CZ306258B6

CZ306258B6 - Kompozice pro přípravu modifikovaných želatinových nanovláken, nanovlákna a způsob jejich přípravy

Info

Publication number: CZ306258B6
Application number: CZ2014-5A
Authority: CZ
Inventors: Veronika Švachová; Josef Jančář; Lucy Vojtová; Milan Alberti; David Pavliňák; Pavel Hyršl
Original assignee: Vysoké Učení Technické V Brně; Masarykova Univerzita
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2016-11-02
Also published as: CZ20145A3

Abstract

Předkládané řešení poskytuje kompozici pro přípravu želatinových nanovláken s obsahem oxidované celulózy, která obsahuje želatinu a sodnou sůl oxidované celulózy, přičemž hmotnostní poměr sodné soli oxidované celulózy ku želatině je v rozmezí 0,1 až 2, a popřípadě dále obsahuje rozpouštědlo vybrané ze skupiny zahrnující kyselinu mravenčí, kyselinu octovou a jejich směsi. Dále řešení popisuje způsob přípravy nanovláken zvlákněním této kompozice a nanovlákna takto připravená.

Description

Kompozice pro přípravu modifikovaných želatinových nanovláken, nanovlákna a způsob jejich přípravy

Oblast techniky

Předmětem vynálezu jsou antibakteriální želatinová nanovlákna modifikovaná oxidovanou celulózou vhodná pro použití v regenerativní medicíně měkkých tkání jako antibakteriální hemostatikum, kryty ran pro vlhké hojení, případně ve tkáňovém inženýrství na regeneraci kůže, dále kompozice pro jejich přípravu a způsob přípravy.

Dosavadní stav techniky

Želatina je směs bílkovin, která se získává částečnou hydrolýzou z přírodního proteinu kolagenu. Je biokompatibilní, biodegradabilní a má vysokou absorpční schopnost a hemostatické účinky. Uplatnění nachází jak v potravinářství, ve farmacii, tak v biomedicíně, kde slouží jako konstrukční materiál pro buňky v tkáňovém inženýrství. K přípravě želatinových nanovláken se kromě organických rozpouštědel na bázi fluoru (2,2,2-trifluorethanol [Z. M. Huang, Y. Z. Zhang, S. Ramakrishna, C. T. Lim, Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer 45 (2004) 5361-5368], l,l,l,3,3,3-hexafluor-2-propanol [S.-H. Gu, Z.-M. Wang, J. Ren, C.-Y. Zhang, Electrospinning of gelatin I poly (L-lactide) blend and its characteristics for wound dressing. Materiál Science and Engineering C 29 (2009) 1822-1828]) využívá elektrostatické zvlákňování z kyseliny octové nebo mravenčí [Petráš D. a kol.: Bezpečná nanovlákna. Chemické Listy, 103 (2009) 1009 - 1016] a také směsi ethanol/fosfátový pufr [Z. Zha, W. Tend, V. Markle, Z. Dai, X. Wu, Fabrication of gelatin nanofíbrous scaffolds using ethanol/phosphate buffer saline as a benign solvent. Biopolymers 97 (2012) 1026-1036],

Celulóza je po chemické stránce polydisperzní lineární biopolymer (polysacharid), který je složen z poly-(l,4)-D-glukózových jednotek s asyndiotaktickou konfigurací. Aby mohla být získána celulózová nanovlákna, je zapotřebí vybrat vhodné rozpouštědlo nebo směsi rozpouštědel. Ve struktuře celulózy jsou velmi silné intramolekulámí vodíkové vazby, což způsobuje její nerozpustnost v běžných rozpouštědlech [V. Kumar, T. Yang, HNOj/HjPCL-NaNCL mediated oxidation of cellulose - preparation and characterization of bioabsorbable oxidized cellulose in high yields and with different levels of oxidation. Carbohydrate Polymers 48 (2002) 403-12]. Rozpouštědla vhodná k rozpuštění čisté celulózy nejsou těkavá, proto je nutné při zvlákňování zajistit zvláštní koagulační postupy, které odstraňují rozpouštědlo z elektrostaticky spřadených vláken. Mezi tato rozpouštědla patří směs N-methyl-morfolin N-oxid/voda (nNMMO/H₂O) a směs chlorid lithný/dimetylacetamid (LiCI/DMAc) [Μ. V. Frey: Electrospinning cellulose and cellulose derivatives. Polymer Reviews, 48 (2008) 378-391], Další možnosti zvlákňování jsou uvedeny v následující tabulce č. 1.

- 1 CZ 306258 B6

Tab. 1: Možnosti elektrostatického zvlákňování čisté celulózy.

Rozpouštědlo	Reference
nNMM0/H₂0	Μ. V. Frey: Polymer Reviews, 48 (2008) 378-391 Z. H. Huang et al.: Carbon, 40 (8) (2002) 1363-1367 C. W. Kim. et al.: Polymer, 47 (2006) 5097-5107 P. Kulpinski: J. Appl. Polymer Sci., 98 (4) (2005) 1855-1859 M. S. Khil et al.: Macromolecular Research, 13 (2005) 62-67
nNNMO	M. S. Khil et al.: Macromolecular Research, 13 (2005) 62-67 P. Kulpinski: J. Appl. Polymer Sci., 103 (3) (2007) 1473-1482
Ethylendiamin (ED)/thiokyanatan draselný (KSCN)	P. Kulpinski: J. Appl. Polymer Sci., 103 (3) (2007) 1473-1482 A. Frenot et al.: J. Appl. Polymer Sci., 98 (4) (2005) 1855-1859
(LiCl)/DMAc	Μ. V. Frey: Polymer Reviews, 48 (2008) 378-391 C. W. Kim. et al.: Polymer, 47 (2006) 5097-5107 C. W. Kim et al.: J. Polymer Sci. Part B-Polymer Physics, 43 (13) (2005)1673-1683 Viswanathan G. et al.: Biomacromolecules, 7 (2) (2006) 415-418 C. W. Kim. et al.: J. Polymer Sci. Part B: Polymer Physics, 40 (18)(2002)2119-2129 .
1 -Butyl-3-methy limidazolium chlorid nebo 1—ethyl—3— — methylimidazolium benzoát	Z. H. Huang et al.: Carbon, 40 (8) (2002) 1363-1367 C. W. Kim. et al.: J. Polymer Sci. Part B: Polymer Physics, 40 (18)(2002)2119-2129

Následující tabulka (tab. 2) uvádí možnosti elektrostatického zvlákňování derivátů celulózy. Deriváty celulózy jsou mnohem lépe rozpustné než samotná celulóza.

-2CZ 306258 B6

Tab. 2: Možnosti elektrostatického zvlákňování různých derivátů celulózy.

Derivát celulózy	Rozpouštědlo	Reference
Acetát celulózy	Aceton/voda	W. K. Son et al.: J. Polym. Sci. Polym. Phys. 42(2004)5-11 W. K. Son et al.: Biomacromolecules.5 (2004)197-201 W. K. Son et al.: Macromol. Rapid Comum. 25 (2004) 1632-1637 W. K. Son et al.: Carbohyd. Polym. 65 (2006)430-434
Acetát celulózy	Aceton/DMAc	H. Qi et al.: Biomacromolecules. 7 (2006)2327-2330 H. Liu et al.: J. Polym. Sci. Polym. Phys. 41 (2003) 953-964 Y. Wang et al.: J. Polym. Sci. Polym. Chem. 42 (2004) 4289-4299 P. Taepaiboon et al.: Eur. J. Pharm. Biopharm. 67 (2007) 387-397 S. Tungprapa et al.: Polymer. 48 (2007) 5030-5041 O. Suwantong et al.: Polymer. 48 (2007) 7546-7557 O. Suwnatong et al.: Polymer. 49 (2008) 4239-4247
Acetát celulózy	Aceton/ dimethy líbrmamid (DMF)/trifluoroethanol	Z. Ma et al.: J. Membr. Sci. 319 (2008) 23-28
Acetát celulózy	Kyselina octová/voda	S. 0. Han et al.: Mater. Lett. 62 (2008) 23-28
Acetát celulózy	Aceton, chloroform, DMAc, DMF/dichlormethan (DCM), kyselina mravenčí, metanol, pyridin, voda	S. Tungprapa et al.: Cellulose 14 (2007) 563-575
Triacetát celulózy	Methylen chlorid/etanol	S. O. Han et al.: Mater. Lett. 59 (2005) 2998-3001
Ethyl celulóza	Tetrahydro furan (THF)/DMAc	X. Wu et al.: J. Appl. Polym. Sci. 97 (2005)1292-1297

-3 CZ 306258 B6

		J. Y. Park et al.: J. Ind. Eng. Chem. 13 (2007)1002-1008
Ethyl-kyanoethyl celulóza	THF	S. Zhao et al.: J. Appl. Polym. Sci. 91 (2004)242-246 S. Zhao et al.: Cellulose 10 (2003) 405- 409
Hydroxypropylcelulóza	Voda/etanol	A. Frenot et al.: J. Appl. Polymer Sci., 98 (4) (2005) 1855-1859
Ftalát hydroxypropyl methyl celulóza	Aceton/etanol	M. Wang et al.: J. Appl. Polym. Sci. 103 (2007)2177-2184
Methyl celulóza	Voda/etanol	H. Liu et al.: J. Polym. Sci. Polym. Phys. 41(2003)953-964
Acetát celulózy/hydroxyapatit	Kyselina octová/aceton	A. Bishop et al.: Polym. Adv. Technol. 17 (2006)902-906
Acetát celulózy/PEG	DMAc/aceton	C. Chen et al.: Polymer. 48 (2007) 5202- 5207
Acetát celulózy/PEO	DMF, DMF/dioxan	L. Chen et al.: Polymer. 49 (2008) 12661275 L. Zhang et al.: Carbohyd. Polym. 71 (2008)196-207
Karboxymethyl celulóza/PEO		H. Liu et al.: J. Polym. Sci. Polym. Phys. 41 (2003)953-964

Mezi deriváty celulózy můžeme zařadit mimo jiné i oxidovanou celulózu. Taje kompletně biokompatibilní, bioresorbovatelná a biodegradovatelná, neimunogenní a komerčně snadno dostupná. Je prokázán její baktericidní účinek proti bakteriím Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Beta streptococcus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis, Bacteroides fragilis, Klebsiella aerogenes a Clostridium perfringens [M. Hora, E. Eret, T. Urge, J. Klečka, Možnosti využití tkáňových lepidel při ledvinu šetřících výkonech u tumorů ledvin, Česká urologie, 2007, 147-153;

www.bloodness.wz.cz/cz/ot.hemost.koag.htm]. Využití má ve zdravotnictví, kde se používá pře- devším jako lokální hemostatikum, v kosmetickém a farmaceutickém průmyslu jako aditivum do různých přípravků [V. Kumar, T. Yang, HNOýHJOj-NaNCb mediated oxidation of cellulose - preparation and characterization of bioabsorbable oxidized cellulose in high yields and with different levels of oxidation Carbohydrate Polymers 48 (2002) 403^112]. Hemostatický účinek oxidované celulózy se projeví tvorbou sraženiny, která se vstřebává přibližně 1 až 2 týdny [M. Hora et al.: Česká urologie, 2007, 147-153].

Oxidovaná celulóza nebyla doposud zvlákněna. Nebyla také nalezena data, která by udávala, že by připravený nanovlákenný materiál obsahoval jako přídavek oxidovanou celulózu. Většinou se ke zvláknění použije nederivovaná celulóza nebo derivát jako např. acetát celulózy, který se po zvláknění zoxiduje za vzniku oxidované celulózy. Např. ultrajemná vlákna oxidované celulózy byla připravena metodou, kterou popisují Son, Youk a Park [Biomacromolecules 5 (2004) 197201]. Autoři využívají zvlákňování acetátu celulózy, která je potom deacetylací převedena na celulózu. Celulóza je následně oxidována pomocí směsi HNO^/H^PCL-NaNCE Khil a kol. [Macromolecular Research, 13 (2005) 62-67] elektrostaticky zvláknili celulózu ze směsi roz

-4CZ 306258 B6 pouštědel NMM0/H₂0. Získaná nanovlákna zoxidovali při teplotě 25 °C pomocí směsi perfluorovaného uhlíku (FC-84) aNO₂. Poté byla nanovlákna ponořena do směsi 2-propanol/voda.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je kompozice pro přípravu želatinových nanovláken s obsahem oxidované celulózy, obsahující želatinu a sodnou sůl oxidované celulózy, přičemž hmotnostní poměr sodné soli oxidované celulózy ku želatině je v rozmezí 0,1 až 2, s výhodou 1.

Kompozice pro želatinová nanovlákna s výhodou dále obsahuje rozpouštědlo vybrané ze skupiny zahrnující kyselinu mravenčí, kyselinu octovou a jejich směsi.

Předmětem předkládaného vynálezu je také způsob přípravy nanovláken spočívající v tom, že se připraví roztok smícháním želatiny a sodné soli oxidované celulózy v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující kyselinu mravenčí, kyselinu octovou a jejich směsi. Tento roztok se promíchá na magnetické míchačce. Ve výhodném provedení se může i vystavit účinkům ultrazvuku. Zvlákňování se provádí za laboratorní teploty známými způsoby, s výhodou pomocí zvlákňovacího přístroje, např. technologií Nanospider.

Předmětem předloženého vynálezu jsou dále želatinová nanovlákna obsahující sodnou sůl oxidované celulózy, připravitelná zvlákněním podle předkládaného vynálezu. Nanovlákna jsou vlákna mající rozměr v řádu nanometrů až stovek nanometrů, tedy s výhodou v rozmezí 1 nanometru až 1 mikrometru. Tato nanovlákna mají výrazné baktericidní účinky.

Objasnění výkresů

Obr. 1: ATR-FTIR spektrum zvlákněného vzorku podle příkladu provedení.

Obr. 2a: SEM zobrazení sodné soli oxidované celulózy v želatinových nanovláknech podle příkladu provedení.

Obr. 2b: EDX zobrazení barevného prvkového rozlišení získaného materiálu podle příkladu provedení. Žlutě je sodík (Na), zeleně dusík (N), modře kyslík (O) a červeně uhlík (C).

Obr. 3: EDX spektrum oxidované celulózy v želatinových nanovláknech podle příkladu provedení.

Obr. 4: Baktericidní bioluminiscence vzorku podle příkladu provedení.

Příklady uskutečnění vynálezu

Bylo smícháno 20 ml kyseliny octové (p.a., Penta), 8,3 hmotn. % želatiny (Sigma Aldrich z hovězí kůže, typ B) a 8,3 hmotn. % sodné soli oxidované celulózy (Syntesia, a. s., Česká republika). Poté byla směs míchána na magnetické míchačce po dobu 19 hodin. Směs byla ponechána 15 min v ultrazvuku. Zvlákňování bylo realizováno za teploty okolí (21,5 °C), při 60% relativní vlhkosti vzduchu a tlaku 97 kPa pomocí zvlákňovacího přístroje Nanospider Elmarco NSLAB 500.

Následující tabulka (tab. 3) uvádí podmínky zvlákňování.

-5 CZ 306258 B6

Tab. 3: Experimentální podmínky elektrostatického zvlákňování vzorku.

d [mm]	U[kV]	Ι[μΑ]	Otáčení [ot/ min]
150	47,9	3	5,5

d - vzdálenost elektrod; U - aplikované napětí; I - procházející proud; otáčení - rychlost otáčení elektrody kolem své osy

Získaná nanovlákna byla studována pomocí infračervené spektroskopie (ATR-FTIR), viz obr. 1, struktura a morfologie vláken byla sledována pomocí skenovacího elektronového mikroskopu (SEM), viz obrázky 2a a 2b, a prvkové analýzy (EDX), viz obr. 3. Baktericidní účinky vláken byly testovány pomocí přímé inhibice růstu bioluminiscenčních bakterií. ATR-FTIR analýza prokázala přítomnost absorpčního pásu sodné soli oxidované celulózy v materiálu. Na výřezu spektra lze vidět, že nanesená nanovlákna jsou superpozicí spekter samotné želatiny a sodné soli oxidované celulózy. Absorpční pás v oblasti okolo 1400 cm ¹ přísluší vibraci karboxylové skupiny vázané na uhlíku C6 pyranózového kruhu oxidované celulózy.

SEM analýza potvrdila získání neuspořádaných želatinových nanovláken o průměru 262 ± 34 nanometrů s homogenně rozloženou oxidovanou celulózou, jak prokázala prvková analýza EDX.

EDX analýza také potvrdila homogenní, rovnoměrné zastoupení iontů Na⁺ v celém objemu nanovlákenného materiálu, viz obr. 3.

Baktericidní aktivita získaných nanovláken byla testována luminometricky. Tato metoda sleduje inhibici bioluminiscence během bakteriálního růstu plazmidem modifikovaných bakterií E. coli K12.

Na obr. 4 černá plná čára znázorňuje kontrolní viabilitu modifikovaného kmene E. coli. Tečkovaná křivka odpovídá viabilitě E. coli v přítomnosti samotné želatiny a čárkovaná viabilitě E. coli n přítomnosti želatinových nanovláken s přídavkem sodné soli oxidované celulózy. Z obr. 4 lze vyčíst, že nově připravený materiál vykazuje trvalou téměř 90% inhibici bakteriálního růstu po celou dobu testování.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kompozice pro přípravu želatinových nanovláken s obsahem oxidované celulózy, vyznačená tím, že obsahuje želatinu a sodnou sůl oxidované celulózy, přičemž hmotnostní poměr sodné soli oxidované celulózy ku želatině je v rozmezí 0,1 až 2, s výhodou 1.
2. Kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že dále obsahuje rozpouštědlo vybrané ze skupiny zahrnující kyselinu mravenčí, kyselinu octovou a jejich směsi.
3. Způsob přípravy želatinových nanovláken s obsahem oxidované celulózy, vyznačený tím, že se připraví roztok smícháním želatiny a sodné soli oxidované celulózy v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující kyselinu mravenčí, kyselinu octovou a jejich směsi, a tento roztok se zvlákní.
4. Zelatinová nanovlákna s obsahem oxidované celulózy, vyznačená tím, že obsahují želatinu a sodnou sůl oxidované celulózy, a jsou připravitelná způsobem podle nároku 3.