CZ30270U1 - A means for storage, transportation and application of stem cells - Google Patents
A means for storage, transportation and application of stem cells Download PDFInfo
- Publication number
- CZ30270U1 CZ30270U1 CZ2016-33101U CZ201633101U CZ30270U1 CZ 30270 U1 CZ30270 U1 CZ 30270U1 CZ 201633101 U CZ201633101 U CZ 201633101U CZ 30270 U1 CZ30270 U1 CZ 30270U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- mmol
- solution
- hours
- mscs
- Prior art date
Links
- 238000003860 storage Methods 0.000 title claims description 30
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 73
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 46
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 37
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 20
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 20
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 20
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 10
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 7
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 7
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- -1 glucose disaccharide Chemical class 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108010013480 succinylated gelatin Proteins 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- QEDVGROSOZBGOZ-WXXKFALUSA-N (e)-but-2-enedioic acid;n-[2-[[2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenoxy)propyl]amino]ethyl]morpholine-4-carboxamide Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.C=1C=C(O)C=CC=1OCC(O)CNCCNC(=O)N1CCOCC1.C=1C=C(O)C=CC=1OCC(O)CNCCNC(=O)N1CCOCC1 QEDVGROSOZBGOZ-WXXKFALUSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108700042768 University of Wisconsin-lactobionate solution Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002180 anti-stress Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009583 bone marrow aspiration Methods 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 description 1
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 231100000075 skin burn Toxicity 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000001912 transporting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 210000001644 umbilical artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Technické řešení se týká prostředku pro uchování, transport a aplikaci kmenových buněk k léčebnému použití, tvořeného pufrovaným vodným roztokem trehalózy, určeného pro uchování kmenových buněk po nezbytnou dobu před jejich aplikací pacientovi při teplotě kolem 4 °C. Dosavadní stav technikyThe invention relates to a device for the preservation, transport and administration of stem cells for medical use, consisting of a buffered aqueous solution of trehalose, intended to preserve the stem cells for a necessary period of time before administration to a patient at a temperature of about 4 ° C. BACKGROUND OF THE INVENTION
Využití kmenových buněk, zejména mezenchymálních kmenových buněk (MSCs - mesenchymal stem cells), je v současné době na vzestupu díky jejich výrazným imunomodulačním, protizánětlivým a antioxidačním vlastnostem. Kmenové buňky dále produkují nejrůznější parakrinní faktory prospěšné pro regeneraci postižené tkáně a zároveň jsou schopny se diferencovat do buněk postižené tkáně. Pro tyto vlastnosti jsou využívány v moderní medicíně k léčení různých onemocnění.The use of stem cells, especially mesenchymal stem cells (MSCs), is currently on the rise due to their marked immunomodulatory, anti-inflammatory and antioxidant properties. In addition, the stem cells produce a variety of paracrine factors beneficial to the regeneration of the affected tissue while being able to differentiate into the cells of the affected tissue. Because of these properties, they are used in modern medicine to treat various diseases.
Před aplikací MSCs určených k terapeutickým účelům je třeba jejich důkladná charakterizace a testování. Je většinou nutné potvrdit jejich bezpečnost (testy sterility, přítomnost endotoxinů a mykoplazmat) ajejich identitu (povrchové znaky). MSCs je třeba transportovat z místa výroby do místa podání buněk pacientovi. Všechny tyto procedury prodlužují dobu uskladnění buněk po sklizni (po ukončení jejich výroby) a zvyšují nároky na prodlouženou životaschopnost buněk. Jak uvádí Sohn a kolektiv (Cytotherapy, 2013), viabilita MSCs v solném roztoku klesá již po dvouhodinové kultivaci.Thorough characterization and testing of MSCs for therapeutic purposes is required. It is usually necessary to confirm their safety (sterility tests, the presence of endotoxins and mycoplasmas) and their identity (surface features). MSCs need to be transported from the site of manufacture to the site of cell administration to the patient. All these procedures prolong the shelf life of the cells after harvesting (after the end of their production) and increase the demand for prolonged cell viability. As reported by Sohn et al (Cytotherapy, 2013), the viability of MSCs in saline decreases after two hours of culture.
Pro uchování buněk se využívá většinou modifikovaných roztoků primárně vyvinutých pro transport orgánů (US 7951590 B2, US 6045990 A, WO 2010064054 AI).Mostly modified solutions primarily developed for the transport of organs are used for cell preservation (US 7951590 B2, US 6045990 A, WO 2010064054 A1).
Použití různých roztoků pro dlouhodobé uchování mezenchymálních kmenových buněk je popsáno také v následujících publikacích. Ginis a kolektiv (Tissue Eng Part C Methods, 2012; testovali uchování adherentních mezenchymálních kmenových buněk v roztoku Hypothermosol® FRS při 4 °C. Viabilita takto uchovaných buněk se pohybovala mezi 70-80 % po 2-4 denním skladování. Chen a kolektiv (Cell Transplant, 2013) testovali uchování buněk v roztoku Plasmalyte obsahujícím lidské sérum a dextrózu. Další komerčně dostupné roztoky (HBSS a ViaSpan®) testovali autoři Corwin a kolektiv (Cryobiology, 2014). Viabilita MSCs po 48 hodinovém uložení Při 4 °C byla 45 %. Publikace Pogozhykha a kolektivu (PLoS One, 2015) popisuje přibližně 50%, zachování životaschopnosti MSCs po 24 hodinovém uskladnění buněk při 4 °C v kultivačním médiu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) s 10% fetálním bovinním sérem.The use of various solutions for long-term preservation of mesenchymal stem cells is also described in the following publications. Ginis et al. (Tissue Eng Part C Methods, 2012; tested retention of adherent mesenchymal stem cells in Hypothermosol® FRS solution at 4 ° C. The viability of the cells so preserved ranged between 70-80% after 2-4 days storage. Chen et al. Cell Transplant, 2013) tested cell retention in Plasmalyte solution containing human serum and dextrose Other commercially available solutions (HBSS and ViaSpan®) were tested by Corwin et al (Cryobiology, 2014) The viability of MSCs after 48 hours storage at 4 ° C was 45 Pogozhykha et al. (PLoS One, 2015) describes approximately 50% maintaining MSCs viability after 24 hours storage of cells at 4 ° C in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum.
Popisované roztoky obsahují celou řadu látek, které by po dobu uchování buněk měly udržovat správné pH, zajišťovat optimální osmolaritu roztoku, chránit buňky před intracelulámím edémem, kontrakci, volnými radikály, apoptózou a dalšími negativními vlivy hypotermie.The solutions described contain a variety of substances that should maintain the correct pH, maintain optimal solution osmolarity, protect cells from intracellular edema, contraction, free radicals, apoptosis, and other negative effects of hypothermia throughout the cell retention period.
Trehalóza, disacharid glukózy, která je syntetizována nižšími organizmy v případech, kdy jsou vystaveny stresu, chladu, vysokým teplotám nebo vysušení, je známa jako protistresový faktor.Trehalose, a glucose disaccharide that is synthesized by lower organisms when exposed to stress, cold, high temperatures or desiccation, is known as an anti-stress factor.
Je hojně využívána v humánní medicíně, například pro zabránění úbytku vody v buňkách (dehydrataci), při vystaveni buněk nadměrnému teplu, chladu nebo kyslíkovým radikálům, proti účinkům hypoxie až anoxie a proti hypoxicko-reoxygenačnímu poškození. Díky svým jedinečným vlastnostem je trehalóza využívána v potravinářském, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu.It is widely used in human medicine, for example to prevent water loss in cells (dehydration), when exposed to excessive heat, cold or oxygen radicals, against the effects of hypoxia to anoxia and against hypoxic-reoxygenation damage. Due to its unique properties, trehalose is used in the food, pharmaceutical and cosmetic industries.
Předpokládá se, že trehalóza zabraňuje denaturaci a inaktivaci proteinů a chrání lipidovou dvojvrstvu buněčných membrán proti poškození, Trehalóza pravděpodobně slouží i jako zdroj uhlíku a glukózy pro zajištění buněčných funkci, dále jako pohlcovač volných radikálů a poskytuje ochranu proti oxidačnímu stresu. Proto je v některých případech využívaná v roztocích pro dlouhodobé uchování tkání a buněk v podmínkách hypotermie, při kryoprezervaci a lyofylizaci (mrazovém vysoušení).It is believed that trehalose prevents protein denaturation and inactivation and protects the lipid bilayer of cell membranes against damage. Trehalose probably also serves as a source of carbon and glucose to provide cellular function, as a free radical scavenger and provides protection against oxidative stress. Therefore, in some cases it is used in solutions for the long-term preservation of tissues and cells under hypothermia, cryopreservation and freeze-drying.
Patent WO 2014208053 AI popisuje využití různých fyziologických roztoků s přídavkem dextranů a trehalózy vhodných pro transplantaci savčích buněk.WO 2014208053 A1 discloses the use of various saline solutions with the addition of dextrans and trehalose suitable for mammalian cell transplantation.
CZ 30270 UlCZ 30270 Ul
Trehalóza je také součásti roztoků pro uchování a transplantaci orgánů chráněných patenty US 6365338 Bl a US 8512940 B2.Trehalose is also part of solutions for the preservation and transplantation of organs protected by patents US 6365338 B1 and US 8512940 B2.
Patentová přihláška US 20150351380 Al popisuje, mimo jiné, přidání trehalózy do roztoku pro uchování buněk pro regenerativní medicínu.US patent application 20150351380 A1 describes, inter alia, the addition of trehalose to a cell preservation solution for regenerative medicine.
Patentová přihláška US 20130260461 Al popisuje roztok obsahující trehalózu a kmenové buňky, který potlačuje shlukování a zvyšuje životaschopnost těchto buněk.US patent application 20130260461 A1 discloses a solution containing trehalose and stem cells which suppresses clumping and increases the viability of these cells.
V článku Di a kolektivu (J Cell Physiol. 2012) je uvedeno, že přítomnost trehálózy v roztoku pro uchovávání mezenchymálnlch kmenových buněk výrazně zvyšuje jejich viabililtu při skladování při teplotě 4 °C, přičemž nejlepších výsledků bylo dosaženo s koncentrací 40 mM trehalózy.In Di et al (J Cell Physiol. 2012), the presence of trehalose in a mesenchymal stem cell storage solution significantly increases their viability when stored at 4 ° C, with best results at a concentration of 40 mM trehalose.
Většina těchto roztoků byla původně vyvinuta pro transport orgánů určených k transplantaci a nejsou primárně určeny pro aplikaci pacientovi. Tyto roztoky se většinou skládají z velkého počtu anorganických solí, organických kyselin, sacharidů, polysacharidů, antioxidantů, pufrovacích a chelatačních činidel, stabilizátorů nebo antiapoptotických faktorů, které nemusí být ve všech případech schváleny pro lidské použití při intravenózním, intraarteriálním, intramuskulárním, intratekálním, subkutánním, subkunjunktiviálním, lokálním a jiném podání.Most of these solutions were originally developed for the transport of organs to be transplanted and are not primarily intended for administration to a patient. These solutions mostly consist of a large number of inorganic salts, organic acids, carbohydrates, polysaccharides, antioxidants, buffering and chelating agents, stabilizers or anti-apoptotic factors, which may not in all cases be approved for human use in intravenous, intraarterial, intramuscular, intrathecal, subcutaneous , subcunjunctivial, topical and other administration.
Podstata technického řešeníThe essence of the technical solution
Výše uvedené nedostatky odstraňuje prostředek pro uchování, transport a aplikaci kmenových buněk k léčebnému použití, tvořený pufrovaným vodným roztokem trehalózy. Tento roztok obsahuje jako nezbytné složky kationty K+ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Na+ v množství 20 až 80 mmol/1; anionty Cl' v množství 0,5 až 40 mmol/1, anionty PO43' a/nebo HPO42', a/nebo H2PO4' v celkovém množství 20 až 65 mmol/1, a trehalózu v množství 60 až 300 mmol/1. Koncentrace uvedených složek jsou v rámci uvedeného rozmezí voleny tak, aby hodnota pH roztoku byla 7,1 až 7,6. V nejjednodušším provedení technického řešení nemusí prostředek podle technického řešení obsahovat žádné další záměrně přidávané složky. V každém případě, optimální celková osmolarita roztoku není vyšší než 400 mosmol/1.The above-mentioned drawbacks are eliminated by means of a buffered aqueous trehalose solution for the preservation, transport and administration of stem cells for medical use. This solution contains 20-50 mmol / l K + cations as necessary and 20-80 mmol / l Na + cations; anions Cl 'in an amount of 0.5 to 40 mmol / l, anions PO4 3 ' and / or HPO4 2 ', and / or H2PO4' in a total amount of 20 to 65 mmol / l, and trehalose in an amount of 60 to 300 mmol / l . Concentrations of said components are selected within the range so that the pH of the solution is 7.1 to 7.6. In the simplest embodiment of the invention, the composition according to the invention need not contain any other intentionally added components. In any case, the optimum total osmolarity of the solution is not more than 400 mosmol / L.
V dalších provedeních technického řešení roztok dále může obsahovat kationty Mg2+ a/nebo Ca2+ v celkovém množství 0 až 2 mmol/1 a anionty S042' a/nebo HSO4' v celkovém množství 0 až 2 mmol/1. Jestliže jsou kationty Mg2+ a/nebo Ca2+ přítomny jako záměrně přidaná složka, jsou v roztoku obsaženy v celkovém množství 0,1 až 2 mmol/1. Jestliže jsou anionty S042' a/nebo HSO4' přítomny jako záměrně přidaná složka, jsou v roztoku obsaženy v celkovém množství 0,5 až 2 mmol/1.In other embodiments, the solution may further comprise cations of Mg 2+ and / or Ca 2+ in a total amount of 0 to 2 mmol / L and anions SO 4 2 'and / or HSO 4' in a total amount of 0 to 2 mmol / L. If the Mg 2+ and / or Ca 2+ cations are present as a deliberately added component, they are contained in the solution in a total amount of 0.1 to 2 mmol / l. If the SO 4 2 'and / or HSO 4' anions are present as a deliberately added component, they are present in the solution in a total amount of 0.5 to 2 mmol / l.
Ve výhodném provedení technického řešení roztok obsahuje kationty K+ v množství 28 až 32 mmol/1, kationty Na+ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Mg2+ a/nebo Ca2+ v celkovém množství 0,4 až 1,2 mmol/1, anionty Cl' v množství 0,5 až 20 mmol/1, anionty PO43' a/nebo HPO42' a/nebo H2PO4' v celkovém množství 40 až 50 mmol/1, anionty SO42' a/nebo HSO4' v celkovém množství 0,9 až 1,2 mmol/1.In a preferred embodiment, the solution contains K + cations in an amount of 28 to 32 mmol / l, Na + cations in an amount of 20 to 50 mmol / l, Mg 2+ and / or Ca 2+ cations in a total amount of 0.4 to 1, 2 mmol / l, anions Cl 'in an amount of 0.5 to 20 mmol / l, anions PO4 3 ' and / or HPO4 2 'and / or H2PO4' in a total amount of 40 to 50 mmol / l, anions SO4 2 'and / or or HSO4 'in a total amount of 0.9 to 1.2 mmol / l.
Ve zvláště výhodných provedeních technického řešení roztok obsahuje trehalózu v množství 230 až 270 mmoí/1.In particularly preferred embodiments, the solution contains trehalose in an amount of 230 to 270 mmol / l.
Zvláště výhodné je, když vodný roztok neobsahuje vedle kationtů K+, kationtů Na+, kationtů Mg2+ a/nebo Ca2+, aniontů Cl', aniontů PO43 a/nebo HPO42' a/nebo H2PO4', aniontů SO42' a/nebo HSO4' a trehalózy žádné další záměrně přidané složky. Samozřejmě nelze vyloučit, že v roztoku jsou stopová množství látek, jejichž přítomnost je podmíněna výrobou nebo jinak náhodná.It is particularly preferred that the aqueous solution does not contain, in addition to K + cations, Na + cations, Mg 2+ and / or Ca 2+ cations, Cl 1 anions, PO 4 3 anions and / or HPO 4 2 'and / or H2PO 4 ', SO4 2 anions and / or HSO4 'and trehalose no other deliberately added ingredients. Of course, it cannot be excluded that there are trace amounts of substances in the solution, the presence of which is conditioned by production or otherwise accidental.
Prodloužení skladovatelnosti kmenových buněk před podáním pacientovi je nutné kvůli možnosti otestovat jejich sterilitu, což je nezbytný krok před každým podáním buněk pacientovi. Prodloužení skladovatelnosti a uchování životaschopnosti buněk je nutné i pro možnost transportu buněk na větší vzdálenosti.Prolonging the shelf life of the stem cells prior to administration to the patient is necessary to test their sterility, which is a necessary step before each administration of the cells to the patient. Prolonging shelf life and maintaining cell viability is also necessary for the possibility of transporting cells over longer distances.
Konkrétněji prostředek podle technického řešení je určen k uskladnění buněk při teplotě -4 °C až 25 °C, s výhodou 0 °C až 8 °C, nejčastěji 4 °C až 6 °C. Dostatečná životaschopnost buněk je přitom zachována po dobu minimálně 72 hodin. Prostředek podle technického řešení se skládá More particularly, the composition of the invention is intended to store cells at a temperature of -4 ° C to 25 ° C, preferably 0 ° C to 8 ° C, most often 4 ° C to 6 ° C. Sufficient cell viability is maintained for at least 72 hours. The device according to the invention consists
CZ 30270 Ul z farmaceuticky přijatelných sloučenin a muže být použit přímo k aplikaci kmenových buněk, které jsou v něm uchovány.U1 from pharmaceutically acceptable compounds and can be used directly to deliver the stem cells stored therein.
V souladu s tím může být prostředek podle technického řešení použit k prodloužení životaschopnosti kmenových buněk, například při teplotě 0 °C až 8 °C po dobu až 72 hodin.Accordingly, the composition of the invention can be used to extend stem cell viability, for example at 0 ° C to 8 ° C for up to 72 hours.
Prostředek podle technického řešení je určen zejména pro uchování mezenchymálních kmenových buněk získaných z kostní dřeně, tukové tkáně, periferní krve nebo z extraembryonálních tkání (placenta, pupečník, pupečníková krev) nebo embryonálních, nervových, indukovaných nebo limbálních kmenových buněk savců včetně člověka. Může sloužit také k uchování kmenových buněk uchycených na biologickém nosiči.The composition according to the invention is particularly intended for the preservation of mesenchymal stem cells obtained from bone marrow, adipose tissue, peripheral blood or extraembryonic tissues (placenta, umbilical cord, cord blood) or embryonic, neural, induced or limbal stem cells of mammals including humans. It can also serve to preserve stem cells attached to a biological carrier.
Prostředek podle technického řešení obsahující příslušné kmenové buňky je určen k léčbě zánětlivých onemocnění včetně posttraumatické zánětlivé reakce po poškození nebo úrazu a také k léčbě degenerativních a neurodegenerativních onemocnění. Prostředek podle technického řešení obsahující příslušné kmenové buňky lze dále využít při léčbě traumat, vývojových vad, hojení ran a popálenin kůže, k náhradě tkání, léčbě nemocí pohybového aparátu (šlachy, klouby, zánětlivá onemocnění - artritida, osteoartritida), kostních defektů, diabetů, mrtvice, kardiologických a onkologických onemocnění.The composition according to the invention comprising the respective stem cells is intended for the treatment of inflammatory diseases including post-traumatic inflammatory reaction after injury or injury as well as for the treatment of degenerative and neurodegenerative diseases. The composition according to the invention containing the respective stem cells can further be used in the treatment of traumas, developmental defects, wound healing and skin burns, tissue replacement, musculoskeletal diseases (tendons, joints, inflammatory diseases - arthritis, osteoarthritis), bone defects, diabetes, stroke, cardiological and oncological diseases.
Kmenové buňky uchované v prostředku podle technického řešení mohou být aplikovány bez nutnosti odmytí tohoto prostředku přímo pacientovi zejména intravenózně, intraarteriálně, intramuskulámě, subkutánně, subkunjunktiviálně nebo intratekálně, a to buď samostatně, nebo s nosičem.Stem cells retained in the composition of the present invention may be administered without the need to wash the composition directly to the patient, particularly intravenously, intraarterially, intramuscularly, subcutaneously, subcunjunctivally or intrathecally, either alone or with a carrier.
Nosičem kmenových buněk mohou být funkční biomateriály. Může se jednat o syntetické biokompatibilní polymery (kyselina polylaktidová PLA, kyselina polyglykolová PGA, polyethylenglykol PEG, polykaprolakton PCL, polyhydroxybutyrát PHB a další), přírodní polymery a polysacharidy (kolagen typu I, hyaluronová kyselina, fibrin, chitosan, celulóza, škrob a další) nebo extracelulámí matrice (ECM) ve formě hydrogelu, nanovláken nebo mikrovláken. Nosičem může být biodegradabilní i nedegradabilní materiál.Stem cell carriers may be functional biomaterials. They can be synthetic biocompatible polymers (polylactidic acid PLA, polyglycolic acid PGA, polyethylene glycol PEG, polycaprolactone PCL, polyhydroxybutyrate PHB and others), natural polymers and polysaccharides (collagen type I, hyaluronic acid, fibrin, chitosan, cellulose, starch and others) or extracellular matrix (ECM) in the form of hydrogel, nanofibres or microfibers. The carrier can be both biodegradable and non-degradable material.
Alternativně se pro aplikace, které počítají s nosičem, mohou kultivace kmenových buněk provádět v přítomnosti těchto nosičů a společně uchovávat a aplikovat v prostředku podle technického řešení.Alternatively, for carrier-counting applications, stem cell cultures can be carried out in the presence of these carriers and co-stored and applied in a composition according to the invention.
Alternativně se mohou kmenové buňky uchovávat v prostředku podle technického řešení a před aplikací pacientovi smíchat s biokompatibilními nosiči a podávat pacientovi společně.Alternatively, the stem cells may be stored in the composition of the present invention and mixed with the biocompatible carriers prior to administration to the patient and administered together to the patient.
Objasněni výkresuClarification of the drawing
Na připojených vyobrazeních jsou mikrofotografie diferencovaných mezenchymálních kmenových buněk (BM-MSCs) z kostní dřeně po 72 hodinovém skladování v roztoku podle technického řešení v chladových podmínkách. Obrázky ilustrují schopnost BM-MSCs diferencovat do buněk adipocytů, chondrocytů a osteocytů.The attached drawings are photomicrographs of differentiated mesenchymal stem cells (BM-MSCs) from bone marrow after 72 hours of storage in solution according to the invention under cold conditions. The figures illustrate the ability of BM-MSCs to differentiate into adipocyte, chondrocyte and osteocyte cells.
Obrázky ilustrují:The pictures illustrate:
obr. lAadipogenní, obr. IB chondrogenní a obr. 1C osteogenní diferenciaci.1Aadipogenic, 1B chondrogenic, and 1C osteogenic differentiation.
Příklady uskutečnění technického řešeníExamples of technical solutions
Příklad 1: izolace a kultivace MSCs z kosím dřeně (BM-MSCs)Example 1: Isolation and cultivation of MSCs from scythe (BM-MSCs)
Aspirace kostní dřeně byla provedena trepanobioptickou jehlou, která je součástí odběrového setu obsahujícího fyziologický roztok s heparinem a gentamicinem. Po transportu kostní dřeně do prostor pro sterilní zpracování biologického materiálu byl vzorek smíchán s infuzním roztokem Gelofusinu. Množství přidaného Gelofúsinu odpovídalo 25 % objemu kostní dřeně. Směs sedimentovala 10-30 minut a poté byla odebrána vrstva prstence mononukleámích buněk. V odebrané vrstvě buněk byla analyzována buněčnost směsi hematologickým analyzátorem. Do každéBone marrow aspiration was performed with a trepanobioptic needle, which is part of a collection set containing saline with heparin and gentamicin. After transporting the bone marrow to the sterile processing area of the biological material, the sample was mixed with a Gelofusin infusion solution. The amount of Gelofusin added corresponded to 25% of the bone marrow volume. The mixture sedimented for 10-30 minutes and then the mononuclear cell ring layer was removed. In the harvested cell layer, the cellularity of the mixture was analyzed by a hematology analyzer. Into each
CZ 30270 Ul z připravených kultivačních lahví o ploše 75 cm2 bylo přidáno 10 ml kompletního kultivačního média (médium Alpha MEM Eagle obsahující 5% lidský destičkový lyzát a gentamicin) a definované množství suspenze izolovaných buněk (5-10 milionu jaderných buněk) pro nasazení primokultury. Kultivace buněk probíhala při teplotě 37 ± 0,5 °C. V průběhu kultivace buněk probíhala průběžná výměna kompletního kultivačního média s případným oplachem buněk pomocí 10 ml pufru PBS na jednu kultivační láhev. Dle množství rostoucích buněk probíhalo jejich pasážování, tedy řízené enzymatické odloučení adherujících buněk a jejich přenesení na větší kultivační plochu. Tento proces vždy začal optickou kontrolou kultury pod mikroskopem; optimální pro růst kultury bylo dosažení 80-90% pokrytí buněk kultivačního dna. Pro pašážování bylo nutné odsátí kultivačního média, oplach kultury 10 ml pufru PBS a přidání 1 ml roztoku enzymu TrypLE Selecí CTS. Kultivační lahve byly cca 4 minuty inkubovány při 37 ± 0,5 °C. Správný průběh enzymatické reakce byl kontrolován pod mikroskopem. Pokud se buňky pohybovaly s proudící kapalinou po poklepání kultivační lahve, byl do každé lahve přidán 1 ml infuzního roztoku 20% HSA (lidský sérový albumin) a 6 ml pufru PBS. Tato směs byla promíchána jemným nasátím a vysátím z pipety a byla převedena do centrifugační zkumavky a centrifugována (230 g, 5 minut). Peleta buněk byla resuspendována v kompletním kultivačním médiu a suspenze buněk rozdělena na požadované množství kultivačních lahví. Třetím pasážováním buněk bylo dosaženo finální suspenze buněk. Ta byla navíc ještě jednou promyta pufrem PBS a centrifugována (230 g, 5 minut).10 ml of complete culture medium (Alpha MEM Eagle medium containing 5% human platelet lysate and gentamicin) and a defined amount of isolated cell suspension (5-10 million nuclear cells) for primoculture were added from the prepared 75 cm 2 culture flasks. . The cells were cultured at 37 ± 0.5 ° C. During cell culture, the complete culture medium was continuously exchanged with optional cell rinsing with 10 ml PBS buffer per culture flask. Depending on the number of growing cells, their passage, that is, the controlled enzymatic separation of adherent cells and their transfer to a larger cultivation area. This process has always begun by optical inspection of the culture under a microscope; optimal for the growth of the culture was to achieve 80-90% coverage of the culture bottom cells. For smuggling, aspirating the culture medium, rinsing the culture with 10 ml of PBS buffer and adding 1 ml of TrypLE enzyme solution by CTS selection were necessary. The culture flasks were incubated at 37 ± 0.5 ° C for about 4 minutes. The correct course of the enzymatic reaction was checked under a microscope. If cells were moving with flowing liquid after tapping the culture flask, 1 ml of 20% HSA (human serum albumin) infusion solution and 6 ml PBS buffer were added to each flask. This mixture was mixed by gentle suction and pipet suction and transferred to a centrifuge tube and centrifuged (230 g, 5 minutes). The cell pellet was resuspended in complete culture medium and the cell suspension was divided into the required number of culture flasks. The third passage of the cells resulted in a final cell suspension. This was additionally washed once with PBS and centrifuged (230 g, 5 minutes).
Pro vytvoření přípravku podle provedení technického řešení byla peleta získaná výše uvedeným postupem resuspendována v roztoku přípravku uvedeném v příkladu 4A (s 250 mM trehalózou, který je dále označován TR-Y 250), 4B (s 200 mM trehalózou, označovaném TR Y 200) a v roztoku Hypothermosolu® FRS (označovaném zde HTS).To form the formulation of the invention, the pellet obtained by the above procedure was resuspended in a solution of the formulation of Example 4A (with 250 mM trehalose, hereinafter referred to as TR-Y 250), 4B (with 200 mM trehalose, referred to as TR Y 200), and in a solution of Hypothermosol® FRS (referred to herein as HTS).
Obsah kmenových buněk byl zpravidla 5 χ 105 až 1 χ 107 MSCs/ml. Při intravenózní aplikaci se může podávat například 1 χ 106 MSCs/kg hmotnosti pacienta.Stem cell content was generally 5 χ 10 5 to 1 χ 10 7 MSCs / ml. For intravenous administration, for example, 1 × 10 6 MSCs / kg patient weight may be administered.
Příklad 2: Izolace tukových MSCs (AT-MSCs)Example 2: Isolation of Fat MSCs (AT-MSCs)
Lipoaspirát o objemu 40-200 ml byl odebrán pomocí standardní tumescenční liposukce od dobrovolných dárců. AT-MSCs byly izolovány z lipoaspirátu 60 minutovou enzymatickou digescí pomocí 0,3 U/ml enzymu Collagenase NB 6 GMP Grade. Digestovaný lipoaspirát byl promyt pufrem PBS a centrifugován při 230 g, 5 minut při pokojové teplotě. Vzniklá peleta na dně zkumavky byla resuspendována v kultivačním médiu a nasazena na kultivační lahve o ploše 75 cm2. Dále bylo postupováno podle příkladu 1.A 40-200 ml lipoaspirate was collected using standard tumescence liposuction from volunteer donors. AT-MSCs were isolated from lipoaspirate by 60 minute enzymatic digestion with 0.3 U / ml Collagenase NB 6 GMP Grade enzyme. The digested lipoaspirate was washed with PBS and centrifuged at 230 g for 5 minutes at room temperature. The resulting pellet at the bottom of the tube was resuspended in culture medium and seeded onto 75 cm 2 culture flasks. Example 1 was followed.
Příklad 3: Izolace pupečníkových MSCs (WJ-MSCs)Example 3: Isolation of umbilical cord MSCs (WJ-MSCs)
Lidský pupečník byl získán od zdravých novorozenců ihned po porodu. Pupečníkové arterie a véna byly odstraněny a pupečníková tkáň (Whartonův gel, WJ) byla nakrájena na malé kousky (cca 1 - 2 mm3). MSCs z umbilikální tkáně byly izolovány explantátovou metodou nebo enzymatickou digescí. Při explantátové metodě byly kousky tkáně vysazeny do kultivační lahve, ze které byly po 10 dnech odmyty. Buňky, které vycestovaly z WJ a přisedly na plast, byly dále kultivovány a zpracovány podle příkladu 1. Buněčná suspenze vzniklá po enzymatické digescí byla dále zpracována a kultivována podle příkladu 2.Human umbilical cord was obtained from healthy newborns immediately after delivery. Umbilical arteries and vein were removed and the umbilical cord tissue (Wharton's gel, WJ) was cut into small pieces (about 1-2 mm 3 ). MSCs from umbilical tissue were isolated by explants or by enzymatic digestion. In the explanter method, pieces of tissue were placed in a culture flask and washed off after 10 days. The cells that exited the WJ and sat on the plastic were further cultured and processed according to Example 1. The cell suspension resulting from enzymatic digestion was further processed and cultured according to Example 2.
Příklad 4: Možné přípravy 100 ml prostředku (roztoku) podle technického řešeníExample 4: Possible preparations of 100 ml of a composition (solution) according to the invention
Příklad 4A. Příprava roztoku podle technického řešení s 250 mM trehalózou (TR-Y 250). Navážíme 0,408 g KH2P04 a 0,213 g Na2HPO4, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCl2 x 2H2O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO4 a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 9,45 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 358 mosm.Example 4A. Preparation of solution according to the invention with 250 mM trehalose (TR-Y 250). Weigh 0.408 g KH 2 PO 4 and 0.213 g Na 2 HPO 4 , dissolve in 20 ml distilled water; weigh 0.007 g of CaCl 2 x 2H 2 O and dissolve in 10 ml of distilled water; weighed 0.012 g MgSO 4 and dissolved in 10 ml of distilled water. Mix the prepared solutions and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 9.45 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 358 mosm.
Příklad 4B. Příprava roztoku podle technického řešení s 200 mM trehalózou (TR-Y 200).Example 4B. Preparation of the solution according to the invention with 200 mM trehalose (TR-Y 200).
Navážíme 0,408 g KH2PO4, a 0,213 g Na2HPO4, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCl2 x 2H2O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO4 a rozCZ 30270 Ul pustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 7,56 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 308 mosm.Weigh 0.408 g KH 2 PO 4 , and 0.213 g Na 2 HPO 4 , dissolve in 20 ml distilled water; weigh 0.007 g of CaCl 2 x 2H 2 O and dissolve in 10 ml of distilled water; weighed 0.012 g MgSO 4, and we go rozCZ 30,270 IU in 10 ml distilled water. Mix the prepared solutions and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 7.56 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 308 mosm.
Příklad 4C. Příprava roztoku podle technického řešení s 250 mM trehalózou.Example 4C. Preparation of solution according to the invention with 250 mM trehalose.
Navážíme 0,816 g KH2PO4 a 0,426 g Na2HPO4, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,014 g CaCl2 x 2H2O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,024 g MgSO4 a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4 a doplníme do 100 ml destilovanou vodou (vznikne směs 1).Weigh 0,816 g KH2PO4 and 0,426 g Na 2 HPO 4 , dissolve in 20 ml distilled water; weigh 0.014 g of CaCl 2 x 2H 2 O and dissolve in 10 ml of distilled water; weighed 0.024 g MgSO 4 and dissolved in 10 ml of distilled water. Mix the solutions thus prepared and adjust the pH to 7,4 and make up to 100 ml with distilled water (mixture 1).
Rozpustíme 37,8 g trehalózy v destilované vodě a doplníme do 100 ml (vznikne směs 2).Dissolve 37.8 g of trehalose in distilled water and make up to 100 ml (mixture 2).
Výsledný roztok vznikne smícháním tří dílů směsi 2, šesti dílů směsi 1 a tří dílů destilované vody. Úprava pH není potřeba. Výsledná osmolarita roztoku je 358 mosm.The resulting solution is formed by mixing three parts of mixture 2, six parts of mixture 1 and three parts of distilled water. No pH adjustment is required. The resulting osmolarity of the solution is 358 mosm.
Příklad 4D. Příprava TR-Y s 200 mM trehalózou.Example 4D. Preparation of TR-Y with 200 mM trehalose.
Navážíme 0,816 g KH2PO4 a 0,426 g Na2HPO4, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,014 g CaCl2 x 2H2O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,024 g MgSO4 a roz15 pustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4 a doplníme do 100 ml destilovanou vodou (vznikne směs 1).Weigh 0,816 g KH 2 PO 4 and 0,426 g Na 2 HPO 4 , dissolve in 20 ml distilled water; weigh 0.014 g of CaCl 2 x 2H 2 O and dissolve in 10 ml of distilled water; weighed 0.024 g MgSO 4, and we go roz15 in 10 ml distilled water. Mix the solutions thus prepared and adjust the pH to 7,4 and make up to 100 ml with distilled water (mixture 1).
Rozpustíme 37,8 g trehalózy v destilované vodě a doplníme do 100 ml (vznikne směs 2).Dissolve 37.8 g of trehalose in distilled water and make up to 100 ml (mixture 2).
Výsledný roztok vznikne smícháním dvou dílů směsi 2, pěti dílů směsi 1 a tří dílů destilované vody. Úprava pH není potřeba. Výsledná osmolarita roztoku je 308 mosm.The resulting solution is formed by mixing two parts of mixture 2, five parts of mixture 1 and three parts of distilled water. No pH adjustment is required. The resulting osmolarity of the solution is 308 mosm.
Příklad 5: Životaschopnost BM-MSCs, AT-MSCs a WJ-MSCs po 48-72 hodinovém skladováníExample 5: Viability of BM-MSCs, AT-MSCs and WJ-MSCs after 48-72 hours storage
Byla hodnocena životaschopnost MSCs izolovaných z lidské kostní dřeně, tukové a pupečníkové tkáně uchovaných po dobu 48 a 72 hodin pri teplotě okolo 4 °C. MSCs z lidské kostní dřeně, tukové a pupečníkové tkáně byly vyrobeny podle příkladů 1, 2 a 3. MSCs byly sklizeny a resuspendovány v prostředku podle technického řešení podle příkladu 1. Po 48, resp. 72 hodinách byla stanovena životnost buněk na základě tri nezávislých metod.The viability of MSCs isolated from human bone marrow, adipose and umbilical tissue stored for 48 and 72 hours at about 4 ° C was evaluated. MSCs from human bone marrow, adipose, and umbilical cord tissue were made according to Examples 1, 2 and 3. MSCs were harvested and resuspended in the composition of the invention according to Example 1. After 48, respectively. 72 hours of cell viability was determined using three independent methods.
Nejprve byla suspenze barvena propidium jodidem a viabilita buněk stanovena metodou průtokové cytometrie. U buněk s narušenou plazmatickou membránou dochází k vazbě barviva, nepoškozené živé buňky zůstávají neobarvené. Následně bylo vysazeno stejné objemové množství buněk odpovídající počtu 100 000 buněk v čerstvém stavu na 24 a 96 jamkovou kultivační desku.First, the suspension was stained with propidium iodide and cell viability was determined by flow cytometry. In cells with disrupted plasma membranes, dye binding occurs, undamaged living cells remain unstained. Subsequently, equal volumes of cells corresponding to 100,000 fresh cells were seeded in 24 and 96 well culture plates.
Po 24 hodinách byl na buňkách proveden Amalar blue® test (96 jamková destička), který vypovídá o metabolické aktivitě kultivovaných buněk a buňky z 24 jamkové destičky byly sklizeny a spočítány pomocí Bůrkerovy komůrky. Výsledky byly porovnány s výsledky získanými v čase 0 (ihned po sklizni; finální pasáži). Jako kontrolní konzervační roztok byl použit roztok Hypothermosol® FRS (HTS) podle US 8642255.After 24 hours, cells were subjected to the Amalar blue® assay (96 well plate), which reflects the metabolic activity of the cultured cells and cells from the 24 well plate were harvested and counted using a Bürker chamber. The results were compared with those obtained at time 0 (immediately after harvest; final passage). Hypothermosol® FRS (HTS) solution according to US 8642255 was used as a control preservative solution.
Viabilita stanovená barvením propidium jodidem odráží životaschopnost jednotlivých buněk v suspenzi. Propidium jodid je látka, která neprostupuje membránou živých buněk. U poškozených a neživotaschopných buněk se propidium jodid váže na DNA.The viability determined by propidium iodide staining reflects the viability of individual cells in suspension. Propidium iodide is a substance that does not cross the living cell membrane. In damaged and non-viable cells, propidium iodide binds to DNA.
Životaschopnost BM-MSCs sledovaná barvením propidium jodidem bezprostředně po 48 hodinách skladování dosahovala více než 80 % u všech studovaných roztoků (tabulka č. 1). PoThe viability of BM-MSCs measured by propidium iodide staining immediately after 48 hours of storage was more than 80% for all solutions studied (Table 1). After
72 hodinovém skladování klesla asi o 5 % u buněk v roztoku TR-Y 250 a HTS, zatímco v TR-Y72 hours of storage decreased by about 5% in TR-Y 250 and HTS cells, while in TR-Y
200 byl pokles nejvyšší, na hodnotu 73,4 ± 3,1 %. Aby bylo možné posoudit funkčnost BMMSCs po skladování buněk, byly buňky kultivovány přes noc v kompletním médiu s cílem jejich adherence na kultivační plochu. Adherence na kultivační plast je jedním ze znaků kmenových buněk. Adherentní buňky byly sklizeny a pomocí Bůrkerovy komůrky byl stanoven jejich počet.200 was the highest decrease to 73.4 ± 3.1%. To assess the functionality of BMMSCs after cell storage, cells were cultured overnight in complete medium for adherence to the culture area. Adherence to culture plastic is one of the traits of stem cells. Adherent cells were harvested and counted using a Bkerker chamber.
Koeficient adherence byl stanoven jako poměr mezi počtem sklizených a nasazených buněk. Koeficient adheze buněk po 48 hodinách skladování se pohyboval v rozmezí 80-90 % a byl nejvyšší u buněk v roztoku TR-Y 250. Po 72 hodinách skladování bylo pozorováno další snížení, avšak nejnižší hodnoty byly získány u buněk v roztoku HTS (66 ± 4,4 %). Byla sledována také metabolická aktivita adherentních buněk pomocí Alamar blue® testu. Aktivní složka AmalarThe coefficient of adherence was determined as the ratio between the number of cells harvested and seeded. The coefficient of adhesion of cells after 48 hours of storage ranged from 80-90% and was highest in TR-Y 250 cells. After 72 hours of storage, further reductions were observed, but the lowest values were obtained in HTS cells (66 ± 4). , 4%). The metabolic activity of adherent cells was also monitored using the Alamar blue® test. Amalar active ingredient
CZ 30270 Ul blue® testu je sloučenina resazurin, která proniká do všech buněk. Životaschopné, metabolicky aktivní buňky jsou schopny tuto modrou sloučeninu přeměnit na jasně červené fluorescenční barvivo resofurin. Množství fluorescence nebo absorbance je přímo úměrné počtu živých buněk a koresponduje s metabolickou aktivitou buněk. Pro tento účel byly buňky kultivovány přes noc, aby byla zajištěna jejich adherence, následně byl přidán 10% roztok Alamar blue® v kompletním kultivačním médiu a BM-MSCs byly inkubovány po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C. Intenzita fluorescence byla hodnocena na čtečce mikrotitračních destiček při vlnové délce excitace 535 nm a vlnové délce emise 550 nm. Metabolická aktivita adherentních buněk byla prezentována jako poměr mezi intenzitou fluorescence BM-MSCs po 48 nebo 72 hodinách skladování a buněk ze ío stejné skupiny před uskladněním (po sklizni). Dynamika poklesu metabolické aktivity BH-MSCs skladovaných ve studovaných roztocích byla obdobná jako dynamika, poklesu koeficientu adherence buněk.The U1 blue® assay is a resazurin compound that penetrates all cells. Viable, metabolically active cells are able to convert this blue compound into the bright red fluorescent dye resofurin. The amount of fluorescence or absorbance is proportional to the number of viable cells and corresponds to the metabolic activity of the cells. For this purpose, the cells were cultured overnight to ensure their adherence, followed by a 10% Alamar blue® solution in complete culture medium and the BM-MSCs were incubated for 4 hours at 37 ° C. Fluorescence intensity was evaluated on a microplate reader at an excitation wavelength of 535 nm and an emission wavelength of 550 nm. Metabolic activity of adherent cells was presented as the ratio between the fluorescence intensity of BM-MSCs after 48 or 72 hours of storage and cells from the same group before storage (after harvest). The dynamics of decrease of metabolic activity of BH-MSCs stored in studied solutions was similar to dynamics, decrease of coefficient of cell adherence.
Výsledky měření všech parametrů životaschopnosti BM-MSCs shrnuté v tabulce č. 1 ukazují, že nejvhodnějším roztokem pro 48 - 72 hodinové chladové uchování je roztok TR-Y 250. Ko15 merčně dostupný roztok HTS se ukázal jako roztok uchovávající nejnižší viabilitu buněk po 48 hodinovém chladovém skladování BH-MSCs, po 72 hodinovém uchovám BM-HSCs v tomto roztoku byl pouze vjednom ze tří sledovaných parametrů lepší než TR-Y 200.The results of measurements of all BM-MSCs viability summarized in Table 1 show that the most suitable solution for 48-72 hour cold storage is TR-Y 250. The Ko15 commercially available HTS solution has been shown to retain the lowest cell viability after 48 hour cold storage. storage of BH-MSCs, after 72 hours of preservation of BM-HSCs in this solution, only one of the three endpoints was superior to TR-Y 200.
Tabulka 1 - MSCs z kostní dřeněTable 1 - Bone marrow MSCs
(TR-Y 250} přípravek dle technického řešení obsahující 250mM trehalózu; (TR-Y 200) přípravek dle technického řešeni obsahující 200mM trehalózu; (HTS) roztok Hypothermosolu® FRS.(TR-Y 250} formulation according to the invention containing 250 mM trehalose; (TR-Y 200) formulation according to the invention containing 200 mM trehalose; (HTS) Hypothermosol® FRS solution.
Životaschopnost ΑΤ-MSCs po 48 hodinách skladování hodnocena barvením propidium jodidem dosahovala přibližně 95 % u všech studovaných skupin a po 72 hodinách skladování se snížila o 5-7 % (tabulka č. 2). Nicméně parametry buněčné adheze byly po 48 hodinovém skladování o 15 % nižší v porovnání s metodou barvení propidium jodidem. Pro chladové uchování ATMSCs se ukázal jako nejméně vhodný roztok TR-Y 200. Rozdíly mezi TR-Y 250 a HTS se přiThe viability of ΑΤ-MSCs after 48 hours of storage as measured by propidium iodide staining was approximately 95% for all study groups and decreased by 5-7% after 72 hours of storage (Table 2). However, cell adhesion parameters were 15% lower after 48 hours storage compared to the propidium iodide staining method. The TR-Y 200 solution has proven to be the least suitable solution for the cold storage of ATMSCs. The differences between TR-Y 250 and HTS
48 hodinovém chladovém uchování ukázaly jako bezvýznamné, TR-Y 250 byl oproti tomu výrazně lepší u parametrů sledující koeficient adherence a metabolickou aktivitu po 72 hodinách než roztok HTS.The 48-hour cold retention proved to be insignificant, while the TR-Y 250 was significantly better for parameters following the adherence coefficient and metabolic activity after 72 hours than the HTS solution.
CZ 30270 UlCZ 30270 Ul
Tabulka 2 - MSCs z tukové tkáněTable 2 - MSCs from adipose tissue
(TR-Y 250) přípravek dle technického řešení obsahující 250mM trehalózu; (TR-Y 200) přípravek dle technického řešení obsahující 200mM trehalózu; (HTS) roztok Hypothermosolu® FRS.(TR-Y 250) a formulation of the invention comprising 250 mM trehalose; (TR-Y 200) formulation according to the invention comprising 200 mM trehalose; (HTS) Hypothermosol® FRS solution.
Kmenové buňky získané z pupečníkové tkáně uchované v roztoku dle technického řešení obsahujícím 250 mM trehalózu po dobu 48 hodin při 4 °C si zachovaly viabilitu (stanovenou barve5 ním propidíum jodidem) vyšší než 90 %, naproti tomu WJ-MSCs uchované v roztoku HTS si zachovaly viabilitu jen okolo 80 %. Z výsledků v tabulce ě. 3 vyplývá, že hodnoty koeficientu adherence byly v porovnání s metodou barvením propidíum jodidem nižší, avšak dynamika trendů mezi jednotlivými roztoky zůstala stejná. Nejvyšší koeficient adherence WJ-MSCs po 72 hodinách skladování byl ve skupině TR-Y 250 (73,8 ± 4,3 %). Ve všech sledovaných páralo metrech vykazovaly buňky uchované v TR-Y 250 nejvyšší životaschopnost. U WJ-MSCs uchovaných v komerčním roztoku HTS byla ve všech sledovaných parametrech zjištěna nejnižší životnost.Umbilical cord-derived stem cells maintained in solution according to the invention containing 250 mM trehalose for 48 hours at 4 ° C retained viability (determined by staining with iodide) greater than 90%, while WJ-MSCs retained in HTS solution retained viability of only about 80%. From the results in table no. 3 shows that the adherence coefficient values were lower compared to the propidium iodide staining method, but the dynamics of the trends between the individual solutions remained the same. The highest adherence coefficient of WJ-MSCs after 72 hours of storage was in the TR-Y group 250 (73.8 ± 4.3%). The cells retained in the TR-Y 250 showed the highest viability in all the measured few meters. WJ-MSCs stored in a commercial HTS solution were found to have the lowest viability in all endpoints.
Tabulka 3 MSCs z pupečníkové tkáněTable 3 Umbilical cord MSCs
{TR-Y 250) přípravek dle technického řešeni obsahující 250mM trehalózu; {TR-Y 200) přípravek dle technického řešení obsahující 200mM trehalózu; (HTS) roztok Hypothermosolu® FRS.(TR-Y 250) an inventive formulation comprising 250 mM trehalose; (TR-Y 200) a formulation according to the invention comprising 200 mM trehalose; (HTS) Hypothermosol® FRS solution.
Z uvedených výsledků vyplývá, že buňky uchované v roztoku TR-Y 250 a TR-Y 200 po dobu 48 - 72 hodin v chladových podmínkách si ve všech sledovaných parametrech zachovávají vysokou životnost.The results show that cells stored in TR-Y 250 and TR-Y 200 solutions for 48-72 hours under cold conditions retain a long lifetime in all endpoints.
Příklad 6: Zachování fenotypu BM-MSCs po 72 hodinovém chladovém uchování - analýza povrchových znakůExample 6: Preservation of the BM-MSCs phenotype after 72 hours cold storage - surface character analysis
Povrchové znaky kmenových buněk jsou jedním ze základních znaků charakterizujících jejich identitu. Pro detekci povrchových znaků bylo použito značení BM-MSCs protilátkami konjugovanými s fluorescenční značkou. Značené BM-MSCs po 72 hodinovém uchování v chladových podmínkách v prostředku obsahujícím 250 mM trehalózu (TR-Y 250) podle technického řešení byly analyzovány na průtokovém cytometru za použití excitačních laserů o vlnové délce 405 nm,Surface features of stem cells are one of the basic features characterizing their identity. Labeling of BM-MSCs with fluorescent label conjugated antibodies was used to detect surface features. Labeled BM-MSCs after 72 hours storage under cold conditions in a formulation containing 250 mM trehalose (TR-Y 250) according to the invention were analyzed on a flow cytometer using excitation lasers with a wavelength of 405 nm,
488 nm a 633 nm. Byly testovány znaky CDI05, CD90, CD73, HLA-DR, CD45, CD34, CDI4,488 nm and 633 nm. Features CDI05, CD90, CD73, HLA-DR, CD45, CD34, CDI4,
CD19. Analýza prokázala pozitivitu znaků (>90 % buněk) CD105, CD90 a CD73, zatímco negativitu znaků (<10 % buněk) HLA-DR, CD45, CD34, CD14 a CD19. Tyto výsledky odpovídají správnému fenotypu kmenových buněk.CD19. The analysis showed the positivity (> 90% of cells) of CD105, CD90 and CD73, whereas the positivity (<10% of cells) of HLA-DR, CD45, CD34, CD14 and CD19. These results correspond to the correct stem cell phenotype.
CZ 30270 UlCZ 30270 Ul
Příklad 7: Zachování funkčních vlastností BM-MSCs po 72 hodinovém uchování v chladových podmínkáchExample 7: Preservation of BM-MSCs after 72 hours storage under cold conditions
U BM-MSCs, které byly skladovány po dobu 72 hodin v prostředku podle technického řešení (roztok TR-Y 250) při cca 4 °C, byla potvrzena jejich schopnost diferencovat do buněk adipocytů, osteocytů a chondrocytů. Buňky byly po 72 hodinovém skladování v roztoku TR-Y 250 v chladových podmínkách vysazeny na kultivační plast a kultivovány s vhodnými diferenciačními médii. Po 21 dnech byly buňky zafixovány a obarveny olejovou červení, alciánovou modří a alizarinovou červení pro důkaz adipogenní, chondrogenní a osteogenní diferenciace. Byly pořízeny mikroskopické fotografie diferenciovaných buněk (obr. 1).BM-MSCs that were stored for 72 hours in a formulation according to the invention (TR-Y 250 solution) at about 4 ° C were confirmed to be able to differentiate into adipocyte, osteocyte and chondrocyte cells. After 72 hours of storage in TR-Y 250 solution under cold conditions, the cells were plated on culture plastic and cultured with suitable differentiation media. After 21 days, cells were fixed and stained with oil red, alcian blue and alizarin red to demonstrate adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation. Microscopic photographs of differentiated cells were taken (Fig. 1).
Příklad 8: Životaschopnost WJ-MSCs uchycených na biologickém nosiči po 48-72 hodinovém skladováníExample 8: Viability of WJ-MSCs retained on biological carrier after 48-72 hours storage
WJ-MSCs z lidské pupečníkové tkáně byly vyrobeny podle příkladu 3. Po pasážování buněk podle příkladu 1 byly WJ-MSCs vysazeny na biologický nosič na bázi PCL nanovlákna v hustotě 150 000 buněk/cm2. Po dvoudenní kultivaci byl biologický nosič s buňkami vyjmut z kultivační nádoby, opláchnut roztokem PBS a uložen v prostředku podle příkladu 4A při teplotě okolo 4 °C. Množství uchycených buněk na biologickém nosiči bylo stanoveno pomocí fluorescenčního barvení biologického nosiče s uchycenými WJ-MSCs. Byl použit protokol barvení mikrofilament pomocí faloidinu a buněčných jader pomocí DAPI. Mikroskopické vyhodnocení obarvených preparátů prokázalo, že i po 72 hodinovém skladování bylo na nosiči uchyceno dostatečné množství živých buněk, jejichž počet byl o cca 20 % nižší než u nosiče s buňkami obarveného ihned po vyjmutí z kultivačního média. Po 48 hodinovém skladování došlo jen k 15% poklesu počtu živých buněk. Předpokládáme, že mrtvé buňky, které ztrácejí schopnost adheze a mění svůj tvar z protáhlého na kulovitý, byly z materiálu vyplaveny během barvicího procesu.WJ-MSCs from human umbilical tissue were produced according to Example 3. After passage of the cells according to Example 1, WJ-MSCs were seeded on a biological carrier based on PCL nanofiber at a density of 150,000 cells / cm 2 . After two days of cultivation, the cell carrier was removed from the culture vessel, rinsed with PBS, and stored in the composition of Example 4A at a temperature of about 4 ° C. The amount of captured cells on the biological carrier was determined by fluorescent staining of the biological carrier with WJ-MSCs attached. The microfilament staining protocol with phaloidin and cell nuclei with DAPI was used. Microscopic evaluation of the stained preparations showed that even after 72 hours of storage, a sufficient number of viable cells were retained on the carrier, approximately 20% lower than that of the cell-stained carrier immediately after removal from the culture medium. After 48 hours of storage, there was only a 15% decrease in the number of viable cells. We assume that dead cells that lose adhesion and change their shape from elongated to spherical were washed out of the material during the dyeing process.
NÁROKY NA OCHRANUPROTECTION REQUIREMENTS
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-33101U CZ30270U1 (en) | 2016-05-13 | 2016-05-13 | A means for storage, transportation and application of stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-33101U CZ30270U1 (en) | 2016-05-13 | 2016-05-13 | A means for storage, transportation and application of stem cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ30270U1 true CZ30270U1 (en) | 2017-01-17 |
Family
ID=57965575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2016-33101U CZ30270U1 (en) | 2016-05-13 | 2016-05-13 | A means for storage, transportation and application of stem cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ30270U1 (en) |
-
2016
- 2016-05-13 CZ CZ2016-33101U patent/CZ30270U1/en not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Marquez-Curtis et al. | Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: biological, clinical and cryopreservation aspects | |
| KR102193132B1 (en) | Trehalose and dextran-containing solution for transplanting mammalian cells | |
| US10104881B2 (en) | Composition comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids, and plant protein hydrolysates as active ingredients for cryopreservation of stem cells or primary cells | |
| KR102253850B1 (en) | Cryopreservation solution for mammalian cells | |
| EP3454652B1 (en) | Solution for the preservation, transport and application of stem cells | |
| CZ30270U1 (en) | A means for storage, transportation and application of stem cells | |
| JP6830294B1 (en) | Mammalian cell preservation solution containing trehalose | |
| KR102192587B1 (en) | Excipients composition for preserving of stem cells | |
| TWI837281B (en) | Cell cryopreservation solution and gradual freezing method of cells | |
| CZ309446B6 (en) | Means for cryopreservation of human or animal cells | |
| Marquez-Curtis et al. | Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: Biological, clinical and cryopreservation aspects: Update from 2015 review | |
| CZ31206U1 (en) | A preparation for preserving human or animal cells at very low temperatures | |
| WO2024149047A1 (en) | Cryopreservation solution based on liquid-liquid condensed phase, preparation method therefor and use thereof | |
| CZ2018116A3 (en) | Method of preserving animal cells | |
| WO2022268900A1 (en) | Methods for cryoprotection and lyoprotection of cells | |
| Marquez-Curtis et al. | Cryopreservation of mesenchymal stromal cells 2 derived from various tissues 3 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20170117 |
|
| ND1K | First or second extension of term of utility model |
Effective date: 20200414 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20230513 |