CZ304336B6 - Method of monitoring infection pressure of brood pest, device for making the same and use of a testing card for monitoring infection pressure of the brood pest - Google Patents
Method of monitoring infection pressure of brood pest, device for making the same and use of a testing card for monitoring infection pressure of the brood pest Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304336B6 CZ304336B6 CZ2012-263A CZ2012263A CZ304336B6 CZ 304336 B6 CZ304336 B6 CZ 304336B6 CZ 2012263 A CZ2012263 A CZ 2012263A CZ 304336 B6 CZ304336 B6 CZ 304336B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- test card
- bee
- sample
- detection layer
- layer
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/32—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Bacillus (G)
Abstract
Description
Vynález se týká oblasti monitorování zdravotního stavu včelstev při chovu včel, konkrétně detekce a monitorování infekčního tlaku moru včelího plodu, způsobeného bakterií Paenibacillus larvae.The invention relates to the field of monitoring the health of bee colonies in beekeeping, and more particularly to the detection and monitoring of infectious bladder infestation pressure caused by Paenibacillus larvae.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Včela medonosná (Apis mellifera L) je v chovu ohrožována a postihována řadou onemocnění. Mezi nejvýznamnější patří i tzv. mor včelího plodu, postihující především vývojová stadia larev a kukel včel. Toto celosvětově rozšířené a vysoce infekční onemocnění včel je způsobeno grampozitivní bakterií Paenibacillus larvae, vytvářející za určitých podmínek spory. Tyto spory jsou vysoce odolné, chráněné sedmi ochrannými vrstvami, které jim umožňují životnost až 50 let. Infikované včelí larvy se mění po infekci na koloidní tekutinu a později na hnědočerný příškvar. Včely, které se snaží vyčistit příškvar ze dna buněk včelích plástů, rozšiřují infekci uvnitř úlu. Onemocnění je tak infekční, že za několik měsíců nebo let dojde k úhynu celého včelstva. Zbytky plástů, úl, uhynulé larvy a zásoby se pak stávají atraktorem pro okolní včelstva a infekční náloží na mnoho dalších let.The honey bee (Apis mellifera L) is endangered and affected by a number of diseases. Among the most important is the so-called plague of bee brood, mainly affecting the developmental stages of larvae and pupae of bees. This widespread and highly infectious bee disease is caused by the Gram-positive bacteria Paenibacillus larvae, which causes spores under certain conditions. These spores are highly durable, protected by seven protective layers, allowing them to last up to 50 years. Infected bee larvae turn into colloid fluid after infection and later become brownish-black. Bees trying to clear the grease from the bottom of the honeycomb cells spread the infection inside the hive. The disease is so infectious that in a few months or years the whole colony will die. Remains of combs, hive, dead larvae and supplies then become an attractor for surrounding colonies and infectious charges for many years to come.
Detekce včelího moru se po dlouhou dobu prováděla pouze vizuálními prohlídkami, kde se vyhledávaly klinické příznaky včelího moru na plástech. Mor včelího plodu se klinicky projevuje hlavně u zavíčkovaného plodu a typickými příznaky jsou propadlá, ztmavlá a někdy proděravělá víčka. U podezřelých buněk se prováděl tzv. sirkový test. Tento test ale není spolehlivý, protože klihovité stádium rozložené larvy trvá jen velmi krátce, pak dochází k tvorbě tuhého příškvaru. Jiné známé metody jsou sice spolehlivé, ale dosti zdlouhavé a spočívají v biochemické a morfologicko-fyziologické identifikaci kultivovaných izolátů. Další metody jsou založeny na specifické reakci bakteriofága BL-2, druhově-specificky atakujícího právě Paenibacillus larvae, které mohou být použity pro rychlou diagnostiku podezřelých vzorků. Nicméně i tato metoda předpokládá poměrně zdlouhavou kultivaci.For a long time, the detection of bee plague was performed only by visual examinations, where the clinical signs of bee plague on the combs were searched for. Bee fever is clinically manifested mainly in the capped fetus and typical symptoms are sunken, darkened and sometimes perforated eyelids. Suspected cells were subjected to the so-called match test. However, this test is not reliable because the glue-like stage of the decomposed larvae takes only a very short time, then a rigid smear is formed. Other known methods are reliable, but rather lengthy and consist of biochemical and morphological-physiological identification of cultured isolates. Other methods are based on the specific reaction of bacteriophage BL-2, species-specific attacking just Paenibacillus larvae, which can be used for rapid diagnosis of suspect samples. However, even this method assumes a relatively lengthy cultivation.
Stávající nejvíce používané a známé metody detekce moru včelího plodu jsou založeny na PCR (Polymerase Chain Reaction) testu nebo na kultivačním testu. Jedná se o standardní metodiky podle platných směrnic O.I.E. (Office International des Epizooties - O.I.E. Terrestrial Manual, 2008). Každá země určuje rozsah a intenzitu monitoringu moru včelího plodu na území svého státu a taktéž rozsah a intenzitu o informování, preventivních opatřeních a potírání nemoci. Z pohledu epidemiologie jsou určitě metody včasné detekce, prevence a rychlého odhalení jedním z hlavních nástrojů potírání této závažné infekční choroby včel. Čím dříve je ohnisko odhaleno, tím menší jsou následné náklady na jeho likvidaci.The current most widely used and known methods for the detection of bee plague are based on the PCR (Polymerase Chain Reaction) test or the culture test. These are standard methodologies according to the applicable O.I.E guidelines. (Office International des Epizooties - O.I.E. Terrestrial Manual, 2008). Each country determines the extent and intensity of the monitoring of bee plague in its national territory as well as the extent and intensity of information, preventive measures and disease control. From an epidemiological point of view, early detection, prevention and rapid detection methods are certainly one of the main tools for combating this serious infectious bee disease. The sooner the focus is detected, the lower the subsequent costs of its disposal.
PCR test je spolehlivá, rychlá a účinná metoda používaná v mikrobiologické diagnostice, při které se molekulární technikou zjišťuje přítomnost DNA patogenních spor ve vzorku. Pro potřeby PCR testuje nejprve nutné zajistit reprezentativní část vzorku za celé vyšetřované včelstvo, jež ale představuje obvykle pouhých 150 mg včel nebo larev, kukel apod. Jedna larva přitom váží 100 až 120 mg (podobně tak i dospělá včela) a zajistila by dostatečné množství materiálu. To by ale nebylo reprezentativní za celé včelstvo. Proto je potřeba značný čas pro primární zpracování vzorku (drcení a homogenizace), tak aby tento vzorek reprezentoval eventuální patologický obraz podezřelého včelstva. Je také možné jako vzorek použít včelí měl. Měl představují drobné voskové částečky, které vznikají při odvíčkování uložených glycidových zásob v plástech během zimního období. Tyto částečky včetně roztočů, propolisu, částí těl, spor apod. propadají na podložku na dno úlu, kde je možno měl zachytit. V případě včelí měli, odpadá problém s reprezenta- 1 CZ 304336 B6 tivností vzorku za celé včelstvo, narůstají však technické a časové nároky na přípravu vzorku před provedením testu. PCR test spočívá v izolaci DNA z podezřelého vzorku a ve vlastní PCR reakci založené na amplifikaci úseku DNA bakterie Paenibacillus larvae, přičemž diagnostika je ukončena gelovou elektroforézou a vizualizací gelu na transluminátoru.The PCR test is a reliable, fast and efficient method used in microbiological diagnostics, in which the presence of DNA of pathogenic spores in a sample is detected by molecular techniques. For PCR purposes, it is first necessary to provide a representative portion of the sample for the entire colony under examination, but usually only 150 mg of bees or larvae, pupae, etc. One larva weighs 100 to 120 mg (similarly to an adult bee) and ensures sufficient material . But that would not be representative of the entire colony. Therefore, considerable time is needed for the primary processing of the sample (crushing and homogenization) so that this sample represents an eventual pathological picture of the suspected colony. It is also possible to use bee had as a sample. It should be represented by tiny wax particles that are formed when decanting stored carbohydrate stores in combs during the winter. These particles, including mites, propolis, body parts, spores, etc., fall on a pad at the bottom of the hive where they should be trapped. In the case of bees, there was no problem with the representativeness of the sample for the whole colony, but the technical and time requirements for sample preparation before the test were increased. The PCR test consists in isolating DNA from the suspect sample and in a PCR reaction based on the amplification of the DNA section of the bacterium Paenibacillus larvae, which is terminated by gel electrophoresis and gel visualization on the transluminator.
Pro potřeby kultivačního testuje nejčastěji používána včelí měl ze zimního odběru (leden). Taje následně rozpuštěna v toluenu, převedena do pufru a ten inokulován na živném agarovém médiu, které obsahuje kyselinu nalidixovou (30 mg/litr) pro potlačení růstu necitových bakterií. Naočkované kultivační misky s agarovým živným médiem jsou inkubovány 7 dní při teplotě 37 °C. Kultivované kolonie na miskách jsou vyhodnoceny vizuálně.For the needs of cultivation tests the most commonly used bee had from the winter harvest (January). It is then dissolved in toluene, buffered and inoculated on nutrient agar medium containing nalidixic acid (30 mg / liter) to suppress the growth of non-citric bacteria. Inoculated culture dishes with agar nutrient medium are incubated for 7 days at 37 ° C. Cultured colonies on plates are evaluated visually.
PCR test a kultivační test mohou být použity alternativně, jejich cena je přibližně srovnatelná. Nevýhoda obou známých způsobů spočívá ve velké pracnosti při přípravě vzorků a dále v časové náročnosti provádění celého testu včetně nutnosti transportu vzorků do příslušné laboratoře.The PCR assay and the culture assay can be used alternatively, the cost of which is approximately comparable. The disadvantage of both known methods lies in the great labor in the preparation of samples and in the time consuming performance of the whole test including the necessity of transporting the samples to the appropriate laboratory.
Z patentových dokumentů US 2002/192 742 a EP 0928 830 je známý testovací systém pro kultivaci mikroorganismů obsahující detekční a krycí vrstvu. Kultivace mikroorganismů probíhá v detekční vrstvě v živném médiu v kombinaci se specifickým chromogenním systémem pro vybarvení kultivovaného mikroorganismu. Krycí vrstva zabraňuje dekontaminaci během kultivace. Jsou známé některé aplikace tohoto systému pro zjišťování kvality vzduchu a podzemní vody v jeskyních.From the patent documents US 2002/192 742 and EP 0928 830 a test system for the cultivation of microorganisms comprising a detection and covering layer is known. Cultivation of the microorganisms takes place in the detection layer in the nutrient medium in combination with a specific chromogenic system for staining the cultured microorganism. The coating prevents decontamination during cultivation. Some applications of this system for detecting air and groundwater quality in caves are known.
Není ale známé použití a řešení testovacího systému, který by byl vhodný pro monitorování infekčního tlaku moru včelího plodu.However, there is no known use and solution of a test system that is suitable for monitoring infectious swine fever pressure.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Výše uvedené nevýhody zcela odstraňuje řešení nového způsobu monitorování infekčního tlaku moru včelího plodu a zařízení k provádění tohoto způsobu podle předloženého vynálezu.The above disadvantages are completely eliminated by the solution of the novel method of monitoring infectious swine fever pressure and the apparatus for carrying out the method according to the invention.
Podstata způsobu spočívá v tom, že pro detekci a kultivaci bakterií se použije přenosná testovací karta opatřená detekční vrstvou obsahující živné médium MYPGP (Mueller - Hinton broth, Yeast extract, Potassium phosphate, Glucose, Pyruvate) tvořené Mueller - Hinton živným médiem, kvasniěným extraktem, fosfátem draselným, pyruvátem a glukózou, s kyselinou nalidixovou a chromogen 2,3,5-trifenyltetrazoliumchlorid (tzv. TTC). Kyselina nalidixová může být nahrazena kyselinou pipemidovou (30 mg/litr). Detekční vrstva je překrytá odnímatelnou krycí vrstvou, přiěemž detekční vrstva se po sejmutí krycí vrstvy aktivuje zvlhčením sterilním fyziologickým roztokem. Následně se na detekční vrstvu aplikuje vzorek ze zkoumaného úlu (včelí plod, otisk plástu, jiné části úlu nebo včely, popř. inokulaci kapalného vzorku přímo na detekční vrstvu testovací karty), následně se detekční vrstva opět překryje krycí vrstvou, proběhne tepelné ošetření karty s naneseným vzorkem po dobu alespoň 10 min při teplotě 80 °C, a bakterie se kultivují po dobu až 7 dní při teplotě 37 °C, a nakonec se zbarvené kolonie vykultivovaných bakterií vyhodnotí vizuálním způsobem. Po ukončení kultivace a vyhodnocení je v některých případech výhodné, že testovací karta se vzorkem se po ukončení kultivace uchovává ve zmrazeném stavu, při teplotě -20 °C pro účely důkazu, pro účely překultivování otiskem (uchování zajímavého kmene), nebo pro účely archivace.The principle of the method is to use a portable test card provided with a detection layer containing MYPGP nutrient medium (Mueller-Hinton broth, Yeast extract, Potassium phosphate, Glucose, Pyruvate) consisting of Mueller-Hinton nutrient medium, fermented extract, potassium phosphate, pyruvate and glucose, with nalidixic acid and chromogen 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (called TTC). Nalidixic acid may be replaced by pipemidic acid (30 mg / liter). The detection layer is covered with a removable cover layer, wherein the detection layer is activated by moistening with sterile saline after removal of the cover layer. Subsequently, the sample from the examined hive (bee fetus, honeycomb imprint, other part of the hive or bee, or inoculation of the liquid sample directly on the test card detection layer) is applied to the detection layer, then the detection layer is again covered with a covering layer. with the sample for at least 10 min at 80 ° C, and the bacteria are cultured for up to 7 days at 37 ° C, and finally the stained colonies of cultured bacteria are evaluated visually. Upon completion of the culture and evaluation, it is in some cases advantageous that the sample test card is stored frozen at -20 ° C for the purpose of proofing, for the purpose of imprinting (preservation of the interesting strain), or for archiving purposes at the end of the culture.
Výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že dochází ke značné úspoře pracnosti a času při přípravě vyšetřovaných vzorků, a navíc odpadá transport vzorků do laboratoře a následná komunikace s laboratoří při vyhodnocení výsledků, neboť vizuální vyhodnocení lze provést v běžných provozních podmínkách.The advantage of the method according to the invention is that it saves considerable labor and time in the preparation of the samples to be examined, and moreover, the transport of samples to the laboratory and subsequent communication with the laboratory during the evaluation of the results is eliminated,
Předmětem vynálezu je dále i zařízení k provádění výše popsaného způsobu monitorování infekčního tlaku moru včelího plodu. Podstata zařízení spočívá v tom, že je tvořeno alespoň jednouThe invention also relates to an apparatus for carrying out the above-described method for monitoring infectious swine fever pressure. The essence of the device is that it is formed at least once
- 2 CZ 304336 B6 přenosnou testovací kartou, kteráje alespoň na jedné své straně opatřena detekční vrstvou obsahující živné médium MYPGP snalidixovou nebo pipemidovou kyselinou a chromogen 2,3,5trifenyltetrazoliumchlorid (TTC), přičemž detekční vrstva je z jedné strany překryta odnímatelnou krycí vrstvou prostupnou pro kyslík, a z druhé strany je opatřena vodotěsnou deskou.A portable test card having a detection layer comprising at least one side containing MYPGP nutrient medium with snalidix or pipemid acid and 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) chromogen, the detection layer being covered on one side by a removable cover layer permeable to oxygen, and from the other side is provided with a waterproof plate.
Výhoda zařízení podle vynálezu spočívá v tom, že je snadno přenosné a přitom zcela vyhovující pro odběr vzorku v terénu a zajištění kultivace požadovaných bakterií ve tmě a při teplotě 37 °C, což lze snadno zajistit i v podmínkách mimo laboratoř. Kyselina nalidixová popř. kyselina pipemidová v živném médiu přitom funguje, spolu s tepelným ošetřením, jako účinný prostředek k potlačení růstu jiných bakterií než Paenibacillus larvae.The advantage of the device according to the invention is that it is easy to carry and yet perfectly suited for sampling in the field and ensuring the cultivation of the desired bacteria in the dark and at a temperature of 37 ° C, which can easily be ensured even outside the laboratory. Nalidixic acid Pipemidic acid in the nutrient medium functions, together with a heat treatment, as an effective means of inhibiting the growth of bacteria other than Paenibacillus larvae.
Ve výhodném provedení zařízení podle vynálezu je krycí vrstva tvořena fólií z průhledného materiálu, což umožňuje odečtení velikosti kolonií kultivovaných bakterií vizuálně přímo přes krycí vrstvu.In a preferred embodiment of the device according to the invention, the cover layer is formed by a foil of transparent material, which allows reading the size of the colonies of cultured bacteria visually directly through the cover layer.
V dalším výhodném provedení zařízení podle vynálezu je detekční vrstva nebo krycí vrstva opatřena čtvercovou sítí pro odečtení velikosti kultivovaných a vybarvených kolonií bakterií.In a further preferred embodiment of the device according to the invention, the detection layer or the cover layer is provided with a square mesh for reading the size of the cultured and stained colonies of bacteria.
V dalším výhodném provedení vynálezu je vodotěsná deska opatřena samolepící vrstvou, kterou lze upevnit např. do úlu.In a further preferred embodiment of the invention, the watertight plate is provided with a self-adhesive layer which can be fixed, for example, to a hive.
Předmětem vynálezu je rovněž použití testovací karty opatřené alespoň na jedné své straně detekční vrstvou obsahující živné médium a chromogen, přičemž detekční vrstva je překryta odnímatelnou krycí vrstvou, pro monitorování infekčního tlaku moru včelího plodu způsobeného bakterií Paenibacillus larvae, kultivací a vyhodnocením vybavených kolonií bakterií ze vzorku pocházejícího z úlu (včelí plod, otisk plástu, jiné části úlu nebo včely, popř. inokulace kapalného materiálu) aplikovaného na detekční vrstvu a tepelně ošetřeného. Pro použití testovací karty se jako živné médium s výhodou použije MYPGP bujón, chromogen tvořený 2,3,5-trifenyltetrazoliumchlorid (TTC) a kyselina nalidixová nebo pipemidová.The invention also relates to the use of a test card provided with at least one side of a detection layer comprising a nutrient medium and a chromogen, wherein the detection layer is covered with a removable cover layer to monitor infectious bladder infectious pressure caused by Paenibacillus larvae. originating from a hive (bee fetus, honeycomb imprint, other part of the hive or bee, or inoculation of liquid material) applied to the detection layer and heat treated. To use the test card, MYPGP broth, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) chromogen and nalidixic or pipemidic acid are preferably used as the nutrient medium.
Výhody řešení podle vynálezu spočívají zejména v možnosti okamžitého použití, přičemž odpadá pracná příprava vzorku, a ve srovnání s kultivačním testem odpadá příprava a sterilizace živného média, sterilizace antibiotik, rozlévání živného média do Petriho misek apod. Další výhoda spočívá ve výrazné úspoře pracovního prostoru a objemu odpadů. Testovací karty mají mnohonásobně delší životnost a použitelnost. Zásadní výhoda spočívá v jednoduchosti použití metody a zařízení podle vynálezu při detekci a monitorování moru včelího plodu přímo v terénu, přičemž lze využít různé metody aplikace vzorku na testovací kartu dle aktuálních možností.The advantages of the solution according to the invention consist mainly in the possibility of immediate use, without the laborious preparation of the sample, and in comparison with the culture test, the preparation and sterilization of the nutrient medium, sterilization of antibiotics, spilling of the nutrient medium into petri dishes etc. volume of waste. Test cards have a much longer lifetime and usability. A major advantage lies in the ease of use of the method and apparatus of the invention in the detection and monitoring of bee plague directly in the field, whereby various methods of applying the sample to the test card can be utilized according to actual possibilities.
Vynález tedy odstraňuje především technickou náročnost spojenou s odběrem vzorků plodu (kartu lze otisknout na včelí plod, včelí plást apod.) a transportu do laboratoře, dále náročnost přípravy agarových ploten, přípravy inokula, očkování na agarovou plotnu nebo instrumentální náročnost spojenou s prováděním PCR testu v laboratorních podmínkách. Řešení více zpřístupní a zlevní metodu monitoringu infekčního tlaku z okolí pro potřeby včelařů. Výroba standardizovaných karet jednotná metodika jejich použití a vyhodnocení umožní regionální, celostátní i celosvětové shodné posouzení infekčního tlaku moru.Therefore, the invention eliminates the technical complexity associated with the collection of fetal samples (the card can be printed on a bee fetus, honeycomb etc.) and transport to the laboratory, the agar plate preparation, the inoculum preparation, the agar plate vaccination or the instrumental complexity associated with PCR under laboratory conditions. The solution will make the method of monitoring the infectious pressure from the surroundings more accessible and cheaper for the needs of beekeepers. The production of standardized cards by a uniform methodology of their use and evaluation will enable regional, national and worldwide consistent assessment of infectious pressure of the plague.
Způsobem a zařízením podle vynálezu určeným pro monitorování infekčního tlaku moru včelího ploduje možné zachytit původce moru včelího plodu v předklinickém stadiu onemocnění, dále je možné přijmout alternativní způsoby léčby onemocnění a přijmout adekvátní metody prevence a zabránit tak šíření onemocnění, navýšení dalších škod a dále přechodu onemocnění do jeho klinického stadia.With the method and apparatus of the present invention for monitoring infectious bladder infectious pressure, it is possible to capture pathogenic agents of bee brood in the preclinical stage of the disease, to adopt alternative methods of treating the disease and to adopt adequate prevention methods to prevent the spread of disease to its clinical stage.
Způsobem a zařízením podle vynálezu určeným pro monitorování moru včelího ploduje možné provádět robustní epidemiologické studie na velkém území s cílem lokalizovat místo šíření nákazy a tím zacílit další screening potenciálně nemocných včelstev na specifické lokality.With the method and apparatus of the present invention for monitoring bee plague, it is possible to conduct robust epidemiological studies over a large area in order to locate the site of disease spread and thereby target further screening of potentially ill colonies to specific sites.
-3 CZ 304336 B6-3 CZ 304336 B6
Způsobem a zařízením podle vynálezu určeným pro monitorování moru včelího plodu je možné se zaměřit na oblasti a konkrétní chovatele včelstev, kteří se významnější měrou podílejí na distribuci včelstev nebo včelích matek na další území (chovatelé matek, prodejci včelstev). Z hlediska epidemiologických rizik představují závažnou skupinu, která by se v případě i subklinického průběhu onemocnění významně podílela na masivním šíření onemocnění.With the method and apparatus of the present invention intended for monitoring bee plague, it is possible to target areas and particular bee keepers that are more involved in the distribution of bee colonies or bee mothers to other territories (mother breeders, bee sellers). From the point of view of epidemiological risks, they represent a serious group that would contribute significantly to the massive spread of the disease in case of subclinical course of the disease.
Způsobem a zařízením podle vynálezu určeným pro monitorování moru včelího plodu je možné po ukončení kultivace při 37 °C odečíst a pro účely důkazu, pro účely překultivování otiskem (uchování zajímavého kmene), nebo pro účely archivace, uložit do mrazícího zařízení při teplotě -20 °C. Testovací karta je vysoce skladná a nenáročná na prostor (výsledky kultivace na Petriho miskách se mrazit a uchovávat nedají, stejně tak jako není možné skladovat výsledky metody PCR - elektroforetické gely).The method and apparatus according to the invention for monitoring bee plague can be read after 37 ° C cultivation and stored in a freezer at -20 ° for evidence, for reclamation purposes (preservation of the interesting strain) or for archiving purposes. C. The test card is highly storage and space-saving (Petri dish culture results cannot be frozen and stored as well as PCR electrophoretic gels).
Objasnění výkresůClarification of drawings
Vynález bude blíže objasněn pomocí výkresů, na nichž znázorňují obr. 1 perspektivní pohled na testovací kartu, obr. 2 perspektivní pohled na testovací kartu při snímání krycí vrstvy, obr. 3 schematický řez úlem při aplikaci vyšetřovaného vzorku včelí měli na testovací karty, obr. 4 perspektivní pohled na testovací kartu se vzorkem včelí měli překrytým krycí vrstvou v průběhu kultivace, obr. 5 perspektivní pohled na testovací kartu při vizuálním vyhodnocení vykultivovaných kolonií bakterie Paenibacillus larvae.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a perspective view of a test card; FIG. 2 is a perspective view of a test card when removing the cover; FIG. 4 is a perspective view of a test card with a bee sample having an overlay overlaid during cultivation; FIG. 5 is a perspective view of a test card in a visual evaluation of cultivated colonies of Paenibacillus larvae.
Příklady uskutečnění vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní příklady uskutečnění vynálezu jsou představovány pro ilustraci, nikoli jako omezení příkladů provedení vynálezu na uvedené případy. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána. I tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.It is to be understood that the specific embodiments of the invention described and illustrated below are presented by way of illustration and not by way of limitation of the examples to the examples. Those skilled in the art will find, or will be able to ascertain, using routine experimentation, more or less equivalents to specific embodiments of the invention specifically described herein. These equivalents will also be included within the scope of the following claims.
Pro přípravu přenosné testovací karty i byla využita karta určená pro tzv. kartové testy užívané v potravinářském průmyslu. Karta i je složena z několika vrstev. Povrch karty i chrání průhledná odnímatelná krycí vrstva 3, což je tenká fólie propustná pro kyslík. Pod ní je detekční vrstva 2, což je dvouvrstvá textilní podložka z netkané textilie se spodní částí fy do které se nasaje živné médium s chromogenem. Strukturu karty 1 uzavírá vodotěsná deska 4 a samolepící vrstva 5. Na povrchu netkané textilie detekční vrstvy 2 je naznačena čtvercová síť 11 sloužící k usnadnění odečtu kolonií kultivovaných bakterií 10. Po odstranění odnímatelné krycí vrstvy 3 byla detekční vrstva 2 karty f resp. její spodní vrstva 6 napuštěna i ml živného média tvořeného MYPGP bujónem, doplněného kyselinou nalidixovou a chromogenem. Jako chromogen byl použit 2,3,5trifenyltetrazoliumchlorid v koncentraci 0,0025 %. Textilní podložka tvořící detekční vrstvu 2 byla opět zakryta krycí fólií tvořící odnímatelnou krycí vrstvu 3.For the preparation of the portable test card i was used a card intended for the so-called card tests used in the food industry. Card i is composed of several layers. The surface of the card 1 is protected by a transparent removable cover layer 3, which is a thin, oxygen-permeable film. Underneath is the detection layer 2, which is a two-layer non-woven textile backing with a lower part into which the nutrient medium with chromogen is sucked. The structure of the card 1 is closed by a waterproof plate 4 and a self-adhesive layer 5. On the surface of the nonwoven fabric of the detection layer 2 is indicated a square mesh 11 to facilitate the reading of the colonies of cultured bacteria. its lower layer 6 was impregnated with 1 ml of nutrient medium consisting of MYPGP broth supplemented with nalidixic acid and chromogen. The chromogen used was 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride at a concentration of 0.0025%. The textile backing forming the detection layer 2 was again covered with a cover foil forming a removable cover layer 3.
Aplikace testovací karty 1 pro monitoring výskytu infekčního tlaku moru včelího plodu podle vynálezu probíhá tak, že po odstranění odnímatelné krycí vrstvy 3 se aplikuje vyšetřovaný vzorek 7 na detekční vrstvu 2 ve formě roztoku, spadu nebo otiskem.The application of the test card 1 for monitoring the occurrence of infectious swine fever pressure according to the invention proceeds in such a way that, after removal of the removable cover layer 3, the sample to be examined 7 is applied to the detection layer 2 in solution, fallout or imprint.
Aplikace vzorku 7 probíhá buď přímo ve včelím úle 9, nebo mimo úl 9. Zjišťování výskytu původce onemocnění přímo v úle 9 se provádí buď otiskem testovací karty 1 na podložce, stěnách úlu 9, nebo na povrch zavíčkovaných buněk pláství 8, případně časově omezeným otiskem samotných včel 12 na zavěšené testovací kartě i v místě plodu, nebo spadem vzorku 7 včelí měli na testovací kartu i uloženou na dně úlu 9. Mimo úl 9 lze aplikovat vzorek 7 např. ve formě roztoku, připravený složitějším způsobem. Na obr. 3 je znázorněn příklad aplikace vzorku 7 včelí měliSample 7 is applied either directly in the bee hive 9 or outside the hive 9. Detection of the causative agent of the disease directly in the hive 9 is performed either by imprinting the test card 1 on the substrate, the hive walls 9 or the surface of the honeycomb cells. of bees 12 on a suspended test card even at the fetus site, or by fallout of sample 7, bees had a test card i stored at the bottom of the hive 9. Besides hive 9, sample 7 can be applied eg in the form of a solution prepared in a more complex manner. Fig. 3 shows an example of applying sample 7 to bees
-4CZ 304336 B6 na testovací karty i přilepené samolepící vrstvou 5 na dně úlu 9. Včely 12 pohybující se po úlu 9 při odvíčkování buněk pláství 8 vytvářejí drobné částice, které padají na dno úlu 9 (tzv. včelí měl). Jsou-li v úlu 9 přítomny spory bakterií Paenibacillus larvae, dostanou se do vzorku 7 včelí měli na detekční vrstvu 2 testovací karty i.The bees 12 moving along the hive 9 while unwinding the cells of the honeycomb 8 form tiny particles that fall to the bottom of the hive 9 (the so-called bee had). If spores of bacteria of Paenibacillus larvae are present in the hive 9, they reach the sample 7 bees had on the detection layer 2 test cards i.
Po aplikaci vyšetřovaného vzorku 7 na textilní podložku tvořící detekční vrstvu 2 se detekční vrstva 2 opět překryje odnímatelnou krycí vrstvou 3, provede se tepelné ošetření karty s naneseným vzorkem po dobu 10 min při teplotě 80 °C a dále probíhá inkubace testovacích karet i ve tmě po dobu až 7 dnů při teplotě 37 °C. Poté se vizuálně odečtou kolonie kultivovaných bakterií 10 Paenibacillus larvae a zjištěná data se přepočítají na jednotku plochy. V porovnání s předem vypracovanou stupnici nákazy odpovídající počtu kolonií bakterií K) Paenibacillus larvae na plochu, se určí infekční tlak v úlu 9. Testovací karta 1 se vzorkem 7 se uloží do mrazicího boxu, kde se archivuje při teplotě -20 °C pro pozdější průkaz hladiny infekčního tlaku.After application of the test sample 7 to the textile substrate forming the detection layer 2, the detection layer 2 is again covered with a removable cover layer 3, heat treated with the sample card for 10 minutes at 80 ° C and incubates the test cards even in the dark. up to 7 days at 37 ° C. Then, colonies of cultured 10 Paenibacillus larvae bacteria are visually counted and converted to area units. Compared to a pre-established scale of infection corresponding to the number of colonies of Kenibacillus larvae per area, the hive 9 infectious pressure is determined. The test card 1 with sample 7 is stored in a freezer where it is stored at -20 ° C for later detection infectious pressure levels.
Samotná přítomnost kolonií Paenibacillus larvae však nedokazuje existenci klinického stadia onemocnění včelstva morem včelího plodu. Vytyčení ohniska moru včelího plodu provádí příslušná Veterinární správa a mor včelího plodu prokazuje mikrobiologickým vyšetřením včelího plodu (dle O.I.E. - terrestrial manual 2.2.2 - AFB), a dále prokázáním klinického stadia moru včelího plodu na larvách a kuklách ve včelstvu vizuálně. Klinické stádium moru včelího plodu představuje konečné stadium vývoje původce onemocnění v hostiteli (včelstvu).However, the mere presence of colonies of Paenibacillus larvae does not prove the existence of a clinical stage of bee colon disease. The outbreak of the bee plague is carried out by the appropriate Veterinary Administration and the bee plague is demonstrated by a microbiological examination of the bee brood (according to O.I.E. - terrestrial manual 2.2.2 - AFB) and by demonstration of the clinical stage of the bee brood on larvae and pupae visually. The clinical stage of bee brood represents the final stage of development of the causative agent in the host (colony).
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Způsobem a zařízením podle vynálezu určeným pro monitorování infekčního tlaku moru včelího ploduje možné zachytit původce moru včelího plodu v předklinickém stadiu onemocnění, dále je možné přijmout alternativní způsoby léčby onemocnění a přijmout adekvátní metody prevence a zabránit tak šíření onemocnění, navýšení dalších škod a dále přechodu onemocnění do jeho klinického stadia.With the method and apparatus of the present invention for monitoring infectious bladder infectious pressure, it is possible to capture pathogenic agents of bee brood in the preclinical stage of the disease, to adopt alternative methods of treating the disease and to adopt adequate prevention methods to prevent the spread of disease to its clinical stage.
Claims (7)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2012-263A CZ304336B6 (en) | 2012-04-17 | 2012-04-17 | Method of monitoring infection pressure of brood pest, device for making the same and use of a testing card for monitoring infection pressure of the brood pest |
| PCT/CZ2013/000051 WO2013156006A1 (en) | 2012-04-17 | 2013-04-16 | Method of monitoring the infection pressure of american foulbrood, the equipment necessary for this method, and the use of test cards therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2012-263A CZ304336B6 (en) | 2012-04-17 | 2012-04-17 | Method of monitoring infection pressure of brood pest, device for making the same and use of a testing card for monitoring infection pressure of the brood pest |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2012263A3 CZ2012263A3 (en) | 2013-10-30 |
| CZ304336B6 true CZ304336B6 (en) | 2014-03-12 |
Family
ID=48463653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2012-263A CZ304336B6 (en) | 2012-04-17 | 2012-04-17 | Method of monitoring infection pressure of brood pest, device for making the same and use of a testing card for monitoring infection pressure of the brood pest |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ304336B6 (en) |
| WO (1) | WO2013156006A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107130055A (en) * | 2017-07-11 | 2017-09-05 | 伊犁职业技术学院 | Bee larva bacillus TaqMan fluorescent quantitative PCR detection methods |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0928830A1 (en) * | 1996-07-17 | 1999-07-14 | Chisso Corporation | Microbial media |
| US20020192742A1 (en) * | 1999-12-17 | 2002-12-19 | Masashi Ushiyama | Microorganism incubator and microorganism culture medium comprising the same |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2007319780A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-22 | Haas, John I. | Compositions and methods for inhibiting a honey bee pathogen infection on controlling a hive infestation |
| KR20100056238A (en) * | 2008-11-19 | 2010-05-27 | 대한민국(농촌진흥청장) | Diagnostic method for american foulbood(panibacillus larvae) and primer for performing the same |
-
2012
- 2012-04-17 CZ CZ2012-263A patent/CZ304336B6/en not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-04-16 WO PCT/CZ2013/000051 patent/WO2013156006A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0928830A1 (en) * | 1996-07-17 | 1999-07-14 | Chisso Corporation | Microbial media |
| US20020192742A1 (en) * | 1999-12-17 | 2002-12-19 | Masashi Ushiyama | Microorganism incubator and microorganism culture medium comprising the same |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Morita H. et al. Sensitivity and specificity of the Sanita-kun Aerobic Count: internal validation and independent laboratory study 2003 J. AOAC Int. 86, 355-66 * |
| Mulec J., et al. Comparative microbial sampling from eutrophic caves in Slovenia and Slovakia using RIDA®COUNT test kits, January 2012 International Journal of Speleology 41, 1-8 * |
| Ryba S. et al. A PCR method of detecting American Foulbrood (Paenibacillus larvae) in winter beehive wax debris 2009 Vet. Microbiol. 139, 193-196 * |
| Ryba S. et al. The Use of RIDA®COUNT for Monitoring the American Foulbrood Pathogen 2012 Open Journal of Veterinary Medicine, 2, 233-236, Published Online December 2012 * |
| Ushiyama M. Iwasaki M. Evaluation of Sanita-kun E. coli & coliform sheet medium for the enumeration of total coliforms and E. coli 2010 J. AOAC Int. 93, 163-83 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2012263A3 (en) | 2013-10-30 |
| WO2013156006A1 (en) | 2013-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Robert et al. | Conventional methods for the diagnosis of dermatophytosis | |
| Garcia et al. | Ostreid herpesvirus 1 detection and relationship with Crassostrea gigas spat mortality in France between 1998 and 2006 | |
| Locke et al. | An integrated management strategy to prevent outbreaks and eliminate infection pressure of American foulbrood disease in a commercial beekeeping operation | |
| London et al. | An automated system for rapid non-destructive enumeration of growing microbes | |
| Cruz et al. | Morphological changes of Ascaris spp. eggs during their development outside the host | |
| Vandelannoote et al. | Application of real-time PCR in Ghana, a Buruli ulcer-endemic country, confirms the presence of Mycobacterium ulcerans in the environment | |
| Hornitzky et al. | A culture technique for the detection of Bacillus larvae in honeybees | |
| KR20110132388A (en) | Methods and articles for detecting deoxyribonuclease activity | |
| Lesne et al. | Changes in culturability and virulence of Salmonella typhimurium during long-term starvation under desiccating conditions | |
| Afonso et al. | Molecular detection of Anaplasma phagocytophilum DNA in the lesser horseshoe bat (Rhinolophus hipposideros) guano | |
| Gende et al. | Searching for an American foulbrood early detection threshold by the determination of Paenibacillus larvae spore load in worker honey bees | |
| Ansari et al. | Diagnosis and molecular detection of Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood in honey bees in Saudi Arabia | |
| Ansari et al. | Survey and molecular detection of Melissococcus plutonius, the causative agent of European Foulbrood in honeybees in Saudi Arabia | |
| Gillard et al. | Distribution of Paenibacillus larvae spores inside honey bee colonies and its relevance for diagnosis | |
| Milbrath | Honey bee bacterial diseases | |
| Matović et al. | American Foulbrood—Old and Always New Challenge | |
| Anjum et al. | Prevalence of American foul brood disease of honeybee in north-west Pakistan | |
| Lindström | Distribution of Paenibacillus larvae spores among adult honey bees (Apis mellifera) and the relationship with clinical symptoms of American foulbrood | |
| CZ304336B6 (en) | Method of monitoring infection pressure of brood pest, device for making the same and use of a testing card for monitoring infection pressure of the brood pest | |
| Khezri et al. | Prevalence of American foulbrood in asymptomatic apiaries of Kurdistan, Iran | |
| Khol et al. | Grass silage contaminated with Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP): a possible source of paratuberculosis infection in ruminants? | |
| Bzdil | Detection of Paenibacillus larvae spores in the debris and wax of honey bee by the Tween 80 method | |
| CZ23859U1 (en) | Device to monitor infection pressure of brood pest | |
| Darsonval et al. | Confocal laser microscopy analysis of Listeria monocytogenes biofilms and spatially organized communities | |
| Cook et al. | Non-lethal isolation of the fungal pathogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) from amphibians |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20170417 |