehalózu (Curr Stem Cell Res Ther., 2008) pro mražení rybích embryonálních kmenových buněk. Přidaná trehalóza do kryoprotektivního roztoku obsahujícího DMSO zvýšila viabilitu rozmražených buněk.Dash and colleagues tested trehalose (Curr Stem Cell Res Ther., 2008) for freezing fish embryonic stem cells. Trehalose added to the cryoprotectant solution containing DMSO increased the viability of thawed cells.
Velmi pozitivní účinek 1M roztoku trehalózy na mražení kmenových CD34 + buněk izolovaných z periferní krve popisuje Martinetti (Biomed Rep., 2017).A very positive effect of 1M trehalose solution on freezing stem CD34 + cells isolated from peripheral blood is described by Martinetti (Biomed Rep., 2017).
Použití extracelulámí a také intracelulámí trehalózy v kryoroztoku příznivě ovlivňuje vitalitu rozmražených kmenových buněk izolovaných z pupečníkové krve (Motta a kol., Cryobiology, 2014).The use of extracellular as well as intracellular trehalose in cryosolution favorably affects the vitality of thawed stem cells isolated from umbilical cord blood (Motta et al., Cryobiology, 2014).
Campbell a kolektiv popisuje (Cryobiology, 2012) výhodné použití 0,2 až 0,4M roztoku trehalózy v kombinaci s uhličitanem sodným a kultivačním médiem EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) pro mražení hovězích endotheliálních buněk.Campbell et al describe (Cryobiology, 2012) the preferred use of a 0.2 to 0.4M trehalose solution in combination with sodium carbonate and EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) culture medium for freezing bovine endothelial cells.
Velice výhodná se ukazuje 24 hodinová preinkubace buněk s trehalózou před samotným procesem mražení. Výhodu preinkubace buněk 200mM roztokem trehalózy také popisuje Petrenko a kol. (Cryo Letters. 2014).A 24-hour pre-incubation of cells with trehalose before the actual freezing process proves to be very advantageous. The advantage of preincubation of cells with 200mM trehalose solution is also described by Petrenko et al. (Cryo Letters. 2014).
Patentová přihláška CN 105961374 popisuje kryoprotektivní roztok pro uchováníPatent application CN 105961374 describes a cryoprotective solution for preservation
-1 CZ 309446 B6 mesenchymálních kmenových buněk. Tento roztok obsahuje zejména polyethylenglykol a albumin, přičemž jako jednu ze složek obsahuje i trehalózu.-1 CZ 309446 B6 mesenchymal stem cells. This solution mainly contains polyethylene glycol and albumin, while it also contains trehalose as one of the components.
Přihláška CN 105494317 popisuje zamražení kmenových buněk izolovaných z tukové tkáně v roztoku obsahujícím zejména lipoprotein, trehalózu a glycerin.Application CN 105494317 describes the freezing of stem cells isolated from adipose tissue in a solution containing mainly lipoprotein, trehalose and glycerin.
Patentová přihláška CN 104012519 popisuje výhodnou kombinaci trehalózy a erytropoietinu v kryoprotektivním roztoku.Patent application CN 104012519 describes an advantageous combination of trehalose and erythropoietin in a cryoprotective solution.
Patentová přihláška US 2011008300 popisuje výhodné použití roztoku s obsahem trehalózy a glycerinu pro kryoprezervaci tukové tkáně.Patent application US 2011008300 describes the advantageous use of a solution containing trehalose and glycerin for cryopreservation of adipose tissue.
Patentová přihláška KR 20140046690 popisuje mražení prasečích spermatogonálních buněk v roztoku obsahujícím 200 mM trehalózy, fetální hovězí sérum, DMSO a kultivační médium Alpha MEM (Alpha Modification of Eagle's Minimum Essential Media).Patent application KR 20140046690 describes the freezing of porcine spermatogonial cells in a solution containing 200 mM trehalose, fetal bovine serum, DMSO and culture medium Alpha MEM (Alpha Modification of Eagle's Minimum Essential Media).
Obdobně, přihláška CN 102578077 je zaměřena na problematiku mražení mesenchymálních kmenových buněk v kryoroztoku obsahujícím DMSO, trehalózu a další komponenty. Kryoroztok je použit bez obsahu séra.Similarly, application CN 102578077 is focused on the issue of freezing mesenchymal stem cells in a cryosolution containing DMSO, trehalose and other components. The cryosolution is used without serum.
Korejský patent KR 20120078094 popisuje výhodnou kombinaci DMSO, trehalózy, katalasy a kaspasového inhibitoru zVAD-fmk pro mražení kmenových buněk izolovaných z plodové vody.Korean patent KR 20120078094 describes an advantageous combination of DMSO, trehalose, catalase and the caspase inhibitor zVAD-fmk for freezing stem cells isolated from amniotic fluid.
Roztok obsahující trehalózu a další farmaceuticky použitelné ingredience je popsán v české patentové přihlášce PV 2016-284. Přihláška popisuje hypothermické skladování buněk v tomto roztoku při teplotě snížené až na -4 °C.A solution containing trehalose and other pharmaceutical ingredients is described in Czech patent application PV 2016-284. The application describes the hypothermic storage of cells in this solution at a temperature reduced to -4 °C.
Dosud známá řešení neumožňují hluboké zmražení za použití farmaceuticky nekompatibilních složek, což výrazně v klinické praxi znemožňuje bezprostřední využití takových roztoků po rozmražení.The solutions known so far do not allow deep freezing using pharmaceutically incompatible components, which significantly prevents the immediate use of such solutions after thawing in clinical practice.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Výše uvedené nedostatky odstraňuje prostředek pro uchování kmenových buněk při velmi nízkých teplotách, který je tvořen vodným roztokem trehalózy, který obsahuje disacharid trehalózu v množství 250 až 400 mmol/1.The above-mentioned shortcomings are eliminated by a means for preserving stem cells at very low temperatures, which consists of an aqueous solution of trehalose, which contains trehalose disaccharide in an amount of 250 to 400 mmol/1.
Podle vynálezu roztok sestává z pufrovaného vodného roztoku 250 až 400 mmol/1 trehalózy, který obsahuje jednoduché soli pro tlumení výkyvů pH, přičemž pH roztoku je 7,1 až 7,6, a přičemž celková osmolarita roztoku není vyšší než 900 mosmol/1. Osmolaritou se v této přihlášce rozumí osmolarita vypočtená způsobem v této oblasti techniky obvyklým, nebo, v případě že by byla vyšší než vypočtená, osmolarita změřená.According to the invention, the solution consists of a buffered aqueous solution of 250 to 400 mmol/1 trehalose, which contains simple salts to buffer pH fluctuations, the pH of the solution being 7.1 to 7.6, and the total osmolarity of the solution not being higher than 900 mosmol/1. In this application, osmolarity is understood as osmolarity calculated in a manner customary in this field of technology, or, in case it would be higher than calculated, osmolarity measured.
Tento roztok s výhodou obsahuje jako nezbytné složky kationty K+ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Na+ v množství 20 až 80 mmol/1, anionty Cl v množství 0,5 až 40 mmol/1, a anionty PO43 a/nebo HPO42 a/nebo H2PO4 v celkovém množství 20 až 65 mmol/1. Horní mez obsahu trehalózy je určena tím, že celková osmolarita roztoku nemá být vyšší než 900 mosmol/1. Horní mez obsahu trehalózy v pufrovaném roztoku je tedy o množství disociovaných solí nižší než 900 mosmol/1. Koncentrace uvedených složek jsou v rámci uvedeného rozmezí voleny tak, aby hodnota pH roztoku byla 7,1 až 7,6. V nejjednodušším provedení vynálezu nemusí prostředek podle vynálezu obsahovat žádné další záměrně přidávané složky. V každém případě, optimální celková osmolarita roztoku není vyšší než 900 mosmol/1.This solution preferably contains as necessary components K + cations in the amount of 20 to 50 mmol/1, Na + cations in the amount of 20 to 80 mmol/1, Cl anions in the amount of 0.5 to 40 mmol/1, and PO4 3 anions and /or HPO4 2 and/or H2PO4 in a total amount of 20 to 65 mmol/1. The upper limit of the trehalose content is determined by the fact that the total osmolarity of the solution should not be higher than 900 mosmol/1. The upper limit of the trehalose content in the buffered solution is therefore lower than 900 mosmol/1 by the amount of dissociated salts. The concentrations of the mentioned components are chosen within the mentioned range so that the pH value of the solution is 7.1 to 7.6. In the simplest embodiment of the invention, the composition according to the invention does not need to contain any other intentionally added components. In any case, the optimal total osmolarity of the solution is not higher than 900 mosmol/1.
V dalších provedeních vynálezu roztok dále může obsahovat kationty Mg2+ a/nebo Ca2+ vIn other embodiments of the invention, the solution may also contain Mg 2+ and/or Ca 2+ cations in
-2 CZ 309446 B6 celkovém množství 0 až 2 mmol/1 a anionty SO42 a/nebo HSO4 v celkovém množství 0 až 2 mmol/1. Jestliže jsou kationty Mg2+ a/nebo Ca2+ přítomny jako záměrně přidaná složka, jsou v roztoku obsaženy v celkovém množství 0,1 až 2 mmol/1. Jestliže jsou anionty SO42· a/nebo HSO4· přítomny jako záměrně přidaná složka, jsou v roztoku obsaženy v celkovém množství 0,5 až 2 mmol/1.-2 CZ 309446 B6 in a total amount of 0 to 2 mmol/1 and SO4 2 and/or HSO4 anions in a total amount of 0 to 2 mmol/1. If Mg 2+ and/or Ca 2+ cations are present as an intentionally added component, they are contained in the solution in a total amount of 0.1 to 2 mmol/1. If SO4 2 · and/or HSO4 · anions are present as an intentionally added component, they are contained in the solution in a total amount of 0.5 to 2 mmol/1.
Ve výhodném provedení vynálezu roztok obsahuje kationty K+ v množství 28 až 32 mmol/1, kationty Na+ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Mg2+ a/nebo Ca2+ v celkovém množství 0,4 až 1,2 mmol/1, anionty Cl v množství 0,5 až 20 mmol/1, anionty PO43 a/nebo HPO42 a/nebo H2PO4 v celkovém množství 40 až 50 mmol/1, anionty SO42 a/nebo HSO4 v celkovém množství 0,9 až 1,2 mmol/1.In a preferred embodiment of the invention, the solution contains K + cations in an amount of 28 to 32 mmol/1, Na + cations in an amount of 20 to 50 mmol/1, Mg 2+ and/or Ca 2+ cations in a total amount of 0.4 to 1.2 mmol/1, Cl anions in the amount of 0.5 to 20 mmol/1, PO4 3 and/or HPO4 2 and/or H2PO4 anions in the total amount of 40 to 50 mmol/1, SO4 2 and/or HSO4 anions in the total amount of 0 .9 to 1.2 mmol/1.
Zvláště výhodné je, když vodný roztok neobsahuje vedle kationtů K+, kationtů Na+, kationtů Mg2+ a/nebo Ca2+, aniontů Cl’, aniontů PCX3- a/nebo HPO42· a/nebo H2PO4·, aniontů SO42· a/nebo HSO4· a trehalózy žádné další záměrně přidané složky. Samozřejmě nelze vyloučit, že v roztoku jsou stopová množství látek, jejichž přítomnost je podmíněna výrobou nebo jinak náhodná.It is particularly advantageous if the aqueous solution does not contain, in addition to K + cations, Na + cations, Mg 2+ and/or Ca 2+ cations, Cl' anions, PCX 3- and/or HPO4 2 · and/or H2PO4 ·, SO4 anions 2 · and/or HSO4· and trehalose no other intentionally added components. Of course, it cannot be ruled out that there are trace amounts of substances in the solution, the presence of which is conditioned by production or otherwise random.
Konkrétněji, prostředek podle vynálezu je určen k uskladnění buněk při nízkých a velmi nízkých teplotách od -5 °C až do -273 °C. Prostředek podle vynálezu je zvláště vhodný k uskladnění kmenových buněk při teplotách od -18 °C do -196 °C, s výhodou -60 °C až -196 °C, nej častěji 80 °C až -196 °C. Režim mražení prostředku podle vynálezu může mít různý průběh. Může být použito programovatelných mrazicích jednotek (např. IceCube; SY-LAB) či dalších teplotně optimalizovaných zařízení: Mr. Frosty™ (Thermo Fisher Scientific) či CoolCell® (BioCision). S výhodou lze suspenzi buněk v prostředku podle vynálezu mrazit také přímým uložením vzorku do par tekutého dusíku. Tekutý dusík či jeho páry jsou z pohledu mražení i uskladnění vzorku nej vhodnější.More specifically, the device according to the invention is designed to store cells at low and very low temperatures from -5°C to -273°C. The composition according to the invention is particularly suitable for storing stem cells at temperatures from -18°C to -196°C, preferably -60°C to -196°C, most often 80°C to -196°C. The mode of freezing the product according to the invention can have a different course. Programmable freezing units (e.g. IceCube; SY-LAB) or other temperature-optimized devices can be used: Mr. Frosty™ (Thermo Fisher Scientific) or CoolCell® (BioCision). Advantageously, the suspension of cells in the composition according to the invention can also be frozen by directly placing the sample in liquid nitrogen vapor. Liquid nitrogen or its vapors are the most suitable from the point of view of freezing and storing the sample.
Prostředek podle vynálezu se skládá z farmaceuticky přijatelných sloučenin a může být použit přímo k aplikaci kmenových buněk, které jsou v něm zmraženy. Po rozmražení kmenových buněk je zajištěna jejich dostatečná životaschopnost.The composition according to the invention consists of pharmaceutically acceptable compounds and can be used directly to apply the stem cells that are frozen in it. After thawing the stem cells, their sufficient viability is ensured.
Prostředek podle vynálezu je určen zejména pro mrazové uchování mezenchymálních kmenových buněk získaných z kostní dřeně, tukové tkáně, periferní krve nebo z extraembryonálních tkání (placenta, pupečník, pupečníková krev) nebo embryonálních, nervových, indukovaných nebo limbálních kmenových buněk savců včetně člověka. Může sloužit také k uchování kmenových buněk uchycených na biologickém nosiči. Z podstaty samotného vynálezu, tedy osmotický vliv roztoku na buňky před zmražením vč. stabilizace buněčné membrány, je možné očekávat pozitivní vliv roztoku také na jiné buněčné typy.The product according to the invention is intended in particular for the cryopreservation of mesenchymal stem cells obtained from bone marrow, adipose tissue, peripheral blood or from extraembryonic tissues (placenta, umbilical cord, umbilical cord blood) or embryonic, neural, induced or limbal stem cells of mammals, including humans. It can also be used to preserve stem cells attached to a biological carrier. From the essence of the invention itself, i.e. the osmotic effect of the solution on the cells before freezing incl. stabilization of the cell membrane, it is possible to expect a positive effect of the solution on other cell types as well.
Kmenové buňky uchované v prostředku podle vynálezu mohou být po rozmražení aplikovány bez nutnosti odmytí tohoto prostředku přímo pacientovi zejména intravenózně, intraarteriálně, intramuskulámě, subkutánně, subkunjunktiviálně nebo intratekálně, a to buď samostatně, nebo s nosičem.Stem cells preserved in the composition according to the invention can be applied after thawing without the need to wash off this composition directly to the patient, especially intravenously, intraarterially, intramuscularly, subcutaneously, subconjunctivally or intrathecally, either alone or with a carrier.
Nosičem kmenových buněk může být biodegradabilní i nedegradabilní materiál. Nosičem mohou být funkční biomateriály. Může se jednat o syntetické biokompatibilní polymery (kyselina polylaktidová PLA, kyselina polyglykolová PGA, polyethylenglykol PEG, polykaprolakton PCL, polyhydroxybutyrát PHB a další), přírodní polymery a polysacharidy (kolagen typu I, hyaluronová kyselina, fibrin, chitosan, celulóza, škrob a další) nebo extracelulámí matrice (ECM) ve formě hydrogelu, nanovláken nebo mikrovláken. Alternativně se pro aplikace, které počítají s nosičem, mohou kultivace kmenových buněk provádět v přítomnosti těchto nosičů a společně uchovávat a aplikovat v prostředku podle vynálezu.The carrier of stem cells can be biodegradable or non-degradable material. The carrier can be functional biomaterials. These can be synthetic biocompatible polymers (polylactic acid PLA, polyglycolic acid PGA, polyethylene glycol PEG, polycaprolactone PCL, polyhydroxybutyrate PHB and others), natural polymers and polysaccharides (collagen type I, hyaluronic acid, fibrin, chitosan, cellulose, starch and others) or extracellular matrix (ECM) in the form of hydrogel, nanofibers or microfibers. Alternatively, for applications requiring a carrier, the stem cell cultures can be performed in the presence of such carriers and stored and administered together in the composition of the invention.
Roztok trehalózy podle vynálezu je možné použít k dlouhodobému uskladnění hluboce zmražených mezenchymálních kmenových buněk. Hlubokým zmražením se rozumí zmražení naThe trehalose solution according to the invention can be used for long-term storage of deep-frozen mesenchymal stem cells. Deep freezing means freezing to
-3 CZ 309446 B6 velmi nízké teploty od -18 °C do -196 °C. Nižší teploty jsou také možné, i když méně praktické. Dlouhodobým uskladněním se rozumí uskladnění po dobu více než tří dnů, ale i několika týdnů nebo měsíců, například až pěti let.-3 CZ 309446 B6 very low temperatures from -18 °C to -196 °C. Lower temperatures are also possible, although less practical. Long-term storage means storage for more than three days, but also several weeks or months, for example up to five years.
Pufrovaný vodný roztok trehalózy, obsahující trehalózu v množství 250 až 400 mmol/1, kationty K+ v množství 28 až 32 mmol/1, kationty Na+ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Mg2+ a/nebo Ca2+ v celkovém množství 0,4 až 1,2 mmol/1, anionty Cl v množství 0,5 až 20 mmol/1, anionty PO43· a/nebo HPO42· a/nebo H2PO4· v celkovém množství 40 až 50 mmol/1, anionty SO42· a/nebo HSO4· v celkovém množství 0,9 až 1,2 mmol/ů, je možné použít zejména k dlouhodobému uskladnění hluboce zmražených mezenchymálních kmenových buněk.Buffered aqueous solution of trehalose, containing trehalose in the amount of 250 to 400 mmol/1, K + cations in the amount of 28 to 32 mmol/1, Na + cations in the amount of 20 to 50 mmol/1, Mg 2+ and/or Ca 2+ cations in a total amount of 0.4 to 1.2 mmol/1, Cl anions in an amount of 0.5 to 20 mmol/1, anions PO4 3 · and/or HPO4 2 · and/or H2PO4· in a total amount of 40 to 50 mmol/ 1, SO4 2 · and/or HSO4 · anions in a total amount of 0.9 to 1.2 mmol/s, can be used especially for long-term storage of deep-frozen mesenchymal stem cells.
Příklady uskutečnění vynálezuExamples of implementation of the invention
Příklad 1: Izolace a kultivace MSCs z kostní dřeně (BM-MSCs)Example 1: Isolation and Culture of Bone Marrow MSCs (BM-MSCs)
Aspirace kostní dřeně byla provedena trepanobioptickou jehlou, která je součástí odběrového setu obsahujícího fyziologický roztok s heparinem a gentamicinem. Po transportu kostní dřeně do prostor pro sterilní zpracování biologického materiálu byl vzorek smíchán s infuzním roztokem Gelofůsinu. Množství přidaného Gelofusinu odpovídalo 25 % objemu kostní dřeně. Směs sedimentovala 10 až 30 minut a poté byla odebrána vrstva prstence mononukleámích buněk. V odebrané vrstvě buněk byla analyzována buněčnost směsi hematologickým analyzátorem. Do každé z připravených kultivačních lahví o ploše 75 cm2 bylo přidáno 10 ml kompletního kultivačního média (médium Alpha MEM Eagle obsahující 5% lidský destičkový lyzát a gentamicin) a definované množství suspenze izolovaných buněk (5 až 10 milionů jaderných buněk) pro nasazení primokultury. Kultivace buněk probíhala při teplotě 37 ±0,5 °C a 5 % CO2. V průběhu kultivace buněk probíhala průběžná výměna kompletního kultivačního média s případným oplachem buněk pomocí 10 ml pufiru PBS na jednu kultivační láhev. Podle množství rostoucích buněk probíhalo jejich pasážování, tedy řízené enzymatické odloučení adherujících buněk a jejich přenesení na větší kultivační plochu. Tento proces vždy začal optickou kontrolou kultury pod mikroskopem; optimální pro růst kultury bylo dosažení 80 až 90% pokrytí buněk kultivačního dna. Pro pasážování bylo nutné odsátí kultivačního média, oplach kultury 10 ml pufiru PBS a přidání 1 ml roztoku enzymu TrypLE Select CTS. Kultivační lahve byly cca 4 minuty inkubovány při 37±0,5 °C. Správný průběh enzymatické reakce byl kontrolován pod mikroskopem. Pokud se buňky pohybovaly s proudící kapalinou po poklepání kultivační lahve, byl do každé lahve přidán 1 ml infůzního roztoku 20% HSA (lidský sérový albumin) a 6 ml pufiru PBS. Tato směs byla promíchána jemným nasátím a vysátím z pipety a byla převedena do centrifůgační zkumavky a centrifugována (230 g, 5 minut). Peleta buněk byla resuspendována v kompletním kultivačním médiu a suspenze buněk rozdělena na požadované množství kultivačních lahví. Třetím pasážováním buněk bylo dosaženo finální suspenze buněk. Ta byla navíc ještě jednou promyta pufrem PBS a centrifugována (230 g, 5 minut). Pro vytvoření přípravku podle provedení vynálezu byla peleta získaná výše uvedeným postupem resuspendována v roztoku přípravku uvedeném v příkladu 2A (s 250 mM trehalózou, který je dále označován TR-250), 2B (s 300 mM trehalózou, označovaném TR-300), 2C (s 350 mM trehalózou, označovaném TR-350), 2D (s 400 mM trehalózou, označovaném TR-400) a 2E (pouze vodný roztok s 400 mM trehalózou označovaném TRH-400). Značkou mM nebo také mmol/1 je označován počet milimolů v litru roztoku.Bone marrow aspiration was performed with a trepanobioptic needle, which is part of a sampling set containing saline solution with heparin and gentamicin. After transporting the bone marrow to the room for sterile processing of biological material, the sample was mixed with Gelofůsin infusion solution. The amount of Gelofusin added corresponded to 25% of the bone marrow volume. The mixture was allowed to sediment for 10 to 30 minutes, and then the ring layer of mononuclear cells was collected. In the removed layer of cells, the cellularity of the mixture was analyzed with a hematology analyzer. 10 ml of complete culture medium (Alpha MEM Eagle medium containing 5% human platelet lysate and gentamicin) and a defined amount of isolated cell suspension (5 to 10 million nucleated cells) were added to each of the prepared culture flasks with an area of 75 cm 2 for starting the primoculture. Cell cultivation took place at a temperature of 37 ± 0.5 °C and 5% CO2. During the cultivation of the cells, the complete culture medium was continuously replaced with possible rinsing of the cells with 10 ml of PBS buffer per culture bottle. According to the number of growing cells, their passage took place, i.e. the controlled enzymatic separation of adherent cells and their transfer to a larger cultivation area. This process always began with an optical inspection of the culture under a microscope; reaching 80 to 90% coverage of the culture bottom cells was optimal for culture growth. For passaging, it was necessary to aspirate the culture medium, rinse the culture with 10 ml of PBS buffer and add 1 ml of TrypLE Select CTS enzyme solution. The culture bottles were incubated for about 4 minutes at 37±0.5 °C. The correct course of the enzymatic reaction was checked under a microscope. If the cells moved with the flowing liquid after tapping the culture bottle, 1 ml of 20% HSA (human serum albumin) infusion solution and 6 ml of PBS buffer were added to each bottle. This mixture was mixed by gentle pipetting and was transferred to a centrifuge tube and centrifuged (230 g, 5 min). The cell pellet was resuspended in complete culture medium and the cell suspension divided into the required number of culture bottles. A final cell suspension was achieved by the third passaging of the cells. It was additionally washed once more with PBS buffer and centrifuged (230 g, 5 minutes). To create the preparation according to the embodiment of the invention, the pellet obtained by the above-mentioned procedure was resuspended in the solution of the preparation shown in example 2A (with 250 mM trehalose, which is hereinafter referred to as TR-250), 2B (with 300 mM trehalose, referred to as TR-300), 2C ( with 350 mM trehalose, designated TR-350), 2D (with 400 mM trehalose, designated TR-400), and 2E (only aqueous solution with 400 mM trehalose designated TRH-400). The label mM or mmol/1 indicates the number of millimoles in a liter of solution.
Obsah zmražených kmenových buněk byl zpravidla 5 x 10s až 1 x 107 MSCs/ml. Takto připravená suspenze buněk byla průběžně míchána lehkým protřepáním po dobu nejméně deseti minut při pokojové teplotě. Zároveň byla stanovena viabilita vstupní suspenze buněk. Následně byla suspenze (TR-250 a TR-300) uložena do mrazáku o teplotě -70 °C v mrazicím zařízení CoolCell® (BioCision). Paralelně byly vzorky uloženy přímo do teploty -70 °C či do -196 °C na dobu 24 hodin (tabulka 1). V tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty viability buněk zmražených pouhým uložením do teploty -196 °C, nicméně buňky jsou v suspenzi v různých roztocích (TRThe content of frozen stem cells was usually 5 x 10 s to 1 x 10 7 MSCs/ml. The cell suspension thus prepared was continuously mixed by gentle shaking for at least ten minutes at room temperature. At the same time, the viability of the input cell suspension was determined. Subsequently, the suspension (TR-250 and TR-300) was stored in a -70 °C freezer in a CoolCell® freezer (BioCision). In parallel, the samples were stored directly at a temperature of -70 °C or -196 °C for 24 hours (table 1). Table 2 shows the viability values of cells frozen by simply storing them at -196 °C, however, the cells are in suspension in different solutions (TR
-4 CZ 309446 B6-4 CZ 309446 B6
350, TR-400 a TRH-400). Následně byly všechny vzorky uloženy do Dewarovy nádoby obsahující tekutý dusík. Po jejich rozmražení ve vodní lázni při 37 °C byly vzorky testovány podle příkladu 3.350, TR-400 and TRH-400). Subsequently, all samples were placed in a Dewar container containing liquid nitrogen. After thawing them in a water bath at 37 °C, the samples were tested according to Example 3.
Příklad 2: Možné přípravy 100 ml roztoku podle vynálezuExample 2: Possible preparations of 100 ml of the solution according to the invention
Příklad 2A. Příprava roztoku podle vynálezu s 250 mM trehalózou (TR-250)Example 2A. Preparation of the solution according to the invention with 250 mM trehalose (TR-250)
Navážíme 0, 408 g KH2PO4 a 0,213 g Na2HPO4, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCb x 2H2O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO4 a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 9,45 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 358 mosmol/1.Weigh out 0.408 g of KH2PO4 and 0.213 g of Na2HPO4, dissolve in 20 ml of distilled water; weigh 0.007 g of CaCb x 2H2O and dissolve in 10 ml of distilled water; weigh 0.012 g of MgSO4 and dissolve in 10 ml of distilled water. Mix the solutions prepared in this way and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 9.45 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 358 mosmol/1.
Příklad 2B. Příprava roztoku podle vynálezu s 300 mM trehalózou (TR-300)Example 2B. Preparation of the solution according to the invention with 300 mM trehalose (TR-300)
Navážíme 0,408 g KH2PO4 a 0,213 g Na2HPO4, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCb x 2H2O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO4 a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 11,34 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 408 mosmol/1.Weigh out 0.408 g of KH2PO4 and 0.213 g of Na2HPO4, dissolve in 20 ml of distilled water; weigh 0.007 g of CaCb x 2H2O and dissolve in 10 ml of distilled water; weigh 0.012 g of MgSO4 and dissolve in 10 ml of distilled water. Mix the solutions prepared in this way and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 11.34 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 408 mosmol/1.
Příklad 2C. Příprava roztoku podle vynálezu s 350 mM trehalózou (TR-350)Example 2C. Preparation of the solution according to the invention with 350 mM trehalose (TR-350)
Navážíme 0,408 g KH2PO4 a 0,213 g Na2HPO4, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCb x 2H2O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO4 a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 13,23 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 458 mosmol/1.Weigh out 0.408 g of KH2PO4 and 0.213 g of Na2HPO4, dissolve in 20 ml of distilled water; weigh 0.007 g of CaCb x 2H2O and dissolve in 10 ml of distilled water; weigh 0.012 g of MgSO4 and dissolve in 10 ml of distilled water. Mix the solutions prepared in this way and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 13.23 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 458 mosmol/1.
Příklad 2D. Příprava roztoku podle vynálezu s 400 mM trehalózou (TR-400)Example 2D. Preparation of the solution according to the invention with 400 mM trehalose (TR-400)
Navážíme 0, 408 g KH2PO4 a 0,213 g Na2HPO4, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCb x 2H2O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO4 a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 15,12 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 508 mosmol/1.Weigh out 0.408 g of KH2PO4 and 0.213 g of Na2HPO4, dissolve in 20 ml of distilled water; weigh 0.007 g of CaCb x 2H2O and dissolve in 10 ml of distilled water; weigh 0.012 g of MgSO4 and dissolve in 10 ml of distilled water. Mix the solutions prepared in this way and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 15.12 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 508 mosmol/1.
Příklad 2E. Příprava vodného nepufrovaného roztoku podle vynálezu s 400 mM trehalózou (TRH-400)Example 2E. Preparation of an aqueous unbuffered solution according to the invention with 400 mM trehalose (TRH-400)
Navážíme a rozpustíme 15,12 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 400 mosmol/1.Weigh and dissolve 15.12 g of trehalose and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 400 mosmol/1.
Příklad 3: Životaschopnost BM-MSCs po jejich zmražení a následném rozmražení (uskladnění v tekutém dusíku)Example 3: Viability of BM-MSCs after their freezing and subsequent thawing (storage in liquid nitrogen)
Byla hodnocena životaschopnost MSCs izolovaných z lidské kostní dřeně uchovaných v roztoku TR-250, TR-300, TR-350, TR-400 a TRH- 400 ihned po jejich rozmražení. Nejprve byla suspenze barvena propidiumjodidem a viabilita buněk stanovena metodou průtokové cytometric. Viabilita stanovená barvením propidiumjodidem odráží životaschopnost jednotlivých buněk v suspenzi. Propidiumjodid je látka, která neprostupuje membránou živých buněk. U poškozených a neživotaschopných buněk se propidiumjodid váže na DNA. Životaschopnost BM-MSCs sledovaná barvením propidiumjodidem bezprostředně po rozmražení dosahovala více než 50 % u vzorků zmražených šokovým uložením do -70 °C či do -196 °C (tabulka 1). Nejvhodnější seThe viability of MSCs isolated from human bone marrow preserved in TR-250, TR-300, TR-350, TR-400 and TRH-400 solution immediately after thawing was evaluated. First, the suspension was stained with propidium iodide and cell viability was determined by flow cytometry. Viability determined by propidium iodide staining reflects the viability of individual cells in suspension. Propidium iodide is a substance that does not penetrate the membrane of living cells. In damaged and non-viable cells, propidium iodide binds to DNA. The viability of BM-MSCs monitored by propidium iodide staining immediately after thawing reached more than 50% in samples frozen by shock storage to -70 °C or to -196 °C (Table 1). The most suitable se
-5 CZ 309446 B6 ukazuje právě přímé uložení suspense buněk v prostředku podle vynálezu do -70 °C či -196 °C v roztoku TR-250 i TR-300 (tabulka 1). Nej lepších výsledků bylo ovšem dosaženo při použití roztoku TR-400 s nejvyšší koncentrací trehalózy. Ten chrání buňky před poškozením mrazem nejvíce, viabilita buněk se po rozmražení pohybuje nad 60 % (tabulka 2).-5 CZ 309446 B6 shows the direct storage of the suspension of cells in the composition according to the invention to -70 °C or -196 °C in TR-250 and TR-300 solution (table 1). However, the best results were achieved using the TR-400 solution with the highest concentration of trehalose. The latter protects cells from frost damage the most, cell viability after thawing is over 60% (table 2).
Tabulka 1 - MSCs z kostní dřeně, viabilita buněk v roztoku TR-250 a TR-300 v různých režimech mraženíTable 1 - MSCs from bone marrow, cell viability in TR-250 and TR-300 solution in different freezing modes
Tabulka 2 - MSCs z kostní dřeně, viabilita buněk uložených přímo do -196 °C v různých roztocích dle vynálezuTable 2 - MSCs from bone marrow, viability of cells stored directly to -196 °C in various solutions according to the invention
Rozmražené buňky byly paralelně také testovány pomocí následné kultivace a byla sledována jejich schopnost adherence na kultivační plastik a jejich morfologické vlastnosti. Základní vlastností mesenchymálních kmenových buněk je jejich schopnost adherence na kultivační plastiku. Z morfologického hlediska mají životaschopné mesenchymální kmenové buňky protáhlý fibroblastový tvar. Bylo vysazeno stejné objemové množství buněk odpovídající počtu 100 000 buněk v čerstvém stavu na 24 jamkovou kultivační desku. Po 48 hodinách byly buňky hodnoceny pod mikroskopem. Nejvyšší míra adheze byla pozorována u suspenze buněk mražených přímým uložením do -70 °C či -196 °C v roztoku podle vynálezu (TR- 250, TR-300, TR-350 a TR-400). Všechny adherované buňky odpovídaly morfologii mesenchymálních kmenových buněk. Tato pozorování jsou v souladu s pozorováním při detekci viability pomocí propidiumjodidu.The thawed cells were also tested in parallel using subsequent cultivation and their ability to adhere to the culture plastic and their morphological properties were monitored. The basic property of mesenchymal stem cells is their ability to adhere to culture plastic. Morphologically, viable mesenchymal stem cells have an elongated fibroblastic shape. An equal volume of cells corresponding to the number of 100,000 fresh cells was plated in a 24-well culture plate. After 48 hours, the cells were evaluated under a microscope. The highest degree of adhesion was observed in the suspension of cells frozen by direct storage to -70 °C or -196 °C in the solution according to the invention (TR-250, TR-300, TR-350 and TR-400). All adhered cells corresponded to the morphology of mesenchymal stem cells. These observations are consistent with those observed in viability detection using propidium iodide.
Orientačními pokusy bylo zjištěno, že obsah trehalózy může být i vyšší než 400 mmol/1, avšak 5 její účinek se již nijak významně nezvyšuje, přičemž při celkové osmolaritě vyšší než 900 již je roztok farmaceuticky nevhodný, a naopak obsah trehalózy nižší než 60 mmol/1 nemá již pozorovatelný vliv.Orientation experiments have shown that the trehalose content can be higher than 400 mmol/l, but its effect does not increase significantly, while with a total osmolarity higher than 900, the solution is already pharmaceutically unsuitable, and on the contrary, the trehalose content is lower than 60 mmol/l 1 no longer has an observable effect.
Claims (5)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2017-396A CZ309446B6 (en) | 2017-07-07 | 2017-07-07 | Means for cryopreservation of human or animal cells |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2017-396A CZ309446B6 (en) | 2017-07-07 | 2017-07-07 | Means for cryopreservation of human or animal cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ2017396A3 CZ2017396A3 (en) | 2019-01-16 |
CZ309446B6 true CZ309446B6 (en) | 2023-01-25 |
Family
ID=65000868
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2017-396A CZ309446B6 (en) | 2017-07-07 | 2017-07-07 | Means for cryopreservation of human or animal cells |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ309446B6 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ309716B6 (en) * | 2019-12-12 | 2023-08-16 | Bioinova, A.S. | A preparation for treating degenerative damage to the retina |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998046072A1 (en) * | 1997-04-15 | 1998-10-22 | Biostore New Zealand Limited | Compositions for the preservation of living biological materials and methods of their use |
EP1647186A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-19 | Nipro Corporation | Cell-preservation liquid |
US20110008300A1 (en) * | 2008-03-19 | 2011-01-13 | Cryo-Save Ag | Cryopreservation of Adipose Tissue for the Isolation of Mesenchymal Stem Cells |
-
2017
- 2017-07-07 CZ CZ2017-396A patent/CZ309446B6/en unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998046072A1 (en) * | 1997-04-15 | 1998-10-22 | Biostore New Zealand Limited | Compositions for the preservation of living biological materials and methods of their use |
EP1647186A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-19 | Nipro Corporation | Cell-preservation liquid |
US20110008300A1 (en) * | 2008-03-19 | 2011-01-13 | Cryo-Save Ag | Cryopreservation of Adipose Tissue for the Isolation of Mesenchymal Stem Cells |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Biomedical Reports (March 2017) Vol. 6, No. 3, pp. 314-318; ISSN: 2049-9434. E-ISSN: 2049-9442 * |
Cryobiology (June 2012) Vol. 64, No. 3, pp. 240-244; ISSN: 0011-2240; E-ISSN: 1090-2392; Campbell, L. H. et al:"Culturing with trehalose produces viable endothelial cells after cryopreservation" * |
NIE, Ying; DE PABLO, Juan J.; PALECEK, Sean P. Platelet cryopreservation using a trehalose and phosphate formulation. Biotechnology and bioengineering, 2005, 92.1: 79-90. ISSN: 0006-3592 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ2017396A3 (en) | 2019-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Marquez-Curtis et al. | Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: biological, clinical and cryopreservation aspects | |
Yong et al. | Review of non-permeating cryoprotectants as supplements for vitrification of mammalian tissues | |
CA2719806A1 (en) | Method, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue | |
US20220202876A1 (en) | Viable lyophilized compositions derived from human tissues and methods of making the same | |
KR102253850B1 (en) | Cryopreservation solution for mammalian cells | |
JP7401865B2 (en) | Methods for obtaining enriched populations of functional mesenchymal stem cells, cells obtained thereby, and compositions comprising the cells | |
US10104881B2 (en) | Composition comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids, and plant protein hydrolysates as active ingredients for cryopreservation of stem cells or primary cells | |
CN104145943A (en) | Cryopreservation protection liquid for Wharton jelly tissues of human umbilical cord and preparation and application of cryopreservation protection liquid | |
CZ309446B6 (en) | Means for cryopreservation of human or animal cells | |
CZ2016284A3 (en) | A device for storage, transport and application of stem cells | |
Huang et al. | Cryopreservation of human T lymphocytes under fast cooling with controlled ice nucleation in cryoprotective solutions of low toxicity | |
TWI837281B (en) | Cell cryopreservation solution and gradual freezing method of cells | |
CZ31206U1 (en) | A preparation for preserving human or animal cells at very low temperatures | |
WO2024149047A1 (en) | Cryopreservation solution based on liquid-liquid condensed phase, preparation method therefor and use thereof | |
CZ30270U1 (en) | A means for storage, transportation and application of stem cells | |
CZ2018116A3 (en) | Method of preserving animal cells | |
Marquez-Curtis et al. | Cryopreservation of mesenchymal stromal cells 2 derived from various tissues 3 |