CZ283137B6

CZ283137B6 - Method of controlling fermentation of l-threonine by making use of dissolved oxygen concentration

Info

Publication number: CZ283137B6
Application number: CZ932499A
Authority: CZ
Inventors: Jiří Rndr. Drsc. Plachý; Karel Ing. Bezděk; Pavel Ing. Běhounek; Milan Ing. Kratochvíl; František Ing. Csc. Pospíšil
Original assignee: Icn Czech Republic A.S.
Priority date: 1993-11-19
Filing date: 1993-11-19
Publication date: 1998-01-14
Also published as: CZ249993A3; SK279793B6; SK35894A3

Abstract

This invention involves improving the manner of controlling the fermentation of L-threonine, an essential amino acid used in the feed industry and also for pharmaceutical (therapeutic) purposes, by cultivating the production strain Escherichia coli 472 T-23 in a liquid production medium containing common nutriments and additives. The principle of the new procedure, by which a high growth and production speed and a yield of L-threonine of about 80 g/l is achieved with a conversion of saccharose of about 42%, consists of controlling the agitation and aeration performed according to the value of the pH (6.5 to 7.0) and the content of dissolved oxygen (0.7 to 0.9 mg/l) in the medium, and in the continual addition of a solution of saccharose and ammonia. The novelty of the invention consists of controlling the fermentation of L-threonine using a concentration of dissolved oxygen which is kept at 0.7 to 0.9 mg/l.

Description

Způsob řízení fermentace L-threoninu s využitím koncentrace rozpuštěného kyslíkuMethod for controlling fermentation of L-threonine using dissolved oxygen concentration

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká způsobu řízení fermentace L-threoninu kultivací produkčního kmene Escherichia coli 472 T-23 v tekutém produkčním médiu, obsahujícím zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli a/nebo stopové prvky a/nebo biofaktory, za aerobních podmínek.The invention relates to a method for controlling the fermentation of L-threonine by culturing an Escherichia coli 472 T-23 production strain in a liquid production medium comprising assimilable carbon and nitrogen sources, mineral nutrient salts and / or trace elements and / or biofactors under aerobic conditions.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

L-threonin je esenciální aminokyselina, používaná jednak v živočišné výrobě k obohacování 15 krmných směsí, jednak v medicíně. Z ekonomických i technických důvodů bylo tedy potřebné mít k dispozici takový technologický postup, kterým by bylo možno získávat tuto aminokyselinu jednoduše a v přijatelném výtěžku. Jako rentabilní byly shledány a dále vyvinuty postupy biosyntetické, především kultivace vhodných mikroorganismů, u kterých bylo využito jejich schopnosti hromadit L-threonin v kultivačním médiu v relativně vysokých množstvích. 20 Mikroorganismy, vhodné k tomuto účelu, zejména kmeny Escherichia coli, syntetizují ale Lthreonin v množstvích, potřebných především pro vlastní proteosyntézu, nebo jako intermediát biosyntézy isoleucinu. Teprve kombinací metod mutace, selekce a genového inženýrství se podařilo získat kmen Escherichia coli 472 T-23 /USA pat. spis č. 4,278.765/, který byl schopen při kultivaci v médiu se sacharózou jako zdrojem uhlíku hromadit za 40 h až 40 g/1 L-threoninu 25 při konverzi sacharózy kolem 33 %. Dalšími zásahy a doplněním médií vhodnými koncentracemi isoleucinu a penicilinu G se podařilo postupně zvýšit výtěžky L-threoninu na 66 až 73 g/1, při konverzi sacharózy 38 až 40 %.L-threonine is an essential amino acid used in animal production to enrich 15 feed mixtures and in medicine. Thus, for economic and technical reasons, it was necessary to have a technological process that could be used to obtain this amino acid simply and in an acceptable yield. Biosynthetic processes, in particular cultivation of suitable microorganisms, have been found to be profitable and further developed, in which their ability to accumulate L-threonine in the culture medium in relatively high amounts has been utilized. However, microorganisms suitable for this purpose, in particular strains of Escherichia coli, synthesize Lthreonine in amounts necessary primarily for the intrinsic proteosynthesis or as an intermediate of isoleucine biosynthesis. Only a combination of mutation, selection, and genetic engineering methods was able to obtain the Escherichia coli 472 T-23 / USA pat strain. No. 4,278,765], which was able to accumulate in 40 h to 40 g / L of L-threonine 25 at a sucrose conversion of about 33% when cultured in sucrose medium as a carbon source. By further interventions and supplementing the media with appropriate concentrations of isoleucine and penicillin G, the yields of L-threonine were gradually increased to 66-73 g / l, with a sucrose conversion of 38-40%.

Cílem dalšího vývoje výroby L-threoninu bylo nalezení takového způsobu řízení fermentace, 30 jenž by umožňoval optimální ovlivnění metabolické aktivity produkčního kmene, čímž by bylo dosaženo nejen zvýšení produkce, ale i vytvořeny předpoklady pro automatickou regulaci nově vyvinutého technologického postupu fermentační výroby L-threoninu.The aim of the further development of L-threonine production was to find a method of fermentation control that would allow an optimal influence on the metabolic activity of the production strain, thus not only increasing production but also creating the prerequisites for automatic control of the newly developed L-threonine fermentation process.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Těmto požadavkům vyhovuje podle vynálezu způsob řízení fermentace L-threoninu s využitím koncentrace rozpuštěného kyslíku kultivací produkčního kmene Escherichia coli 472 T-23 v tekutém produkčním médiu, obsahujícím sacharózu a amoniak jako zdroje asimilovatelného 40 uhlíku a dusíku, minerální živné soli a/nebo stopové prvky a/nebo biofaktory, za aerobních podmínek míchání a vzdušnění, podstata vynálezu pak spočívá v tom, že se po zahájení růstu producenta a za současné produkce L-threoninu udržuje v produkčním médiu amoniakem a amoniakálním roztokem sacharózy kromě pH v rozmezí 6,5 až 7,0 ještě obsah rozpuštěného kyslíku v rozmezí hodnot 0,7 až 0,9 mg kyslíku/1. Řízení procesu podle koncentrace 45 rozpuštěného kyslíku se provádí změnou otáček míchadla, eventuálně změnou intenzity vzdušnění. Udržování koncentrace rozpuštěného kyslíku těsně nad limitní hodnotou umožňuje dosáhnout maximální výtěžnosti L-threoninu. Kultivace se ukončí po zastavení růstu, kdy koncentrace sacharózy poklesne pod hodnotu 0,5 g/1 a koncentrace rozpuštěného kyslíku klesne pod koncentraci limitní, tj. 0,7 mg/1.According to the present invention, a method for controlling L-threonine fermentation using dissolved oxygen concentration by culturing a production strain of Escherichia coli 472 T-23 in a liquid production medium containing sucrose and ammonia as sources of assimilable 40 carbon and nitrogen, mineral nutrient salts and / or trace elements and / or biofactors, under aerobic mixing and aeration conditions, the object of the invention is to maintain the production medium with ammonia and ammonia sucrose solution in addition to a pH in the range of 6.5 to 7 after the growth of the producer and at the same time L-threonine production. The dissolved oxygen content in the range of 0.7 to 0.9 mg oxygen / l. The control of the process according to the dissolved oxygen concentration 45 is carried out by varying the stirrer speed or possibly by changing the aeration intensity. Maintaining the dissolved oxygen concentration just above the limit allows the maximum yield of L-threonine to be achieved. Cultivation is terminated after the growth is stopped when the sucrose concentration falls below 0.5 g / l and the dissolved oxygen concentration falls below the limit concentration, i.e. 0.7 mg / l.

Vysokou růstovou a produkční rychlost použitého mikroorganismu lze při realizaci způsobu podle vynálezu udržovat po celou dobu fermentace kontinuálním dávkováním roztoku sacharózy a roztoku amoniaku na základě měření pH, jež se snižuje v důsledku zvýšené metabolické aktivity mikroorganismu v exponenciální fázi růstu a jež se projevuje zvýšením respirace,The high growth and production rate of the microorganism used in the process of the invention can be maintained throughout the fermentation by continuous dosing of sucrose solution and ammonia solution based on a pH measurement that decreases due to increased metabolic activity of the microorganism in the exponential phase of growth.

- 1 CZ 283137 B6 snížením koncentrace rozpuštěného kyslíku, kyslíkovým limitem a zvýšenou spotřebou sacharózy. Na základě měření koncentrace rozpuštěného kyslíku a/nebo pH je dávkován roztok sacharózy, který obnoví respiraci a následně i růst a produkci.By reducing the dissolved oxygen concentration, the oxygen limit, and the increased consumption of sucrose. By measuring dissolved oxygen concentration and / or pH, a sucrose solution is dosed to restore respiration and subsequently grow and produce.

Popsaným způsobem podle vynálezu se velmi jednoduchým opatřením podařilo zvýšit výtěžky L-threoninu až na 80 g/1, při konverzi sacharózy kolem 42 %.In a very simple way, according to the present invention, the yields of L-threonine were increased up to 80 g / l, with a sucrose conversion of about 42%.

Příklad provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Do fermentačního tanku o objemu 30 litrů, opatřeného míchadly a přívodem sterilního vzduchu, bylo umístěno 15 litrů kultivačního média, obsahujícího 450 g afínované sacharózy, 75 g kvasničného autolyzátu, 75 g síranu amonného, 6 g síranu hořečnatého, 30 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,3 g síranu železnatého, 0,3 g síranu manganatého a 9 g sojového 15 oleje. Po sterilizaci (120 °C/30 min) bylo kultivační médium ochlazeno na 37 °C, byly přidány g penicilinu G a provedeno očkování 1 ml buněčné suspenze, získané kultivací produkčního mikroorganismu Escherichia coli 472 T-23 za stejných podmínek jako v produkčním stupni. Fermentace probíhala za konstantní teploty 37 °C, přetlaku 0,5 barr a vzdušnění 0,9 m³/s, při rychlosti míchání 500 až 900 ot/min, udržované automaticky tak, aby koncentrace rozpuštěného 20 kyslíku /počáteční stav 3,5 mg/1/ neklesla pod 0,7 mg/1. Během procesu byla kontinuálně měřena koncentrace rozpuštěného kyslíku /počáteční stav 3,5 mg/1/, pH, teplota, tlak a průtok vzduchu. Semikontinuálně byla sledována optická denzita /růstová rychlost/, koncentrace L-threoninu /produkční rychlost/, koncentrace sacharózy a koncentrace amoniakálního dusíku.In a 30 liter fermenter tank equipped with stirrers and sterile air supply, 15 liters of culture medium containing 450 g of affinity sucrose, 75 g of yeast autolysate, 75 g of ammonium sulfate, 6 g of magnesium sulfate, 30 g of potassium dihydrogen phosphate, 0, 3 g of ferrous sulfate, 0.3 g of manganese sulfate and 9 g of soybean oil. After sterilization (120 ° C / 30 min), the culture medium was cooled to 37 ° C, g of penicillin G was added and seeded with 1 ml of cell suspension obtained by culturing the production microorganism Escherichia coli 472 T-23 under the same conditions as in the production step. The fermentation was carried out at a constant temperature of 37 ° C, an overpressure of 0.5 barr and an aeration of 0.9 m ³ / s, at a stirring speed of 500 to 900 rpm, maintained automatically to a dissolved oxygen concentration of 20 / initial state of 3.5 mg. (1) did not fall below 0.7 mg / l. During the process, the dissolved oxygen concentration (initial state 3.5 mg / l), pH, temperature, pressure and air flow were continuously measured. The optical density (growth rate), L-threonine concentration (production rate), sucrose concentration and ammonia nitrogen concentration were monitored semicontinuously.

Po 8 h, kdy proces byl v latentní fázi, začal produkční organismus růst a produkovat L-threonin. Následkem stoupající růstové rychlosti a tím i respirace, začal pokles koncentrace rozpuštěného kyslíku a zároveň pokles pH. Do 20. kultivační hodiny bylo pH automaticky upravováno přidáváním 25% vodného roztoku amoniaku na hodnotu 6,5 až 7,0. Spotřeba sacharózy byla /asi ve 20. kultivační hodině/ indikována snížením respirace, což vedlo ke zvýšení koncentrace rozpuštěného kyslíku v médiu. Při zvýšení koncentrace rozpuštěného kyslíku na hodnotu 0,9 mg/l byl do média dávkován roztok afinové sacharózy, obsahující v 1 litru 400 g cukru a 250 ml 25% vodného roztoku amoniaku tak dlouho, až se koncentrace rozpuštěného kyslíku ustálila na hodnotě 0,7 mg/1.After 8 hours, when the process was in the latent phase, the production organism began to grow and produce L-threonine. As a result of increasing growth rate and thus respiration, a decrease in dissolved oxygen concentration and a decrease in pH began. By the 20 th culture hour, the pH was automatically adjusted to 6.5-7.0 by adding 25% aqueous ammonia solution. Sucrose consumption was indicated by a decrease in respiration (at about 20 h) resulting in an increase in dissolved oxygen concentration in the medium. When the dissolved oxygen concentration was increased to 0.9 mg / l, an affine sucrose solution containing 400 g of sugar in 1 liter and 250 ml of a 25% aqueous ammonia solution was added to the medium until the dissolved oxygen concentration stabilized at 0.7 mg / l.

Po poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku pod hodnotu 0,7 mg/1 /při maximálním míchání 900 ot/min/ byl dávkován 70 % roztok sacharózy rychlostí 200 ml/h, opět automaticky v závislosti na zvýšení koncentrace rozpouštěného kyslíku na hodnotu 0,9 mg/1, pH bylo automaticky regulováno na hodnotu 6,5 až 7,0 přidáváním 25% vodného roztoku amoniaku.After the dissolved oxygen concentration dropped below 0.7 mg / l (with a maximum stirring of 900 rpm), a 70% sucrose solution was dosed at 200 ml / h, again automatically as the dissolved oxygen concentration increased to 0.9 mg / min. 1, the pH was automatically regulated to 6.5-7.0 by the addition of 25% aqueous ammonia solution.

Při zastavení růstu a poklesu růstové rychlosti na nulovou hodnotu bylo zastaveno dávkování sacharózy, její koncentrace se nechala klesnout na hodnotu pod 0,5 g/1 a fermentace byla ukončena. Po 42 h kultivace bylo dosaženo produkce 80 g/1 L-threoninu, při konverzi sacharózy 42 %.When the growth stopped and the growth rate dropped to zero, the dosing of sucrose was stopped, its concentration was allowed to drop below 0.5 g / l and the fermentation was stopped. After 42 hours of cultivation, 80 g / L of L-threonine was produced, with a sucrose conversion of 42%.

Z kultivačního média lze L-threonin izolovat buď jako technický produkt, nebo jako čistou krystalickou substanci.L-threonine can be isolated from the culture medium either as a technical product or as a pure crystalline substance.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

L-threonin, připravený způsobem podle vynálezu, lze využít jednak v krmivářství, jednak k farmaceutickým /léčebným/ účelům.The L-threonine prepared by the process of the invention can be used both in the feed industry and for pharmaceutical / therapeutic / purposes.

Claims

A method of controlling L-threonine fermentation using dissolved oxygen concentration by culturing a production strain of Escherichia coli 472 T-23 in a liquid production medium containing sucrose and ammonia as sources of assimilable carbon and nitrogen, mineral nutrient salts and / or trace elements and / or biofactors aerobic mixing and aeration conditions, while maintaining a pH of 6.5 to 7.0, characterized in that the dissolved oxygen concentration is maintained at 0.7 to 0.9 mg / L after the growth of the producer is started with the production of L-threonine. 1 by controlling the mixing and aeration intensity and the addition of the sucrose solution and the ammonia solution, and after stopping the growth and decreasing the growth rate of the microorganism to zero and reducing the sucrose concentration in the production medium to below 0.5 g / l, the cultivation is terminated.