CZ282711B6

CZ282711B6 - Cultivated epidermal transplant

Info

Publication number: CZ282711B6
Application number: CZ941315A
Authority: CZ
Inventors: Pavel Mudr. Csc. Brychta; Jana Komárková; Jiří Doc. Mudr. Csc. Adler
Original assignee: Lékařská Fakulta Masarykovy Univerzity
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1994-05-31
Publication date: 1997-09-17
Also published as: CZ131594A3

Abstract

This cultivated epidermal transplant, intended for treating burns and dermal defects, can be prepared from the initial embryonic and/or foetal epidermis, which is separable from the dermis, which is fragmented, and the cell suspension obtained is cultivated into at least a one-layer system of a mutually bonded epithelia.<IMAGE>

Description

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká kultivovaného epidermálního transplantátu, zejména kultivovaného lidského epidermálního epitelu, a způsobu jeho přípravy.The invention relates to a cultured epidermal transplant, in particular a cultured human epidermal epithelium, and a process for its preparation.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Kůže je důležitý orgán, který pokrývá povrch lidského těla a tvoří rozhraní mezi živým systémem a okolním prostředím. Kůže zabezpečuje řadu funkcí, jako například ochranu před fyzikálními a chemickými faktory, termoregulaci a obranu organismu před infekcí. Kůže sestává z pokožky neboli epidermis, škáry neboli dermis a podkoží neboli stratům subcutaneum. Z hlediska integrity povrchu kůže má nej důležitější úlohu epidermis.Skin is an important organ that covers the surface of the human body and forms the interface between the living system and the environment. The skin provides a number of functions, such as protection from physical and chemical factors, thermoregulation and defense against infection. The skin consists of the skin or epidermis, the dermis or dermis and the subcutaneous tissue or strata subcutaneum. The epidermis plays the most important role in skin surface integrity.

Epidermis sestává ze dvou částí, přičemž každá z nich je vícevrstevná. Vnitřní část obsahuje keratinocyty, buňky pojmenované podle vláknitých bílkovin - keratinů, které jsou v nich tvořeny. Basální vrstva vnitřní části epidermis je tvořena malými dělícími se buňkami, které se ve vyšších vrstvách diferencují. Zevní část epidermis je tvořena komeocyty, odumřelými buňkami, které zabezpečují mechanickou odolnost kůže. Basální membrána odděluje epidermis od dermis. Dermis je tvořena pojivovou tkání s fibroblasty, které vytvářejí kolagen a elastin. Jsou zde také vlasové váčky, potní a mazové žlázy a cévní kapiláry.The epidermis consists of two parts, each of which is multilayered. The inner part contains keratinocytes, cells named after the fibrous proteins - keratin, which are formed in them. The basal layer of the inner part of the epidermis consists of small dividing cells that differentiate in the higher layers. The outer part of the epidermis is made up of comeocytes, dead cells that ensure mechanical resistance of the skin. The basement membrane separates the epidermis from the dermis. The dermis is formed by connective tissue with fibroblasts that produce collagen and elastin. There are also hair follicles, sweat and sebaceous glands and vascular capillaries.

S ohledem na uvedenou nezastupitelnou úlohu kůže je její poškození popálením považováno za jeden z nej závažnějších úrazů člověka. Toto poranění s ohledem na rozsah postižení je ve velkém počtu smrtelné, léčba je velmi zdlouhavá a bolestivá, často s trvalými následky tělesnými i psychickými.Given the irreplaceable role of the skin, burn damage is considered to be one of the most serious human injuries. This injury is fatal due to the extent of the disability, the treatment is very lengthy and painful, often with permanent physical and psychological consequences.

Zásadní pokrok v léčbě těžkých popálenin přineslo zavedení kultivace lidských adultních keratinocytů in vitro za účelem přípravy epiteliální tkáně. V této souvislosti je třeba především uvést práce prof. Howarda Greena a jeho spolupracovníků, věnované optimalizaci a standardizaci podmínek sériové kultivace lidských adultních keratinocytů na výživné vrstvě fibroblastů stabilní linie 3T3. Jejich základní principy jsou obsaženy v US patentovém spisu č. 4 016 036 a návazně v US patentovém spisu č. 4 364 866. Touto metodou jsou keratinocyty preparovány pomocí trypsinu z malé kožní biopsie, veliké řádově několik centimetrů čtverečních, a kultivovány v médiu s růstovými faktory na výživné vrstvě fibroblastů, inhibovaných letálním ozářením. Proliferace a dělení keratinocytů vede ke tvorbě jejich kolonií. Postupně se vytváří souvislá vrstva buněk, spojených desmosomy. V další fázi této kultivace se tvoří vícevrstevný epitel, který lze od růstové podložky oddělit pomocí enzymu dispasy. Epitel, vytvořený metodou podle prof. Greena, je fixován na vhodný nosič a je připraven k transplantaci na postižené místo. Bylo experimentálně prokázáno, že pomocí takto uskutečňované kultivace lze z původní biopsie o ploše dvou centimetrů čtverečních získat během tří týdnů epidermis o ploše jednoho metru čtverečního. Použití kultivovaných epidermálních transplantátů přineslo tímto v léčbě popálenin a kožních defektů zásadní pokrok, což jednoznačně prokazují více jak desetileté zkušenosti z této oblasti, jak jsou například shrnuty v práci: Carolyn C. Compton - Wound healing potential of cultured epithelium 1993, 5, 95-111.A major advance in the treatment of severe burns has been the introduction of in vitro cultivation of human adult keratinocytes to prepare epithelial tissue. In this context it is necessary to mention the work of prof. Howard Green and his collaborators, dedicated to optimizing and standardizing conditions for serial cultivation of human adult keratinocytes on the 3T3 stable lineage fibroblast layer. Their basic principles are contained in U.S. Pat. No. 4,016,036 and consequently in U.S. Pat. No. 4,364,866. By this method keratinocytes are prepared using trypsin from a small skin biopsy, a few centimeters in size, and cultured in growth medium. factors on the nutrient layer of fibroblasts inhibited by lethal radiation. Proliferation and division of keratinocytes leads to their colony formation. Gradually, a continuous layer of cells connected by desmosomes is formed. In the next phase of this culture, a multilayered epithelium is formed which can be separated from the growth mat by the enzyme dispase. Epithelium, created by the method of prof. Green is fixed to a suitable carrier and ready to be transplanted to the affected area. It has been experimentally demonstrated that with this cultivation, an epidermis of one square meter can be obtained within three weeks from the original biopsy of two square centimeters. The use of cultured epidermal transplants has thus brought significant progress in the treatment of burns and skin defects, as evidenced by more than 10 years of experience in this field, as summarized in: Carolyn C. Compton - Wound healing potential of cultured epithelium 1993, 5, 95- 111.

Mimo těchto základních výše uvedených prací, vztahujících se k problematice kultivace epidermálních transplantátů lze jako specifický dále uvést způsob kultivace fetálních mezenchymálních buněk, obsažený v mezinárodní přihlášce vynálezu čísla spisu WO 87/05931, jehož výsledkem je produkce struktur podobných pankreatickým ostrůvkům, které jsou schopny produkovat inzulín. V předmětném mezinárodním ochranném dokumentu je popsána obecnáIn addition to the aforementioned work relating to the problem of epidermal transplantation, the method of culturing fetal mesenchymal cells, disclosed in International Application No. WO 87/05931, resulting in the production of pancreatic islet-like structures capable of producing insulin. The international protection document in question describes a general one

- 1 CZ 282711 B6 představa tvorby adultních specializovaných buněk z nezralých fetálních buněk v podmínkách in vivo, jako například tvorba nových nervových buněk při poškozeni nervové tkáně nebo tvorba nových epidermálních buněk při hojení ran. Výše uvedený způsob kultivace fetálních mezenchymálních buněk neřeší problém možné kultivace fetálních kožních kmenových buněk in vitro, zejména z důvodu odlišnosti samotné podstaty řešení i z důvodu obecně nemožné použitelnosti kultivace fetálních mezenchymálních buněk in vivo pro kultivaci epidermálních transplantátů in vitro.The idea of generating adult specialized cells from immature fetal cells in vivo, such as the formation of new nerve cells in nerve tissue damage or the formation of new epidermal cells in wound healing. The aforementioned method of culturing fetal mesenchymal cells does not solve the problem of the possible in vitro cultivation of fetal skin stem cells, in particular because of the very nature of the solution and the generally impossible applicability of in vivo cultivation of fetal mesenchymal cells for in vitro epidermal transplantation.

Tyto již mnohaleté zkušenosti však současně prokázaly, že sériová kultivace lidských adultních keratinocytů již prakticky dospěla do své optimální fáze a pomocí této metody se už nedaří výrazněji urychlit vývin takovéto epidermální tkáně, což má zejména praktický nepříznivý důsledek v jejích značných pořizovacích nákladech.However, these many years of experience have also shown that serial cultivation of human adult keratinocytes has practically reached its optimal stage and this method is no longer able to significantly accelerate the development of such epidermal tissue, which in particular has a practical adverse effect in its considerable cost.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Výše uvedenou problematiku řeší a nedostatky známých vytvoření a způsobu přípravy kultivovaných epidermálních transplantátů, zejména lidského epidermálního epitelu, odstraňuje jedno- a vícevrstevný kultivovaný epidermální transplantát v provedení podle předmětného vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že je připravitelný z výchozí embryonální a/nebo fetální epidermis, jež je oddělitelná od dermis, která se fragmentuje a získaná buněčná suspenze se kultivuje do nejméně jednovrstevné soustavy vzájemně vázaných epitelií. Dále je podle vynálezu kultivovaný epidermální transplantát charakterizován tím, že se jednovrstevná soustava epitelií odloučí od růstové podložky enzymaticky. Podle vynálezů je pak kultivovaný epidermální transplantát ještě výhodně charakterizován tím, že se jednotlivé epitelie a/nebo jejich kolonie výchozí embryonální a/nebo fetální epidermis kultivují s fibroblasty, jejichž dělení se předem inhibuje.The above-mentioned problem is solved and the drawbacks of known embodiments and methods for the preparation of cultured epidermal transplants, in particular human epidermal epithelium, are overcome by the monolayer and multilayer cultured epidermal transplant of the embodiment of the present invention. epidermis, which is separable from the dermis, which is fragmented, and the cell suspension obtained is cultured in at least a monolayer system of interconnected epitheliums. Further, according to the invention, the cultured epidermal transplant is characterized in that the monolayer system of epithelial cells is separated enzymatically from the growth mat. According to the inventions, the cultured epidermal transplant is still preferably characterized in that the individual epithelium and / or its colonies of the starting embryonic and / or fetal epidermis are cultured with fibroblasts whose division is pre-inhibited.

Výhoda vytvoření kultivovaného epidermálního transplantátu, připravítelného z výchozí embryonální a/nebo fetální epidermis, jež je oddělitelná od dermis, která se fragmentuje a získaná buněčná suspenze se kultivuje do nejméně jednovrstevné soustavy vzájemně vázaných epitelií, spočívá především v jejich potenci produkovat do kultivačního média významně větší množství růstových faktorů oproti užívaným adultním epidermálním epiteliím. Navíc lze takovéto médium, obsahující růstové faktory, uvolněné v průběhu kultivace embryonálních a/nebo fetálních epitelií způsobem přípravy podle vynálezu využít jako tzv. kondiciované médium ke kultivaci jiných, například právě adultních epiteliálních buněk. Kromě toho lze využitím tohoto kondiciovaného média nahradit některé růstové faktory, například růstový epidermální faktor. Protože růstový potenciál embryonálních a/nebo fetálních epitelií je oproti porovnatelným adultním epiteliím vyšší, dochází k tvorbě kultivovaného epidermálního transplantátu podle vynálezu zřetelně rychleji, což umožňuje statisticky významně zkrátit dobu, potřebně k přípravě kultivovaných epidermálních transplantátů a tedy i dobu mezi odběrem kožní biopsie a transplantací. Praktickým důsledkem této skutečnosti je, že při použití kultivovaných embryonálních a/nebo fetálních transplantátů podle vynálezu je u hlubokých popálenin II.b stupně, kterých je většina, dosaženo epitelizace rány za statisticky významně kratší dobu, což má nepochybně příznivý vliv na fyzický i psychický stav postiženého člověka. Rovněž ekonomické výsledky jsou zde příznivější, neboť dochází ke znatelnému snížení nákladů na přípravu kultivovaných embryonálních a/nebo fetálních epidermálních transplantátů podle vynálezu oproti stávajícím značným nákladům na přípravu kultivovaných adultních epidermálních transplantátů. Navíc lze u výhodného způsobu přípravy kultivovaného epidermálního transplantátu podle vynálezu izolovat od kultivovaných jednotlivých epitelií a/nebo jejich kolonií vytvářené růstové proteiny, které samy o sobě mohou sloužit k podpoře růstu a množení epiteliálních buněk in vitro nebo in vivo.The advantage of forming a cultured epidermal transplant obtainable from a starting embryonic and / or fetal epidermis that is separable from the dermis that is fragmented and the cell suspension obtained is cultured into at least a monolayer system of interconnected epitheliums lies primarily in their ability to produce significantly greater a number of growth factors compared to the adult epidermal epithelium used. In addition, such a medium containing growth factors released during the cultivation of embryonic and / or fetal epithelium by the method of preparation according to the invention can be used as a so-called conditioned medium for the cultivation of other, for example adult epithelial cells. In addition, some growth factors, such as growth epidermal factor, may be substituted for this conditioned medium. Since the growth potential of embryonic and / or fetal epithelial cells is higher than comparable adult epithelial cells, the production of the cultured epidermal transplant of the invention is markedly faster, allowing a statistically significant reduction in the time required to prepare cultured epidermal transplants. . The practical consequence of this is that the use of the cultured embryonic and / or fetal transplants of the invention results in wound epithelialization in a statistically significantly shorter time in the most severe grade II.b burns, which has undoubtedly beneficial effects on the physical and mental state disabled person. Also, the economic results are more favorable here, since there is a noticeable reduction in the cost of preparing the cultured embryonic and / or fetal epidermal transplants of the invention compared to the current significant cost of preparing the cultured adult epidermal transplants. In addition, in a preferred method of preparing a cultured epidermal transplant of the invention, the growth proteins produced by the individual epithelial cells and / or their colonies can be isolated, which can themselves serve to promote the growth and multiplication of epithelial cells in vitro or in vivo.

-2CZ 282711 B6-2GB 282711 B6

Přehled obrázků na výkresechBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Vynález bude dále blížeji objasněn pomocí přiložených výkresů, na nichž znázorňuje obr. 1 mikrofotografii kolonií embryonálních epitelií po dvou dnech kultivace, obr. 2 mikrofotografii jednovrstevného embryonálního epitelu po sedmi dnech kultivace, obr. 3 mikrofotografii řezu vícevrstevným embryonálním epitelem po dvanácti dnech kultivace, obr. 4 mikrofotografii ultratenkého řezu vícevrstevným epitelem po dvanácti dnech kultivace a obr. 5 mikrofotografii ultratenkého řezu vícevrstevným embryonálním epitelem po dvanácti dnech kultivace v oblasti mezibuněčných spojení.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a photomicrograph of embryonic epithelial colonies after two days of cultivation; FIG. 2 is a photomicrograph of single-layer embryonic epithelium after seven days of cultivation; FIG. 3 is a photomicrograph of a section of multilayer embryonic epithelium after 12 days of cultivation; Fig. 4 is a photomicrograph of ultrathin sections of multilayer epithelium after twelve days of cultivation, and Fig. 5 is a photomicrograph of ultrathin sections of multilayer embryonic epithelium after twelve days of cultivation in the area of intercellular junctions.

Příklad provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Nejprve byly získány kožní biopsie z embryí a/nebo fetů po indukovaném abortu z důvodu zdravotní indikace ze strany matky. Kožní biopsie byly odebírány nejpozději 12 hodin po abortu a uloženy do minimálního esenciálního média s antibiotiky. Kožní biopsie byly promyty fosfátovým pufrem s antibiotiky, převedeny do roztoku enzymů, například trypsinu, a inkubovány 12 až 18 hodin při teplotě 4 °C. Působení enzymu bylo inhibováno přidáním minimálního esenciálního média s fetálním bovinním sérem. Dále byly kožní biopsie mechanicky preparovány tak, že se embryonální a/nebo fetální epidermis oddělí od dermis. Embryonální a/nebo fetální epidermis byla mechanicky fragmentována a získaná buněčná suspenze zfiltrována. Poté byla buněčná suspenze centrifugována, sediment resuspendován a inokulován v hustotě 10⁶ buněk/láhev 75 cm² do minimálního esenciálního média s fetálním bovinním sérem, růstovými faktory a antibiotiky. Embryonální a/nebo fetální epidermální epitelie byly kultivovány na výživné vrstvě fibroblastů linie 3T3, jejichž dělení bylo inhibováno mitomycinem C při teplotě 37 °C po dobu 2 týdnů, jejichž průběžný stav kultivace je patrný na obr. 1 a 2. V průběhu kultivace embryonálních a/nebo fetálních epitelií se pak vytváří nejméně jednovrstevná soustava vzájemně vázaných epitelií kultivovaného epidermálního transplantátu podle vynálezu, jak je názorně patrno na obr. 3, 4 a 5. Při tomto průběhu kultivace embryonálních a/nebo fetálních epitelií uvedeným způsobem přípravy kultivovaného epidermálního kultivovaného transplantátu podle vynálezu jsou do kultivačního roztoku rovněž uvolňovány růstové faktory, například epidermální růstový faktor. Takovýto kultivační roztok s růstovými faktory lze použít ke stimulaci růstu a množení epiteliálních buněk in vitro nebo in vivo, například při léčbě kožních defektů.First, skin biopsies were obtained from the embryos and / or fetuses after induced abortion for maternal health indication. Skin biopsies were taken no later than 12 hours after abortion and stored in minimal essential antibiotic medium. Skin biopsies were washed with phosphate buffered antibiotics, transferred to an enzyme solution such as trypsin, and incubated for 12-18 hours at 4 ° C. Enzyme activity was inhibited by the addition of minimal essential medium with fetal bovine serum. Further, skin biopsies were mechanically prepared by separating the embryonic and / or fetal epidermis from the dermis. The embryonic and / or fetal epidermis was mechanically fragmented and the cell suspension obtained was filtered. The cell suspension was then centrifuged, the sediment resuspended and inoculated at a density of 10 ⁶ cells / 75 cm ² flask into minimal essential medium with fetal bovine serum, growth factors and antibiotics. The embryonic and / or fetal epidermal epitheliums were cultured on a nutrient layer of fibroblasts of line 3T3, the division of which was inhibited by mitomycin C at 37 ° C for 2 weeks, the progress of which is evident in Figures 1 and 2. and / or fetal epithelial cells are then formed at least a monolayer system of interconnected epithelial cultures of the cultured epidermal transplant of the invention, as illustrated in FIGS. 3, 4, and 5. During this course of embryonic and / or fetal epithelium cultivation, According to the invention, growth factors such as epidermal growth factor are also released into the culture solution. Such a growth factor culture solution can be used to stimulate the growth and multiplication of epithelial cells in vitro or in vivo, for example in the treatment of skin defects.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Předmětný kultivovaný epidermální transplantát je zejména využitelný při léčbě popálenin a kožních defektů.The present cultured epidermal transplant is particularly useful in the treatment of burns and skin defects.

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS

Claims

A cultured epidermal transplant obtainable from a parent embryonic and / or fetal epidermis that is separable from the dermis that is fragmented and the cell suspension obtained is cultured into at least a monolayer system of interconnected epitheliums.

The cultured epidermal transplant of claim 1, wherein the monolayer system of epithelial cells is separated enzymatically from the growth pad.

-3 CZ 282711 B6

The cultured epidermal transplant of claim 1, wherein the individual epithelium and / or colonies thereof of the starting embryonic and / or fetal epidermis are cultured with fibroblasts whose division is pre-inhibited.