Plošný zdroj záření, zejména k navození a monitorování fotodynamického jevu in vitro

Oblast techniky

Vynález se týká uspořádání plošného zdroje záření s homogenitou světelného pole, určeného zejména k navození a monitorování fotodynamického jevu in vitro, především ve standardních analytických Petriho miskách s možností kontinuálního monitoringu změn v běžných mikrodestičkových analyzátorech pro jeho transparentnost a při zajištění možnosti provedení změn ve složení a tlaku okolní atmosféry analyzovaného vzorku.

Dosavadní stav techniky

Fotodynamický jev představuje kombinovaný účinek čtyř složek, a to fotosensitivní látky (sensitizeru), molekulárního kyslíku, světla a substrátu, nejčastěji biologického charakteru. Výsledným produktem této reakce je tvorba různých forem reaktivního kyslíku, zoxidovaný substrát a zregenerovaný sensitizer, který byl aktivován světlem. Tento jev nachází své hlavní uplatnění ve fotodynamické terapii, kde jsou sensitizery přednostně vychytávány v patologicky změněných buňkách. Po následném ozáření buněk viditelným zářením o vlnové délce shodné s absorpčním maximem sensitizeru dochází k jejich destrukci, na níž se účastní převážně singletní kyslík a další radikály. Doba života těchto produktů v buněčném prostředí je velmi krátká, neboť velmi rychle reagují s okolními biomolekulami. V závislosti na velikosti takto navozených změn v jejich molekulární struktuře, a tedy míře buněčného poškození, může dojít k nastartování řady buněčných procesů vedoucí k zániku buňky. Sensitizer je bez světelné aktivace netoxický, a má vlastnost vlastní fluorescence, které se také využívá v diagnostice. Navozené buněčné poškození lze sledovat pomocí různých světlem aktivovaných sond za pomocí detekce, například jejich fluorescence pomocí spektrofluorimetru.

V preklinické výzkumné fázi se při studiu efektivností tohoto druhu terapie využívají různé nádorové a nenádorové buněčné kultury, kultivované např. na Petriho miskách nebo analytických mikrodestičkách. Jako zdroje světelné energie k aktivaci sensitizeru se nejčastěji používá laserové nebo diodové světlo. K vytvoření širší ozařovací plochy se často umísťuje mezi laserový paprsek a zkoumaný objekt optický difuzér. U světla pocházejícího z LED diod je dosaženo osvětlovacího pole různým uspořádáním několika LED diod, vytvářejících různou míru homogenity světelného toku jak pro aplikace in vivo, což je popsáno například v dokumentech KP 2009/0 055 891, EP 2 044 974, US 2009/088 824, CN 101 214 403, US 2007/239 233, US 20007/225 778, WO 02 098 508, WO 2005/035 058, WO 9 321 842, tak pro aplikace in vitro, což je známo z dokumentů DE 102 008 008 875, CZ 302 829, CZ 302 084 nebo WO 9 321 842. Uspořádání diod v ozařovačích je buď nahodilé, nebo v řadách se stejnou nebo rozdílnou vzájemnou vzdáleností.

Vhodné uspořádání diod spojené se vznikem homogenního světelného poleje popsáno v několika spisech, například ve WO 2005/035 058, CZ 302 829, které řeší problém homogenity při ozařovaní ze shora. LED diody jsou u tohoto řešení uspořádány v hexagonálním tvaru, v konstantní vzdálenosti vůči sobě a jsou upevněny na podložce nad úložištěm. U řešení dle spisu CN 203 247 266 (U) je homogenity dosaženo pohybem destičky s umístěnými LED prvky a pomocí rozptylu na přídatném matném skle. Analýza vzorku se běžně provádí detekcí signálu pomocí detekčního zařízení umístěného nad nebo pod vzorkem. Nevýhodou tohoto řešení je, že analýzu výsledného účinku fotodynamické terapie in vitro, tedy stanovení celkového množství oxidované látky, je možno provádět až po určitém čase ozáření. Velmi často užívaným a oblíbeným detektorem je totiž chemická značka, která se po proniknutí do buněk a její oxidaci přeměňuje na fluorescenční produkt, jehož celkový výtěžek lze snadno stanovit pomocí komerčně dostupných fluorescenčních spektrofotometrů nebo readerů. Z důvodu rychlých fotofyzikálněchemických změn spojených se vznikem reaktivních forem kyslíku a samotné autofotooxidaci

- 1 CZ 305993 B6 detekční značky je žádoucí, aby měření probíhala kontinuálně v čase. Určité řešení přináší zařízení dle CZ 302 084, kde je ozařování prováděno z boku. Tento způsob řešení je však vhodný pro relativně malé vzorky a nedosahuje takové homogenity jako u přímého ozařování ze shora.

Úkolem předkládaného vynálezu je představit k využívání takový plošný zdroj záření, který by byl konstrukčně poměrně jednoduchý, poskytoval světlo o poměrně rovnoměrném světelném toku a zároveň umožňoval kontinuální monitorování produktů vzniklých při fotodynamickém jevu pomocí komerčně dostupných spektrofotometrů nebo readerů a při zajištění možnosti provedení změn ve složení a tlaku okolní atmosféry analyzovaného vzorku.

Podstata vynálezu

Stanoveného cíle je dosaženo vynálezem, kterým je plošný zdroj záření zejména k navození a monitorování fotodynamického jevu in vitro ve vzorcích umístěných v úložišti, který je tvořen uzavíratelným tělesem opatřeným shora otevřenou středovou komorou upravenou jednak pro vyjímatelné vložení úložiště s analyzovaným vzorkem a jednak pro nad ním vyjímatelné usazení polotransparentní tenkostěnné ozařovací destičky opatřené diodovými čipy rozmístěnými v řadách se vzájemným hexagonálním uspořádáním, přičemž diodové čipy jsou paralelně propojeny se sběrnicí, která je vedena po obvodu ozařovací destičky a je propojena s vnějším napájecím zdrojem, a jsou ustaveny v ozařovací destičce tak, že jejich světelné paprsky jsou směrovány přímo dolů k úložišti.

Ve výhodném provedení je středová komora vytvořena tak, že její horní rám vystupuje nad horní čelo tělesa a v jejích bočních obvodových stěnách jsou vytvořena oblouková vybrání, která jsou opatřena nákružky pro vertikální ustavení úložiště, a nad obloukovými vybráními jsou vytvořeny v podstatě obdélníkové zářezy pro uložení ozařovací destičky.

Je rovněž výhodné, když je těleso opatřeno odklopným víkem, na jehož vnitřním čele je vytvořen středový výřez, jehož tvar a rozměry odpovídají tvaru a rozměrům horního rámu středové komory tělesa, přičemž na horním rámuje uloženo obvodové těsnění pro umožnění hermetického uzavření středové komory.

Konečně je výhodné, když v tělese jsou zabudovány uzavíratelné průchody, které jsou bočně nebo čelně zaústěny do středové komory, a boční vývod pro umožnění propojení vodičů vedených ze sběrnice ozařovací destičky s napájecím zdrojem.

V optimálním provedení jsou středový výřez víka i dno středové komory opatřeny transparentními okénky pro umožnění kontroly a monitorování procesů uvnitř středové komory.

Zařízením podle vynálezu se dosahuje nového a vyššího účinku v tom, že konstrukční řešení plošného zdroje záření umožňuje kontinuální monitorování produktů vznikajících při fotodynamickém jevu. Další výhodou je, že ozařovací destičky osázené diodovými čipy jsou snadno vyjímatelné a je možné je pouze vysunutím a zasunutím vyměnit za jiné destičky s jinými vyzařovacími charakteristikami. Nezanedbatelnými přednostmi zařízení je jeho nízká pořizovací cena, malé zástavbové rozměry a minimální energetická náročnost provozu.

Objasnění výkresů

Konkrétní příklad konstrukčního provedení plošného zdroje záření je objasněn pomocí přiložených výkresů, kde obr. 1 je celkový axonometrický pohled na zdroj záření v uzavřeném stavu,

-2CZ 305993 B6 obr. 2 pohled na zdroj záření z obr. 1 při odklopení víka a v explodovaném provedení, obr. 3 je pohled na alternativní provedení zdroje záření při odklopení víka a v explodovaném provedení a obr. 4 je detailní pohled na část ozařovací destičky se schématem uspořádání a elektrického zapojení diodových čipů.

Výkresy, které znázorňují představovaný vynález a následně popsané příklady konkrétních provedení v žádném případě neomezují rozsah ochrany uvedený v definici, ale jen objasňují podstatu vynálezu.

Příklady uskutečnění vynálezu

Plošný zdroj záření je v základním provedení tvořen deskovitým tělesem 1, s výhodou obdélníkového tvaru, které je opatřeno shora otevřenou středovou komorou 11, jejíž horní rám 111 vystupuje nad horní čelo 12 tělesa L Boční obvodové stěny 112 středové komory 11 jsou uzpůsobeny pro uložení jednak úložiště 3, například Petriho misky, s analyzovaným vzorkem a jednak polotransparentní tenkostěnné ozařovací destičky 4. V provedení podle obr. 2 jsou v bočních obvodových stěnách 112 nad sebou vytvořena oblouková vybrání 113, která jsou opatřena nákružky 114 pro vertikální ustavení úložiště 3, a v podstatě obdélníkové zářezy 115 pro umístění ozařovací destičky 4. Na horní ploše obdélníkových zářezů 114 jsou pak uloženy neznázoměné vodivé pružné konektory pro umožnění elektrického připojení ozařovací destičky 4 pomocí rovněž neznázoměných vodičů, které jsou vyvedeny vně tělesa 1 jeho bočním vývodem 13 k napájecímu zdroji. Těleso 1 je opatřeno odklopným víkem 2, na jehož vnitřním čele 21 je vytvořen středový výřez 22, jehož tvar a rozměry odpovídají tvaru a rozměrům horního rámu 111 středové komory 11 tělesa L Na horním rámu 111 je uloženo obvodové těsnění 5, které umožňuje hermetické uzavření středové komory 11, například pomocí šroubových spojů 6, přičemž v tělese 1 jsou zabudovány uzavíratelné průchody 7, které jsou opatřeny uzavíracími ventily nebo rychlospojkami a které jsou bočně nebo čelně zaústěny do středové komory 11 a umožňují pomocí změn tlaku nebo druhu vháněného média regulovat okolní atmosféru analyzovaného vzorku. Středový výřez 22 víka 2 i dno 116 středové komory 11 jsou pak opatřeny transparentními okénky 8 pro umožnění kontroly a monitorování procesů uvnitř středové komory 11.

Polotransparentní tenkostěnná ozařovací destička 4, která je základním funkčním členem plošného zdroje záření, je opatřena diodovými čipy 41 rozmístěnými v řadách se vzájemným hexagonnálním uspořádáním a ustavenými tak, že jejich světelné paprsky jsou směrovány přímo dolů k úložišti 3. Jednotlivé řady se sériově zapojenými diodovými čipy 41 jsou paralelně propojeny se sběrnicí 42 vedenou po obvodu ozařovací destičky 4, jak je patrné z obr. 4. Sběrnice 42 je pak propojena pomocí neznázoměných vodičů, které jsou vyvedeny vně tělesa 1 jeho bočním vývodem 13, k napájecímu zdroji.

Konstrukce celého plošného zdroje záření, ale především uspořádání diodových čipů 41 musí být zvoleno tak, aby bylo dosaženo maximální homogenity světelného pole a aby vliv částečného zastínění byl relativně nezávislý na umístění vzorku v úložišti 3. Proto je vhodné hexagonální rozmístění diodových čipů 44. Plošná hustota diodových čipů 41 pak přímo určuje míru homogenity a transparentnost zdroje. Čím je větší, tím je menší transparentnost a naopak. Při studiu fotodynamických procesů je problematika homogenity významnější a z hlediska teoretických výpočtů je nejvhodnější, když transparentnost ozařovací destičky 4 zbytečně nepřevyšuje 50 %.

Účinnost a funkčnost plošného zdroje záření byla testována pro současné, komerčně vyráběné, vysoce svítivé diodové čipy 41 o maximálních rozměrech 0,33 a 0,40 mm s vyzařovacími výkony jednoho diodového čipu 41 až 50 mW a s emitací záření v oblasti vlnových délek 415 a 660 nm. Pro uspořádání pole o 195 čipů byla vytvořena homogenně ozářená plocha pro detekční oblast

-3CZ 305993 B6 dna Petriho misky o průměru 35 mm. Pro dosažení větší homogenity by bylo optimální tento počet chipů v souladu s předchozím odstavcem navýšit. Pro diodové čipy 41 o velikosti 0,4 x 0,4 mm se zanedbáním úzkého sériového propojení by počet diodových čipů 41, který připadá na plochu o průměru 35 mm se zachováním 50% propustnosti, byl cca 6 013 (π x 17,5² / 0,4²).

Popsaná konstrukce plošného zdroje záření není jediným možným provedením vynálezu, ale bez vlivu na jeho podstatu může být řešena vlastní konstrukce tělesa 1 jiným způsobem a může být použit jiný počet diodových čipů 41 podle jejich velikosti a velikosti analyzované oblasti, tedy průměru úložiště 3. Uzavíratelné průchody 7 mohou být z tělesa 1 vyvedeny bočně nebo čelně a hermetické uzavírání středové komory 11 může být jiným než šroubovým spojem 6.

Průmyslová využitelnost

Světelného zdroje podle vynálezu lze použít pro sledování fotodynamických změn metodami in vitro ve standardizovaných úložištích, zejména pro fotodynamickou terapii, která se používá k destrukci nádorových buněk pomocí singletního kyslíku a jiných radikálů vznikající v nádorové tkáni po jejím ozáření světlem. Svojí velikostí a transparentností umožňuje studium fotodynamických procesů v běžných komerčně dostupných mikrodestičkových analyzátorech.