CZ284255B6 - Promotor-cílový vektor, jím nalezené streptomy-cetové promotory, jakož i jejich isolace a použití - Google Patents
Promotor-cílový vektor, jím nalezené streptomy-cetové promotory, jakož i jejich isolace a použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ284255B6 CZ284255B6 CS922460A CS246092A CZ284255B6 CZ 284255 B6 CZ284255 B6 CZ 284255B6 CS 922460 A CS922460 A CS 922460A CS 246092 A CS246092 A CS 246092A CZ 284255 B6 CZ284255 B6 CZ 284255B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- promoter
- promoters
- expression
- dna
- phage
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 13
- 241000948169 Streptomyces viridosporus Species 0.000 abstract description 4
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 11
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 11
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 10
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 101100292444 Drosophila melanogaster mthl1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150059488 NUDT1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 101100042793 Gallus gallus SMC2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101710161955 Mannitol-specific phosphotransferase enzyme IIA component Proteins 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000015541 sensory perception of touch Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Promotor cílový vektor, způsob identifikace a isolace streptomycetových promotorů za pomocí tohoto cílového vektoru, jakož i isolovaných promotorů samotných, výhodně promotorů pSI a p14 fága | 19 S. ghanaensis.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká promotorů pSl a pl4 fágu 119 Streptomyces ghanaensis.
Dosavadní stav techniky
Pro homologické a heterologické exprese genů ve streptomycetách jsou dosud k dispozici relativně málo silné promotory. K. tomuto účelu dosud používané a popsané promotory pocházejí převážně z genů rezistentních na antibiotika, jakož i jiných genů, jejichž exprese je regulována jinými genovými produkty.
Aby se mohly lépe využít streptomycety jako hostitelské organismy pro silnou expresi libovolných genů, jsou zapotřebí odpovídajícím způsobem silné konstitutivní promotory, jakož i promotory definované síly. Takovéto promotory se mohou nalézt například v DNA lytických bakteriofágů.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu jsou promotory pro expresi cizích proteinů, izolované z DNA fága U19, kterými jsou promotory p 14 a pSl se sekvencí č. 1 a 2.
Pomocí promotor-cílového vektoru pGL703 (obr. 1) je možno izolovat vhodný fágový promotor.
U tohoto cílového vektoru se jedná o kyvadlový plazmid, který nese replikační oblasti plazmidu E. coli pACYC184 a plazmidu streptomycet pSG5. Jako selekční markér pro streptomycety má neomycinový rezistenční gen (NmR) Tn5, jako nový indikátorový gen bezpromotorový gentamycinový rezistenční gen Tnl696 (Gm p). Dodatečně má chloramfenikolový rezistenční gen (CmR) jako markér E. coli. Proti směru indikátorového genu se nachází terminátor transkripce fágu fd a několikanásobné klonovací místo (mcs), které má mimo jiné singulární štěpná místa BamHI a Clal. Obě restrikční místa se mohou použít pro Shot-gun klonování DNA, která byla restringována víceštěpným enzymem Sau3A, popřípadě Tagl u odpovídajícím způsobem modifikované DNA.
Bezpromotorový gentamycin-rezistenční gen jako podstatná součást má v 5-kódovací oblasti dva TTA-kodony, které se v konstitutivně exprimovaných streptomycetových genech nevyskytují, nebo se vyskytují vzácně. Odpovídající exprese genů, prokazatelná zprostředkovanou rezistencí, probíhá tedy pouze při odpovídajícím způsobem vysoké hladině m-RNA v buňce. Z tohoto hlediska je indikátorový gen obzvláště vhodný pro identifikaci silnějších promotorů. Další výhodou cílového vektoru je možnost testovat fragmenty DNA, nesoucí promotor, na jejich aktivitu přímo, to znamená bez překlonování, v E. coli.
Jako velmi vhodný organismus poskytující promotory se ukázal virulentní fág 119 S. ghanaensis, který' má s 13,6 kb nejmenší ze všech dosud známých popsaných aktinofágových genomů (obr. 2).
DNA fága 119 existuje modifikovaná, takže není subklonovatelná dostupným víceštěpným enzymem Sau3A. Zde se uplatňuje další schopnost cílového vektoru, neboť tento má vedle singulárního štěpného místa BamHI singulární štěpné místo Clal před indikátorovým genem, které dovoluje subklonování fágové DNA pomocí alternativního víceštěpného enzymu Tagl.
- 1 CZ 284255 B6
Plazmidy s fragmenty DNA, nesoucími promotory, se mohou identifikovat primární selekcí transformantů na médiu, obsahujícímu gentamicin a dodatečně mohou být testovány na expresi neomycin rezistenčního genu. Výše gentamicinové rezistence, jakož i izolovaných promotorů z vytvořeného transkriptovaného množství jsou mírou pro sílu promotoru.
Na fágovém genomu mohou být identifikovány dvě oblasti, nesoucí promotor (obr. 3). Z nich pocházejí mimo jiné promotory pl4 apSl, které mají různou transkripční aktivitu. Sekvenční data promotoru pl4 jsou uvedena v tabulce 1 jako sekvence č. 1 a sekvenční data promotoru pS 1 jsou uvedena v tabulce 2 jako sekvence č. 2.
Tabulka 1
Sekvence DNA promotoru p 14
TCGAATCAGCCGGATTCGCGGAAGACGTACAGGTGCACTGGAAGCCTGTAGAGACCTTCG AGCTTAGTCGGCCTAAGCGCCTTCTGCATGTCCACGTGACCTTCGGACATCTCTGGAAGC A A A A A A A A A A
TAQI, 3 HINFI, 10 HPAII, 13 HINFI, 17 FNUDII, 21 MBOII, 25 MAEII, 27 RSAI, 33 HGIAI SDUI SDUI, 58 TAQI,
ATGGATGAGCAATCGAGAAGTAAGCACACCGGGCGGATTTCCGCCAAGCTTCCTATCCAG TACCTACTCGTTAGCTCTTCATTCGTGTGGCCCGCCTAAAGGCGGTTCGAAGGATAGGTC
A A A AA A
FOKI, 73 TAQI, 89 HPAII NCII SCRFI, 106 HINDIII, 107 ALUI , 117 APYI ECORII SCRFI, , _____________
GAGATATTATGAGTTACGTAGACCTACGCI±TGACC TTGATG ^GGCGGCGTGAGďTAcJÁ CTCTATAATACTCAATGCATCTGGATGCGGftACTGG AACTAC rCCGCCGCACTCGRTGIn? -3C1T ,r, A A * _10U
-35U -35I
133 MAEIII, 135 SNABI, 136 MAEII, 138 ACCI, 162 MNLI, 165 FN UIVHI, 173 ALUI, ______ , 1 ___ 2 1 X Bcaaiactcgattaggtcaaggtggaacgcagagagggtctgactgcctgagtcggtagt apttaJtgagctaatccagttccaccttgcgtctctcccagactgacggactcagccatca
A A A
-101
RBSI
188 TAQI, 214 MNLI, 228 DDEI,
230 HINFI, caggtgatgagggagatagagccaagcaaagaggagagggtcattgcgggttactsctac
GTCCACTACTCCCTCTATCTCGGTTCGTTTCTCCTCTCCCAGTAACGCCCAATCACGATG
A A A
RBSA11 A
243 HPHI, 249 MNLI, 263 TTH111II, 271 MNLI, 276 MNLI,
TCGATGTACCTGGAGAGGAGTTCCCCAAACTCCGCCTTCTCGCCCTCTGTCAGGTCGA AGCTACATGGACCTCTCCTCAAGGGGTTTGAGGCGGAAGAGCGGGAGACAGTCCAGCT A A A A A A A
301 TAQI, 306 RSAI, 309 APYI ECORII SCRFI, 310 GSUI, 315 MNL I, 344. MNLI, 355 TAQI,
-2CZ 284255 B6
Tabulka 2
Sekvence DNA promotoru pS 1
TCGAATCAGCCGGATTCGCGGAAGACGTACAGGTGCACTGGAAGCCTGTAGAGACCTTCG AGCTTAGTCGGCCTAAGCGCCTTCTGCATGTCCACGTGACCTTCGGACATCTCTGGAAGC
TAQI, 3 HINFI, 10 HPAII, 13 HINFI, 17 FNtJDII, 21 MBO1I, 25 MAEII, 27 RSAI, 33 HGIAI SDUI SDUI, 58 TAQI,
ATGGATGAGCAATCGAGAAGTAAGCACACCGGGCGGATTTCCGCCAAGCTTCCTATCCAG TACCTACTCGTTAGCTCTTCATTCGTGTGGCCCGCCTAAAGGCGGTTCGAAGGATAGGTC
FOKI, 73 TAQI, 89 HPAII NCII SCRFI, 106 HINDIII, 107 ALOI , 117 APYI ECORII SCRFI,
GAGATATTATGAGTTACGTAGACCTACGCC FTGACC TTGATG AGGCGGCGTGAGC TACÍ A CTCTATAATACTCAATGCATCTGGATGCGGRACTGG KACTAC TCCGCCGCACTCG MG1Γ A A A A _ gen A A A
3511 -351
133 ΜΑΕΙΣΙ, 135 SNABI, 136 MAEII, 138 ACCI, 162 MNLI, 165 FN UIVHI, 173 ALUI, ,1 ___ Λ----Λ l__
T CAAIXCTCGATTAGGTCAAGGTGGAACGCAGAGAGGGTCTGACTGCCTGAGTCGGTAGT ApTTAfrGAGCTAATCCAGTTCCACCTTGCGTCTCTCCCAGACTGACGGACTCAGCCATCA
A A A
-101
RBSI
188 TAQI, 214 MNLI, 228 DDEI,
230 HINFI, caggtgáTgagggagatagagccaagcaaagaggagagggtcattgcgggttáGTCctac GTCCACTACTCCCTCTATCTCGGTTCGTTTCTCCTCTCCCAGTAACGCCCAATCACGATG A A A RgSAU A
243 HPHI, 249 MNLI, 263 TTH111II, 271 MNLI, 276 MNLI,
TCGAŤGTACCTGGAGAGGAGTTCCCCAAACTCCGCCTTCTCGCCCTCTGTCAGGTCGA AGCTACATGGACCTCTCCTCAAGGGGTTTGAGGCGGAAGAGCGGGAGACAGTCCAGCT * A A A A A A
301 TAQI, 306 RSAI, 309 APYI ECORII SCRFI, 310 GSUI, 315 MNL I, 344. MNLI, 355 TAQI,
EIII, 330 MNLI, 331 DDEI, 341 ΜΒΟΣΙ, 353 NCII SCRFI, 354 HPA II. <—...
367 HGIEII, 374 HPAII, 376 HGICI KPNI NIAIV, 377 RSAI, 399 A PYI ECORII SCRFI, 402 ACYI, 403 HGAI, 405 MAEIII, 406 HPHI,
CTTTCGA GAAAGCT
424 TAQI
-3CZ 284255 B6
Promotor pl4 vede v testu pro stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) kaši dvojnásobně silné expresi genu, než promotor erm-up (Zitat), který platil dosud za nejsilnější streptomycetový promotor. Na rozdíl od tohoto je promotor pl4 také vE. coli. Odpovídající MIC-testy ukazují ve srovnání se silným syntetickým hybridopromotorem tac třikrát silnější hodnoty exprese. Mohou být identifikovány -10 a-35 konsenzní oblasti (I:II) podobné E. coli, které ale ve srovnání s dosud popsanými SEP sekvencemi jsou nově strukturovány. Promotorové oblasti nejsou uspořádány tandemovitě, ale jsou přímo sousedící (-35, I, II), popřípadě částečně se překrývající (-10, I, II). Rozestup obou oblastí odpovídá +7 (I), popřípadě 19 (II) párům bází a leží tedy v optimálním rozmezí. Zatímco -35 oblasti odpovídají až najeden (II), popřípadě dva (I) páry bází stanovené SEP konsenzní sekvenci (-TTGACA-), odlišují se -10 oblasti silněji od stávající konsenzní sekvence. Zde se nachází motiv ATCAAT (I), popřípadě TACAAT (Π), přičemž čtyřem bázím GAAT se přisuzuje esenciální role. Krátké přímé opakování sekvence (1), jakož i delší repeát (2) 9 párů bází a dvě potenciální místa pro vazbu ribosomů (RBS I, II) jsou rovněž význačné pro oblast promotoru.
Promotor pSl, který není aktivní v E. coli, má rovněž krátká opakování sekvence na 1, Γ, 2, přičemž druhá součást jsou šest párů bází dlouhé duplikace. V těchto se nachází motiv -CAGAAG-, který má možná funkci při poznávání RNA-polymerázy, ve smyslu konvenčních -10 promotorových oblastí (I). V protisměru první poteciální -10 oblasti (I) se nachází sekvence (II) podobná -35. Dále je velmi dobře identifikovatelné místo pro vazbu ribosomů (RBS).
Se zřetelem na hodnoty gentamicinové exprese je pSl srovnatelný s pl4, zatímco v neomycinovém rezistenčním testu vykazuje pouze asi čtvrtinu aktivity promotoru erm-up (Bibb M. J., Janssen G. R., Unsual features of transcription and translation of antibiotic resistance genes in antibiotic-producting Streptomyces, in: Fifth Intemational Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, 1986, eds.: Alacevic M., Hranueli D., Toman Z.). Je použitelný z hlediska biologické bezpečnosti, neboť je aktivní pouze ve streptomycetách.
Vynález se týká dále promotor-cílového vektoru pGL 703, jakož i analogicky konstruovaných vektorů, které obsahují bezpromotorový gentamicin rezistenční gen, způsobu izolace promotorů za pomoci takovéhoto způsobu, jakož i tím nalezených promotorů, především pl4 apSl, a konečně jejich použití.
Přehled obrázků na výkresech
Legenda k obr. 1: promotor cílový vektor pGL703
MGS značí vícenásobné klonovací místo a obsahuje štěpící místa pro restrikční enzymy.
EcoRI Sstl KpnI Smál Pstl HindlII Clal Xbal BamHI EcoRI Sstl KpnI.
Gm P značí bezpromotorový gentamicin -gen;
CmR značí rezistenční gen proti chloramfenikolu;
NmR značí rezistenční gen proti neomycinu, a fd značí terminátor transkripce fága fd.
Legenda k obr. 2: restrikční síly DNA 119 fága
-4CZ 284255 B6
Nahoře jsou znázorněna štěpná místa jednotlivých restrikčních enzymů, dole délky a polohy jednotlivých restrikčních štěpů pro každý z použitých 6 enzymů.
Legenda k obr. 3: identifikované oblasti promotoru na genomu 119
Oblasti promotoru jsou v mapě genomu 119 zaneseny jako I a II.
V následujících příkladech provedení je předložený vynález dále objasněn.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Charakterizace 119 DNA
Fág 119 se izoluje z bakterie S. ghanaensis jako lytický fág (kolonie s průměrem 1,5 - 2,0 mm) a charakterizuje se. Zatímco průměr hlavičky fága (82,8 nm) a délka ocásku (371,8 nm) se nachází v oblasti dosud popsaných bakteriofágů, je 119 DNA s 13,6 kb nejmenší ze všech dosud známých aktinofágových DNA. Restrikční analýza udává (obr. 2), že DNA není enzymy BamHI a Sau3A štěpitelná a tím je k dispozici modifikovaná. Vyskytuje se jako dvojitě spirálová lineární molekula v hlavičce fága. Nedají se dokázat žádné kohezivní konce, ale homologní konce. Fágový genom má dvě promotorové oblasti (obr. 3, I a II), přičemž se silný promotor p 14 nachází v oblasti II.
Příklad 2
Identifikace 119 fágových promotorů
DNA I19„která nemůže být fragmentována enzymem Sau3A, se parciálně štěpí pomocí alternativního víceštěpného enzymu Taql na délky fragmentů menší než 1,5 kb a liguje se pomocí cílového vektoru pGL703, rozštěpeného pomocí Clal. Ligační vsázka se transformuje přímo nebo také nepřímo přes E. coli po S. lividans TK.23. Po přímé transformaci a převrstvení regenerační destičky s koncentrací gentamicinu 30 pg/ml v médiu se mohou izolovat tři gentamicin rezistentní TK23 kolonie, zatímco po předchozím pomnožení hybridních plazmidů v ligační směsi v E. coli s následující izolací DNA a transformací po S. lividans TK23 se izoluje třináct gentamicin rezistentních jednotlivých kolonií (nepřímá cesta). Všechny takto získané selektanty se jeví v následném testu podle očekávání jako kanamycin rezistentní.
Příklad 3
Klasifikace 119 promotorů
Plazmidy gentamicin rezistentních kolonií streptomycet se reizolují, transformují se přes E. coli a zde se přesněji charakterizují se zřetelem na inzerce. Přitom se ukázalo, že větší část izolovaných fragmentů DNA, nesoucích promotory, je aktivní také v E. coli, to znamená, že vedou k expresi indikátorového genu. Vedle toho byly také izolovány fragmenty, které vykazují transkripční aktivitu pouze ve streptomycetách. Na základě této vlastnosti a také na základě promotory zprostředkované výše gentamicinové rezistence jak ve streptomycetách, tak také v E. coli (v případě SEP sekvence), byly izolované 119 promotory klasifikovány. Nejsilnější
-5CZ 284255 B6 hodnoty exprese gentamicin rezistenčního genu v obou organismech vykazoval promotor pl4 jako SEP sekvence, v S. lividans čistý streptomycetový promotor pSl. Poměrně nízká výše rezistence 5 - 10 pg Gm/ml je opodstatněna relativně slabou translační hodnotou indikátorového genu ve streptomycetách. Proto je tento systém obzvláště vhodný pro izolaci silnějších promotorů ze streptomycet nebo jejich bakteriofágů.
Přesnější charakteristika síly promotorů se provádí v rovině m-RNA. Tím se může primárně provedená klasifikace ověřit. Pomocí analýzy Dot-Blot, při které sloužil výtěžek Nm-m-RNA jako inertní kontrola, se potvrdilo, že pl4 vykazuje nejsilnější transkripční aktivitu ze všech identifikovaných 119 promotorů u S. lividans.
Příklad 4
Subklonování promotorů pro důkaz jejich aktivity mimo cílového vektoru
Aby se vyloučily artefakty, jako jsou například sekvenční konstelace z vícenásobných klonovacích míst pGL703 a inzerovaných fragmentů DNA, které mohou vést k aktivitě promotoru, byly pl4 apSl subklonovány ve vektoru pIJ487 (John Innes Foundation, Norwich, England) a selektovány v S. lividans na expresi bezpromotorového neomycinového genu. V následujícím Nm-MIC-testu se ukázalo, že pl4 vede ke dvakrát tak vysoké neomycinové rezistenci a pSl v tomto systému k asi čtvrtinové neomycinové rezistenci, než erm-up. Promotor, který byl dosud v literatuře počítán za nejsilnější streptomycetový promotor.
Tyto výsledky potvrzují ještě jednou způsobilost nového cílového vektoru pro izolaci obzvláště silných streptomycetových promotorů.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (2)
1. Promotor pro expresi cizích proteinů, izolovaný z DNA fága 119, kterým je promotor p 14 se sekvencí č. 1
TCGAATCAGC CGGATTCGCG GAAGACGTAC AGGTGCACTG GAAGCCTGTA 50
GAGACCTTCG ATGGATGAGC AATCGAGAAG TAAGCACACC GGGCGGATTT 100
CCGCCAAGCT TCCTATCCAG GAGATATTAT GAGTTACGTA GACCTACGCC 150
TTGACCTTGA TGAGGCGGCG TGAGCTACAA TCAATACTCG ATTAGGTCAA 200
GGTGGAACGC AGAGACGGTC TGACTGCCTG AGTCGGTAGT CAGGTGATGA 250
GGGAGATAGA GCCAAGCAAA GAGCAGAGGG TCATTGCGGG TTAGTGCTAC 300
TCGATGTACC TGGAGAGGAG TTCCCCAAAC TCCGCCTTCT CGCCCTCTGT 350
CAGGTCGA
358 nebo promotor pS 1 se sekvencí č. 2.
TCGAGGTAAA TACCTCTTCG GCTAGTCCTT CGTAATAGTC TTCTGCGGTT50
GTGTAATCGT CTCTCCTATG GAGCTGCCAT CGCGCTCCGC AGATGACGCA100
GAACAGCTCT GCTCTAGATG TTATCAGAGT ACACTCGGTC CACGAATACC150
CGGCCGGTGG ACTTATTACA GCGCATTGAC GCCACCCTTA TAGCTAACGT200
CGGTGACCGC CGAAGCGTGC CAGAGCTACC CGCCTTGTAC GAGGCCAGGG250
ACAGCAGAAG CGAAAGCTAC CGCTGCACCA CCAGAAGTAC CGAAGAAACC300
GGACCAATCA AAGTCGAGAG CCTAGCGGCC CTCAGTTCCT TCTTCTCGGA350
TACCCGGCGA CAGATGACCT TTGCCGGTAC CCCATCAAGG ATTGAGAACC400
AGGCGTCACC ACCTTGATTA CTTTCGA427
-6CZ 284255 B6
2. Použití promotorů podle nároku 1 pro expresi cizích proteinů v Escherichia coli nebo streptomycetách.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4126415 | 1991-08-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ246092A3 CZ246092A3 (en) | 1993-02-17 |
| CZ284255B6 true CZ284255B6 (cs) | 1998-10-14 |
Family
ID=6438020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS922460A CZ284255B6 (cs) | 1991-08-09 | 1992-08-07 | Promotor-cílový vektor, jím nalezené streptomy-cetové promotory, jakož i jejich isolace a použití |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5328998A (cs) |
| EP (1) | EP0531717A2 (cs) |
| JP (1) | JP3391817B2 (cs) |
| KR (1) | KR100253036B1 (cs) |
| CA (1) | CA2075549C (cs) |
| CZ (1) | CZ284255B6 (cs) |
| SK (1) | SK282380B6 (cs) |
| TW (1) | TW298602B (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4323147B2 (ja) * | 2002-09-10 | 2009-09-02 | 天野エンザイム株式会社 | トランスグルタミナーゼ生産菌 |
| CN108490193B (zh) * | 2018-04-03 | 2019-07-16 | 浙江大学 | 基于转录组学链霉菌次级代谢强启动子挖掘方法及应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4332900A (en) * | 1980-10-01 | 1982-06-01 | The Upjohn Company | Construction of co-integrate plasmids from plasmids of Streptomyces and Escherichia |
| DE3614903A1 (de) * | 1986-05-02 | 1987-11-05 | Hoechst Ag | Gentamycin-resistenzgene und ihre verwendung als marker |
| GB8723000D0 (en) * | 1987-09-30 | 1987-11-04 | Antibioticos Sa | Expression vectors |
| DE3809691A1 (de) * | 1988-03-23 | 1989-10-12 | Hoechst Ag | Verfahren zur selektion grosser dna-abschnitte |
| US5164305A (en) * | 1990-01-18 | 1992-11-17 | Cetus Oncology Corporation | Streptomyces promoter and method of use thereof |
-
1992
- 1992-08-04 TW TW081106142A patent/TW298602B/zh not_active IP Right Cessation
- 1992-08-07 KR KR1019920014161A patent/KR100253036B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-07 CZ CS922460A patent/CZ284255B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-08-07 CA CA002075549A patent/CA2075549C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-07 JP JP23289492A patent/JP3391817B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-07 US US07/925,920 patent/US5328998A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-07 SK SK2460-92A patent/SK282380B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-08-07 EP EP92113466A patent/EP0531717A2/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3391817B2 (ja) | 2003-03-31 |
| CA2075549A1 (en) | 1993-02-10 |
| EP0531717A2 (de) | 1993-03-17 |
| CA2075549C (en) | 2003-12-30 |
| EP0531717A3 (cs) | 1994-03-30 |
| JPH05292969A (ja) | 1993-11-09 |
| SK282380B6 (sk) | 2002-01-07 |
| KR930004464A (ko) | 1993-03-22 |
| TW298602B (cs) | 1997-02-21 |
| SK246092A3 (en) | 1995-07-11 |
| CZ246092A3 (en) | 1993-02-17 |
| US5328998A (en) | 1994-07-12 |
| KR100253036B1 (ko) | 2000-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kieser et al. | pIJ101, a multi-copy broad host-range Streptomyces plasmid: functional analysis and development of DNA cloning vectors | |
| US5102797A (en) | Introduction of heterologous genes into bacteria using transposon flanked expression cassette and a binary vector system | |
| Roberts et al. | Genetic characterization of the stabilizing functions of a region of broad-host-range plasmid RK2 | |
| Buttner et al. | Cloning, disruption, and transcriptional analysis of three RNA polymerase sigma factor genes of Streptomyces coelicolor A3 (2) | |
| Brückner | A series of shuttle vectors for Bacillus subtilis and Escherichia coli | |
| Kieser et al. | [21] Genetic manipulation of Streptomyces: Integrating vectors and gene replacement | |
| Hopwood et al. | Streptomycetes | |
| Mendez et al. | Cloning of whiG, a gene critical for sporulation of Streptomyces coelicolor A3 (2) | |
| Bonekamp et al. | Mechanism of UTP-modulated attenuation at the pyrE gene of Escherichia coli: an example of operon polarity control through the coupling of translation to transcription | |
| Boccard et al. | Structural analysis of loci involved in pSAM2 site-specific integration in Streptomyces | |
| Thompson et al. | The control region of the F sex factor DNA transfer cistrons: physical mapping by deletion analysis | |
| Davis et al. | Transcription and autoregulation of the stabilizing functions of broad‐host‐range plasmid RK2 in Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens and Pseudomonas aeruginosa | |
| Lydiate et al. | A 2.6 kb DNA sequence of Streptomyces coelicolor A3 (2) which functions as a transposable element | |
| Volff et al. | Artificial circularization of the chromosome with concomitant deletion of its terminal inverted repeats enhances genetic instability and genome rearrangement in Streptomyces lividans | |
| Dillard et al. | Analysis of Streptococcus pneumoniae sequences cloned into Escherichia coli: effect of promoter strength and transcription terminators | |
| US6924106B2 (en) | Rifamycin biosynthesis gene cluster | |
| Omer et al. | Site-specific insertion of biologically functional adventitious genes into the Streptomyces lividans chromosome | |
| Gil et al. | Cloning of a chloramphenicol acetyltransferase gene of Streptomyces acrimycini and its expression in Streptomyces and Escherichia coli | |
| US4703009A (en) | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes | |
| Trieu-Cuot et al. | Transposition behavior of IS15 and its progenitor IS15-Δ: are cointegrates exclusive end products? | |
| CZ284255B6 (cs) | Promotor-cílový vektor, jím nalezené streptomy-cetové promotory, jakož i jejich isolace a použití | |
| Günthert et al. | Cloning and expression of Bacillus subtilis phage DNA methyltransferase genes in Escherichia coli and B. subtilis | |
| WO2002103010A1 (en) | Methods and materials for targeted gene disruption in actinomycete bacteria | |
| US5212080A (en) | Method of DNA sequencing using DNA transposon Tn5seql | |
| Conley et al. | Effects of the pSC101 partition (par) locus on in vivo DNA supercoiling near the plasmid replication origin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120807 |