CZ287499A3 - Cílené dodání sloučenin vitaminu D - Google Patents

Abstract

Řešení se týká konjugátu, který obsahuje alespoňjednu sloučeninu vitaminu Da alespoňjednu přenosovoumolekulu, farmaceutických prostředků obsahujícíchtakový konjugát a způsobů pro použití konjugátu pro místně cílené dodání vitaminuDnebojeho analogů do vybraných tkání. Při podání výhodné formy pacientovi přenosová složka konjugátu podle předkládaného vynálezu vyhledá a váže se navybranou tkáň, jakoje kostní nebo nádorová tkáň, ve které mávitamin D terapeutický účinek.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká cíleného dodání sloučenin vitaminu D, konkrétně dodání do kostí a do nádorů.

Dosavadní stav techniky

Příliš často je lékař postaven před neřešitelné dilema. Pro účinnou terapii onemocnění je nutné balancovat mezi devastací způsobenou onemocněním a škodlivými účinky léku pro léčbu onemocnění. Ačkoliv by měla být terapie podána ve zcela tolerovaném režimu, často je kompromisem, který umožňuje pouze přijatelnou léčbu.

Za absence preventivních prostředků bránících vzniku onemocnění je další ideální alternativou vývoj léků, které specificky rozpoznávají příčinu onemocnění a napravují ji. Takzvaný magický projektil neboli koncept podání léčiv cíleně do specifického místa není novou myšlenkou. Tento koncept je, založen na vazbě účinku léku na specifické receptory-. zprostředkované děje. Tento koncept stále slouží jako primární základ pro vývoj léků a protilátek.

Chemická modifikace léků v některých případech zvyšuje jejich cílovou orgánovou specificitu. Například byly vyvinuty systémy pro cílené podání sloučenin jako je estradiol a ethinylestradiol do mozku, které jsou založené na redukční konversi dihydropyridin-pyridiniová sůl. Brewster et al., 31, J. Med.

Chem. (1988) 244. Kovalentní navázání některých cukrů na léky může zvyšovat jejich vychytávání v játrech, Ponpinom et al., v Receptor Mediated Targeting of Drugs (Gregoriadis et al.,.vyd.)

NATO ASI series, Plenům Press, New York, 1983, str. 53.

Ve většině případů je nicméně nutné použití specifického nosiče, který je navržen pro transport a dodání léku do cílové tkáně. V takových případech jsou distribuční charakteristiky léku samotného irelevantní, protože to, zda je lék dodán k cílovým buňkách je určeno charakteristikami nosiče. Nicméně, po dodání k cílovým buňkám je stále nutné brát v úvahu distribuci léku na úrovni intracelulární.

Mnoho částic bylo navrženo jako nosiče pro léky. V poslední době se zájem zaměřil na monoklonální protilátky a koloidní přepravní systémy jako jsou liposomy a polymerické mikrosféry.

Viz např. Davis et al., v Site-Specific Drug Delivery (Tomlinson et al., vyd.), John Wiley, New York, 1986, str. 93,

Jako nosiče pro léky byly také navrženy solubilní molekuly, včetně DNA, lektinů, póly-L-lysinu, virosomů, insulinu, dextranu, HCG, dipeptidů a také buněčných systémů jako jsou erytrocyty a fibroblasty. Viz například Poznaňský et al., 36 Pharmacol Rev. (1984) 277. Ještě jiní výzkumníci se pokusili použít jako nosiče pro léky lipoproteiny, zejména lipoproteiny o nízké hustotě. Viz např. Counsell et al., 25 J. Med. Chem. (1982) 1115.

Potřeba cíleného dodání léků je nejvyšší u patologických stavů jako jsou nádory a vážné virové infekce. Vedlejší účinky léků využívaných v léčbě nádorových onemocnění jsou často dosti závažné. Protinádorovými léky jsou ovlivněny jiné rychle rostoucí tkáně, jako je kostní dřeň a buňky sliznice gastrointestinálního traktu, kvůli kterým musí být terapie často ukončena.

Potřeba cíleného dodání léku je také značná u onemocnění kostí, zejména při osteoporose. Ná základě skutečnosti, že ·: '4 •

í.

v \ t .

> -σ’ v osteoporosa probíhá v určitém rozsahu u všech postmenopausálních žen bylo navrženo cílené dodání kostních činidel do mineralizované kostní matrix. 0 některých činidlech je známo, že jsou vychytávána v kostech nebo že mají afinitu ke kostem a vazba takových činidel majících afinitu ke kostem na enzymy, steroidy nebo hormony umožňuje cílené podání činidel do kosti. Například bylo navrženo navázání činidla s afinitou ke kostem, jako je tetracyklin, na inhibitor karbo-anhydrasy, za použití přemosťujícího činidla, za zisku sloučenin vhodných pro léčbu nebo profylaxi degenerativních onemocnění kostí, viz Evropská patentová přihláška č. 201057.

Dále bylo navrženo navázání hormonu, například kalcitoninu nebo insulinu podobného růstového faktoru, na kyselinu aminomethylenbisfosfonovou. Viz Japonská patentová přihláška č. 2104-593A. U.S. patentová přihláška 5183815 popisuje, že vazba steroidu na kyselinu alkylbisfosfonovou může mít lokalizovaný terapeutický účinek na kost. Evropská patentová přihláška č. 0512844A1 popisuje vazbu kostníh růstového faktoru, jako je transformující růstový faktor - S, na molekuly mající afinitu ke kostem, jako je tetracyklin, kalcitonin, bisfosfonaty, kyselina polyasparagová, kyselina polyglutamová, aminofosfo-cukry nebo estrogeny, za vzniku činidla lokálně podporujícího tvorbu kosti.

Dlouhou dobu je známo, že vitamin D má významnou biologickou úlohu v kostním a minerálovém metabolismu. Je dobře známo, že vitamin D má zásadní úlohu ve stimulaci absorpce vápníku a v regulaci metabolismu vápníku. Objevy aktivních forem vitaminu D (M.F. Holick et al., 68, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 803 - 804 (1971); G. Jones.dt al.,,14, Biochemistry, 1250 - 1256 (1975) a aktivních analogů vitaminu D (M.F. Holick et al., Science 180:

190 - 191 (1973); H.Y, Lamet al., Science 186: 1038-1040 (1974)) způsobily mnoho nadšení a vyvolaly spekulace o použitelnosti • · · · • · · • « ·

těchto forem vitaminu D v léčbě onemocnění spojených se ztrátou kostní hmoty.

Studie na zvířatech zkoumající tyto aktivní sloučeniny vitaminu D naznačily, že tato činidla budou užitečná v obnově rovnováhy vápníku. Dále, časné klinické studie naznačily, že podání 0,5 ^g/den la,25-dihydroxyvitaminu D₃, hormonálně aktivní formy vitaminu D₃, skupině postmenopausálních žen zlepšilo absorpci vápníku ve střevu, stejně jako rovnováhu vápníku u žen. Na tomto základě popisuje a chrání U.S. patent 4225596 (patent 596) použití la,25-dihydroxyvitaminu D₃ pro zvýšení absorpce a retence vápníku. Ve stejném patentu je takové použití také chráněno pro la, 25-dihydroxyvitaminu D₂ a Ια-hydroxyvitaminu D₂, kde tyto sloučeniny jsou podle uvedeného patentu zejména vhodné a snadno substituovatelné za 1,25-dihydroxycholekalciferol (la,25-dihydroxyvitamin D₃).

Lepší ukazatelem účinnosti sloučenin vitaminu D v prevenci nebo léčbě onemocnění spojených se ztrátou kostní hmoty je nicméně kost samotná než absorpce nebo rovnováha vápníku. Novější klinická data ukazují, že při dávkách uvedených v patentu 596 má 1a,25-dihydroxyvitamin D₃ nejlepší účinnost v prevenci nebo obnovení ztráty kostní hmoty nebo obsahu minerálů v kosti (S.M. Ott and C.H. Chesnut, Ann.Int. Med. 110: 267-274 (1989); J.C. Gallagher et al., Ann. Int. Med. 113: .649-655 (1990); J. Aloia et al., Amer. J. Med. 84: 401-408 (1988)).

Tyto klinické studie s la, 25-dihydroxyvitaminem D₃ a jiné studié provedené s Ια-hydroxyvitaminem D₃' (M. Shiraki et al., Endocřinol. Japan 32: 305-315 (1985)) naznačují, že kapacita těchto dvou sloučenin vitaminu D pro obnovu kostní hmoty a obsahu minerálů: v kosti je závislá na dávce. Tyto studie také ukazují, že při dávkách nutných pro skutečnou účinnost těchto dvou • « 0 0 • 0 0 0 00

0 0 0

0 0

0 0 0 » 0 0 0 » 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 sloučenin je toxicita ve formě hyperkalcemie a hyperkalcurie hlavním problémem. Konkrétně, pokusy zvýšit dávku la,25-dihydroxyvitaminu D_s nad 0,5 ^g/den často vedly k toxicitě. Při dávkách nižších než 0,5 ^g/den nebyly pozorovány žádné účinky na kostní hmotu nebo obsah minerálů. (Viz G.F. Jensen et al., Clin. Endocrinol. 16: 515-524 (1982); C. Christiansen et al.,

Eur. J. Clin. Invest. 11: 305-309 (1981)). Byla prokázána účinnost 2 ^g/den ΐα-hydroxyvitaminu D₃ na zvýšení kostní hmoty u pacientů se senilní osteoporosou (O.H. Sorensen et al., Clin. Endocrinol. 7: 169S-175S (1977)). Data z klinických studií provedených na Japoncích, populaci, která má nízký příjem vápníku, naznačují účinnost Ια-hydroxyvitaminu D₃ v dávce 1 /zg/den (M. Shiraki et al. , Endocrinol. Japan. 32: 305-315 (1985);

H. Orimo et al., Bone and Minerál 3: 47-52 (1987)). Nicméně, při dávce 2 ^g/den Ια-hydroxyvitaminu D₃ byla toxicita přítomna v přibližně 67% případů, zatímco při dávce 1 ^g/den byla toxicita přítomná přibližně ve 20% případů.

Nověji byly objeveny nové účinky vitaminu D. V buňkách různých orgánů, které se neúčastní na homeostase vápníku, byly objeveny specifické jaderné receptory pro la,25-dihydroxyvitamin D₃. Například, Miller et al., 52 Cancer Res. (1992) 515-520, prokázal biologicky aktivní, specifické receptory pro la,25-dihydroxyvitamin D₃ v buněčné linii lidského karcinomu prostaty, LNCaP.

Přesněji, bylo popsáno, že některé sloučeniny vitaminu D a jeho analogy jsou účinnými inhibitory proliferace maligních buněk a induktory/stimulátory buněčné diferenciace.

Například U.S. patent č. 4391802, Suda et al., popisuje, že sloučeniny Ια-hydroxyvitaminu D, zejména la,25-dihydroxyvitamin D₃ a Ια-hydroxyvitamin D₃, mají silnou,antileukemickou aktivitu, která je způsobena indukcí diferenciace maligních buněk (zejména • Φ · • · φ φφφ φ φ φ φ φ φ leukemických buněk) na nemaligní makrofágy (monocyty) a ža tyto sloučeniny jsou použitelné pro léčbu leukemie. V jiném příkladu Skowronski et al., 136 Endocrinology (1995) 20-26, popsal antiproliferativní a diferenciační účinky Ια,

25-dihydroxyvitaminu D₃ a jiných analogů vitaminu D₃ na buněčné linie karcinomu prostaty.

Předběžné proliferační studie, jak jsou uvedeny výše, se zaměřily výlučně na sloučeniny vitaminu D₃. I když mohou být tyto sloučeniny vysoce účinné v navození diferenciace maligních buněk v kultuře, jejich praktické využití v diferenciační terapii jako protinádorových činidel je významně omezeno z důvodů jejich stejně vysoké účinnosti na metabolismus vápníku. V koncentracích nutných pro in vivo použití jako antileukemických činidel indukuj i tyto sloučeniny značně zvýšené a potenciálně nebezpečné koncentrace vápníku v krvi z důvodů jejich vlastní kalcemické aktivity. To znamená, že klinické použití la,

25-dihydroxyvitaminu D₃ a jiných analogů vitamínu D₃ jako protinádorových činidel je vyloučeno nebo výrazně limitováno z důvodů rizika hyperkalcemie. Toto ukazuje na potřebu sloučenin s vyšší specifickou aktivitou a selektivitou účinku, t.j. sloučenin vitaminu D s antiproliferativními a diferenciačními účinky, ale s menší aktivitou pro vznik hyperkalcemie, než mají známé sloučenina a analogy vitaminu D.

V oboru neexistují materiály nebo způsoby pro cílené dodání sloučenin vitaminu D do specifických cílových tkání, například do kostí nebo nádorů, jako jsou nádory prostaty.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obsahuje konjugaty sloučenin vitaminu D neb analgů vitaminu D, ^;a molekul pro cílené dodání, které'mají • · · • · · · fl ·· fl· • flfl ··· · · · · • flflfl flfl · · · · • fl flfl ·· · · ··« • flfl · · · · • flflfl flfl flflfl ·« ·· flfl schopnost cíleného dodání sloučenin vitaminu D. Specifické konjugaty zahrnují kostní-terapeutické konjugaty a protinádorové konjugaty. Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující takové konjugaty a způsoby proo cílené dodání vitaminu D v konjugatu do požadované tkáně pacienta. Předkládaný vynález poskytuje překvapivě užitečné prostředky pro dodání sloučenin, analogů a derivátů vitaminu D, do požadovaných tkání (t.j. cílových tkání).

Konjugaty podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu skupinu vitaminu D asociovanou s cílenou molekulou mající afinitu k cílové tkáni. V jednom provedení vynález obsahuje konjugat alespoň jednu skupinu vitaminu D asociovanou s cílenou molekulou prostřednictvím alespoň jedné spojovací skupiny, jako je vazba mezi vitaminem D a přenosovou molekulou, bifunkční spojovací skupina nebo jiné spojovací skupiny jako je avidin-biotinová vazba. V jiném provedení obsahuje konjugat přenosovou molekulu mající afinitu k požadované tkáni asociovanou s alespoň jednou skupinou vitaminu D a s druhým terapeutickým činidlem, které je jiné než vitamin D.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu skupinu vitaminu D asociovanou s alespoň jednou cílenou molekulou a vhodný farmaceuticky přijatelný nosič.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob pro cílené dodání vitaminu D nebo analogu vitaminu D, ve kterém je pacientovi podána terapeuticky účinná dávka konjugatu ve farmaceuticky přijatelném nosiči, kde konjugat obsahuje alespoň jednu skupinu vitaminu D asociovanou s alespoň jednou přenosovou molekulou prostřednictvím spojovací skupiny a kde přenosová molekula má afinitu k požadované tkáni. Způsob je navržen pro cílené dodání vitaminu D do požadované tkáně u pacienta.

«9 9· «

• ·9·

Konjugat, farmaceutický prostředek a způsob podle předkládaného vynálezu umožňují cílené dodání vitaminu D do požadované tkáně u pacienta. Toto cílené dodání sloučenin vitaminu D v konjugatech podle předkládaného vynálezu umožňuje účinné dodání sloučeniny do cílové tkáně za podání relativně menších dávek konjugatu pacientovi ve srovnání s dodáním stejného množství sloučeniny, pokud je podaná samostatně. Tím, že předkládaný vynález umožňuje snížení podaného množství sloučeniny vitaminu D, také významně snižuje riziko hyperkalcemie a jiných vedlejších účinků spojených s podáním sloučenin nebo analogů vitaminu D pacientům běžným způsobem.

Další výhody a úplné pochopení jednotlivých provedení, složení prostředků a fyzikálních vlastností bude zřejmé z následujícího podrobného popisu výhodných provedení a z připojených obrázků. Je třeba si uvědomit, že obrázky jsou uvedeny pouze pro ilustraci a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Popis obrázků na připojených výkresech

Výhodné příklady provedení předkládaného vynálezu jsou dále popsány s odkazy na připojené výkresy, ve kterých označují podobné symboly podobné prvky, a kde:

Obr. 1 zobrazuje reakční schéma pro přípravu konjugatu la,24-dihydroxyvitaminu D₂ (la,24-(OH)₂D₂) a aminoalkyl-1,1-bisfosfonatu, který je navázán na C-24 vitaminu D;

Obr. 2A a 2B zobrazují reakční schéma pro přípravu konjugatu la,24-(OH)₂D₂ a aminoalkyl-1,1-bisfosfonatu, který je navázán na

C-l vitaminu D;

Obr. 3 zobrazuje reakční schéma pro přípravu konjugatu • · ·· ♦ ·· ·· •99 «··· · · f · • 9 · 9 9·· · · · · • 9 ♦ · 9 9 · · » * * ···

99· 9·· 9 · ···· «· ··· ·· ·» ··

Ια,24-(OH)_D₂ a aminoalkyl-1,1-bisfosfonatu, který je navázán na C-3 vitaminu D;

Obr. 4A a 4B zobrazují reakčni schéma pro přípravu konjugátu la,25-dihydroxyvitaminu D₃ (la, 25-(OH) ₂D₃) a aminoalkyl-1,1-bisfosfonatu, který je navázán na C-l vitaminu D;

Obr. 5 zobrazuje reakčni schéma pro přípravu konjugátu la,25-(OH)_zD₃ a aminoalkyl-1,1-bisfosfonatu, který je navázán na C-3 vitaminu D;

Obr. 6 zobrazuje reakčni schéma pro přípravu konjugátu la,25-(OH)₂D₃ a aminoalkyl-1,1-bisfosfonatu, který je navázán na C-25 vitaminu D;

Obr. 7 je schematický diagram přípravy konjugátu vitaminu D a monoklonální protilátky, ve kterém je použito avidin-biotinové spojovací skupiny.

Předkládaný vynález se týká použití prostředků obsahujících vitamin D v cíleném dodání léčiv. Nejvhodnější je předkládaný vynález pro cílené dodání vitaminu D do kostí· a do nádorových buněk. Proto bude předkládaný vynález nyní popsán s ohledem na taková provedení. Odborníkům v oboru však bude jasné, že takový popis předkládaného vynálezu je míněn pouze jako příklad a neměl by být považován za omezení jeho rozsahu.

Předkládaný vynález je charakterizován schopností cíleného dodání sloučenin vitaminu D prostřednictvím konjugátu vitaminu D a přenosové molekuly mající afinitu k požadované tkáni.Například, konjugat vitaminu D a činidla s afinitou ke kosti je navržen pro transport a dodání vitaminu D do kosti. Tyto vlastnosti jsou • 44

44

4 4

444 • 4

4

4444 44 • 4 » · 4 » 4 4 dosaženy pomocí nové kombinace fyzikálních a chemických vlastností.

V následujícím popisu vynálezu jsou stupně přípravy provedeny při teplotě okolí a atmosférickém tlaku, pokud není uvedeno j inak.

Jak je zde použit, znamená termín přenosová molekula molekulu, která se váže na požadovanou tkáň nebo která ovlivňuje metabolismus požadované tkáně. Například, kostní-přenosová molekula zahrnuje molekuly s vychytáváním v kostech, jako jsou tetracyklin, kalcitonin, bisfosfonaty, chelační činidla, fosfáty, kyselina polyasparagová, kyselina polyglutamová, aminofosfocukry, peptidy, o kterých, je známo, že jsou asociovány s minerálovou složkou kosti, jako je osteonektin, kostní sialoprotein a osteopontin, proteiny s doménami vážícími se na minerály v kosti, a podobně. Kostní přenosové molekuly také zahrnují molekuly, které sami ovlivňují resorpci kosti a rychlost tvorby kosti, jako jsou bisfosfonaty, estrogeny a jiné steroidy, jako je například dehydroepiandrosteron (DHEA) . Tyto molekuly s afinitou ke kostem mohou mít také terapeutický vliv na růst kosti a/nebo mohou mít synergní nebo aditivní vliv s vitaminem D na resorpci nebo tvorbu kosti. Mezi molekuly s afinitou ke kosti patří také některé chelaty iontů kovů - aminokyselin; mezi molekuly s afinitou k prostatě patří některé steroidy jako je DHEA. Mezi činidla s afinitou k nádorům patří některé protilátky.

Jak je zde použit, znamená termín požadovaná tkáň nebo cílová tkáň vybranou tkáň v těle, která má být léčena nebo do které má být dopraven vitamin D nebo jeho analog. Termín léčení nebo léčba označujé.‘ hojení, prevenci, zmírnění, zlepšení, profylaxi onemocnění nebo vybrané tkáně, stejně jako inhibici abnormálního růstu/ například hyperproliferace buněk, a navození «9 9«

9 9

9 99

9

9 ••99 9·

99 94 • 9 · · 9

9 9 9 9 • 4 999 4 4 4 • · 4

4 4 4 4 4 diferenciace buněk.

Termín terapeutické činidlo označuje materiál, který má hojivý vliv na tkáň při podání nebo dopravení do požadované tkáně. Termín kostní terapeutické činidlo označuje specifický typ terapeutického činidla, které zmírňuje onemocnění nebo poruchy kosti při podání nebo dodání do kosti. Příklady kostních terapeutických činidel jsou sloučeniny vitaminu D, konjugované estrogeny nebo jejich ekvivalenty, antiestrogeny, kalcitonin, bisfosfonaty, vápníkové doplňky, kobalamin, pertussis toxin, bor a jiné kostní růstové faktory jako je transformující růstový faktor β, aktivin nebo kostní morfogenní protein.

Konjugaty podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu sloučeninu, analog, složku nebo skupinu vitaminu D (která je zde označena jako D) asociovanou s alespoň jednou přenosovou molekulou (která je zde označena jako T) a patří mezi ně konjugaty representované vzorcem (I):

(D) * (Τ) (I)

m. n kde n a m představují celé číslo od 1 výše; a * označuje to, že přenosová molekula (T) je asociována se sloučeninou, analogem, složkou nebo skupinou vitaminu D (D) . Je třeba si uvědomit, že termín vitamin D, jak je zde použit, označuje všechny sloučeniny mající běžnou strukturu vitaminu D skládající se z A,

C a D kruhů a C-17 vedlejšího řetězce, stejně jako sloučeniny previtaminu D, které jsou termmálními izomery odpovídajících forem vitaminu D, ve kterých mohou být základní struktury substituované, nesubstituované nebo modifikované, jako jsou například 19-nor sloučeniny. Je třeba si také uvědomit, že skupina vitaminu D si v konjugatu udržuje svou biologickou účinnost, například svůj příznivý účinek, na kost, nebo v případě

99 9 99 99 99 • 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 · « * φ ·· · · · · ·· «·····

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 99 99 ·· previtaminu D izomerizuje na odpovídající formu vitaminu D, která má biologickou účinnost.

Jak jsou zde použity, označují termíny asociovaný s nebo asociace připojení nebo vazbu jedné složky konjugatu (například skupiny vitaminu D) nebo skupiny vitaminu D a spojovacího prvku na druhou složku konjugatu, například na přenosovou molekulu nebo na přenosovou molekulu a spojovací prvek, kde toto připojení nebo vazba jsou zprostředkovány kovalentní vazbou, vodíkovým můstkem, kovovou vazbou, van der Wallsovými silami, iontovou vazbou, coulombovými silami, hydrofobními nebo hydrofilními interakcemi, adsorpcí nebo absorpcí, chelací, nebo jakoukoliv kombinací výše uvedených vazeb. Termíny skupina nebo složka, jak jsou použity s ohledem na vitamin D nebo D, nebo s ohledem na přenosovou molekulu nebo T, označují vitamin D nebo přenosovou molekulu v popsané konjugované formě, t.j. po asociování.

Asociace mezi analogem vitaminu D a přenosovou molekulou může proběhnout v jakékoliv pozici molekuly analogu vitaminu D, v závislosti na funkcionalitě přenosové molekuly. Například, bisfosfonat nebo amid může být vhodně navázán v těch pozicích sloučenin vitaminu D nebo analogů vitaminu D, které mají hydroxylové skupiny, jako je například C-l, C-3, C-24, C-25.

Sloučeniny a analogy vitaminu D použitelné v předkládaném vynálezu jsou sloučeniny vzorce (II):

«9 99 » 9 9

999 • 99

99

9 9 9 9

9 9 9 9

9 999 999

9 9 kde R^{1 *} je H nebo OH; Z je nasycená nebo nenasycená, přímá nebo rozvětvená C-C uhlovodíková skupina; Y je =CH₂; a t je 0 nebo 1, takže pokud je t = 0, tak je sloučenina vzorce (II) 19-nor sloučenina. Výhodně je Z vedlejší řetězec vzorce (IIIA):

m

Q

R⁷

R⁵ (IIIA) kde m je 0 nebo 1; R^s je H nebo OH; R⁶ nebo R⁷ jsou nezávisle H, OH, nižší alkyl, nižší fluoralkyl, O-nižší alkyl, O-nižší acyl, O-aromatický alkyl, nižší cykloalkyl, nebo tvoří spolu s uhlíkem, cyklický uhlovodík; a Q je -C=C-, je 0 nebo celé číslo od na který jsou navazany, C₃-C_e -C==C- nebo R³V _R⁴* , kde n do 7, R³ je CH₃ nebo H a R⁴ je H nebo OH. Například může být Z cholesterolový nebo ergosterolový vedlejší řetězec vzorce (IIIB):

kde R^a a R® jsou oba H nebo tvoří dohromady dvojnou vazbu mezi C-22 a C-23; R³ je CH₃ nebo H; R⁴ a R⁵ jsou nezávisle. H nebo OH; a R⁶ nebo R⁷ jsou nezávisle H, OH, nižší alkyl, nižší fluoralkyl, O-nižší alkyl, O-nižší acyl, O-aromatický alkyl, nižší cykloalkyl, nebo tvoří spolu s uhlíkem, na který jsou navázány (například C-25), C₃-C_e cyklický uhlovodík.

ΦΦ φφ φ φ φ φ φφφ φ φ • φ φ φφφφ φ φ φφφ φ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ »·» φφφ φ φ φφφ φφ φφ φφ

Sloučeniny vitaminu D podle předkládaného vynálezu také zahrnují sloučeniny previtaminu D, výhodně la-hydroxyprevitamin D, který může obsahovat běžné cholesterolové a ergosterolové postraní řetězce, které mohou být volitelně substituované, výhodně hydroxy-substituované, například na C-24 nebo na C-25. Sloučeniny previtaminu D jsou termální izomery odpovídajících sloučenin vitaminu D, například Ια-hydroxyprevitamin D₃ je termálním izomerem Ια-hydroxyvitaminu D_a, a existují v teplotní rovnováze s odpovídaj ícími sloučeninami vitaminu D.

Z přenosových molekul jsou výhodné ty molekuly, které vedou při použití v konjugatu vzorce (I) k dodání alespoň části konjugatu, konkrétně složky konjugatu tvořené vitaminem D, do cílového místa (například do cílových buněk, cílového orgánu, nádoru, atd.). Výhodné přenosové molekuly obsahují chemické skupiny mající požadovanou specificitu, hormony (například modifikátory biologické odpovědi), a protilátky, výhodně monoklonální nebo polyklonální protilátky nebo fragmenty protilátek mající požadovanou specificitu. Mezi výhodné přenosové molekuly s pořadovanou specifickou afinitou ke kosti patří bisfosfonaty, tetracyklin, polymalonaty a dehydroepiandrosteron.

Konjugaty vzorce (I) jsou připraveny za podmínek (jako je pH, teplota nebo koncentrace solí), které nejsou škodlivé pro jednotlivé složky konjugatu a dále v přítomnosti vhodných rozpouštědel, pokud jsou nutná. Pro kontrolu pH je použito pufru nebo je přidána vhodná kyselina nebo baze. Reakční podmínky jsou závislé na typu asociace (*) vytvořené mezi sloučeninou vitaminu D nebo analogem vitaminu D (D) a přenosovou molekulou (T) v konjugatu.

Molární poměr T:D v konjugatech vzorce (I) je výhodně 1:1.

ta ·· ta · · *· ta· ta · • · ta · · ta

Předkládaný vynález také obsahuje ty konjugaty, ve kterých je D asociován s T prostřednictvím spojovací skupiny (která je zde označena jako G) mezi D a T; takové výhodné konjugaty mají obecný vzorec (IV):

[ (T) -(G')J *[(G) -(D) 1 (IV)

XX X SF XI ttl Ic kde každý G' představuje stejnou nebo odlišnou spojovací skupinu; každý G'' představuje stejnou nebo odlišnou spojovací skupinu; g a k jsou každý nezávisle celé číslo od 1 výše; f a h jsou každý nezávisle celé číslo od 0 výše; - je vazba v tom případě, že je spojovací skupina přítomna; n a m jesou stejné, jak je definováno výše; a * označuje skutečnost, že složka přenosové molekuly je asociována se složkou vitaminu D prostřednictvím spojovací skupiny G¹ nebo G'' nebo prostřednictvím obou spojovacích skupin v těch případech, že jsou obě spojovací skupiny přítomny. Je třeba si uvědomit, že D si uchovává v konjugatu svou biologickou účinnost, nebo v případě, že D je previtamin D, dochází k izomerizaci na odpovídající formu vitaminu D, která má biologickou účinnost.

V těch případech, kdy f nebo hjeO (agak jsou 1) , má konj-ugat vzorce (IV) zjednodušený vzorec (V) :

D - G - Τ (V) m n

V takových případech je G výhodně bifunkční spojovací skupina, například kyselina polyglutamová nebo kyselina polyasparagová, nebo vazebná skupina tvořená modifikací D a/nebo T s následnou tvorbou vazby.

Výhodné spojovací skupiny pro použití v konjugatech vzorce (IV) jsou ty skupiny, které váží skupinu vitaminu D na přenosovou

• · · • · · • · • · • ···

• · molekulu bez významného narušení biologické účinnosti vitaminu D a bez významného narušení afinity přenosové molekuly v konjugatu. Spojovací skupiny vytvářejí vazbu mezi skupinou přenosové molekuly a skupinou vitaminu D v konjugatu, kde uvedená vazba musí být dostatečně stabilní, alespoň do té doby, než je konjugat dopraven do blízkosti cíle. Za některých okolností je vitamin D dopravený do cílové oblasti jako část konjugatu účinější po odštěpení alespoň jedné spojovací skupiny spojující přenosovou molekulu a vitamin D. V takových případech je alespoň jedna taková spojovací skupina odštěpena potom, co je konjugat dopraven do blízkosti cíle. Jinými slovy, odštěpením spojovacích skupin v takových případech je možné předejít sférickým překážkám mezi vitaminem D a přenosovou molekulou, které existují v některých konjugatech podle předkládaného vynálezu, kde takové sférické překážky redukují účinnost vitaminu D v konjugatu.

V uvedeném provedení obsahuje konjugat podle předkládaného vynálezu činidlo účinné v léčbě onemocnění kostí, t.j. konjugat obsahuje skupinu vitaminu D a činidlo vychytávané v kostech. Výhodnými činidly s afinitou ke kostem jsou bisfosfonaty (BP) (které jsou také označovány jako difosfonaty) . Například, specifická bisfosfonatová skupina použitelná v předkládaném vynálezu má vzorec (VI):

po₃h₂

Y _ (CH₂)_n — C — R² (VI)

PO₃H₂ kde R² je H nebo OH, Y je NH, 0 nebo NR⁸, kde R⁸ je H nebo

C_i~C₄alkyl a n je celé číslo od 1 do 4. Zejména výhodný kostní terapeutický konjugat, kde T je BP, má vzorec (VII) :

ft· ·· • · · • ft · · • ft ftft • ftft ftftftft ftft * ft· • ftft ft ftftft • · ft · ft · ft • ftft ftft ftft ftft • ftft · • « ft · ·· · ftft* • ft ftft ft·

D - BP (VII) kde BP je navázán například v C-l, C-3, C-17, C-24 nebo C-25 pozici D skupiny.

Konkrétní kostní terapeutické konjugaty vhodné pro použití v předkládaném vynálezu, kde T je bisfosfonat, jsou konjugaty vzorce (VIII):

kde R¹ je H nebo OH; R² je H nebo OH; X je 0 nebo S; Y je NH, neb,o NR, kde R je H nebo C_i-C₄alkyl; n je 1 až 4; a jejich farmaceuticky přijatelné soli; t.j., bisfosfonat je navázán na skupinu vitaminu D v pozici C-17.

Vynález také poskytuje konjugaty vzorce (IX):

HO'

(IX)

ΦΦ ** • · · • φφφ • φ · · φφφ ΦΦΦΦ kl φ »« ΦΦ ·Φ

ΦΦΦ Φ Φ Φ · Φ

ΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ Φ Φ · ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ Φ Φ φφφ 5» ΦΦ ΦΦ kde R¹ je Η nebo OH; R² je H nebo OH; R³ je CH₃ nebo H; R⁴ je H nebo OH; X je O nebo S; Y je NH, O nebo NR, kde R je H nebo C^-C^alkyl; n je celé číslo od 1 do 4; R® a R⁹ jsou oba H nebo tvoří dohromady dvojnou vazbu mezi C-22 a C23; a jejich farmaceuticky přijatelné soli; t.j., bisfosfonat je navázán na skupinu vitaminu D v pozici C-25.

Vynález také poskytuje konjugaty vzorce (X):

PO₃H₂ kde R¹ je H nebo OH; R² je H nebo OH; R³ je CH₃ nebo H; R⁴ je H nebo OH; X je O nebo S; Y je NH, 0 nebo NR, kde R je H nebo C^-C^alkyl; R^s je H nebo OH; n je celé číslo od 1 do 4; R® a R⁹ jsou oba H nebo tvoří dohromady dvojnou vazbu mezi C-22 a C23; a jejich farmaceuticky přijatelné soli; t.j., bisfosfonat je navázán na skupinu vitaminu D v pozici C-3.

Vynález také poskytuje konjugaty vzorce (XI):

• · · • ·· · • I»

(XI)

HO

kde R² je H nebo OH; R³ je CH₃ nebo H; R⁴ je

H nebo OH; X je O nebo S; Y je NH, O nebo NR, kde R je H nebo C^-C^alkyl; R⁵ je H nebo OH; n je celé číslo od 1 do 4; R⁸ a R⁹ jsou oba H nebo tvoří dohromady dvojnou vazbu mezi C-22 a C23; a jejich farmaceuticky přijatelné soli; t.j., bisfosfonat je navázán na skupinu vitaminu D v pozici C-l.

Je třeba si uvědomit, že typická vazba mezi bisfosfonatem a vitaminem D je přes hydroxylovou skupinu vitaminu D, která je přeměněna na skupinu

II která je navázána na aminovou nebo hydroxylovou skupinu, t.j. Y, bisfosfonatu za vzniku karbamatové nebo karbonátové vazby. X může být 0 nebo S. Například může být hydroxylová skupina obsažena ve struktuře vitaminu D v pozici C-l, C-3, C-24, C-25 a konjugace může být provedena v jakékoliv hydroxylované pozici, ale výhodně

• · φ · • · · • · Φ· φφφφ · <

• i· · · · φ φ » φ φ » · · » φ · »φ · φ

Syntéza konjugátů vzorce (I), kde Τ je bisfosfonat, je provedena podle schématu uvedeném na obr. 1-6. Obecně syntéza obsahuje konversi hydroxylové skupiny ve vitaminu D na halogenformiat (například chlorformiat) nebo na thioformiat s následnou reakcí s vhodnou amino- nebo hydroxylovou skupinou bisfosfonatu za vzniku karbamatové, thiokarbamatové, karbonátové nebo thiokarbonatové vazby. Pokud je R² hydroxylová skupina nebo pokud obsahuje sloučenina vitaminu D jednu nebo více dalších hydroxylových skupin kromě požadované hydroxylové skupiny, tak mohou být tyto skupiny chráněny běžnými skupinami pro chránění hydroxylových skupin, jako je benzyl, silyloxy-, atd., před reakcí, která mění požadovaný hydroxyl na halogenformiatovou nebo thioformiatovou skupinu.

Přesněji, v uvedeném provedení reaguje výchozí sloučenina nebo analog vitaminu D (pokud je to vhodné, tak s chráněnými hydroxylovými skupinami) s fosgenem za vzniku chlorformiatu, který potom reaguje s aminobutyl-1,1-bisfosfonatem za vzniku karbamatové vazby. Potom je provedeno odstranění chránících skupin pro jakékoliv hydroxylové skupiny.

Obr. 1 je schéma syntézy konjugatu la,24-(OH)₂D₂-aminoalkyl1,1-bisfosfonatu. Jak je uvedeno na obr. l, výchozí la,24-(OH)₂D₂ je chráněn silyloxy-skupinami na C-l a C-3. Chráněná D sloučenina (1) reaguje s fosgenem v toluenu za vzniku chlorformiatu (2). Chlorformiat (2) reaguje s tetraisopropyl-4-aminobutyl-l,1-bisfosfonatem (t.j. s chráněním hydroxylové skupiny) v dichlormethanu a reakční směs se přečistí rychlou chromatografii za zisku chráněného konjugatu (4). Chráněný konjugat (4) reaguje s tetrahydrofuranem (THF) a tetrabutylammoniumfluoridem (TBAF) pro dostranění chránících skupin z C-l^á^C-S hydroxylových skupin za zisku tetraisopropylesteru konjugatu (5j . Tetraisopropylester (5) je hydrolyzován trimethylsilylbromidermza vzniku konjugatu • · · · • · « · • · · · • · · * · · • · • · • · ·· · struktury kyseliny bisfosfonové (6). Sloučenina (6) a

9-acetylanthracen v methanolu se ozáří, provede se filtrace, koncentrování a lyofilizace a získá se konjugat (7).

Syntézy uvedené na obr. 2-6 jsou podrobně popsány v následujících příkladech provedení vynálezu.

Výhodné konjugaty vzorce (I) jsou také ty, ve kterých T je DHEA. Obecná steroidní struktura DHEA má 17-keto skupinu a 1-hydroxy skupinu. Obě z těchto skupin mohou být výhodně navázány na hydroxylované pozice na vitaminu D, například esterovou vazbou nebo vazbou esterového typu. Reakce pro tvorbu takových vazeb j sou dobře známé.

Výhodné konjugaty vzorce (I) jsou také ty, ve kterých T je je iont kovu, M. Je dobře známo, že ionty kovů mají afinitu k určitým tkáním, například iont stroncia má afinitu ke kostem. Konjugaty mohou mít také formu přímých komplexů mezi skupinou vitaminu D a iontem kovu, kde skupina má koncovou skupinu s negativním nábojem, například taková skupina, která má jednu nebo více karboxylových skupin v C-24, C-25 atd., obecně D-X'.

Konjugat může mít vzorec (XII):

D-X’ .

M²⁺ (XII)

D-X- ^X kde X je skupina s negativním nábojem jako je karboxylové skupina, C0₂ a M je dvojmocný iont kovu.

Alternativně může být konjugat ve formě vzorce (V) , ve kterém jsou D a M asociovány prostřednictvím spojovací skupiny,

• · · · například prostřednictvím aminokyseliny. Například bylo popsáno, že cheláty iontu kovu-aminokyseliny jsou schopné cíleného dodání léku do určité tkáně. Viz například U.S. patenty č. 4863898; 4176564; a 4172072, které jsou zde uvedeny jako odkaz. Například bylo prokázáno, že cheláty hořčík-lysin mají afinitu ke kosti; a cheláty zinek-methioniň mají afinitu ke kůži. Takové cheláty mají vzorec (AA) * M * (AA) kde M je iont kovu a AA je aminokyselinový zbytek (například lysin, arginin, atd.) a * označuje asociaci aminokyselinového zbytku (AA) s iontem kovu (Μ). V konjugatech podle předkládaného vynálezu je aminokyselina chelátu kov-aminokyselina navázána na skupinu vitaminu D amidovou vazbou uvedenou výše pro ten případ, že T je bisfosfonat. Konjugaty jsou representovány vzorcem (XIII):

D - (AA) * M (XIII) kde D je skupina vitaminu D mající skupinu schopnou vazby na aminokyselinu, například hydroxylovou skupinu; (AA) je aminokyselinový zbytek a M je iont kovu, výhodně dvojmocný iont jako je Sr²⁺, Zn²*, Mg²*, Fe²*, Cu²*, Mn²*, Ca²*, Co²*, Cr²* nebo Mo²*. Přesněji jsou konjugaty ve formě představované vzorcem (XIV):

D-O-C-N-(AA) * Μ (XIV) kde D, M, AA a * jsou stejné, jak jsou definovány výše.

Výhodnými konjugaty vzorce (I) jsou také ty, ve e T • · • · • 9 · · · • · · · · • · ··· ·99 protilátka. Protilátka nebo fragmenty protilátky, které mohou být použity v takových konjugatech, mohou být připraveny technikami dobře známými v oboru. Příkladem vhodných protilátek jsou imunoglobuliny, jako je IgA, IgG, IgD a IgE. Monoklonální protilátky s vysokou specificitou mohou být připraveny hybridizačními technikami, které jsou v oboru dobře známé. Viz např. Kohler et al., 245: Nátuře (1975) 495-497; a 6 Eur. J. Immunol. (1976) 511-519; které jsou zde oba uvedeny jako odkazy. Takové protilátky mohou mít vysoce specifickou reaktivitu. Polyklonální protilátky jsou také vhodné pro použití jako přenosové molekuly v konjugatu. Nicméně, pokud je přenosovou molekulou protilátka, pak je to výhodně monoklonální protilátka.

Vybrané monoklonální protilátky jsou vysoce specifické pro jediný epitop, což je činí výhodnými pro použití jako přenosové molekuly v konjugatech podle předkládaného vynálezu. Konjugaty vitaminu D a monoklonálních protilátek mohou být zaměřeny na specifická místa v cílovém regionu, jako například na specifické receptory pro vitamin D na povrchu nádorové tkáně nebo v kostní tkáni. Způsoby pro izolaci a přípravu monoklonálních nebo polyklonálních protilátek ke specifickým antigenům, jako jsou například protilátky k vybraným tkáním nebo i ke specifickým cílovým proteinům, jsou dobře známé. Viz například Molecular Cloning, 2. vydání, Sambrook et al., vyd., Cold Spring Harbor Lab. Press 1989, 18.3. a dále. Mohou být použity také polyklonální protilátky a jejich výroba je levnější, než výroba monoklonálních protilátek. Polyklonální protilátky jsou však méně specifické k cílovým molekulám. Nicméně je možné vyrobit velká množství monoklonálních protilátek vhodných pro použití v konjugatech podle předkládaného vynálezu technikou tkáňových kultur (například hybridomních buněčných linií).

Konjugaty podle předkládaného vynálezu připravené za použití

• · takových protilátek mohou být zaměřeny na, například, buňky, orgány, nádory, diferenciační antigeny nebo jiné antigeny buněčné membrány, polynukleové kyseliny, jako je například DNA a RNA nebo na jakékoliv biologicky aktivní molekuly. Protilátky k receptorům pro vitamin D na cílových buňkách mohou být vhodné pro použití v konjugatech podle předkládaného vynálezu.

V těch konjugatech podle předkládaného vynálezu, ve kterých je T monoklonální protilátka, je asociace T * D provedena výhodně prostřednictvím spojovací skupiny G, například prostřednictvím vazby avidin-biotin představované vzorcem G' - G'¹, za použití známých technik pro avidin-biotin. Takové konjugaty obsahující spojovací skupinu, například vitamin D - biotin - avidin protilátka, jsou výhodně znázorněny vzorcem (D - G' ) * (G’ ' - T)

Schéma pro vazbu protilátek na sloučeniny vitaminu D nebo analogy vitaminu D, za použití například avidinu-biotinu, je uvedeno na obr. 7.

S ohledem na obr. 7, avidin má vysokou afinitu pro koenzym biotin. Jedná se o silnou, nekovalentní interakci, která byla využita pro konjugaci protilátek na různé sloučeniny. Biotin nebo avidin je vhodně navázán buď na sloučeninu vitaminu D nebo na protilátku. Je možno využít mnoha různých schémat pro navázání sloučenin vitaminu D a protilátek. Například může být biotin navázán na protilátku za vzniku biotinylované protilátky a avidin může být navázán na sloučeninu vitaminu D za vzniku komplexu avidin-vitamin D. Tyto dva komplexy potom reagují za vzniku konjugatu protilátka-biotin-avidin-vitamin D. Konjugat vitamin D-biotin-avidin-protilátka je připraven stejným způsobem, jak je uveden na obr. 7. ' ♦ · ♦ ···· ···· • · · · · « ft · · · · • · · * · · · ft · ·« ftftft ftft· ftftft · · «•ftft ftft · · ♦ ftft «ft » ·

Může být vhodné konjugovat hormony nebo jiná činidla (zde označená jako A) na konjugaty vzorce (I) za vzniku bifunkčního konjugatu vzorce (XV):

(D) * (T) * (A) (XV) m n jp kde A je terapeutické činidlo jiné než vitamin D a p je celé číslo od 1 výše, D, T, man jsou stejné, jak byly definovány výše, s podmínkou, že D a A si zachovávají svou biologickou účinnost a * označuje skutečnost, že přenosová skupina je asociována se skupinou vitaminu D a s terapeutickým činidlem jiným než vitamin D. Například je bifunkční konjugat vzorce (XV) takový konjugat, který je schopen dodat vitamin D do kosti zároveň s jiným osteogenním činidlem, jako je například estrogen.

Proto obsahuje předkládaný vynález také konjugaty vzorce (XV), které jsou kostními terapeutickými konjugaty, ve kterých A je hormon nebo jiné činidlo, o kterém je známo, že příznivě ovlivňuje kostní onemocnění nebo poruchy. Příklady kostních činidel jsou konjugované estrogeny nebo jejich ekvivalenty, antiestrogeny, kalcitonin, bisfosfonaty, vápníkové doplňky, kobalamin, pertussis toxin, bor a jiné kostní růstové faktory jako je transformující růstový faktor S, aktivin nebo kostní morfogenní protein.

Předkládaný vynález také obsahuje konjugaty vzorce (XV), které jsou antiproliferativními konjugaty, ve kterých A je cytotoxické činidlo. Mezi taková činidla patří estramustin, fosfát, prednimustin, cis-platina, S-fluoruracil, melfalan, hydroxymočovina, mitomycin, idarubicin, methotrexat, adriamycin a daunomycin.

Předkládaný vynález zahrnuje všechny možné enantiomery • φ φ φ * φ φ φφφ φ φ · φ φ φφφ Φφφφ • φ φφ φφφ φφφ φφφ φ φ φφφ φ φ φφ φφ jakéhokoliv konjugatu podle předkládaného vynálezu, které vykazují optickou izomerii a všechny možné geometrické formy tvořené cis-trans konfigurací na dvojných vazbách. Dále zahrnuje všechna farmaceuticky přijatelné soli zde popsaných sloučenin, jako jsou sodné, draselné, lithné, amonné soli a podobně.

Velikost profylaktické nebo terapeutické dávky konjugátů podle předkládaného vynálezu se bude lišit podle charakteru a závažnosti léčeného stavu, a podle typu prostředku a způsobu podání. Obecně je denní dávka pro léčbu kostních onemocnění v rozmezí od přibližně 0,025 nmol/kg tělesné hmotnosti do přibližně

2,5 nmol/kg tělesné hmotnosti. Denní dávka pro léčbu hyperproliferativních onemocnění, jako jsou nádory, je obecně v rozmezí od přibližně 0,025 nmol/kg tělesné hmotnosti do přibližně 2,5 nmol/kg tělesné hmotnosti.

Konjugaty vzorce (I) jsou použitelné jako aktivní sloučeniny ve farmaceutických prostředcích, které mají snížené vedlejší účinky a nízkou toxicitu ve srovnání se známými analogy aktivních forem vitaminu D₃.

Farmakologicky aktivní konjugaty podle předkládaného vynálezu mohou být zpracovány běžnými farmaceutickými technikami, za vzniku farmaceutického prostředku vhodné pro podání pacientům, například savcům, včetně lidí. Pro podání účinné dávky konjugatu může být použit jakýkoliv vhodný způsob podání. Například může být použito orální, rektální, lokální, parenterální, intravenosní, intramuskulární, subkutánní, oční, nasální, bukální podání.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují konjugat podle předkládaného vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl jako aktivní činidlo a dále mohou obsahovat

9 » 9 9 » 9 9

9 ···

9 9 9 • 9 farmaceuticky přijatelný nosič a volitelně jiné terapeutické přísady. Prostředky jsou vhodné pro různé výše uvedené způsoby podání, ale nejvýhodnější způsob podání v daném případu bude záviset na charakteru a závažnosti léčeného onemocnění a na vlastnostech aktivní složky. Prostředky jsou obvykle připraveny v jednotkových dávkových formách.

Mezi vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče pro prostředky a způsoby podle předkládaného vynálezu patří například voda, roztoky solí, alkoholy, arabská klovatina, rostlinné oleje (například kukuřičný olej, bavlníkový olej, podzemnicový olej, olivový olej, kokosový olej), olej z rybích jater, olejové estery jako je Polysorbate 80, polyethylenglykoly, želatina, uhlovodany (jako je například laktosa, amylosa nebo škrob), stearan hořečnatý, talek, kyselina křemičitá, viskosní parafin, monoglyceridy a diglyceridy mastných kyselin, pentaerythritolové estery mastných kyselin, hydroxymethylcelulosa, polyvinylpyrrolidon, atd.).

Farmaceutické prostředky mohou být sterilizované, a pokud je to žádoucí, tak mohou být smí seny s pomocnými činidly, jako jsou kluzná činidla, konzervační činidla, stabilizační činidla, smáčivá činidla, emulgační činidla, soli ovlivňující osmotický tlak, pufry, barviva a chuťová korigens. Kromě toho může být konjugat podle předkládaného vynálezu potažen nebo chráněn z toho důvodu, aby se zabránilo imunogenicitě nebo reakci retikuloendotelových buněk (RES), například v játrech. Mezi činidla použitelná pro tento účel patří polyethylenglykol (PEG) a jiná činidla známá v oboru.

V jiném aspektu obsahuje předkládaný vynález způsob pro cílené dodání sloučeniny vitaminu D do vybrané tkáně u pacienta, který obsahuje: (1) přípravu konjugatu sloučeniny vitaminu D s alespoň

99

9 9

9 9

999 999 • · • 9 9 9 ·

· • 9

99 9 • 9

9 99 jednou přenosovou molekulou ve farmaceuticky přijatelném nosiči; a (2) podání terapeuticky účinného množství konjugatu podle předkládaného vynálezu. Nicméně, konjugat je výhodně podán v jedné z následujících forem, podle konkrétního způsobu podání.

Pro parenterální podání jsou výhodné injikovatelné, sterilní roztoky, výhodně olejové nebo vodné roztoky, stejně jako suspenze, emulze, nebo implantáty, včetně čípků. Ampule jsou vhodnými jednotkovými dávkami.

Pro enterální podání jsou zejménavhodné tablety, dražé, kapaliny, kapky, čípky, pastilky, prášky nebo kapsle. Sirup, elixír a podobně může být použit tehdy, je-li žádoucí oslazené vehikulum. Vzhledem k jednoduchosti podání představují tablety a kapsle nejvýhodnější orální dávkové jednotky.

Pro rektální podání jsou konjugaty připraveny ve farmaceutickém prostředku obsahujícím čípkovou bázi, jako je například kakaový olej nebo jiné triacylglyceridy. Pro prodloužení životnosti při skaldování obsahují prostředky výhodně antioxidační činidlo, jako je například kyselina askorbová, butylovaný hydroxyanisol nebo hydrochinon.

Mezi výhodné prostředky pro lokální podání patří transdermální prostředky, aerosoly, krémy, masti, plečové vody, zasýpací prášky a podobně.

Přednostně jsou farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu podány orálně. Denní dávka sloučenin podle předkládaného vynálezu je obvykle v rozmezí od 0,025 do 2,5 nmol/kg, lépe od přibližně 0,025 do přibližně 1 nmol/kg. Obyčejně jsou konjugaty podle předkládaného vynálezu připraveny v jednotkové dávkové formě ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Pro léčbu »· ΦΦ · · · ΦΦ ΦΦ • φ φ · φ · » φφφφ φφφφ φ · · «φφφ

ΦΦ φ · · · φ« φφφφφφ φφφ φ · » φ φ φφφφ ΦΦ φφφ «· ΦΦ φ* hyperproliferativních onemocnění, jako jsou karcinomy, je enterální dávka konjugátu vzorce (I) přibližně 1 mmol až přibližně 100 mmol na dávkovou jednotku; pro léčbu onemocnění kostí je tato dávka přibližně 0,5 nmol až 50 nmol na dávkovou j ednotku.

Dále, odborníků bude také jasné, že takové dávky mohou být obsaženy v systémech s časovaným, t.j. například zpomaleným nebo opožděným, uvolňováním, jako jsou liposomové systémy, polysacharidy s pomalým uvolňováním, salistické nebo jiné polymerové implantáty nebo mikrosféry, stejně v těch systémech, ve kterých je aktivní složka chráněna jedním nebo více různě degradovatelnými potahy, například mikroenkapsulací, enterálním potahem, více potahy atd., a že takové systémy umožňují kontinuální dávkování prostředků, které obsahují.Například enterální potah je resistentní na rozklad v žaludeční šťávě. Je také možné lyofilizovat aktivní složku a použít získaný lyofilizát například pro přípravu přípravku pro injekci.

Je třeba si dále uvědomit, že skutečná výhodná množství aktivní sloučeniny v konkrétních příkladech se budou lišit podlý typu použité sloučeniny, typu prostředku, způsobu aplikace a pořadovaného místa a léčeného organismu. Například, konkrétní dávka pro určitého pacienta závisí na zdravotním stavu, dietních zvyklostech, době a způsobu podání, rychlosti vylučování a na současně užívaných lécích a na závažnosti konkrétního léčeného onemocnění. Dávky pro jednotlivé pacienty mohou být stanoveny běžným způsobem, například srovnáním různých aktivit sloučenin a známých činidel, například za použití běžných farmakologických protokolů.

Předkládaný vynález je dále popsán v následujících příkladech, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

♦ · · ♦ 11 91 99 • 94 9 9 9 9 *

9 9 · · 9 t

9 9 4 111 111

4 9 4 4

4 ·· 11 11

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Syntéza konjugatu la-(OH)-24-aminoalkyl-l,1-bisfosfonat-D

Provedené odkazy se vztahují k reakčnímu schématu uvedenému na obr. l. Roztok známého alkoholu (1) (1,0 g, 1,52 mmol) v toluenu (5 ml) se přidá do 22 ml 12,5% roztoku fosgenu v toluenu a roztok se mísí při teplotě okolí po dobu 20 hodin. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku za zisku chlorformiatu (2).

Pyridin (0,18 ml, 2,2 mmol) se přidá do roztoku (2) (1,1 g,

1,53 mmol) a tetraisopropyl-4-aminobutyl-l,1-bisfosfonatu 3 (viz Saari et al., U.S. patent č. 5183815) (0,92 g, 2,2 mmol) v CH₂C1₂ (12 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 3 dnů. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku sloučeniny (4).

Roztok sloučeniny (4) (0,80 g, 0,74 mmol) v tetrahydrofuranu (THF) (10 ml) a tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) (2,2 ml 1,0 M THF roztoku, 2,2 mmol) se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin. Reakční směs se ředí vodou (30 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 40 ml). Kombinované CH₂C1₂ frakce se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku tetraisopropylesteru (5).

Trimethylsilylbromid (0,39 ml, 2,92 mmol) se přidá do roztoku tetraisopropylesteru sloučeniny (5) (0,5 g, 0,58 mmol) v CH₂C1₂ (6 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin v inertní atmosféře. Reakční směs se koncentruje za redukovaného

99

9 9 9 • 9 9 9 ··♦ 999

9 «9 9·

999 9 4 tlaku a zbytek se ředí vodou (15 ml). Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku sloučeniny (6).

Roztok sloučeniny (6) (250 mg, 0,36 mmol) a 9-acetylanthracenu (21 mg) v methanolu (93 ml) se vloží do ACE 500 ml fotoreaktoru a roztok se propláchne dusíkem po dobu 15 minut. Reakčni směs se ochladí na 0 °C a ozářuje se 400 W Hanovia lampou s filtrací přes uranylové sklo po dobu 2 hodin. Reakčni směs se filtruje a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se ředí vodou (10 ml). Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku titulního konjugátu (7).

Příklad 2: Syntéza 1-aminoalkyl-l,1-bisfosfonat-24-(OH) -D₂ (16)

Provedené odkazy se vztahují k reakčnímu schématu uvedenému na obr. 2A a 2B. Do roztoku sloučeniny (1) (2,0 g, 3,04 mmol) a

N.N-diisopropylethylaminu (0,78 g, 6,1 mmol) o teplotě 0 °C v CH₂C1₂ (25 ml) se přidá chlormethylmethylether (0,29 g, 3,6 mmol). Výsledná reakčni směs se mísí po dobu 1 hodiny při 0 °C, potom po dobu 7 hodin při teplotě okolí a potom se ředí vodou (30 ml). Separovaná vodná fáze se extrahuje CH₂C1 (3 x 25 ml) a kombinované organické fáze se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu za zisku sloučeniny (8).

Roztok sloučeniny (8) (1,99 g, 2,84 mmol) v THF (38 ml) a TBAF (8,4 ml 1,0 M THF) se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin. Reakčni směs se ředí vodou (100 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 100 ml). Kombinované CH₂C1₂ frakce se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku diolu (9) .

• · ·· « 99 99 99

9 9 t9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 · 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 · 9

9999 99 999 99 ·9 99

Do roztoku diolu (9) (1,25 g, 2,64 mmol),

Ν,N-dimethylformamidu (20 ml) a imidazolu (0,54 g, 7,93 mmol) se přidá t-butyldimethylsilylchlorid (0,40 g, 2,64 mmol). Reakční směs se mísí při teplotě okolí po dobu 6 hodin, potom se ředí vodou (60 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 70 ml) . Kombinované organické fáze se promyjí solankou (50 ml), suší se přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu za zisku dvou výsledných oddělených materiálů. Tyto sloučeniny jsou identifikovány na obr. 2A jako alkohol (10) a alkohol (11) .

Jak je zobrazeno v horní části obr. 2B, roztok alkoholu (10) (0,5 g, 0,85 mmol) v toluenu (2,5 ml) se přidá do 12,3 ml 12,5% roztoku fosgenu v toluenu a roztok se mísí při teplotě okolí po dobu 20 hodin. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku za zisku chlorformiatu (12).

Pyridin (0,09 ml, 1,1 mmol) se přidá do roztoku chlorformiatu (12) (0,5 g, 0,77 mmol) a tetraisopropyl-4-aminobutyl-l, 1-bisfosfonatu (3) (0,46 g, 1,1 mmol) v CH₂C1₂ (6 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 3 dnů. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku sloučeniny (13).

Roztok sloučeniny (13) (0,50 g, 0,49 mmol) v THF (7 ml) a TBAF (0,74 ml 1,0 M THF roztoku, 0,74 mmol) se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin. Reakční směs se ředí vodou (20 ml) a extrahuje se CH Cl (3 x 30 ml) . Kombinované CH Cl frakce se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku sloučeniny (14).

w · • ♦· ·· «· · · 1 · · · · • · · · · · * • · · · ··· 111 111 11

111 11 11 11

Trimethylsilylbromid (0,26 ml, 1,96 mmol) se přidá do roztoku tetraisopropylesteru (14) (0,35 g, 0,39 mmol) v CH₂C1₂ (4 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin v inertní atmosféře. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se ředí vodou (15 ml) a methanolem (3 ml) a míšení pokračuje po dobu 8 hodin. Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku sloučeniny (15).

Roztok sloučeniny (15) (0,21 g, 0,31 mmol) a

9-acetylanthracenu (18 mg) v methanolu (80 ml) se vloží do ACE 500 ml fotoreaktoru a roztok se proplachuje dusíkem po dobu 15 minut. Reakční směs se ochladí na 0 °C a ozářuje se 400 W Hanovia lampou s filtrací přes uranylové sklo po dobu 2 hodin. Reakční směs se filtruje a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se ředí vodou (10 ml). Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku titulního konjugátu (16).

Příklad 3: Syntéza la,24-(OH)₂-3-aminoalkyl-l, 1-bisfosfonat-D₂ (21)

Provedené odkazy se vztahují k reakčnímu schématu uvedenému na obr. 3. Roztok alkoholu (11) (0,5 g, 0,85 mmol) v toluenu (2,5 ml) se přidá do 12,3 ml 12,5% roztoku fosgenu v toluenu a roztok se mísí při teplotě okolí po dobu 20 hodin. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku za zisku chlorformiatu (17).

Pyridin (0,081 ml, 1,0 mmol) se přidá do roztoku (17) (0,45 g,

0,69 mmol) a tetraisopropyl-4-aminobutyl-l,1-bisfosfonatu (0,41 g, 1,0 mmol) v CH₂C1₂ (5 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 3 dnů. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku sloučeniny (18) .

φφ φ φ φφ φφ φ φ φ · φ φ φ φ φφφ · ·· • · φ φ φ φ

Φ » φφ φφφ <

• ΦΦΦ φ φ φ φ φφφ φφφφ φφ φ

Roztok sloučeniny (18) (0,47 g, 0,46 mmol) v THF (6,5 ml) a TBAF (0,70 ml 1,0 M THF roztoku, 0,70 mmol) se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin. Reakční směs se ředí vodou (20 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 30 ml). Kombinované CH₂C1₂ frakce se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografíí na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku sloučeniny (19).

Trimethylsilylbromid (0,23 ml, 1,74 mmol) se přidá do roztoku tetraisopropylesteru (19) (0,31 g, 0,34 mmol) v CH₂C1₂ (4 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin v inertní atmosféře. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se ředí vodou (15 ml) a methanolem (3 ml) a míšení pokračuje po dobu 8 hodin. Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku sloučeniny (20).

Roztok sloučeniny (20) (0,21 g, 0,31 mmol) a

9-acetylanthracenu (18 mg) v methanolu (80 ml) se vloží do ACE 500 ml fotoreaktoru a roztok se proplachuje dusíkem po dobu 15 minut. Reakční směs se ochladí na 0 °C a ozářuje se 400 W Hanovia lampou s filtrací přes uranylové sklo po dobu 2 hodin. Reakční směs se filtruje a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se ředí vodou (10 ml). Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku titulního konjugatu (21).

Příklad 4: Syntéza la-aminoalkyl-l,l-bisfosfonat-25-(OH)-D_a (32)

Provedené odkazy se vztahují k reakčnímu schématu uvedenému na obr. 4A a 4B. Roztok známého ketonu (22) (3,1 g, 11,1 mmol) (viz Baggiolini et al., 51 J. Org. Chem. (1986), 3098 - 3108, zde uvedeno jako odkaz), 3,4-dihydro-2H-pyranu (1,52 ml, 16,7 mmol) a pyridinium p-toluensulfonatu (0,1 g, 0,4 mmol) se rozpustí v

I 00

0 ♦ 0 00 » 0 · 9

000 000 • 0 «0

000 ··

CH₂C1₂ (50 ml) a provede se míšení pod obu 24 hodin při teplotě okolí. Reakční směs se promyje vodou (30 ml) a organická fáze se suší přes bezvodý síran sodný, filtruje se a koncentruje se za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu za zisku ketonu (23).

Roztok známého fosfinoxidu (24) (1,35 g, 2,32 mmol) v 35 ml bezvodého THF se ochladí na -78 °C a po kapkách se do něj přidá m-butyllithium (1,45 ml 1,06 M roztoku v hexanu). Aniontový roztok se mísí po dobu 5 minut při -78 °C a potom se během 10-15 minut přidá keton (23) (0,57 g, 1,56 mmol) rozpuštěný v bezvodém

THF (10 ml). Reakční směs se mísí po dobu 2 hodin při -78 °C a potom se ředí 2 N vinanem sodno-draselným (6 ml) a 2 N hydrogenuhličitanem sodným (6 ml). Roztok se zahřeje na teplotu okolí a extrahuje se ethylacetátem (4 x 25 ml). Kombinované organické frakce se promyjí solankou (30 ml), suší se přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu, za použití ethylacetatu/hexanu jako eluens, za zisku sloučeniny (25) .

Roztok sloučeniny (25) (0,95 g, 1,30 mmol) v THF (17 ml) a TBAF (3,90 ml 1,0 M THF roztoku, 3,90 mmol) se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin. Reakční směs se ředí vodou (50 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 60 ml). Kombinované CH₂C1₂ frakce se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku diolu (26).

Do roztoku diolu (26) (0,55 g, 1,10 mmol),

N,N-dimethylformamidu (8 ml) a imidazolu (0,255 g, 3,3 mmol) se přidá t-butyldimethylsilylchlorid (0,166 g, 1,10 mmol). Reakční • 9 9« β 9 9

9 99

9 9

9 9

9 9 9 99 ·

99 99

9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 99 999 999

9 9 9 9 • 99 *9 99 99 směs se mísí při teplotě okolí po dobu 6 hodin, potom se ředí vodou (30 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 40 ml). Kombinované organické fáze se promyjí solankou (30 ml), suší se přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu za zisku dvou výsledných separovaných materiálů. Tyto sloučeniny jsou identifikovány na dolní straně obr. 4A jako alkohol (27) a alkohol (28).

Roztok alkoholu (27) (0,25 g, 0,41 mmol) v toluenu (3 mi) se přidá do 6 ml 12,5% roztoku fosgenu v toluenu a roztok se mísí při teplotě okolí po dobu 20 hodin. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku za zisku chlorformiatu (29) , který je uveden v dolní části obr. 4B.

Pyridin (0,047 ml, 0,57 mmol) se přidá do roztoku (29) (0,27 g, 0,4 mmol) a tetraisopropyl-4-aminobutyl-l,1-bisfosfonatu (0,24 g, 0,57 mmol) v CH₂C1₂ (4 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 3 dnů. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku sloučeniny (30) .

Roztok sloučeniny (30) (0,36 g, 0,35 mmol) v THF (5 ml) a TBAF (0,52 ml 1,0 M THF roztoku, 0,52 mmol) se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin. Reakční směs se ředí vodou (15 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 25 ml). Kombinované CH₂C1₂ frakce se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku sloučeniny (31).

Trimethylsilylbromid (0,20 ml, 1,54 mmol) se přidá do roztoku »

·· 99

9 9 • 9 99

9 » 9 · · • * 9 · ·· ··· ··♦ tetraisopropylesteru (31) (0,28 g, 0,30 mmol) v CH^Cl^ (4 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin v inertní atmosféře. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se ředí vodou (15 ml) a methanolem (3 ml) a míšení pokračuje po dobu 0,5 hodiny. Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku titulního konjugatu (32) .

Příklad 3: Syntéza la,25-(OH)₂-3-aminoalkyl-l, 1-bisfosfonat-D₃ (36)

Provedené odkazy se vztahují k reakčnímu schématu uvedenému na obr. 5. Roztok alkoholu (28) (0,26 g, 0,43 mmol) v toluenu (3,0 ml) se přidá do 6,2 ml 12,5% roztoku fosgenu v toluenu a roztok se mísí při teplotě okolí po dobu 20 hodin. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku za zisku chlorformiatu (33).

Pyridin (0,049 ml, 0,59 mmol) se přidá do roztoku chlorformiatu (33) (0,28 g, 0,42 mmol) a tetraisopropyl-4-aminobutyl-l,1-bisfosfonatu (0,25 g, 0,59 mmol) v CH₂C1₂ (5 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 3 dnů. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku sloučeniny (34).

Roztok sloučeniny (34) (0,37 g, 0,36 mmol) v THF (5 ml) a TBAF (0,54 ml 1,0 M THF roztoku, 0,54 mmol) se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin. Reakční směs se ředí vodou (15 ml) a extrahuje se CHCI (3 x 25 ml) . Kombinované CH Cl frakce se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku tetraisopropylesteru (35).

• 4 44

4 4 • 444 • 4 • ·

4444 44 « ·· ·· ·· 44 « 4 4 4 4 «

4 4 4 4 4 · • 4 · 4 ··· 4·· • 44 · 4

444 ·· ·· «*

Trimethylsilylbromid (0,21 ml, 1,60 mmol) se přidá do roztoku tetraisopropylesteru (35) (0,29 g, 0,31 mmol) v CH₂C1₂ (5 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin v inertní atmosféře. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se ředí vodou (15 ml) a methanolem (3 ml) a míšení pokračuje po dobu 0,5 hodiny. Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku titulního konjugatu (36).

Příklad 6: Syntéza la-(OH)-25-aminoalkyl-l,l-bisfosfonat-D₃ (41)

Provedené odkazy se vztahují k reakčnímu schématu uvedenému na obr. 6. Do roztoku etheru (25) (1,31 g, 1,8 mmol) v methanolu (10 ml) a vodě (2 ml) se přidá hydrát pyridinium-p-toluensulfonatu (0,034 g, 0,18 mmol). Reakční směs se mísí při teplotě okolí po dobu 1 hodiny, ředí se vodou (20 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 30 ml). Kombinované organické fáze se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku alkoholu (37) .

Roztok alkoholu (37) (1,09 g, 1,70 mmol) v toluenu (9 ml) se přidá do 25 ml 12,5% roztoku fosgenu v toluenu a roztok se mísí při teplotě okolí po dobu 20 hodin. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku za zisku chlorformiatu (38) .

Pyridin (0,19 ml, 2,32 mmol) se přidá do roztoku chlorformiatu (38) (1,17 g, 1,65 mmol) a tetraisopropyl-4-aminobutyl-l, 1-bisfosfonatu (0,98 g, 2,32 mmol) v CH₂C1₂ (20 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 3 dnů. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku alkoholu (39) .

·«* flfl fl flfl fl flflfl • · • flfl •••fl ·· fl ·

Roztok alkoholu (39) (1,61 g, 1,50 mmol) v THF (20 ml) a TBAF (4,50 ml 1,0 M THF roztoku, 4,50 mmol) se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin. Reakční směs se ředí vodou (60 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 60 ml). Kombinované CH₂C1₂ frakce se suší přes bezvodý síran sodný, filtrují se a filtrát se koncentruje za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografii na silikagelu, za použití methanolu/chloroformu jako eluens, za zisku tetraisopropylesteru (40).

Trimethylsilylbromid (0,75 ml, 5,68 mmol) se přidá do roztoku tetraisopropylesteru (40) (0,93 g, 1,10 mmol) v CH₂C1₂ (20 ml) a směs se mísí při teplotě okolí po dobu 24 hodin v inertní atmosféře. Reakční směs se koncentruje za redukovaného tlaku a zbytek se ředí vodou (30 ml). Směs se filtruje a filtrát se lyofilizuje za zisku titulní sloučeniny (41).

Předkládaný vynález obsahuje konjugaty vitaminu D použitelné pro cílené dodání. Konjugaty obsahují skupinu vitaminu D a přenosovou molekulu, která má afinitu k vybrané tkáni. Konjugaty jsou charakterizovány schopností místně-specifického dodání sloučenin vitaminu D, například konjugat vitaminu D a činidla majícího afinitu ke kostem je navržen pro transport a dodání vitaminu D do kostní tkáně.

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv byl vynález popsán na určitých provedeních, zahrnuje různé modifikace a variace.

Claims (40)

1. Konjugat vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu vitaminu D asociovanou s přenosovou molekulou, která má afinitu k vybrané tkáni.

/

2. Konjugat podle nároku lvyznačující se tím, že molární poměr sloučeniny vitaminu D k alespoň jedné přenosové molekule je 1:1.

3. Konjugat podle nároku lvyznačující se tím, že sloučenina vitaminu D je asociována s přenosovou molekulou prostřednictvím spojovací skupiny.

4. KonjugZt podle nároku 3vyznačující se tím, že že spojovací skupina je vazba tvořená mezi modifikovanou sloučeninou vitaminu D a přenosovou molekulou.

5. Konjugáh podle nároku 3vyznačující se tím, že spojovací skupina je bifunkční spojovací skupina.

6. Konjugat podle nároku 3vyznačující se tím, že sloučenina vitaminu D je asociována s přenosovou molekulou prostřednictvím spojovací skupiny a alespoň jedné další spojovací skupiny.

7. Konjugat podle nároku lvyznačující se tím, že přenosová skupina je bisfosfonatová skupina.

8. Konjugat podle nároku lvyznačující se tím, že přenosová skupina je dehydroepiandrosteronová skupina.

9. Konjugat podle nároku 7vyznačující se tím, že uvedený bisfosfonat je navázán na uvedený vitamin D v C-l, C-3, C-24 nebo C-25 pozici vitaminu D.

10. Konjugat podle nároku lvyznačující se tím, že přenosová molekula je iont kovu.

11. Konjugat podle nároku 5vyznačující se tím, že bifunkční spojovací skupina je aminokyselina komplexně vázaná s přenosovou skupinou a navázaná na sloučeninu vitaminu D amidovou vazbou.

12. Konjugat podle nároku 10 vyznačující se tím, že iont kovu je dvojmocný iont kovu vybraný ze skupiny skládající se z Sr²*, Zn²*, Mg²*, Fe²*, Cu²*, Mn²*, Ca²*, Co²*, Cr²* nebo

Mo²*.

13. Konjugat podle nároku lvyznačující se tím, že přenosovou molekulou je protilátka.

14. Konjugat podle nároku 13 vyznačující se tím, že protilátková přenosová molekula je asociována se sloučeninou vitaminu D prostřednictvím vazby avidin-biotin, kde biotin je navázán na protilátku a avidin je navázán na sloučeninu vitaminu

D.

15. Konjugat podle nároku 13 vyznačující se tím, že přenosovou molekulou je monoklonální protilátka.

16. Konjugat podle nároku 13 vyznačující se tím, že přenosovou molekulou je polyklonální protilátka.

17. Konjugat podle nároku lvyznačující se tím, že obsahuje alespoň jedno další konjugované činidlo jiné než vitamin • · ··

D.

18. Konjugat podle nároku 17 vyznačující se tím, že terapeutickým činidlem je kostní-terapeutické činidlo vybrané ze skupiny zahrnující konjugované estrogeny nebo jejich ekvivalenty, antiestrogeny, kalcitonin, bisfosfonaty, vápníkové doplňky, kobalamin, pertussis toxin, bor, dehydroepiandrosteron, transformující kostní růstový faktor β, aktivin a kostní morfogenní protein.

19. Konjugat podle nároku 17 vyznačující se tím, že terapeutickým činidlem je cytotoxické činidlo vybrané ze skupiny zahrnující estramustinfosfat, prednimustin, cis-platinu,

S-fluoruracil, melfalan, hydroxymočovinu, mitomycin, idarubicin, methotrexat, adriamycin a daunomycin.

20. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje konjugat, který obsahuje alespoň jednu sloučeninu vitaminu D asociovanou s přenosovou molekulou, která má afinitu k vybrané tkáni; a vhodný farmaceuticky přijatelný nosič.

21. Farmaceutický prostředek podle nároku 20 vyznačuj ící se t i m, že dále obsahuje diferencovaně degradovatelný potah obklopující konjugat, který umožňuje kontrolované podání konjugatu.

22. Farmaceutický prostředek podle nároku 21 vyznačuj ící se t i m, že uvedeným potahem je enterální potah.

23. Způsob pro cílené dodání sloučeniny vitaminu^49--drr-vvbrané tkáně pacienJia-n^--y^-g-nT~~a~~čnúr^r~r~cí se t i m, že obsahuje —---~ ’ kroky:

• ·

a) poskytnutí konjugatu, který obsahuje sloučeninu vitaminu/D ve farmaceuticky přijatelném nosiči, kde konjugat obsahuje / alespoň jednu sloučeninu vitaminu D asociovanou s přenosdvou molekulou, která má afinitu k vybrané tkáni; a /

b) podání terapeuticky účinné dávky konjugatu pacientovi.

24. Způsob podle nároku 23 vyznačuj /c i se t i m, že konjugat je podán orálně pacientovi s onemocněním kostí v dávce 0,5 nmol až 50 nmol na jednotkovou d^ýku.

25. Způsob podle nároku 23 v v/z načující se tím, že konjugat je podán orálně pacientovi s hyperproliferativním onemocněním v dávce 1 nmdí až 100 nmol na jednotkovou dávku.

26. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že konjugat je dopraven po podání pacientovi do vybrané tkáně.

27. Způsob podle nároku 26vyznačující se tím, že přenosová molekula je odštěpena po dopravení konjugatu do vybrané tljáně, což zvyšuje účinnost sloučeniny vitaminu D v konjugatu.

28. Konjugat vzorce (I) (D) * (T) m

(I) kde každý D je sloučenina vitaminu D; každý T je přenosová molekula; n a m jsou celá čísla od 1 výše; a * označuje asociaci přenosové molekuly se sloučeninou vitaminu D.

29. Prostředek pro léčbu antiproliferativních onemocnění vyznačující se tím, že obsahuje konjugat podle nároku 28, kde T je činidlo schopné vyhledávání receptorů pro vitamin D na nádorových buňkách.

Φ · · · » · · • · · · « · · ♦ • · · » ·· · ·· ·· ·· ·· • · · · · • · · · · • · ··φ Φ·· • · ·

30. Konjugat podle nároku 28 vyznačující se tím, že T je monoklonální protilátka, polyklonální protilátka nebo jejich fragment, iont kovu, činidlo s afinitou ke kostní tkáni nebo činidlo s afinitou k nádorům.

31. Konjugat podle nároku 30 vyznačuj ící se tím, že činidlo s afinitou ke kostní tkáni je bisfosfonat, tetracyklin, polymalonan nebo dehydroepiandrosteron.

32. Konjugat vzorce (IV) [(T) -(G') 1 *[(G'') - (D) 1 (IV)

2Π JTX TTl· 1^.

kde každý G' představuje stejnou nebo odlišnou spojovací skupinu; každý G'' představuje stejnou nebo odlišnou spojovací skupinu; každý D je sloučenina vitaminu D; každý T je přenosová molekula; g, k, n a m jsou celé číslo od 1 výše; f a h jsou celé číslo od 0 výše; - je vazba v tom případě, že je spojovací skupina přítomna; a * označuje skutečnost, že složka přenosové molekuly je asociována se složkou vitaminu D prostřednictvím spojovací skupiny G’ nebo G' ' nebo prostřednictvím spojovacích skupin G' a G' ' v těch případech, že jsou obě spojovací skupiny přítomny.

33. Konjugat podle nároku 32 vyznačující se tím, že G' je biotin; G'' je avidin a * představuje vazbu avidin-biotin.

34. Konjugat vzorce (XV) (D)_m * (T)_n * (A)^ (XV) kde každý D je sloučenina vitaminu D; každý T je přenosová molekula; každý A je terapeutické činidlo jiné než vitamin D; n, map jsou celá čísla od 1 výše; a * označuje skutečnost, že • · přenosová skupina je asociována se skupinou vitaminu

D a s terapeutickým činidlem jiným než vitamin D.

35. Konjugat podle nároku 34 vyznačující se tím, že A je cytotoxické činidlo nebo kostní-terapeutické činidlo.

36. Konjugat podle nároku 35 vyznačující se tím, že T je činidlo s afinitou ke kostní tkáni.

37. Způsob pro léčbu kostních onemocnění u člověka_____—---— vyznačuj í cí_s_^-tůr-trr; z^obsahuje podání terapeuticky ^ůéinné^davkyTčonjugatu podle nároku 36 subjektu.

38. Konjugat podle nároku 34 vyznačující se tím, že T je činidlo s afinitou ke kostní tkáni a A je činidlo s afinitou ke kostní tkáni.

39. Způsob pro léčbu kostních onemocnění _u__čiověka—---vyznačuj íc__í___s—e—trTTTíb že obsahuje podání terapeuticky ůčinné^davkykonjugatu podle nároku 38 subjektu.

40. Prostředek pro léčbu antíproliferativních onemocnění vyznačující se tím, že obsahuje konjugat podle nároku 34, kde T je činidlo schopné vyhledávání receptorů pro vitamin D na nádorových buňkách a A je cytotoxické činidlo.