CZ28452U1 - Sady primeru pro stanovení odrůdové pravosti cibule analýzou mikrosatelitů (SSR) - Google Patents

Description

Sady primerů pro stanovení odrůdové pravosti cibule analýzou mikrosatelitů (SSR)

Oblast techniky

Vynález se zabývá analýzou délkové variability mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd cibule Allium cepa L. Podstatou je amplifikace úseků genomu obsahující daný mikrosatelitní lokus pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) se specifickými příměry a následná analýza produktů a ztotožnění profilu DNA s deklarovanou odrůdou.

Dosavadní stav techniky

Cibule patří mezi nejstarší a nejvíce užívané druhy zeleniny na celém světě. Využívá se v kuchyni, má i velmi velké preventivní a léčivé účinky na lidský organismus.

Charakterizace odrůd cibule pro kontrolu trhuje problémem stejně jako možnost ověření identity linií při tvorbě hybridního osiva. Chybí dostatečná charakterizace odrůd a linií na molekuláměgenetické úrovni. S objevem polymerázové řetězové reakce (PCR) a jejím zavedením jako rutinní metody v laboratořích molekulární biologie se však značně zrychlil vývoj metod pro studium genetické variability a tudíž se i problém charakterizace odrůd stal řešitelným. V současné době již existuje mnoho metod, které jsou vhodné pro detekci genetické variability. Jednou z metod, která se rutinně používá je analýza mikrosatelitů. Mikrosatelity jsou úseky DNA s opakujícím se motivem nej častěji dvou nukleotidů. Počet opakování daného motivu je dán mnoha faktory a je nutno ho chápat z fylogenetického hlediska. Vlastní příčinou je chromosomální dynamika: chromosomální aberace, nerovnoměrný crossing-over, amplifikace a neúplná replikace určitých segmentů chromosomální DNA (Ondřej, 1992). Mikrosatelity se tudíž vyznačují vysokou mírou variability v počtu opakování jejich motivů, která se ve vlastní analýze projeví jako vysoká míra délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů DNA daného mikrosatelitního lokusu. Výhodou analýzy mikrosatelitů je hypervariabilita, kodominance alel, hojný výskyt v genomech eukaryot, potřeba pouze malého množství DNA, vysoká reproducibilita, možnost provádět analýzy jako multiplex, tj. v jedné reakci analyzovat více SSR lokusů, což výrazně zlevňuje cenu analýz (de Vienne et al., 1998).

Z mnoha komparativních studií (Russel et al. 1997, Nagaoka and Ogihara, 1997; Svobodová et al. 2008) se analýza mikrosatelitů ukazuje jako nejvhodnější metoda pro analýzy genetické variability v rámci druhu - tato metoda nejlépe detekuje rozdíly mezi odrůdami téhož rostlinného druhu.

Podstata technického řešení

Uvedený nedostatek-nedostupnost vhodných postupů pro identifikaci odrůd a linií -řeší sady primerů, kde vždy jeden primer z páru a to forward je fluorescenčně značen (6 - fam, víc, ned) specificky rozlišující odrůdy cibule. Jedná se o primery s jejich pomocí lze amplifikovat variabilní oblasti, tzv. mikrosatelity (dále jen SSR). Pro každou kombinaci mikrosatelitů a odrůdy byl charakterizován specifický signál. Tak je možné jednoznačně odrůdu identifikovat. V tomto případě je možné provádět tzv. multiplexové analýzy a analyzovat tak více (obvykle 3 až 4) mikrosatelity v jedné analýze. Součástí analýzy je velikostní standard a standardy alel.

Protože je nutno rozlišit délku produktu PCR reakce pro daný mikrosatelit s přesností na 2 bp, je nutné použít přesnější metodu než je klasická elektroforéza v agarózovém gelu. Tato metodika byla optimalizována pro použití kapilární elektroforézy v přístrojích ABI PRISM 3130*(Applied Biosystems).

Dále je, podle vynálezu, důležité, využívat dále popsané reakční podmínky dané následující reakční směsí pro každý vzorek, kdy v objemu 15 mikrolitrů reakční směsi je přítomných 6,8 mikrolitrů sterilní deionizované vody (bez DNáz a RNáz), 1,5 mikrolitrů 10X pufru (Biotools, Dynex*), 2,0 mikrolitrů MgCl₂ o koncentraci 15 milimolámí (Biotools, Dynex*), 1,5 mikrolitrů dNTP o koncentraci 2,5 milimolámí, 1,0 mikrolitrů specifického primerů F o koncentraci 5,0 mikromolámí a 1,0 mikrolitrů specifického primerů R o koncentraci 5,0 mikromolámí. K reakční směsi se poté přidá 1 mikrolitr testované DNA.

-1 CZ 28452 U1

PCR (polymerázová řetězová reakce) v reálném čase probíhá v termocykleru při následujícím teplotním profilu: 3 minuty při 95 °C, následuje 35 cyklů skládajících se ze tří kroků (30 sekund při 95 °C, 30 sekund při 60 °C a 30 sekund při 72 °C), a nakonec 5 minut při 72 °C.

Pro kontrolu lze přítomnost PCR produktu ověřit detekcí na 2% agarosovém gelu s délkovým standardem.

Produkty amplifikace jsou separovány elektroforeticky metodou kapilární elektroforézy na přístroji ABIPRISM 3130* (Applied Biosystems), kde příprava vzorku pro analýzu kapilární elektroforézou je následující:

- 10 μΐ Formamid (Applied Biosystems*), 0,5 μΐ LIZ500 (Applied Biosystems*), Vzorky 6FAM, VIC, NED a to z každé amplifikační reakce pro daný vzorek 0,4 μΐ pro příměrový pár v sadě A - Sada Multiplex A

- 10 μΐ Formamid (Applied Biosystems*), 0,5 μΐ LIZ500 (Applied Biosystems*), Vzorky 6FAM, VIC, NED a to z každé amplifikační reakce pro daný vzorek 0,4 μΐ pro příměrový pár v sadě B - Sada Multiplex B

- 10 μΐ Formamid (Applied Biosystems*), 0,5 μΐ LIZ500 (Applied Biosystems*), Vzorky 6FAM, VIC, NED a to z každé amplifikační reakce pro daný vzorek 0,4 μΐ pro primerový pár v sadě C - Sada Multiplex C

- 10 μΐ Formamid (Applied Biosystems*), 0,5 μΐ LIZ500 (Applied Biosystems*), Vzorky 6FAM, VIC, NED a to z každé amplifikační reakce pro daný vzorek 0,4 μΐ pro primerový pár v sadě D - Sada Multiplex D

- 10 μΐ Formamid (Applied Biosystems*), 0,5 μΐ LIZ500 (Applied Biosystems*), Vzorky 6FAM, VIC, NED a to z každé amplifikační reakce pro daný vzorek 0,4 μΐ pro primerový pár v sadě E - Sada Multiplex E

Vyvinuté sady primerů podle technického řešení pro stanovení odrůdové pravosti analýzou mikrosatelitů (SSR) budou využitelné pro molekulámě-biologické hodnocení odrůdové pravosti odrůd cibule Allium cepa L.

Sady primerů pro stanovení odrůdové pravosti byly navrženy původci a jejich kombinace (kombinace příměrových párů) byly optimalizovány pro dané podmínky ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v. v. i., Praha. CZ, kde probíhalo i statistické hodnocení vhodnosti použití různých příměrových kombinací a ověření jejich specificity. Následující příklady provedení vynález pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Název markéru (primerový pár-F a R)	Forward primer	Reverse primer
ACM013-6FAM	6FAM- CAACCTCGAAOAACTCACCG	GCGAATCTTGTTTTTGGGAA
ACM017-VIC	VIC- CCTTCTCCCCATTCTCTTCC	CATCGTCCTCGTCCTCATC
ACM0I8-NED	NED-GGGGAATGGTGGAGAATAGA	AACAGAGGCAAGAGGAGCG
Sada - Multiplex A
ACM004-6FAM	6FAM- TCGTTCTTTAGAACACGTTAGGAA	TGTCGGCGGATATAGTGACA
ACM066-V1C	VÍC- CTCCCCGCAACCAGTAATAA	GCTTGGGTTTTGTTTCTCCA
ACM068-NED	NED- CGAAGGTGAAGGTGTACGGT	CAAATGGCTGCAATAAGCAA
Sada - Multiplex B
ACM091 6-FAM	6FAM- TCTCCTCCTCTAACCAGCCA	GGTGCTCCAGTTGAGCTrTC
ACM093-VIC	VIC- GCCAACAGTTTTCGTAAGTTGA	ATTCTCTTCGGCTTTCGTGA
ACM094-NED	NED- GATGATGGCGAAGACACAGA	AAAAACGGCTTAGGAATTTAACG
Sadu - Multiplex C
ACM105-6FAM	6FAM- CAAGTGGAGCGGGTATTTGT	GAGGCACAACTTCCrCTTCG
ACMI12-VIC	VIC- TTCCCAACAAACGTTCATCA	GTGAAGGGAGAGCAGTGGAG
ACM115-NED	NED- TCCATCTATGCATCTCGCCAC	CTATTCTTCCACTGGGGCAA
Sada - Multiplex D
ACM146-6FAM	6FAM- ATGTCCCAATTCGACCAGAG	CGTTACGGCTGAGAACTTCC
ACMI51-V1C	VIC- TGTCAGACAAGCAACTCCTCC	AGGTGAGGCTTAGATGGGGT
ACM170-NED	NED- TTCTGCAATGAAAACACATTGA	ATCCAACTGAGTCGGCAATC
Sada - Multiplex E

-2CZ 28452 Ul

*) název přístroje nebo dodavatele činidla je dán jen pro orientaci, lze využít jakýkoliv odpovídající přistroj nebo činidlo, které poskytne shodné výsledky.

Příklady provedení

Příklad 1

Pro analýzu byly použity cibule (Allium cepa L.) dostupné na českém trhu. Bylo analyzováno 17 odrůd cibulí. DNA byla izolována z listů pomocí CTAB (cetyltrimethylamonium bromid) a po kontrole kvality izolované DNA a změření její koncentrace byly vzorky DNA naředěny sterilní vodou na pracovní koncentraci 100 ng/μΐ a přidány k reakční směsi. Reakční směs pro jeden vzorek se skládala z: 6,8 mikrolitrů sterilní deionizované vody (bez DNáz a RNáz), 1,5 mikrolitrů 10X pufru (Biotools. Dynex*), 2,0 mikrolitrů MgCl₂ o koncentraci 15 milimolámí (Biotools, Dynex*), 1,5 mikrolitrů dNTP o koncentraci 2,5 milimolámí, 1,0 mikrolitrů specifického primem F o koncentraci 5 mikromolámí a 1,0 mikrolitrů specifického příměru R o koncentraci 5 mikromolámí. Nejprve byl připraven mastermix (reakční směs bez templátové DNA) pro každý pár primerů do zvláštní zkumavky, ten rozpipetován do PCR zkumavek nebo PCR destičky a k němu nakonec přidán po 1 μΐ roztoku vzorku DNA.

Reakce probíhala v termocykleru (Eppendorf *) při následujícím teplotním profilu: 3 minuty při 95 °C, následuje 35 cyklů skládajících se ze tri kroků (30 sekund při 95 °C, 30 sekund při 60 °C a 30 sekund při 72 °C), a nakonec 5 minut při 72 °C.

Na 2% agarosovém gelu byla rozlišena délka získaného produktu pomocí délkového standardu 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Kanada*) a byl detekován PCR produkt.

Produkty amplifikace byly naředěny dle tabulky ředění pro daný PCR produkt, rozpipetovány v objemu 0,4 mikrolitrů do PCR destičky spolu s 10 mikrolitry Formamidu (Applied Biosystems*) a 0,5 mikrolitrů velikostního standardu LIZ500 (Applied Biosystems*) a inkubovány 7 minut při teplotě 95 °C a následně rychle ochlazeny na teplotu 4 °C v cyklem a krátce centrifůgovány. Vzorky jsou poté separovány elektroforeticky metodou kapilární elektroforézy na přístroji ABIPRISM 3130 (Applied Biosystems*).

Uvedený příklad provedení technického řešení pouze dokládá možnosti použití, aniž by jakkoliv omezoval další aplikace.

Průmyslová využitelnost

Tyto sady primerů lze využít pro molekulámě-biologické hodnocení odrůdové pravosti odrůd a linií cibule Allium cepa L.

Vysvětlivky zkratek použitých v textu:

PCR - The Polymerase Chain Reaction SSR - mikrosatelit (Simple Sequence Repeat)

NED - typ fluorescenční značky VIC - typ fluorescenční značky

6-FAM - 6- karboxyfluorescein, typ fluorescenční značky

Použitá literatura:

ABI PRISM 3 130 Reference Manual (http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldokuments/cm s_041469.pdf)

ABI PRISM 3130 - Avant Manual http://www.lifeteehnologies.eom/l/l/4326-abi-prism-3100avant-genetic-analyzer-user-guide.html

ČSN EN ISO 21571 Potraviny - Metody pro detekci geneticky modifikovaných organismů a odvozených produktů. Extrakce nukleové kyseliny (2007)

-3CZ 28452 Ul

De Vienne D., Santoni s. (1998): Les principales sources de marqueur moléculaires, In: de Vienne et al.: Les n arqueur moléculaire en génétique et biotechnologies végétales. INRA, Paris, 1998:15-47.

Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing european Network of GMO Laboratories (ENGL) (CRL 2008).

Jakše }., Martin W., McCallum J., Havey M. J. (2005): single Nucleotide Polymorpisms, Indels, and simple Sequence Repeats for onion Cultivar Identification. Journal of the American society for Horticultural Science, 130:912-917

Nagaoka T., Ogihara Y. (1997): Applicability o inter-simple sequence repeat polymorpisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics 94:597-602.

Ondřej M. (1992): Genové inženýrství kulturních rostlin. Academia. Praha 1992.

Russel J. R., Fuller J. D., Macaulay M., Hatz B. G., Jahoor A., Powel W., Waugh R. (1997): Direct comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs. AFLPs, SSRs and RAPDs. Theoretical and Applied Genetics 95:714-722.

Svobodová, L., Kučera. L., Ovesná. J: Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., 2008,20 pp.

Claims (1)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Sada příměrů pro hodnocení odrůdové pravosti odrůd cibule Allium cepa L., která se v y značují tím, že obsahuje kombinaci příměrů:

   F - 6FAM- CAACCTCGAAGAACTCACCG R - GCGAATCTTGTTTTTGGGAA F - VIC- CCTTCTTTTTATTCTCTTCC R - CATCGTCCTCGTCCTCATC

   F - NED- GGGGAATGGTGGAGAATAGA

   R-AACAGAGGCAAGAGGAGCG nebo

   F - 6FAM- TCGTTCTTTAGAACACGTTAGGAA

   R-TGTCGGCGGATATAGTGACA

   F - VIC- CTCCCCGCAACCAGTAATAA

   R - GCTTGGGTTTTGTTTCTCCA

   F - NED- CGAAGGTGAAGGTGTACGGT

   R - CAAATGGCTGCAATAAGCAA nebo

   F - 6FAM- TCTCCTCCTCTAACCAGCCA

   R - GGTGCTCCAGTTGAGCTTTC

   F - VIC- GCCAACAGTTTTCGTAAGTTGA

   R - AT TCTCTTCGGCTTTCGTGA

   -4CZ 28452 U1

   F - NED- GATGATGGCGAAGACAVAGA R - AAAAACGGCTTAGGAATTTAACG nebo

   F - 6FAM- CAAGTGGAGCGGGTATTTGT 5 R - GAGGCACAACTTCCTCTTCG

   F - VIC- TTCCCAACAAACGTTCATCA R-GTGAAGGGAGAGCAGTGGAG F- NED- TCCATCTATGCATCTCGCCAC R - CTATTCTTCCACTGGGGCAA

   10 nebo

   F- 6FAM- ATGTCCCAATTCGACCAGAG R- CGTTACGGCTGAGAAC TTCC F- VIC- TGTCAGACAAGCAACTCCTCC R- AGGTGAGGCTTAGATGGGGT

   15 F-NED-TTCTGCAATGAAAACACATTGA R- ATCCAACTGAGTCGGCAATC